RGB ve bitki fenotipleme ve fizyolojik araştırma için spektral kök görüntüleme: deneysel kurulum ve iletişim kuralları görüntüleme

Bu prosedürün genel amacı, farklı görüntüleme yöntemlerini birleştirerek toprakla doldurulmuş rizobokslarda büyüyen bitki kökleri hakkında kapsamlı bilgiler elde etmektir. Bu yöntem, farklı kök mimarilerinin daha iyi abiyotik stres direncine olan katkısı gibi bitki fenotipleme ve ıslahı alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yaklaşımın temel avantajı, kök mimarisi için RGB görüntüleme ile kök fonksiyonelliği için hiperspektral görüntülemeyi birleştirmesidir.

Kökler için hiperspektral görüntüleme kullanmanın potansiyeli, spektral bilgilerin bitki kökleri tarafından oluşturulan küçük ölçekli fizyokimyasal değişiklikleri ortaya çıkarabilmesi nedeniyle geniş bir rizosfer parametreleri yelpazesine yayılmaktadır. Rizobox doldurma adımlarının dikkatle yapılması gerektiğinden, bu yöntemin görsel gösterimi kritiktir. Aksi takdirde, kök büyümesi ve kök görünürlüğü olumsuz etkilenecektir.

Bu prosedüre, metin protokolünde ayrıntılarıyla belirtildiği üzere, substrat dolumu için rizoboksların hazırlanmasıyla başlayın. 3.705 gram kuru toprağa 400 gram su ekleyerek, kuru toprağı gram başına 0,108 gramlık bir gravimetrik su içeriğine gelecek şekilde önceden ıslatın. Homojen bir su dağılımı elde etmek için toprağı ve suyu nazikçe karıştırın.

Parçacık boyutunu iki milimetre veya daha küçük tutmak için büyük agregatları manuel olarak parçalayın. Hava boşluklarından kaçınarak, gaz gözlem penceresinin yanına homojen bir toprak tabakası oluşturmak kritik önem taşır. Bitki kök uçları hızla su kaybeder ve hava boşluklarına doğru büyür.

Ayrıca, su haritalaması için spektral görüntü kalitesi olumsuz etkilenmektedir. Önceden ıslatılmış toprağı açık rizoboxlara doldurun ve kutunun iç hacmini kaplayan polistiren bir levha kullanarak hafifçe sıkıştırın; böylece 1,3 grams per cubic centimeter değerinde homojen bir hacim yoğunluğu elde edin. Hedeflenen 0,31 cubic centimeters per cubic centimeter su içeriğine ulaşmak için kalan miktardaki suyu bir sprey şişesiyle yüzeye püskürterek ekleyin.

Yüzey yapısının bozulmasını önlemek ve homojen bir ıslatma sağlamak için damlacık boyutunun küçük olduğundan emin olun. Altlığa gerçekte eklenen su miktarını izlemek için püskürtme sırasında kutuyu bir terazi üzerinde tutun. Suyun 10 dakika boyunca yeniden dağılmasını bekleyin ve ardından camı yüzeye bastırarak yan metal raylarla sabitleyin.

Islatılmış substrat içeren rhizoboxların ortalama son ağırlığı 17.818 ± 68 gramdı. İklim odasını, optimum bitki büyümesi için 440 ve 660 nanometrede spektral piklere sahip, m² başına saniyede 450 mikromol düzeyinde homojen aydınlatma sağlayan sekiz adet LED lamba ile donatın. Ortam parametrelerini bitki ve deney ihtiyaçlarına göre ayarladıktan sonra, kök bölgesini karanlıkta tutmak ve cam yüzeyden sızan ışığa bağlı alg oluşumunu önlemek için cam pencereyi ahşap bir plaka ile kapatın.

Ardından, uygun bir metal çerçeve kullanarak rizoboksları 45 derecelik bir eğimle yerleştirin. Bu işlem, gravitropizm nedeniyle kök büyümesinin cam yüzeye doğru maksimize edilmesini sağlar. RGB kök görüntülemesi için rizoboksu, rizobokstan 80 santimetre uzaklıkta sabitlenmiş dört adet 24 watt'lık floresan lamba ile aydınlatın.

Kök ile açık renkli substrat arka planı arasında düşük kontrast olması durumunda, kök otofloresansından yararlanmak için rizoboks'un alternatif aydınlatmasına 20 santimetre uzaklıkta dört adet 15 watt'lık UV tüpü monte edin. UV lambaları açın ve ardından görüntülecek olan rizoboks'u görüntüleme kutusunun tutucusuna yerleştirin. Daha sonra, bir rizoboks'un üst ve alt yarısını kapsayacak şekilde, yaklaşık üç santimetrelik bir örtüşme ile iki görüntü alın.

Metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı şekilde RGB görüntülerini edinin ve işleyin. Son olarak, elde edilen RGB kök görüntülerinin analizini gerçekleştirin ve ardından uyumsuz bölgeler olup olmadığını kontrol edin. Bu durumda, bir hariç tutma bölgesi tanımlayın ve analizi yeniden başlatın.

Sınıflandırılmamış kökler için ek renk sınıfları ekleyin ve analizi yeniden başlatın. Yanlışlıkla kök olarak sınıflandırılan öğeler için kalıntı ve pürüzlü kenar filtreleme seçeneklerini etkinleştirin veya artırın. Kamera yazılımında önce rizoboks taraması ve beyaz standart için kamera entegrasyon sürelerini belirleyerek görüntü alımını gerçekleştirin.

Bunu yapmak için görüntüleme GUI'sini açın ve kamerayı rizoboksun köklerin bulunduğu bir konumuna getirin. Yazılım tarafından görüntülenen histogramda, kameranın tam dinamik aralığının yaklaşık %85'inin kullanılacağı şekilde, ışıklı bir nesneye odaklanarak kameranın entegrasyon süresini ayarlayın. Farklı substratlar ve kök dokuları için entegrasyon süresinin doğru ayarlanması, kızılötesi kameranın aralığının aşılmasıyla oluşabilecek bilgi kayıplarını önleyerek dinamik aralıktan tam anlamıyla yararlanmak için kritiktir.

Kamera yazılımını kapatmadan önce kamera konumlandırma sistemini beyaz standart hedeflemiş şekilde hareket ettirerek işlemi beyaz standart için tekrarlayın. Ardından Matlab görüntüleme GUI'sini açın ve mevcut rhizobox taramasındaki tüm ayarları girin. Her görüntüleme çalışmasından önce günde bir kez karanlık ve beyaz standartları edinin.

Koyu standart kamera gürültüsünü temsil ederken, beyaz standart maksimum yansıtıcılığı verir. Bu veriler, ön işleme sırasında görüntü normalizasyonu için gereklidir. Rizoboksun tamamının mı yoksa sadece bir kısmının mı taranacağını tanımlayın.

Mevcut durum için, tüm rizoboxların görüntüleri alınır. Ardından tarama başlatılır. Su içeriğinin spektrum tabanlı ölçümü için bir kalibrasyon rizoboxu gereklidir.

Farklı su içeriklerinde toprakla doldurmak amacıyla, bir rizobox'ı polistiren levhalar kullanarak beş santimetrelik bölmelere ayırın. Kalibrasyon rizobox'ını, ekili rizoboxlar için kullanılan ayarların aynısıyla tarayın. Örneğin, kök ve toprak üstü özellikleri birleştirmek için, stomata iletkenliğini ölçmek üzere yaprak porometresini temin edin.

Cihazı iklimlendirme odasında en az bir saat boyunca ortam koşullarına alıştırın. Bitki başına en az üç yapraktan ölçümler yapın. RGB görüntülemeye dayalı olarak, şeker pancarı çeşidi Ferrara'nın temsili bir kök büyüme görüntüsü burada gösterilmiştir.

Ekimden 35 gün sonra, bitki kökleri rizoboxun tabanına ulaşacak şekilde uzamıştır. Rizoboxun üst kısmındaki bazı kök eksenleri RGB görüntülerden segmente edilememiştir. Daha yaşlı bazal köklerin yaşlanması, renklerinin kahverengiye dönmesine neden olur.

Bu nedenle, bir renk eşiğine dayalı olarak bu köklerin toprak arka planından ayrılması başarısız olur. Hiperspektral görüntüleme kullanıldığında, segmentasyon, kök ön planı ve toprak arka planının farklı spektral özelliklerine dayanır. Bu durum, segmentasyon sonucunu iyileştirir.

Manuel olarak takip edilen bir referans görüntü ile ölçülen kök uzunluğu arasındaki farklar yalnızca %1,5'tir. Ayrıca, spektral görüntüleme, su alımı hakkında çıkarım yapmak için kök çevresindeki su içeriğinin hassas bir şekilde haritalanmasına olanak tanır. Burada kök iskeleti siyah renkte gösterilmiştir. Daha açık renkli alanlar, kök eksenlerinin yakınındaki daha yüksek su tükenmesi bölgelerini göstermektedir.

Koyu mavi alanlar, köklerin ulaşamadığı bölgelerdeki daha yüksek toprak su içeriğini temsil eder. Bu videoyu izledikten sonra, tatmin edici kök büyümesini ve görünürlüğünü sağlamak için rizoboxların nasıl doğru şekilde doldurulacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu işlem, daha sonraki görüntüleme ve temsili kök fenotipleme sonuçlarının temelini oluşturur.

Bu prosedürün ardından, kök yaşlanması ve ayrışması gibi kök ve rizosfer özelliklerine dair derinlemesine bilgi elde etmek için K-ortalama kümeleme veya destek vektör makineleri gibi diğer spektral sınıflandırma yöntemleri uygulanabilir. Bir kez kurulduktan sonra, bu teknik kök sistemlerini ve abiyotik stres yanıtını kapsamlı bir şekilde fenotiplemenize olanak tanır. Toplamda üç aydan kısa süren bir deneysel süre ile 10 kültivardan oluşan bir set karakterize edilebilir.