Yöntem bir Vitro kan - beyin bariyerini modeli domuz beyin endotel hücreleri temel alan kurulması için geliştirilmiş

Bu protokolün genel amacı, sıkı bir in vitro kan-beyin bariyeri modeli oluşturmak için primer domuz beyin endotel hücrelerini saflaştırmak ve izole etmektir. Bu yöntem, ilaç dağıtımı, geçirgenlik, reseptör kaçakçılığı ve BB'nin sıkılığı ve polaritesi gibi kan-beyin bariyeri alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu modelin ana avantajı, yüksek TEER ve düşük geçirgenliğe sahip bir in vitro kan-beyin bariyeri modeli oluşturmak için kullanılabilecek birincil beyin endotel hücrelerinin yüksek verimidir. Bu işleme başlamak için, beyinleri steril bir akış tezgahına yerleştirin ve buz üzerine yerleştirilmiş bir beherde bir litre PBS ile nazikçe yıkayın.

Daha sonra, ince uçlu forseps kullanarak meninksleri her beyinden dikkatlice çıkarın. Bir neşter kullanarak, beyindeki gri maddeyi birer birer kazıyın ve izole edilen materyali buz üzerine yerleştirilmiş 20 mililitre DMEM / F-12 içeren Petri kaplarına aktarın. İlk parçalanma için, gri madde malzemesini iğne olmadan 50 mililitrelik bir şırıngadan geçirin.

Prosedürü tüm beyinler için tekrarlayın ve toplanan gri madde materyalini bir araya getirin. İzole edilmiş gri madde malzemesini DMEM/F-12 ortamı ile el tipi bir doku homojenizatörünün öğütücü tüpüne aktarın. Gevşek bir havaneli ile sekiz yukarı ve aşağı vuruş yaparak ve ardından sıkı bir havaneli ile sekiz yukarı ve aşağı vuruş yaparak malzemeyi homojenize edin.

Ardından, filtre tutuculu ve 140 mikronluk filtre ağına sahip 500 mililitrelik mavi kapaklı bir şişe kullanarak homojenatı filtreleyerek kılcal damarları izole edin. Kılcal içeren filtreleri bir sindirim solüsyonu ile Petri kaplarına yerleştirin. Daha sonra, Petri kaplarını 180 RPM'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin veya her 10 dakikada bir hafifçe karıştırın.

Bir saat sonra, kılcal damarları filtrelerden Petri kabından süspansiyon ile yıkayın. Ardından, üç tabaktaki süspansiyonu iki adet 50 mililitrelik tüpe bölün ve her 50 mililitrelik tüpe 10 mililitre DMEM / F-12 ekleyerek sindirimi durdurun. Hücre süspansiyonlarını beş dakika boyunca 250 kez g, dört santigrat derecede santrifüjleyin.

Daha sonra, süpernatanları aspire edin ve her peleti 10 mililitre DMEM / F-12 içinde yeniden süspanse edin. Ardından, her tüpe 20 mililitre daha DMEM / F-12 ekleyin. PBEC'lerin bağlanma koşullarını optimize etmek için, T-75 şişesine kaplama çözeltisi ekleyin, bu da mililitre başına 150 mikrogramda dört kollajen ve mililitre başına 50 mikrogramda fibronektin ve damıtılmış su ile nihai konsantrasyonlarla sonuçlanır ve çözeltinin tüm yüzeyi kapladığından emin olun.

Ardından, kılcal damarları 37 derecelik bir su banyosunda çözün. Donma ortamını çıkarmak için, kılcal damarları yedi dakika boyunca 250 kez g, dört santigrat derece döndürün. Bundan sonra, süpernatanı dikkatlice aspire edin ve peleti 10 mililitrelik alikotun bir ila iki mililitresinde yeniden süspanse edin.

Bunu takiben, kılcal süspansiyonu kaplanmış T-75 şişesine aktarın ve yüzey üzerinde eşit dağılımı sağlamak için şişeyi hafifçe eğin. T-75 şişesini 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksite yerleştirin. Gece boyunca inkübasyondan sonra, bir T-75 şişesi için mililitre başına dört mikrogram puromisin ile takviye edilmiş 10 mililitre PBEC büyüme ortamı hazırlayın ve orta bir değişiklik yapın.

Daha sonra, geçirgen membran eklerini mililitre başına 500 mikrogram kollajen IV ve mililitre başına 100 mikrogram fibronektin ve damıtılmış su ile kaplayarak PBEC tohumlaması için hazırlayın. T-75 şişesine iki mililitre tripsin-EDTA çözeltisi ekleyerek hücreleri tripsinleştirin ve beş ila yedi dakika boyunca 37 santigrat derece,% 5 karbondioksit e yerleştirin. Beyin endotel hücrelerini ayırmak için, T-75 şişesinin yan tarafına parmak uçlarınızla hafifçe vurun.

Daha sonra, hücre çözeltisini 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve beyin endotel hücrelerini yedi dakika boyunca 250 kez g, dört santigrat derece santrifüjleme ile döndürün. Daha sonra, süpernatanı dikkatlice çıkarın ve peleti bir mililitre ortamda yeniden süspanse edin. Ardından, toplam hacmi üç mililitreye çıkarmak için iki mililitre daha orta ekleyin.

Bir hücre sayma odası veya otomatik hücre sayma sistemi kullanarak hücre sayısını manuel olarak sayın. Temassız kokültür için, ekleri, bir gün önce astrosit büyüme ortamı ile tazelenen astrositlerin bulunduğu kuyucuklara aktarın. Ertesi gün, PBEC'leri içeren geçirgen membran ekleri üzerindeki ortamı değiştirin.

Ardından, ortamı kuyulardan dikkatlice aspire edin ve her bir oyuğa 750 mikrolitre farklılaşma ortamı ekleyin. Bunu takiben, ortamı eklerden dikkatlice aspire edin ve kesici uç başına 500 mikrolitre farklılaştırma ortamı ekleyin. Daha sonra, kalan 750 mikrolitre farklılaşma ortamını her bir astrosit kuyusuna ekleyin.

Bundan sonra, hücreleri ertesi güne kadar 37 santigrat derece,% 5 karbondioksit sıcaklıkta farklılaşma ortamı ile inkübe edin. Hücreleri farklılaşma ortamı ile uyardıktan sonraki gün, odayı iki kez damıtılmış su ile, bir kez %70 etanol ile beş dakika ve iki kez daha bi-damıtılmış su ile durulayarak doku direnci ölçüm odası sistemini TEER ölçümleri için hazırlayın. Daha sonra, hazneyi sisteme bağlayın, doku direnci ölçüm haznesine dört mililitre DMEM / F-12 ekleyin ve yaklaşık 30 dakika oda sıcaklığında kalmasına izin verin.

Bundan sonra, ekleri doku direnci ölçüm odasına dikkatlice yerleştirerek TEER ölçümlerini gerçekleştirin. İşte beş gün boyunca görüntülenen PBEC'lerin, kültürlerin ve astrositlerin faz faz kontrast mikroskobu görüntüleri. İlk kültürün ilk gününde saflaştırılmış kılcal damar fragmanları, hem kılcal damarların hem de kontamine edici hücrelerin varlığını gösterdi, bu hücreler, ikinci günde orta düzeyde bir değişiklikten ve ek bir büyüme gününden sonra, büyümelerine kılcal fragmanlardan başlayarak PBEC'ler için seçim gösterdi.

PBEC'lerin birleşik tek katmanları genellikle dört ila altıncı günde elde edildi, bu sırada PBEC'ler iğ şeklinde morfoloji gösterdi ve uzunlamasına hizalandı. Dip kuyucuklarına ekilen sıçan astrositleri normalde beş gün içinde birleşen katmanlara çoğaldı ve iki haftalık büyümeden sonra temassız kokültür modelleri için kullanıldı. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik yedi saat içinde yapılabilir.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, araştırmacıların sıkı ve polarize beyin endotel hücrelerinde ilaç dağıtımını ve reseptör kaçakçılığını keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, in vivo olarak yürütülemeyen yeni çalışmalar için kullanılabilecek bir in vitro kan-beyin bariyeri modelinin nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız.