Verimli üretimi ve besleyici-Alerjik IPSCs CRISPR-Cas9 sistemini kullanarak insan pankreas hücreleri düzenleme

Bu iletişim kuralı koşullarda besleyici içermeyen insan pankreas hücreleri ayak izi-Alerjik İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSCs) nesil ayrıntılı olarak anlatılmaktadır kullanarak CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins ve değiştirilmiş karakterizasyonu düzenleyerek takip tek hücre klonlar.

Bu prosedürün genel amacı, besleyici içermeyen koşullarda insan pankreas hücrelerinden ayak izi bırakmayan indüklenmiş pluripotent kök hücreler veya IPSC'ler üretmek, daha sonra CRISPR-Cas9 ribonükleoproteinleri kullanarak hücreleri düzenlemek ve son olarak modifiye edilmiş tek hücre klonlarını karakterize etmektir. Bu yöntem, ayak izi bırakmayan IPSC'lerin oluşturulması ve CRISPR-Cas9 ribonükleoproteinleri ile düzenleme gibi insan kök hücre genomu düzenleme alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, düzenlenmiş IPSC'lerin klonal satırlarının yüksek güvenilirlikle oluşturulabilmesi ve mozaikçiliğe dair bir kanıt olmamasıdır.

Altı oyuklu bir plakayı soğuk kollajen ile kapladıktan sonra, insan birincil pankreas hücrelerini 2. günde Prigrow III ortamında erken geçişli olarak plakalayın ve transdüksiyon gününde veya sıfırıncı günde kuyu başına yaklaşık 2.5 x 10 ila 5 hücre veya en az% 60 birleşme elde edin. Hücrelerin metin protokolüne göre hasat edilmesinden ve sayılmasından sonra transdüksiyon gününde, bir set Sendai vektör tüpünü buz üzerinde çözün ve her tüpün hesaplanan hacimlerini 1 mL önceden ısıtılmış Prigrow III ortamına dikkatlice ekleyin. Çözeltiyi karıştırmak için hafifçe pipetleyin.

Prigrow III'ü hücrelerden aspire edin ve yeniden programlama virüsü karışımını yavaşça kuyucuklara ekleyin. Daha sonra hücreleri gece boyunca 37 derecelik bir inkübatörde inkübe edin. Transdüksiyondan yirmi dört saat sonra, hücrelerdeki virüs karışımını dikkatlice atın ve taze Prigrow III ortamı ile değiştirin.

Altıncı günde, hücrelere 1 mL hücre ayırma çözeltisi ekleyin ve 10 dakika inkübe edin. Daha sonra, kaya inhibitörlü Prigrow III kullanarak, tüm hücreleri bir gün önce hazırlanan MEF yemeklerinin üzerine koyun. Hücreleri gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Arnavut kaldırımı morfolojisi ve büyük bir çekirdek ve nükleoller ile klonal agregalar oluşturacak olan yeniden programlanmış hücrelerin göstergesi olan hücre kümelerinin veya kolonilerin ortaya çıkması için plakaları düzenli olarak gözlemleyin. Olası IPSC kolonilerini işaretleyin ve büyüme açısından düzenli olarak kontrol edin. Transdüksiyondan yaklaşık dört hafta sonra, 24 kuyulu MEF plakası hazırlandıktan sonra, analiz sertifikasındaki seyreltme faktörüne dayalı olarak alikode ederek matris membranı hazırlayın.

24-48 koloni toplayın ve bunları mTeSR1 ile matris membran kaplı 24 oyuklu plakalara aktarın. Plakaları 24 saat inkübe edin ve ortamı her gün değiştirin. Daha fazla ayrıntı için metin protokolüne bakın.

Matris membran üzerine kaplanmış sağlam kolonileri ayırmak için 500 mcL dispas ekleyin. Hücreleri 20 dakika inkübe ettikten sonra, matris membran kaplı 12 oyuklu plaka üzerine tekrar plakalayın. Metin protokolüne göre alkalin fosfataz boyama, immün boyama ve FACS analizi kullanarak klonları genişletin ve karakterize edin.

SGRNA'ları metin protokolüne göre sentezledikten sonra HIPSC'leri transfekte etmek için, 22 mcL'lik bir reaksiyon hacminde 0.5 mcg Cas9 proteini ve her bir SGRNA'nın 0.5 mcg'sini birleştirerek her numune için nükleofaksiyon ana karışımı hazırlayın. Kaya inhibitörü içeren ortamı aspire ettikten sonra, ISPC'lerin her bir kuyusunu yıkamak için 2 mL RTPBS kullanın. Daha sonra PBS'yi aspire edin ve 1 mL hücre ayırma çözeltisi ekleyin.

Plakayı 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Hücreleri 3 mL mTeSR1 ortamında yeniden süspanse edin ve tek bir hücre süspansiyonu oluşturmak için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Ayrışmış hücreleri 5 mL mTeSR1 ortamı içeren 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.

Nükleofeksiyon ana karışımına, Nükleofektör kitinden 16.4 mcL P3 birincil hücre takviyesi ve 3.6 mcL takviye ekleyin. Hücreleri saydıktan ve döndürdükten sonra, 0.5 x 10'luk her birimi, önceden hazırlanmış transfeksiyon ana karışımının 22 mcL'sindeki 6. hücrelere yeniden süspanse edin. Hücreleri hızlı bir şekilde bir Nükleobüvet şeridinin bir oyuğunun merkezi odasına aktarın.

Ardından, şeridi bir Nükleofektör cihazına yerleştirin ve CB150 programını kullanarak hücreleri nükleofect edin. Nükleofeksiyonu takiben, nükleofecte edilmiş hücrelerin her bir oyuğuna hızlı bir şekilde 10 mikromolar kaya inhibitörü içeren 80 mcL önceden ısıtılmış mTeSR1 ortamı ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetleyerek nazikçe karıştırın.

Hücreleri şeritten nazikçe kaya inhibitörlü mTeSR1 ortamı içeren matris membran önceden kaplanmış 12 oyuklu plakanın kuyularına aktarın. MEF plakalarını hazırladıktan sonra inkübasyonun ikinci gününde, tek hücreli sıralamadan en az iki saat önce 1XSMC4 ile desteklenmiş mTeSR1'den mTeSR1'e kadar olan ortamı değiştirin. Ortamı HIPSC'lerden aspire edin ve hücreleri nazikçe yıkamak için PBS'yi kullanın.

Daha sonra her bir oyuğa 500 mcL hücre ayırma çözeltisi ekleyin ve hücreleri 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Her bir kuyucuğa 1 mL mTeSR1 ekleyerek tek hücreli bir süspansiyon oluşturun ve birkaç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Tek hücreleri önceden hazırlanmış 96 oyuklu bir plakanın ayrı oyuklarına sıralayın.

Tasniften dört gün sonra koloni oluşumu belirgin olmalıdır. Bu noktada, kültür ortamını 1X SMC4 ile desteklenmiş HESC ortamı ile değiştirin. Hedef DNA'yı metin protokolüne göre çıkardıktan ve genişlettikten sonra, tüm klonların PCR ile güçlendirilmiş hedef genomik bölgesini üreticinin talimatlarına göre jel boya karışımından geçirmek için bir fragman analizör kiti kullanın.

Pluripotent IPSC klonlarını metin protokolüne göre onaylayın. Sendai virüsü transdüksiyonundan önce, pankreas hücreleri tipik iğ benzeri morfoloji gösterir. İnsan pluripotent hücre kolonilerine benzeyen 12. günde MEF'lerde küçük sıkı koloniler ortaya çıkar.

Normalde, tamamen yeniden programlanmış insan IPSC kolonileri çok net sınırlara sahiptir ve 23 ila 30. günlerde toplanabilir. 23. günde ayrışmış bir koloni burada gösterilmektedir. Burada, pankreas hücrelerinin Sendai virüsünün yeniden programlanmasından sonra besleyici içermeyen koşullarda toplama ve kültürden sonra bir IPSC kolonisinin tipik bir faz kontrast görüntüsü sunulmaktadır.

Alkalen fosfataz lekeli kırmızı IPSC kolonileri sağdadır. IPSC'ler, bu panellerde görüldüğü gibi pluripotens belirteçleri OCT4 ve NANOG için immün boyama ile doğrulandı. Bu deneyde, IPSC'ler hücre yüzey belirteçleri ile boyanmış ve tek hücre süspansiyonu üzerinde FACS analizi yapılmıştır.

Yeşil tepe pankreas IPSC'lerini temsil eder ve mor tepe IPSC negatif hücreleri içerir. Bu prosedürü denerken, hücre sınıflandırma ve hücre kültürü için aseptik veya steril koşulları korumayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, IPSC'lerde ve ESC'lerde gen hedefleme gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir ve kesin genetik modifikasyonlar yapılarak ek sorular cevaplanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, ayak izi bırakmayan ve besleyici içermeyen IPSC'lerin nasıl güvenilir bir şekilde oluşturulacağını ve genom düzenlemesini iki taraflı olarak nasıl gerçekleştireceğinizi iyi anlamış olmalısınız.