Name: Üretim CRISPR/Cas9 kompleks Pronuclear enjeksiyonla genetiği altın Suriye hamster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Keşfedin, CRISPR/Cas9 sistemi ve pronükleer enjeksiyon kullanarak genetiği değiştirilmiş altın Suriye hamsterları üretme yöntemini. Bu protokol, hassas hamster embriyoları için özel teknikler sunarak insan hastalık modelleri geliştirmede önemli bir ilerleme sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu yayında bildirilen Araştırma Ulusal kurumları alerji ve bulaşıcı hastalıklar (NIAID), Ulusal Sağlık Enstitüleri (için ZW) Ödülü numarası 1R41OD021979 altında ve yeni nesil BioGreen 21 bir araştırma hibe tarafından desteklenmiştir Program, Kore, hayır verin. PJ01107704 (için ZW) ve Hayır verin. PJ01107703 (için IK). İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri veya BioGreen 21 resmi görüşlerini temsil etmiyor. Biz Dr Nikolas Robl el yazması düzenleme için teşekkür ederim.

Bu protokol için açıklanan yordamları kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Utah State University tarafından kabul edildi (IACUC Protokolü: 2484). Bu protokol için kullanılan hamster are yetişkin (6-10 hafta-in yaş) LVG altın Suriye hamster süzün. Tüm hamster Bioinnovation Merkezi, Utah State University vivaryum yerleştirilmiştir. Oda Sıcaklık 23 ° C'de ayarla, nem oranı % 40-50 ayarlanır ve ışık-siklet ayarlanır 14L: 10D (ışık: karanlık). Mümkün olduğunda, embriyo manipülasyon ve surugical yordamları steril teknikleri ile yapılmalıdır.
1. sgRNA ve Cas9/sgRNA Ribonucleoproteins (RNP) hazırlık
<ol><li>Sentez seti (malzemeler tablo, özel sayı: 1) kılavuzda açıklandığı vitro transkripsiyon prosedürleri takip sgRNAs sentez.</li>
	<li>Ribonucleoproteins bir araya getirmek için Cas9 2 µg sgRNA 1 µg ile karıştırın ve mix 10-15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya. PN enjeksiyon için çalışan bir çözüm 100 ng/µL Cas9 ve 50 ng/µL sgRNA 10 mM TE arabelleği (RNase free, Malzemeler tablo) ile konsantrasyon yaptırın.</li>
</ol>2. vazektomi hazırlık
Not: 6-8 haftalık erkek hamster kısırlaştırma ameliyatı gerçekleştirilir. Ameliyat 10-14 gün ilk çiftleşme öncesinde yapılmalıdır. Kısırlık kimden verimli dişilerle çiftleşme başarısız gebelik tarafından onaylanır. Vasectomized erkek normalde onlar daha az cinsel açıdan aktif hale gelmeden önce bir yıl boyunca kullanılabilir.
<ol><li>Erkekler bir doz 40 mg/kg (ketamin) ve 10 mg/kg (xylazine) ketamin/xylazine, mayi (IP) enjeksiyonla anestezi. Anestezi pedal refleks (ayak tutam) eksikliği onaylayın.</li>
	<li>Uyuşturulmuş hamster dorsal recumbency kuru bir doku kağıt üzerinde yatıyordu. Durulama karın antiseptik tedavi cerrahi alternatif tarafından üç tur ile fırçalayın çözümleri arasında % 70 alkol ve povidone-iyot.</li>
	<li>Cerrahi makas 1,5 cm 1 cm her tarafına uzanan orta satırından (Şekil 1a) sünnet derisi kafatası başlayan ile dikey kesi yapmak. Cilt, Cilt altı doku ve linea deşmek alba Periton boşluğu (Şekil 1b) erişmek için.</li>
	<li>Testis testis ve yağ dokusu dışarı zorlamak için Kaudal durumuyla hafif basınç uygulayın. Vas deferens yavaşça Forseps ile kavramak ve dikkatle vas gelen kan damarı forseps (şekil 1 c) ikinci bir dizi ile ayırın.</li>
	<li>Vas deferens Forseps ile bir döngü oluşturmak için basılı tutun. Kırmızı olana alev başka bir forseps ucu ısı ve sonra vaz deferens döngü kaldırmak için kullanabilirsiniz. Yağ dokusu ve testis karın için geri takın. Aynı işlemleri ile karşı taraftaki vas deferens kaldırın.</li>
	<li>İlk deri dikiş tarafından takip kas dikiş. Hayvan normale dönene kadar hayvan 30 min için bir kafes içinde bir sıcak yastık yerleştirin. Normal aktiviteye devam eder kadar hayvan gözlemlemek.</li>
</ol>3. donör/alıcı Hamster hazırlık programı
<ol><li>Monitör ve kayıt estrous döngüleri. Not: Kadın hamster hemen doğum sonra tutulan bir istikrarlı 4-days estrous döngüsü vardır. Kadın ilk gününde estrous opak, sarımsı ve yapışkan vajinal akıntı tarafından (şekil 2a) tespit edilebilir. Dişilerini gün 4'te estrous şeffaf, yapışkan mukus (şekil 2b) tarafından tespit edilebilir.</li>
	<li>Cinsel Olgun kadın için ovumun donör hamster superovulate (> 6 hafta) hamile kısrak serum gonadotropin (PMSG; 50 IU/mL olarak içinde çözünmüş PBS), IP enjeksiyonla estrous döngüsünün ilk günü (Tablo 1) 9-12 AM arasında. Not: PMSG ovumun inducing için ama estrous döngüsü eşitleme için değil.</li>
	<li>80 - 84 h PMSG (gün 4, 6-8 PM), enjeksiyon sonra koyun kadın erkek kafeslerde çiftleşme için. Matings birleşme içinde neden hamster takılan, başarılı matings matings izleyerek garanti.</li>
	<li>Pseudopregnant kadın vasectomized erkekler estrous gün 4'te cinsel Olgun kadın çiftleşme tarafından hazırlayın. Donör ve alıcı kadın hazırlanması için zaman çizelgesi Tablo 2' de gösterilmiştir. Not: Gerçek hamile dişiler de kullanılabilir olarak alıcılar, Yani, kadın ayırt aynı renk verimli erkek ile keçeleşmiş altın renkten bir ceket renk ile. Embriyo transferi türetilmiş pups kat renkleri dayalı tespit edilebilir. Gerçek hamile kadın kullanarak potansiyel bir avantaj endogenously üretilen embriyolar başarılı gebelik sağlamak ve implant enjekte PN embriyo yardımcı olduğunu; gerçek hamile kadın alıcılar kullanarak bir potansiyel endogenously ile rekabet için enjekte PN embriyo gerekir embriyo implantasyonu için üretilen dezavantajıdır.</li>
</ol>4. zigot yalıtım
<ol><li>Kültür ortamı hazırlamak (HECM-9; tarifi ek 2'de açıklanan), McKiernan ve Bavister12' daha önce açıklandığı gibi.</li>
	<li>PN enjeksiyon önce bir gün yemekleri (25 µL/damla) ve HECM-9 ile bir 35 mm çanak kapağı bir PN enjeksiyon damla (100 µL) işleme zigot hazırlayın. Sonra orta damla mineral yağ ile kapağı. Denge orta bir kuluçka gecede aşağıdaki koşullar altında: 37,5 ° C, % 10 CO2, %5 O2, %85 N2 ve %100 nem.</li>
	<li>PN enjeksiyon için zamanlanan gün, embriyo reçeteye göre sarf yemekleri (1 çanak/donör hamster) HECM-9 ile hazırlamak ve bütün yemekleri kullanmak kadar da kuluçka makinesine saklamak.</li>
	<li>CO2superovulated hamster ötenazi.</li>
	<li>Ovidukt yalıtım<ol>
<li>Euthanized kadın hamster dorsal recumbency bir cerrahi örtüsü veya doku kağıt yerleştirin ve karın % 70 etanol sprey ile hazırlayın.</li>
		<li>Sıkıca cilt ve karın kas katmanı orta hat sık ve kesik. Karın organları ortaya çıkarmak için karın zarını deşmek.</li>
		<li>Rahim boynuzları biri iyi bir Forseps ile kavramak ve karın dokudan geri çek. Rahim mesometrium ve Yağ dokusundan ayırmak. Bir kesim ovidukt ve yumurtalık ve ikinci bir kesim arasında (rahim küçük bir parçası dahil) ovidukt ve rahim bitişik olun. İki oviducts aynı floş çanak yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Temizleme ve zigotları toplamak<ol>
<li>Diseksiyon mikroskop altında rahim boynuz tarafında #5 Dumont Forseps ile kavramak ve infundibular sonundan itibaren ovidukt Lümen ev yapımı iğne (şekil 3) yerleştirin ve ovidukt 300-400 µL HECM-9 orta ile yıkayın.</li>
		<li>Hemen zigotları toplar ve onları iki kez HECM-9 orta işleme tabak içinde yıkayın. Gelişme bu aşamada, tüm zigotları kümülüs hücreleri yalanlarım.</li>
		<li>Zigotları hemen toplandıktan sonra gün ışığına maruz kalma en aza indirmek için bir kuluçka (37,5 ° C, % 10 CO2, %5 O2, %85 N2 ve % 100 nem) yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. PN enjeksiyon
<ol><li>Cas9/sgRNA RNP buz çözme ve buz üzerinde karmaşık tüm PN enjeksiyon işlemi sırasında korumak.</li>
	<li>Cas9/sgRNA RNP çözüm hemen önce enjeksiyon deneyler enjeksiyon iğnelerle yükleyin. Cas9/sgRNA RNP solüsyon içeren tüp içine enjeksiyon iğneler arka sonuna yerleştirin ve iğne kılcal eylem tarafından doldurmak Cas9/sgRNA RNP çözüm sağlar.</li>
	<li>İğne ve enjeksiyon yemek hazırlamak. Tutucu pipet için mineral yağ tutucu iğne nın ~ 3 mm içinde ile doldurun. İğne ucu ile microinjector içinde yer tutucu çanak altına yatay ve iğne ucu ile orta emme tarafından doldurun. Enjeksiyon iğne tutucu ters bir 10-15 ° açıyla ayarlayın.</li>
	<li>PN enjeksiyon<ol>
<li>Bir zigot tanımlamak ve tutucu iğne ile iyi bir emici uygulamak. İdeal olarak, erkek ve dişi pronuclei aynı odak mesafesi ve sahibi için hizalanmış paralel bir uzaklıktadır.</li>
		<li>Zona ve erkek pronuclei (saat 3 pozisyon) enjeksiyon iğnesiyle nüfuz.</li>
		<li>Enjeksiyon iğne iğne için kalarak çekirdeği engellemek ve pronucleus zarar görmemesi için pronucleus şişer bir kez hızlı bir şekilde geri alıyorum.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. zigotları Transfer Pseudopregnant hamster için
<ol><li>Bir pseudopregnant hamster (aynı şekilde vazektomi bölümünde açıklandığı gibi) anestezi ve ventral recumbency bir cerrahi örtüsü veya kuru doku kağıt üzerinde yatıyordu.</li>
	<li>Göz kuruluğu önlemek ve başından bir bez veya kağıt ışıktan gözleri korumak için kapak hayvan gözünde göz Yağlama maddeleri uygulanır. Tıraş tarafından vücut yanal yönünü hazırlamak bir yaklaşık 4 cm x 4 cm cilt alan povidone-iyot scrubs ve 3 kez % 70 etanol scrubs 3 kez uygulayarak takip vücudun her tarafında. 2 cm dikey kesi 2 cm Kaudal son kaburga ( rakamlar 4a, 4bgösterildiği gibi) her hayvanın arka tarafında olun.</li>
	<li>Yağ yastığı Forseps ile kavramak ve ovidukt ve rahim görünür hale gelene kadar yavaşça çekin. Bir hemostats ile yağ yastığı Klamp ve yağ yastığı dorsally (şekil 4 c) omurga yansıtır. Öyle ki rahim tüp embriyo transferi (şekil 4 d) için 30 gauge iğne ile nüfuz üreme sistemi getirin.</li>
	<li>HECM-9 yeni bir tabak ile enjekte zigotları yıkayın. Yeni bir cam pipet kullanın (çapı: ~ 150-200 µm) 10-15 zigotları yüklemek için. Bir zincir inci birkaç hava kabarcıkları tarafından takip olarak zigotları düzenleyin. Adım 6.3 açık nüfuz tüpünden pipet yerleştirin ve nazikçe zigotları ovidukt için aktarmak için pipet içine darbe. İlk hava kabarcığı ovidukt yolu (şekil 4e) serbest bırakılıncaya kadar üfleme devam edin.</li>
	<li>Serbest yağ yastığı ve doku karında dönün. Yaklaşık aynı numara (10-15) enjekte embriyoların başka bir ovidukt sistemi için aynı işlemler tarafından aktarın.</li>
	<li>Kas ve 2 kat deride dikiş. Buprenorfin-HCL (0.5 mg/kg) subkutan ameliyat sonrası analjezi yönetmek. Hamster için bir kafes dönmek ve kurtarma için sıcak bir yastık üzerinde kafes yerleştirin. Hayvanın anesteziden tamamen iyileşti sonra kafes hayvan odasına dönün. Ameliyat sonrası ağrı daha altı saat sonra verilir.</li>
</ol>

<ol><li>Takahashi, M., Hori, M., Mutoh, M., Wakabayashi, K., Nakagama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+animal+models+of+pancreatic+carcinogenesis+for+prevention+studies+and+their+relevance+to+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Experimental animal models of pancreatic carcinogenesis for prevention studies and their relevance to human disease.</a> Cancers (Basel). 3 (1), 582-602 (2011).</li>
<li>Wold, W. S., Toth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+three--Syrian+hamster+as+an+animal+model+to+study+oncolytic+adenoviruses+and+to+evaluate+the+efficacy+of+antiviral+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Chapter three--Syrian hamster as an animal model to study oncolytic adenoviruses and to evaluate the efficacy of antiviral compounds.</a> Adv Cancer Res. , 69-92 (2012).</li>
<li>Thomas, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syrian+hamster+as+a+permissive+immunocompetent+animal+model+for+the+study+of+oncolytic+adenovirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Syrian hamster as a permissive immunocompetent animal model for the study of oncolytic adenovirus vectors.</a> Cancer Res. 66 (3), 1270-1276 (2006).</li>
<li>Thomas, M. A., Spencer, J. F., Wold, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+Syrian+hamster+as+an+animal+model+for+oncolytic+adenovirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Use of the Syrian hamster as an animal model for oncolytic adenovirus vectors.</a> Methods Mol Med. , 169-183 (2007).</li>
<li>Hogarth, C. A., Roy, A., Ebert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+evidence+for+the+absence+of+a+functional+cholesteryl+ester+transfer+protein+gene+in+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol+B+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genomic evidence for the absence of a functional cholesteryl ester transfer protein gene in mice and rats.</a> Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 135 (2), 219-229 (2003).</li>
<li>Ebihara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Syrian+golden+hamster+model+recapitulating+ebola+hemorrhagic+fever%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">A Syrian golden hamster model recapitulating ebola hemorrhagic fever.</a> J Infect Dis. 207 (2), 306-318 (2013).</li>
<li>Jove, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidomic+and+metabolomic+analyses+reveal+potential+plasma+biomarkers+of+early+atheromatous+plaque+formation+in+hamsters%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Lipidomic and metabolomic analyses reveal potential plasma biomarkers of early atheromatous plaque formation in hamsters.</a> Cardiovasc Res. 97 (4), 642-652 (2013).</li>
<li>Vairaktaris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hamster+model+of+sequential+oral+oncogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Oncol%22%5BJournal%5D)">The hamster model of sequential oral oncogenesis.</a> Oral Oncol. 44 (4), 315-324 (2008).</li>
<li>Paciello, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syrian+hamster+infected+with+Leishmania+infantum%3A+a+new+experimental+model+for+inflammatory+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Syrian hamster infected with Leishmania infantum: a new experimental model for inflammatory myopathies.</a> Muscle Nerve. 41 (3), 355-361 (2010).</li>
<li>Safronetz, D., Ebihara, H., Feldmann, H., Hooper, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Syrian+hamster+model+of+hantavirus+pulmonary+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">The Syrian hamster model of hantavirus pulmonary syndrome.</a> Antiviral Res. 95 (3), 282-292 (2012).</li>
<li>Fan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+targeting+in+golden+Syrian+hamsters+by+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient gene targeting in golden Syrian hamsters by the CRISPR/Cas9 system.</a> PLoS One. 9 (10), e109755(2014).</li>
<li>McKiernan, S. H., Bavister, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+one-cell+hamster+embryos+with+water+soluble+vitamins%3A+pantothenate+stimulates+blastocyst+production%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Culture of one-cell hamster embryos with water soluble vitamins: pantothenate stimulates blastocyst production.</a> Hum Reprod. 15 (1), 157-164 (2000).</li>
<li>Takenaka, M., Horiuchi, T., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+light+on+development+of+mammalian+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Effects of light on development of mammalian zygotes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (36), 14289-14293 (2007).</li>
</ol>

Biyomedikal Araştırma ve tarım uygulamaları için genetik hayvanlar yaratmada bir biyoteknoloji şirketi uzmanlaşmış, ZW hava Bio, LLC. mali çıkarları vardır.

Daha iyi altın Suriye hamster insan hastalık modelleri olarak potansiyeli için geliştirdiğimiz bir CRISPR/hamster genom hedeflemek için Cas9 karmaşık teslim etmeye yönelik bir PN enjeksiyon protokolü. PN enjeksiyon Protokolü birçok anahtar değişken embriyo kültürü orta, sıcaklık ve dalga boylarında ışık13de dahil olmak üzere en iyi duruma getirir. Ayrıca gen hamster hedefleme başarıyla yürütmek için izlemeniz gereken birkaç hayvan hamster özel işleme yordamlarını vardır. Örneğin, cinsel olgunlaştı...

Altın Suriye hamster (Mesocricetus hava) biyomedikal araştırmalar için en çok kullanılan kemirgenler biridir. ABD Tarım Bakanlığı göre yaklaşık 100.000 hamster hayvan refah kanun (http://www.aphis.usda.gov; erişilen kapsamına türler arasında toplam laboratuvar hayvan kullanımı % 13'ü temsil eden 2015 yılında Amerika Birleşik Devletleri'nde kullanıldı 10 Şubat 2017).
Hamster insan hastalıkların bir dizi çalışmanın diğer kemirgen birkaç avantaj sunar. Örneğin, N-nitrosobis(2-oxopropyl) Amin (BOP) ile indüklenen histopatoloji pankreas duktal Adenokanserine hamster insan pankreas tümörü, benzer BOP tedavi esas olarak tiroid bezi tümörleri fareler ve akciğer ve karaciğer tümörleri sebep olur ise Fareler1. Hamster adenovirüse bakın çoğaltma desteklemek için buldum sadece küçük kemirgen olduğundan, onlar da adenovirus tabanlı oncolytic Vektörler ve anti-adenovirus uyuşturucu2,3,4test etmek için seçim modeli vardır. Neyin hamster model fare ve sıçanlar üzerinde bir avantaj sağlar başka bir hiperlipidemi çalışmada örnektir. İnsanlar ve hamster lipid metabolik yollar büyük benzerlikler sergiler ve her iki tür İngilizce ise metabolizmaları, farelerde yok ve5sıçanlar lipid içinde merkezi bir rol oynayan Kolesteril ester transfer proteini (İngilizce), kodlama gen taşırlar. Ayrıca, hamster Hemorajik hastalığı daha fazla maruz kalma Ebola virüs6takip insan tezahürü temsilcisi geliştirmek. Hamster da ateroskleroz7, sözlü karsinomlar8ve inflamatuar myopathies9çalışmak için seçim modelleri vardır. Son zamanlarda, bu da hamster Andes virüs enfeksiyonu için son derece duyarlı ve hantavirus pulmoner sendromu gibi hastalığı, Andes virüs enfeksiyonu10sadece kemirgen model sağlar geliştirmek kanıtlanmıştır.
Biz son zamanlarda hamster için CRISPR/Cas9 sistem uygulama başarmış ve birkaç satırlık genetik olarak üretilen güvenilir küçük kemirgen model kullanılabilir olduğu insan hastalıkları eğitim roman genetik hayvan modelleri .ilgi görme ihtiyacına yönelik olarak, hamster11mühendislik. Öyle ki diğer türler içinde geliştirilen PN enjeksiyon protokolleri uygun olmayan hamster zigotları için çevre ni son derece duyarlıdır. Bu nedenle, biz bir PN enjeksiyon protokol hamster embriyo içinde vitroişleme için özel gereksinimleri karşılar hamster için geliştirilmiştir. Burada, CRISPR/Cas9 sistemi ve beraberindeki adımlardan tek Kılavuzu RNA (sgRNA) enjekte embriyo transferi alıcı kadın içine hazırlanması kullanarak ayrıntılı PN enjeksiyon yordamı açıklar.

<table><tbody><tr><td>Cas9</td><td>Invitrogen</td><td>B25640</td><td>1 & mu; g/&mu; L (~6.1 &mu; M)</td></tr> <tr><td>GeneArtTM Hassas Sentez Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>A29377</td><td>sgRNA sentezi için</td></tr><tr><td>İnsan serumundan</td><td>Albümin Sigma</td><td>A1653</td><td>Yetiştirme ortamı için</td></tr><tr><td>Aydınlatıcı</td><td>Nikon</td><td>NI-150</td><td>Embriyo transferi için</td></tr><tr><td>Kuluçka makinesi</td><td>New Brunswick</td><td>Galaxy 14S</td><td>Embriyo yetiştiriciliği için</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>PB-7</td><td>Enjeksiyon iğneleri yapmak için</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE Ti-S</td><td>Mikroenjeksiyon için</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>invitrojen</td><td>SMZ745T</td><td>Embriyo transferi için</td></tr><tr><td>Mineral yağ</td><td>Sigma</td><td>M1840</td><td>Karanlıkta tutun</td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Sigma</td><td>G4877-2000IU</td><td>Süperovülasyon için</td></tr></tbody></table>

Üretim crispr/cas9 kompleks pronuclear enjeksiyonla genetiği altın suriye hamster

Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex

Pronuclear (PN) iğne tekniği ilk yabancı genetik malzeme tek hücreli sahne embriyo pronuclei tanıtmak farelerde kurulmuştur. Tanıtılan genetik materyal embriyonik genom entegre ve Transjenik hayvanlar anneler beslemek için enjekte embriyo transferi sonrasında yabancı genetik bilgileri ile oluşturmak. Farelerde başarı, PN enjeksiyon içinde pek çok hayvan türü başarıyla uygulandı. Son zamanlarda, PN enjeksiyon başarıyla reaktifler gen değiştirme ile tanıtmak için olan istihdam faaliyetleri, çeşitli laboratuvar olarak siteye özgü genetik değişiklikleri elde ve çiftlik hayvan türleri için CRISPR/Cas9 sistemi gibi. Çünkü her tür benzersiz sunar mikroenjeksiyon becerileri genetiği değiştirilmiş hayvanlar PN enjeksiyonu ile üretmek için özel set mastering ek olarak, araştırmacılar üreme fizyolojisi ve hedef türler davranışını anlamak gerekir zorluklar. Örneğin, altın Suriye hamster embriyo benzersiz var PN enjeksiyon teknikleri grubumuz tarafından son devrimler kadar bu tür mümkün değildi öyle ki gereksinimleri vitro işleme. Bizim türler-modified PN enjeksiyon protokolü ile biz ve birkaç gen nakavt (KO) üreten başarılı modeli insan hastalıkları için kullanılan (KI) hamster knockin başardı. Burada CRISPR/Cas9 karmaşık hamster, embriyo işleme koşulları, embriyo transferi yordamlar zigotları teslim PN enjeksiyon yordamı açıklamak ve genetik olarak üretmek için gerekli yetiştiriciliği hamster değiştirilebilir.

Genetiği değiştirilmiş hamster üreten açıklanan protokolünün etkinliği aşağıdaki iki kritik adımı sonuçları üzerinde bağlıdır: canlı doğum oranı alıcı kadın ve amaçlanan genetik değişiklikler ile canlı yavru sayısı. Canlı doğum embriyo kalitesi doğrudan sonuçlarını ve PN enjeksiyon ve embriyo transferi işlemleri gerçekleştirme bireysel beceri oranıdır. İşlenmiş embriyoların gelişim potansiyelini atılmamasını emin olmak için büyük bir özenle hamster embriyo vitro işleme sırasında ...

Pronuclear (PN) iğne kümelenmiş düzenli olarak kısa palindromik yineler (CRISPR) interspaced ve CRISPR ilişkili protein-9 nükleaz (CRISPR/Cas9) sistemi genetiği altın Suriye hamster üretmek için son derece verimli bir yöntemdir. Burada, biz gene nakavt hamster CRISPR/Cas9 sistemi ile üretim için detaylı PN enjeksiyon Protokolü tanımlamak.

Üretim CRISPR/Cas9 kompleks Pronuclear enjeksiyonla genetiği altın Suriye hamster

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. ...

Bu protokolün genel amacı, CRISPR/Cas9 Kompleksinin Pronükleer Enjeksiyonu yoluyla Genetik Olarak Modifiye Altın Suriye Hamsterları üretmek için izleyicilere ayrıntılı prosedürler sağlamaktır. Altın Suriye Hamsterında geliştirdiğimiz bu PN enjeksiyon protokolü, bu türde genetik mühendisliğini mümkün kılmaktadır. Bu teknoloji, hayvan modeli geliştirme alanına büyük bir katkıdır.Hamster embriyolarının çevreye karşı aşırı hassasiyeti nedeniyle, hamster embriyolarının özel nişine uygun, özgün bir pronükleer enjeksiyon protokolü geliştirdik. Bu tekniğin geliştirilmesi, genetik olarak modifiye edilmiş hamster modellerinin ilk kez üretilebilmesi sayesinde, insan hastalıklarının modellenmesinde ileriye doğru atılmış büyük bir adımdır. Bu deney için, pronükleer veya PN enjeksiyonundan bir gün önce, zigot işlem kaplarını ve 35 milimetrelik bir kabın kapağında HECM-9 medyumlu PN enjeksiyon damlasını hazırlayın.Besiyeri damlalarını mineral yağ ile örtün. Damlaları ve HECM-9 besiyerini dengelemek için 37.5 degrees celsius sıcaklıkta gece boyunca inkübe edin. PN enjeksiyonu gününde, HECM-9 kullanarak embriyo yıkama kaplarını hazırlayın.İhtiyaç duyulana kadar inkübatörde saklayın. Oviduktları izole etmek için, ötanazi uygulanmış süperovüle bir dişi hamsterı cerrahi örtü üzerine sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Karın bölgesini %70 etanol ile temizleyin.Ardından, orta hatta deri ve abdominal kas tabakasını sıkıca tutun ve abdomenin sonu boyunca bir insizyon yapın. Abdominal organları açığa çıkarmak için peritonu kesin. Sonrasında, uterus boynuzlarından birini kavramak için ince bir forseps kullanın ve dokuyu abdomenden geri çekin.Uterusu mezometriyum ve yağ dokusundan ayırın. İlk kesiyi ovidukt ile over arasına, ikinci kesiyi ise uterusun küçük bir kısmını kapsayacak şekilde ovidukt-uterus birleşiminin yanına yapın. Oviduktları aynı et kabına yerleştirin.Zigotları diseksiyon mikroskobu altında toplamak için, uterus boynuzunun yan tarafını tutmak amacıyla beş numara Dumont pens kullanın. Ev yapımı bir iğneyi infundibüler uçtan ovidukt lümenine yerleştirin. Ardından, oviduktu 300 ila 400 µL HECM-9 medyumu ile yıkayın.Yıkama işleminin hemen ardından zigotları toplayın ve taşıma kabı içerisinde iki kez HECM-9 ile yıkayın. Gelişimin bu aşamasında tüm zigotlar kumulus hücrelerinden arındırılmış olmalıdır. Ardından, ışığa maruz kalmalarını önlemek için enjeksiyona kadar zigotları bir inkübatöre yerleştirin.Enjeksiyona hazırlık için, Cas9-sgRNA RNP'lerini buz üzerinde çözdürün. Enjeksiyondan hemen önce, enjeksiyon iğnesinin arka ucunu çözeltinin bulunduğu tüpe yerleştirip kılcal hareketle dolmasını sağlayarak iğneyi RNP çözeltisiyle doldurun. Ardından, tutucu pipeti mineral yağı ile iğne kıvrımının yaklaşık üç milimetreye kadar olan kısmına kadar doldurun. Tutucuyu, tutucu pipetin ucunun kabın tabanına paralel olacak şekilde mikro enjektöre yerleştirin.İğne ucunu vakumla besiyeri ile doldurun. Ardından, enjeksiyon iğnesini tutucuya karşı 10 ila 15 derecelik bir açıyla yerleştirin. Sonrasında, bir zigot belirleyin ve hafif bir vakum uygulamak için tutucu iğneyi kullanın.Biraz daha büyük olan erkek ve dişi pronükleler tercihen aynı odak düzleminde olmalı ve tutucuya paralel şekilde hizalanmalıdır. Enjeksiyon iğnesini saat üç konumunda kullanarak, zona pellucida ve erkek pronükle içerisine girin. Pronükle şiştiğinde, çekirdeğin iğneye yapışmasını önlemek ve ona zarar vermekten kaçınmak için enjeksiyon iğnesini hızla geri çekin.STAT2 ve RAG1 genleri için Cas9/sgRNA sistemi ile gen hedefleme verimliliği, alıcı dişilerin canlı doğum oranı ve hedeflenen genetik modifikasyonlara sahip canlı yavruların sayısı ile değerlendirilir. Yavrular üzerinde yapılan bir PCR restriksiyon fragman uzunluk polimorfizmi analizi veya PCR-RFLP'den elde edilen genotipleme sonuçları, gen hedefleme verimliliğini gösterir. Birinci şerit biallelik olarak hedeflenen allelleri, üçüncü ve yedinci şeritler ise monoallelik veya mozaik olarak hedeflenen allelleri göstermektedir.Bu teknoloji, araştırmacıların insan hastalıklarının daha yeni genetik olarak mühendisliği yapılmış hamster modellerini geliştirmesinin yolunu açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, CRISPR/Cas9 Kompleksinin pronükleer enjeksiyonu yoluyla genetik olarak mühendisliği yapılmış Golden Syria Hamsterlarının nasıl üretileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

production-genetically-engineered-golden-syrian-hamsters-pronuclear

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

CRISPR/Cas9, genlerin ve genetik elementlerin bozulmasını sağlayan sağlam bir sistemdir. Burada, CRISPR / Cas9 kullanarak memeli hücre hatlarında genomik delesyonların verimli bir şekilde oluşturulması için bir protokol açıklıyoruz.

CRISPR / Cas9 üzerinden Memeli Hücre Hatlarında Genomik Delesyonlar Üretimi

Fare oositlerinin mikroenjeksiyonu hem klasik transgenezis ( yani, transgenlerin rastgele bütünleşmesi) hem de CRISPR aracılı gen hedeflemesi için yaygın olarak kullanılır. Bu protokol, kalite kontrolü ve genotiplendirme stratejileri üzerinde özel bir vurguyla mikroenjeksiyondaki en son gelişmeleri gözden geçiriyor.

Oositlerin Mikroenjeksiyonu ile Genetiği Değiştirilmiş Farelerin Üretilmesi

Biz burada transposon mutagenesis tanımlamak ve transposon leptospiral mutantlar dokularda hamster bir meydan okuma sonra ölçmek için yüksek üretilen iş sıralama ile birleştirir bir tekniğini tanımlamak. Bu iletişim kuralı için hayatta kalma ve hayvanlar yayılmasında ekran mutantlar için kullanılabilir ve vitro çalışmalar için de uygulanabilir.

Yüksek üretilen iş paralel sıralama ölçü Fitness Leptospira interrogans Transposon ekleme mutantlar sırasında altın Suriye Hamster enfeksiyon için

Kümelenmiş düzenli olarak kısa palindromik tekrarlar/ilişkili CRISPR protein 9 (CRISPR/Cas9) interspaced sistem genetik mühendisliği için umut verici bir araçtır ve hedeflenen entegrasyonu transgenes olasılığı kadar açılır. Biz (HMEJ) katılmadan homoloji-aracılı son tarif-verimli DNA Tümleştirme vivo içinde hedef ve gen tedavileri CRISPR/Cas9 kullanarak hedef için strateji tabanlı.

Bir bitiş homoloji-aracılı katılmadan tabanlı strateji kullanarak hedeflenen Integration CRISPR/Cas9-aracılı Vivo içinde

Burada, lentiviral bir vektör perivitelline alanda bir döllenmiş yumurta, basit bir iğne ile transgene entegrasyon ve kurucusu transgenik fareler ile yüksek etkinlik üretimini teşvik için bir protokol mevcut.

Lentiviral aracılı transgenik fareler üretimi: doğrudan eğitim kurucuları basit ve son derece etkili bir yöntem

Hindi (galiba yüksek değerli hedef) Herpesvirus yaygın bir vektör platform olarak kuş hastalıkların bir dizi karşı rekombinant aşı üretimi için kullanılır. Bu makalede bir entegre NHEJ-CRISPR/Cas9 ve Cre-Lox sistemi kullanılarak rekombinant galiba yüksek değerli hedef yönlendirdik aşı üretimi için basit ve hızlı bir yaklaşım açıklar.

Rekombinant kuş Herpesvirus vektörleri ile CRISPR/Cas9 üreten gen düzenleme

Burada, tek hücreli embriyoların kriyopreservation için değiştirilmiş bir yöntem yanı sıra genetik olarak değiştirilmiş farelerin verimli nesil için dondurulmuş çözülmüş embriyolar ve elektroporasyon kullanarak çiftler bir protokol sıyoruz.

Genetiği Değiştirilmiş Farelerin Yüksek Verimli Üretimi için Dondurulmuş Çözülmüş Embriyoların Kullanımı

Böcek ösosyalliğinin birçok özelliği, koloni içi iletişime ve işbölümüne dayanır. Karınca embriyolarındaki anahtar düzenleyici genlerin mikroenjeksiyon ve CRISPR aracılı mutagenez yoluyla genetik manipülasyonu, ösosyal böceklerde özgecil davranışın doğası hakkında fikir verir.

Karınca Harpegnathos tuzlayıcısında CRISPR Aracılı Mutagenez için Embriyo Enjeksiyonları

Mevcut protokol, Gja1'de tam uzunlukta Connexin43 jenerasyonunu koruyan, ancak daha küçük GJA1-20k dahili olarak çevrilmiş izoformun translasyonunu önleyen tek bir M213L mutasyonunu tanımlamaktadır.

Tam Boy Proteinin İfadesini Korurken mRNA'dan Bir İç Translasyonel Başlangıç Bölgesinin Çıkarılması

Mevcut protokol, gen kaseti knock-in ve flokslu fareleri verimli bir şekilde üretmek için CRISPR-Cas9 ve donör DNA'sının zigot mikroenjeksiyonunu tanımlamaktadır.

Farelerde gen kaseti knock-in ve flox alelleri oluşturmak için zigot mikroenjeksiyonu

Burada, CRISPR RNP Zygotes Elektroporasyonu (CRISPR-EZ) adı verilen genetiği değiştirilmiş farelerin verimli bir şekilde üretilmesi için tasarlanmış basit bir tekniği açıklıyoruz. Bu yöntem, elektroporasyon yoluyla düzenleme reaktiflerini embriyolara %100'e yaklaşan bir verimlilikle teslim eder. Bu protokol, memeli embriyolarındaki nokta mutasyonları, küçük genomik eklemeler ve delesyonlar için etkilidir.

Zigotların CRISPR Elektroporasyonu ile Farelerin Verimli Genom Düzenlemesi

Keşfedin, CRISPR/Cas9 sistemi ve pronükleer enjeksiyon kullanarak genetiği değiştirilmiş altın Suriye hamsterları üretme yöntemini. Bu protokol, hassas hamster embriyoları için özel teknikler sunarak insan hastalık modelleri geliştirmede önemli bir ilerleme sağlar.

Üretim CRISPR/Cas9 kompleks Pronuclear enjeksiyonla genetiği altın Suriye hamster

Daha fazla video keşfet