Verimli üretimi ve besleyici-Alerjik IPSCs CRISPR-Cas9 sistemini kullanarak insan pankreas hücreleri düzenleme

Bu prosedürün genel amacı, besleyici hücre içermeyen (feeder-free) koşullarda insan pankreas hücrelerinden iz bırakmayan (footprint-free) indüklenmiş pluripotent kök hücreler veya IPSC'ler üretmek, ardından hücreleri CRISPR-Cas9 ribonükleoproteinleri kullanarak düzenlemek ve son olarak modifiye edilmiş tek hücre klonlarını karakterize etmektir. Bu yöntem, iz bırakmayan IPSC'lerin üretimi ve CRISPR-Cas9 ribonükleoproteinleri ile düzenleme gibi insan kök hücre genom düzenleme alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, düzenlenen IPSC'lerin klonal hatlarının yüksek güvenilirlikle üretilebilmesi ve mozaisizm belirtisinin bulunmamasıdır.

Altı kuyucuklu bir plakayı soğuk kolajen ile kapladıktan sonra, transdüksiyon gününde veya sıfırıncı günde kuyucuk başına yaklaşık 2,5 x 10⁵ hücre veya en az %60 konfluens sağlamak için, 2. gün erken pasaj insan primer pankreas hücrelerini Prigrow III ortamına ekleyin. Transdüksiyon gününde, hücreleri metin protokolüne göre toplayıp saydıktan sonra, bir set Sendai vektör tüpünü buz üzerinde çözdürün ve her tüpün hesaplanan hacimlerini dikkatlice 1 mL önceden ısıtılmış Prigrow III ortamına ekleyin. Solüsyonu karıştırmak için nazikçe pipetleyin.

Prigrow III'ü hücrelerden aspire edin ve yeniden programlama virüs karışımını kuyucuklara yavaşça ekleyin. Ardından hücreleri 37 °C'lik bir inkübatörde gece boyunca inkübe edin. Transdüksiyondan yirmi dört saat sonra, hücrelerin üzerindeki virüs karışımını dikkatlice uzaklaştırın ve taze Prigrow III besiyeri ile değiştirin.

Altıncı günde, hücrelere 1 mL hücre ayırma solüsyonu ekleyin ve 10 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, rok inhibitörlü Prigrow III kullanarak tüm hücreleri bir gün önce hazırlanmış MEF kaplarına ekin. Hücreleri 37 °C'de gece boyunca inkübe edin.

Plakaları, yeniden programlanmış hücrelerin göstergesi olan, arnavut kaldırımı morfolojisine, büyük bir çekirdeğe ve nukleollere sahip klonal agregatlar oluşturacak hücre kümeleri veya kolonilerin oluşumu açısından düzenli olarak gözlemleyin. Olası iPSC kolonilerini işaretleyin ve büyümelerini düzenli olarak kontrol edin. Transdüksiyonu takiben yaklaşık dört hafta sonra, 24 kuyucuklu MEF plakaları hazırladıktan sonra, analiz sertifikasındaki dilüsyon faktörüne göre alikotlayarak matriks membranı hazırlayın.

24-48 koloni seçin ve bunları mTeSR1 içeren, matriks membran kaplı 24 kuyucuklu plakalara aktarın. Plakaları 24 saat boyunca inkübe edin ve besiyerini her gün değiştirin. Ek ayrıntılar için metin protokolüne bakınız.

Matriks membran üzerine ekilen güçlü kolonileri ayırmak için 500 mcL dispase ekleyin. Hücreleri 20 dakika inkübe ettikten sonra, tekrar matriks membran kaplı 12 kuyucuklu plakalara ekin. Klonları, metin protokolüne uygun olarak alkalen fosfataz boyama, immün boyama ve FACS analizi kullanarak genişletin ve karakterize edin.

Metin protokolüne uygun olarak sgRNA'ları sentezledikten sonra hIPSC'leri transfekte etmek için, 22 µL'lik bir reaksiyon hacminde 0,5 µg Cas9 proteini ve her bir sgRNA'dan 0,5 µg'ı birleştirerek her örnek için nükleofeksiyon ana karışımını hazırlayın. Rock inhibitörü içeren medyumu aspire ettikten sonra, iPSC'lerin her bir kuyusunu yıkamak için 2 mL RTPBS kullanın. Ardından PBS'yi aspire edin ve 1 mL hücre ayırma solüsyonu ekleyin.

Plakayı 37 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin. Hücreleri 3 mL mTeSR1 ortamında yeniden süspande edin ve tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için pipetle nazikçe aşağı yukarı çekin. Ayrıştırılmış hücreleri, 5 mL mTeSR1 ortamı içeren 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.

Nükleofeksiyon ana karışımına 16,4 µL P3 primer hücre takviyesi ve Nucleofector kitinden 3,6 µL takviye bir ekleyin. Hücreleri sayıp santrifüjledikten sonra, 0,5 x 10⁶ hücreden oluşan her bir birimi, önceden hazırlanmış 22 µL transfeksiyon ana karışımı içinde yeniden süspanse edin. Hücreleri hızlıca bir Nucleocuvette şeridindeki bir kuyucuğun orta haznesine aktarın.

Ardından, şeridi bir Nucleofector cihazına yerleştirin ve hücreleri CB150 programını kullanarak nükleofekte edin. Nükleofeksiyondan sonra, nükleofekte edilen hücrelerin her kuyucuğuna 10 micromolar rock inhibitörü içeren önceden ısıtılmış 80 mcL mTeSR1 medyumu hızlıca ekleyin. Pipetleme yaparak nazikçe karıştırın.

Hücreleri şeritten, rock inhibitörü içeren mTeSR1 besiyerli, önceden kaplanmış matris membranlı 12 kuyucuklu plakadaki kuyucuklara nazikçe aktarın. MEF plakaları hazırlandıktan sonraki inkübasyonun ikinci gününde, tek hücre ayıklama işleminden en az iki saat önce, HIPSC'lerdeki besiyerini mTeSR1'den 1XSMC4 takviyeli mTeSR1'e değiştirin. HIPSC'lerdeki besiyerini aspire edin ve hücreleri nazikçe yıkamak için PBS kullanın.

Ardından, her bir kuyucuğa 500 mcL hücre ayırma çözeltisi ekleyin ve hücreleri 37 °C'de 10 dakika inkübe edin. Her kuyucuğa 1 mL mTeSR1 ekleyip pipetle birkaç kez nazikçe aşağı yukarı çekerek tek hücre süspansiyonu oluşturun. Tek hücreleri, önceden hazırlanmış 96 kuyucuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına sıralayın.

Sıralamadan dört gün sonra koloni oluşumu belirginleşmelidir. Bu aşamada, kültür ortamını 1X SMC4 ile desteklenmiş HESC ortamı ile değiştirin. Hedef DNA'yı metin protokolüne göre ekstrakte edip çoğalttıktan sonra, tüm klonların PCR ile amplifiye edilmiş hedef genomik bölgesini, üreticinin talimatlarına uygun olarak jel boya karışımı üzerinden çalıştırmak için bir fragman analiz kiti kullanın.

Pluripotent IPSC klonlarını metin protokolüne göre doğrulayın. Sendai virüs transdüksiyonundan önce pankreas hücreleri tipik iğsi morfoloji gösterir. 12. güne gelindiğinde MEF'ler üzerinde insan pluripotent hücre kolonilerini andıran küçük, sıkı koloniler oluşur.

Normal şartlarda, tamamen yeniden programlanmış insan iPSC kolonileri oldukça belirgin sınırlara sahiptir ve 23. ile 30. günler arasında toplanabilir. Burada, 23. gündeki ayrıştırılmış bir koloni gösterilmektedir. Burada, pankreas hücrelerinin Sendai virüsü ile yeniden programlanmasının ardından, koloninin toplanması ve besleyici hücre içermeyen (feeder-free) koşullarda kültüre edilmesinden sonraki tipik bir faz kontrast görüntüsü sunulmuştur.

Kırmızıya boyanmış alkali fosfataz pozitif iPSC kolonileri sağda yer almaktadır. iPSC'ler, bu panellerde görüldüğü üzere, pluripotens belirteçleri OCT4 ve NANOG için yapılan immün boyama ile doğrulanmıştır. Bu deneyde, iPSC'ler hücre yüzey belirteçleri ile boyanmış ve tek hücre süspansiyonu üzerinden FACS analizi gerçekleştirilmiştir.

Yeşil pik pankreatik IPSC'leri temsil eder ve mor pik IPSC negatif hücreleri içerir. Bu prosedür uygulanırken, hücre ayırma ve hücre kültürü için aseptik veya steril koşulların korunması gerektiğini unutmamak önemlidir. Bu prosedürün ardından, IPSC'lerde ve ESC'lerde gen hedefleme gibi diğer yöntemler uygulanabilir ve hassas genetik modifikasyonlar yapılarak ek sorular yanıtlanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, iz bırakmayan ve besleyici hücre içermeyen iPSC'lerin nasıl güvenilir bir şekilde üretileceği ve genom düzenlemenin biallelik olarak nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.