Name: Yöntem bir Vitro kan - beyin bariyerini modeli domuz beyin endotel hücreleri temel alan kurulması için geliştirilmiş (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Keşfedin, domuz beyin endotel hücreleri kullanarak yüksek TEER değerli ve düşük geçirgenlikli in vitro kan-beyin bariyeri modeli kurma yöntemini. Bu protokol ilaç teslimatı ve reseptör trafikleme araştırmaları için sağlam bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Lundbeck Vakfı Hibe numarası R155-2013-14113 ve yazarlar Elisabeth Helena Bruun, Sarah Christine Christensen ve Niels M. Kristiansen için teknik yardım kabul etmek istiyorum.

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması rapor.

Arıtma ve hızla çoğalmak-in pBEC
Arıtma işlemi sırasında kritik adımlar meninkslerde hızlı ve etkili kaldırma ve ayırma arıtma verimi ve saflık ve model uygun kurulması için önemlidir beyaz ve gri madde içerir. PBECs kullanarak sunulan vitro BBB modeli için Biz Geliştirilmiş ve mekanik homojenizasyon izole gri madde boyutu-seçici yüzdeki, sindirim collagenase ile yalıtım için filtre uygulama dayalı bir arıtma yordam Basitleştirilmiş , Dnaz ve Tripsin, ilk bir kültür, microvessel parçacık...

Hücresel yapısı ve fonksiyonu kan - beyin bariyerini
Dolaşım ve merkezi sinir sistemi (MSS) arayüzü BBB CNS microenvironment kontrolünü homoeostatic için anahtar bir düzenleyici site düzgün ve sinir sisteminin korunması için gerekli olan görevi görür. BBB kan damarı Lümen astar endotel hücreleri sitedir. Beyin kılcal, endotel hücreleri karmaşık hücreler arası sıkı kavşaklar oluşturmak ve belirli akını ve sızma taşıyıcılar güçlü polarize ifade şekillerinin çok özel moleküler taşıma kan ve beyin 1arasında olun. Sıkı bağlantı kompleksleri yapısal bileşenlerini aile occludin ve claudin, zonula occludens (ZO) proteinler, cingulin protein içerir ve bileske adezyon molekülleri (sıkışmaları) ilişkili. Claudin 5 paracellular bileske sınırlama içinde özellikle önemlidir. İndüksiyon ve bu karakteristik BBB endotel fenotip Bakımı dahil ile çevredeki hücreleri, perisitlerden, astrocytes, sinir hücreleri ve Bodrum membranlar, hangi beyin endotel ile birlikte form hücreleri de dahil olmak üzere dinamik etkileşimler nörovasküler birim (NVU)2,3. Bu etkileşimler dahil mekanizmaları henüz tam olarak anlaşılmış değil, ancak exchange BBB geçirgenliği modülasyon kısa vadede sağlar ve uzun vadeli BBB özellikleri4indükler hücreleri arasındaki kimyasal sinyallerin içerir. Astrocytes özellikle beyin endotel hücre fenotip için katkıda bulunmak için bilinen ve düzenleyici faktörler gliyal kaynaklı Nörotrofik faktör (hücre içi kampı etkileyen)5, temel fibroblast büyüme faktörü6gibi bir kaynaktır, hidrokortizon7ve dönüştürme büyüme faktörü β (TGF-β)8. TGF-β, etkisini ancak, tartışılan9olmuştur.
Vivo Vitro BBB
İn vivo çalışmalar BBB Biyoloji değerli bilgiler vermeye devam ediyor. Ancak, hücre kültür modelleri ek anlayışlar sağlamak ve sağlık ve hastalığında BBB detaylı moleküler ve fonksiyonel yönlerini anlamak için yararlı araçlar oluşturur. Hücre tipleri ve BBB bileşenlerinin arasındaki karmaşık etkileşimler vitro modellerinde tam olarak ulaşmak zor olsa da, ortada, beyin endotel hücrelerinin ilk arıtma ve uygulama mono-kültür içinde bu yana 10 , 11 , 12, arıtma işlemleri ve BBB koşullarının büyüme kapsamlı geliştirme kültür modelleri, in vivo bariyer büyük benzerlik sonuçlanan cep. Yaygın olarak kullanılan vitro BBB modelleri kemirgen, domuz ve sığır kökenli Primer hücre ve ölümsüzleştirdi hücre satırlarını temel alır. Her model farklı avantajları ve dezavantajları vardır. Karşılaştırma ve model seçimi için doğrulama işaretleri ifade BBB enzimler, ışınlayıcılar, reseptörleri ve yapısal proteinler gibi geçerli kurulan modelleri1, genel bakış, oluşturmak için kullanılır.
Amaç iletişim kuralı
Önemli özelliklerinden biri: BBB bariyer gerginlik ve yüksek AYLARININ henüz çok sayıda mevcut modelleri de vivo içinde düzeylerini yansıtmak değil. Birkaç laboratuar geliştirme ve en iyi duruma getirme katkılarıyla bir araya getiren, bu iletişim kuralının amacı İlköğretim ile birincil pBECs MC ile ya da ezelî ACM veya NCC temel yüksek AYLARININ vitro BBB modeli oluşturmak için bir yöntem sunmaktır astrocytes fare veya domuz kökenli. Modelinin kurulması ve uygulanan yordamlar çabaları bulaşıcı hücreleri ortadan kaldırmak için ve pBECs farklılaşma BBB fenotip içine geliştirmek için içerir. Bu eser güvenilir, yüksek AYLARININ modelleri işyerinde düşük paracellular geçirgenliği ve anahtar sıkı bileske proteinler, taşıyıcılar ve reseptörleri iyi işlev ifadesi ile sonuçlandı. Ancak, üç farklı koşul kültürünün astrocytes beyin endotel hücre fenotip bir faktör olarak, üç farklı fenotipleri beyin endotel hücrelerinin temsil eder. NCC modeli nerede BBB özellikleri maksimal ifade, özellikle bazı özel mekanizmalar ilaç bulma, taşıma çalışmaları ve hücre içi kaçakçılığı, ilgili çalışmaların yanı sıra hücre-hücre etkileşimlerin incelenmesi için yararlıdır avantajlı.
Kökeni ve geçmişi iletişim kuralı
Burada açıklanan pBEC modeli Dr. Louise Morgan ve meslektaşları, hangisinin bir başarılı önceki sığır beyin endotel hücre modeli13tarihinde dayalı tarafından büyük ölçüde (Londra) Eisai laboratuarlarında geliştirilen domuz modeli dayanır. Hücre hazırlık özgün yöntem saflık geliştirmek için subculturing bir adım gelir yüzdeki yakalamak için bir iki aşamalı filtreleme naylon kullanarak kafesleri oldu. Yöntemi önceki gelişiminde en uygun BBB fenotip ve bariyer gerginlik desteklenmiştir orta ACM dahil olmak üzere, büyüme elde edildi. Yöntemine yapılan diğer değişiklikler R. Skinner tarafından Prof N. Rothwell'ın Manchester UK14,15laboratuarında yapılmış. Yöntem Abbott laboratuarı, KCL Londra, nerede Patabendige önemli ölçüde astrocytes veya ACM kullanımı kaçınarak ve puromisindir ile perisitlerden gibi bulaşıcı hücreleri ortadan kaldırarak hazırlamak basit yapılmış tarafından kabul edilmiştir. MC model birkaç önemli şekil-in vivo BBB, etkili sıkı kavşaklar, membran taşıma sistemleri ve reseptör aracılı transcytosis16,17 gibi korunmuş ilk kağıtları doğruladı , 18 , 19 , 20. daha sonra S. Yusof tekrar test astrocyte ortak kültür ve bu belirgin bir biçimde iyileştirilmiş AYLARININ, yani bu şu anda Abbott laboratuarı21' kullanılan tercih edilen varyant bulundu. Model başarıyla oldu M. Nielsen transfer başka değişiklikler nerelerdeydin Aarhus, laboratuarda (Bu iletişim kuralı) tanıttı, ayıklama, tek bir kafes filtrasyon adım ve bir tek filtre kaplama adım kullanarak kolaylaştırmaya gri de dahil olmak üzere önemli kollajen ve fibronektin birleştirerek. Domuz astrocytes (Bu iletişim kuralı) yalıtım için uygulanan prosedür Thomsen ve ark22tarafından açıklanan Aalborg, T. Moos laboratuvarda tarafından geliştirilen iletişim kuralları dayanıyordu. AYLARININ ve Londra ve Aarhus içinde oluşturulan modeli diğer özelliklerini hangi model labs arasında kolayca aktarılır ve iyi dikkatli gözlem ve rasyonalizasyon yöntemi adımlardan yanıt kavramına güven ödünç benzerdir. Nitekim, S. Yusof şimdi yerel koşullara ve doku kaynakları için daha fazla ayarlama dahil bir tropik ülke (Malezya) yılında23, MC model kurmuştur.
Avantajları alternatif yöntemler üzerinde ve şu anda modelleri kurulan
Sığır ve kemirgen kökenli beyin endotel hücrelerine kıyasla, pBECs yalıtım24takip vivo BBB fenotip kaybı daha düşük bir oranı sahip olmanın avantajı sağlar. Ayrıca, pBECs MC (800 Ω cm2)16 monolayers bEND.5 ve bEND.3 (50 Ω cm2) gibi hücre hatları için yaygın olarak bildirilen düzeyleri ile karşılaştırıldığında bile yetiştirilen nispeten sıkı endotel engelleri, şekillendirme yeteneğine 25 , 26 , 27, cEND (300-800 Ω cm2)28,29,30ve cerebEND (500 Ω cm2)29,31,32ve birincil beyin fare (100-300 Ω cm2) endotel hücreleriSS = "xref" > 33,34,35,36 ve fare (100-300 Ω cm2)37,38. Bununla birlikte, AYLARININ bağımlılık üzerinde arıtma ve kültür yordamlar göstermektedir. Çoğu durumda, ACM eklenmesi veya astrocytes ile ortak kültür endotel Katmanlar1gerginlik endotel hücreleri ve artış ayırt edici etkileri gösterir. Yine de, çabaları ile kodlamayla koşulları en iyi duruma getirmek için sadece sığır tabanlı modeller AYLARININ değerleri domuz tabanlı modeller (800 Ω cm2 ' MC, en çok astrocyte ortak kültür 2500 Ω cm2 Ortalamalar) karşılaştırılabilir göstermiştir13 ,39,40,41,42,43,44,45. Birincil sığır beyin üzerine alan modelleri olarak endotel hücreleri büyük varyasyon, laboratuvarlar14,45,46,47,48içinde ve arasında göstermiştir, tekrarlanabilirlik bir sorun olabilir. Rapor burada pBEC modelinde katkıda bulunan laboratuvarlar çok benzer AYLARININ ve paracellular geçirgenlik değerleri düşük değişkenliği hem de laboratuvarlar arasında ile elde ettik. Bu nedenle, burada sunulan yöntemiyle düşük değişkenliği ile güçlü bir modeli kurmak diğer laboratuarlar için mümkün olmalıdır. Sıkı endotel Katmanlar oluşturan ek olarak, pBECs modelleriyle daha önce ifade ve sıkı kavşak proteinler, fonksiyonel BBB taşıyıcılar, reseptörleri ve enzimler, gösterdiği için uygunluğunu test bir dizi çalışmalar15 tarafından doğrulanmış , 16 , 17 , 19 , 20 , 22 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59. Ayrıca, yayınlanmamış transcriptome veri pBECs ortak kültürü üzerinde BBB taşıyıcılar ve reseptörleri (yayınlanmamış sonuçları, Nielsen vd.) beklenen bir profili gösterir.
Domuz tabanlı BBB modeli daha fazla avantajı vardır genom, anatomi, Fizyoloji ve hastalık ilerleme domuz yansıtmak olumlu olan60, özellikleri için kurulan diğer modellere kıyasla daha yüksek bir dereceye insan biyolojisi ilaç endüstrisi. Domuz beyin et endüstrisi ortak bir yan ürün olduğu için onlar deneyler için gerekli ve bir domuz beyin üzerinden yüksek arıtma verimi sağlayan hayvanlar sayısını en aza indirme endotel hücreleri, beyin kolayca erişilebilir bir kaynak oluşturmaktadır. Arıtma ve Primer hücre tarımı biraz zaman alıcı ve model kurma standardizasyon uzmanlık gerektirir rağmen Primer hücre en güvenilir BBB modelleri oluşturma. Bariyer gerginlik, ışınlama ifade profilleri ve microenvironment yönetmelik deneysel bulgular vivo içinde61, yansıtmıyor gibi ölümsüzleştirdi hücre hatları yerine, önemli özellikler olarak olamaz 62. vitro modeller canlı hücre daha yüksek çözünürlükte görüntüleme, görselleştirme hücre içi süreçlerin bir yakın yaklaşım kullanarak hedefleri örneklenen veya gözlenen hücrelere izin vererek mümkün hale avantajı sağlamak yüksek büyütme ile daha iyi optik kalitesi63. İki fotonlu mikroskobu yaşayan hayvanlarda kullanımı böyle değildir. Ayrıca, vitro modelleri hücreleri, görselleştirme tagged proteinlerin ve onların ticareti soruşturma izin transfect olanağı sağlar.
Uygulama modeli
BBB işlevi sabit değildir ve dinamik olarak fizyolojisi ve patoloji modülasyonlu. Nörodejeneratif, dahil olmak üzere birçok nörolojik hastalıklarda enflamatuar ve bulaşıcı hastalıklar, bozulma ve BBB geçirgenliği artmıştır gözlenen64,65,66,67 . Azaltmak ve hastalık ilerleme ve sonraki zarar önlemek için kimlik ve BBB modülasyon temel moleküler mekanizmaları karakterizasyonu büyük önemi vardır. Bu bağlamda güvenilir vitro modelleri ilaç endüstrisi tarafından yüksek talep ve ayrıca MSS ilaçlara geçirgenliği BBB öngörmede önemli rol oynarlar. Geçirgenliği ekran hizmet veren herhangi bir vitro model bir kısıtlayıcı paracellular yol, bir fizyolojik gerçekçi hücre mimarisi ve ışınlama mekanizmaları68fonksiyonel ifade görüntülenmelidir. Önceki çalışmalar16,17,57ve paracellular geçirgenliği ve ifade burada TJ ve AJ proteinlerin gösterdi, sunulan model bu kriterleri karşılayan ve BBB bir aralığı için uygundur çalışmalar her iki normal Fizyoloji ve patoloji. Sunulan arıtma ve ekimi yönteminin güçlü basitlik birleşimini içerir ve tekrarlanabilirlik ve yetenek astrositik dahil bir elde edilen sağlam ve güvenilir yüksek AYLARININ vitro BBB modeli ile etkiler. Bunun amacı, astrocytes, domuz ve sıçan kökenli pBECs benzer bir şekilde22BBB fenotip artırmak için gösterilmiştir.

<table><tbody><tr><td>Fibronektin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Kollajen</td><td>IV Sigma-Aldrich</td><td>C5533</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1524</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F-12</td><td>Lonza</td><td>BE12-719F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / Düşük Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6046</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Plazmadan türetilmiş serum (PDS)</td><td>First Link UK Ltd.</td><td>60-00-89</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td> <td>Gibco Invitrogen</td><td>10-270-106</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin / EDTA</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>Hidrokortizon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4001</td><td></td></tr><tr><td>8-CPT-cAMP</td><td>Biolog</td><td>C010</td><td></td></tr><tr><td>RO 20-1724</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8279</td><td></td></tr><tr><td>Gentamisin Sülfat</td><td>Lonza</td><td>17-518Z</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34896</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>EtOH</td><td>VWR</td><td>20,824,296</td> % 96 EtOH DNAse 1 Sigma-Aldrich'ten<td>% 70 çözeltiyi karıştırın</td></tr><tr><td></td><td></td><td>D4513</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz CLS2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>ddH2O</td><td></td><td></td><td>Elga Sistemi ile üretilmiştir</td></tr><tr><td>T75 şişeleri</td><td>Thermo Scientific</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>Costar Transwell ekleri (Hücre geçirgen membran ekleri)</td> <td>Costar</td><td>CLS3401</td><td>12 oyuklu plaka, 12 mm çap, 0.4 & mu; M Polikarbonat Membran</td></tr><tr><td>15 ml Santrifüj Tüpleri</td><td>Cellstar</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Santrifüj Tüpleri</td><td>Cellstar</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Petri kapları</td><td>Thermo Scientific</td><td>150350</td><td></td></tr><tr><td>Cryo şişeleri</td><td>Thermo Scientific</td><td>377224</td><td></td></tr><tr><td>500 ml şişe</td><td>Thermo Scientific</td><td>159910/159920</td><td></td></tr><tr><td>Neşter</td><td>Swann-Morten</td><td>REF0211</td><td>Tip 24</td></tr><tr><td>Doku homojenizatörü</td><td>Sigma</td><td>D9188</td><td></td></tr><tr><td>140 & mu; m filtreler</td><td>MERCK</td><td>NY4H04700</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m filtreler</td><td>Corning</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>EndOhm hazne sistemi</td><td>World Precision Instruments</td><td>ENDOHM-12 12mm</td><td>Kültür Kapları için EndOhm haznesi</td></tr><tr><td>EVOM2 elektrot sistemi</td><td>World Precision Instruments</td><td>300523+STX100C</td><td>100C sert STX-100C elektrot çifti ile TEER ölçüm sistemi</td></tr><tr><td>Uzun iğne</td><td>Sigma</td><td></td><td>Bir şırıngaya takın</td></tr><tr><td>İnce uçlu kavisli forseps</td><td>KLS Martin</td><td>12-409-12-07</td><td></td></tr><tr><td>Geniş uçlu forseps</td><td>VWR</td><td>82027-390</td><td></td></tr><tr><td>Filtre tutucu</td><td>MERCK Milipore</td><td>Swinnex-47</td><td></td></tr><tr><td>50 ml şırınga</td><td>Braun</td><td>4617509F</td><td></td></tr><tr><td>10 ml şırınga</td><td>Terumo</td><td>SSt20ESI</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Okkludin antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab31721</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Anti-p120 Katenin antikoru</td><td>BD Transdüksiyon laboratuvarları</td><td>610133</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Anti-ZO-1 antikoru</td><td>Invitrogen</td><td>61-7300</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Anti-Claudin 5 antikoru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB4502981</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Alexa Flour 568 ile konjuge eşek anti tavşan IgG</td><td>Thermo Scientific</td><td>A10042</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Alexa Flour 488 ile konjuge eşek anti fare IgG</td><td>Thermo Scientific</td><td>A21202</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEC100X250UC</td><td>0.15&mikro; l/ml son çalışma kabı</td></tr><tr><td>Lucifer Sarı</td><td>Sigma</td><td>L0144</td><td>10 & mikro; g/ml son çalışma konksü</td></tr></tbody></table>

yöntem bir vitro kan - beyin bariyerini modeli domuz beyin endotel hücreleri temel alan kurulması için geliştirilmiş

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

Bu iletişim kuralının amacı ve ekimi pBECs ve vitro kan - beyin bariyerini (BBB) modelleri pBECs mono-kültür (MC), MC astrocyte şartına orta (ACM), ile temel kurmak için en iyi duruma getirilmiş bir yordam sunar ve ortak kültür (NCC) astrocytes, domuz ile temas ya da sıçan kökenli. pBECs izole ve parçaları kapiller beyin cortices aile içi domuz 5-6 aylık üzerinden kültürlü. Bu parçaları dikkatli çıkarılması meninkslerde, yalıtım ve gri madde, filtrasyon, Enzimatik sindirim ve Santrifüjü homojenizasyon tarafından saf. Daha fazla bulaşıcı hücreleri ortadan kaldırmak için kapiller parçaları ile puromisindir içeren kültürlü orta. % 60-95 birleşmesi, kapiller parçalardan büyüyen pBECs için pasajlı zaman geçirgen membran filtre ekler ve modellerinde kurdu. Bariyer gerginlik ve pBECs BBB karakteristik fenotip artırmak için hücreleri aşağıdaki farklılaşma faktörler ile tedavi edildi: membran permeant 8-CPT-kampı (burada kısaltılmış kampı), hidrokortizon ve bir fosfodiesteraz inhibitörü, RO-20-1724 (RO). Yordamı bir 9-11 gün boyunca yürütülen ve NCC modeli oluşturulurken, astrocytes 2-8 hafta önceden kültürlü. Bağlılık protokolündeki açıklanan yordamlara endotel katmanları kurulması son derece kısıtlı paracellular geçirgenliği ile izin verdi, bir ortalama transendothelial elektriksel direnç (AYLARININ) 1249 ± 80 Ω cm gösterilen NCC ile model 2ve paracellular geçirgenliği (Papp) için Lucifer sarı, 0.90 10-6 ± 0,13 10-6 cm sn-1 (± SEM, yani n = 55). Daha fazla bu pBEC fenotip değerlendirilmesi gösterdi sıkı bileske proteinler claudin 5, iyi ifade ZO-1, occludin ve adherens junction protein p120 catenin. Sunulan model bir dizi sağlık ve hastalığında BBB çalışmaları için kullanılabilir ve çok kısıtlayıcı paracellular geçirgenliği ile bu model taşıma ve hücre içi kaçakçılığı çalışmalar için uygundur.

BBB Vitro modelleri kurulması
Sunulmuştur, en iyi duruma getirilmiş yönteminde pBECs tarımı ve geçirgen membran Ekle sisteminin kurulması MC veya ACM veya NCC olmadan astrocytes (şekil 1) ile 9-11 gün (Şekil 2) bir süre için gerçekleştirilmiştir. Endotel hücre seçimi için saflaştırılmış kapiller parçalarının ilk bir kültür puromisindir tedavi için en fazla 5 gün, ...

Protokol amacı birincil domuz beyin endotel hücreleri (pBECs) temel alan bir vitro kan - beyin bariyerini (BBB) modeli kurulması için en iyi duruma getirilmiş bir yordam sunmaktır. Modeli gösterir yüksek tekrarlanabilirlik, yüksek gerginlik ve taşıma ve hücre içi ilaç bulma gelen kaçakçılığı için uygundur.

Yöntem bir Vitro kan - beyin bariyerini modeli domuz beyin endotel hücreleri temel alan kurulması için geliştirilmiş

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

Bu protokolün genel amacı, sıkı bir in vitro kan-beyin bariyeri modeli oluşturmak için primer domuz beyin endotel hücrelerini saflaştırmak ve izole etmektir. Bu yöntem, ilaç dağıtımı, geçirgenlik, reseptör kaçakçılığı ve BB'nin sıkılığı ve polaritesi gibi kan-beyin bariyeri alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu modelin ana avantajı, yüksek TEER ve düşük geçirgenliğe sahip bir in vitro kan-beyin bariyeri modeli oluşturmak için kullanılabilecek birincil beyin endotel hücrelerinin yüksek verimidir. Bu işleme başlamak için, beyinleri steril bir akış tezgahına yerleştirin ve buz üzerine yerleştirilmiş bir beherde bir litre PBS ile nazikçe yıkayın.Daha sonra, ince uçlu forseps kullanarak meninksleri her beyinden dikkatlice çıkarın. Bir neşter kullanarak, beyindeki gri maddeyi birer birer kazıyın ve izole edilen materyali buz üzerine yerleştirilmiş 20 mililitre DMEM / F-12 içeren Petri kaplarına aktarın. İlk parçalanma için, gri madde malzemesini iğne olmadan 50 mililitrelik bir şırıngadan geçirin.Prosedürü tüm beyinler için tekrarlayın ve toplanan gri madde materyalini bir araya getirin. İzole edilmiş gri madde malzemesini DMEM/F-12 ortamı ile el tipi bir doku h

improved-method-for-establishment-an-vitro-blood-brain-barrier-model

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu yöntem, fare beyin mikrovasküler endotel hücreleri izole etmek ve ölümsüzleştirmek açıklamaktadır. Biz beyin dokusu, sindirim adımları, tohumlama ve hücre ölümsüzlük ve homojenizasyon başlayarak adım adım protokol açıklar. Genellikle, homojen, ölümsüzleştirdi mikrovasküler endotel hücre hattı elde etmek için yaklaşık beş hafta sürer.

Bir olarak ölümsüzleştirdi murin Beyin Mikrovasküler Endotel Hücre Hattı Üretimi<em&gt; In Vitro</em&gt; Kan Beyin Bariyeri Modeli

Bu video, kılcal damarların taze domuz beyinlerinden izolasyonunu göstermektedir. İşlem, meninkslerin çıkarılmasını, gri maddenin beyin dokusundan izole edilmesini, kılcal damarları izole etmek için gri maddenin homojenleştirilmesini ve filtrelenmesini ve son olarak kılcal damarları daha da saflaştırmak için enzimatik sindirimin kullanılmasını içerir.

Domuz beyninden kılcal damarların temizlenmesi

Kan-beyin bariyeri (KBB) insan modellerinin oluşturulması BBB yetmezliği ile ilişkili beyin koşulları araştırma yararlanabilir. Burada gözenekli zarın karşı tarafında insan astrosit ve beyin endotel hücreleri coculturing izin veren bir temas BBB modelinin hazırlanması için geliştirilmiş bir tekniği açıklar.

Yöntem kan-beyin bariyerini bir insan hücre tabanlı bir İletişim Modelinin Hazırlanması için Geliştirilmiş

Bu çalışmanın amacı, singeneik fare endotelial hücreler ve astrositlerin ortak-kültür içeren bir in vitro modelinin BBB tekrarlanabilirliğini doğrulamak için oldu. Endotel hücre tek yüksek Teer ve düşük LY geçirgenliği sundu. Belirli TJ proteinlerin ekspresyonu, enflamasyon ve taşıyıcı ve reseptörlerin işlevselliğine fonksiyonel tepkileri değerlendirildi.

Ayarlama-up bir<em&gt; In Vitro</emSıçan Kan-beyin bariyerinin&gt; Model (BBB): BBB geçirimsizliği ve Reseptör aracılı Ulaştırması Bir Odak

Beyin mikrovasküler endotel hücreleri (BMEC), kan-beyin bariyeri (BBB) olarak adlandırılan, kanı ve merkezi sinir sistemini (CNS) ayıran yüksek düzeyde düzenlenmiş bir bariyer oluşturan spesifik bağlantı proteinleri ile birbirine bağlanır. Bu protokolde tartışıldığı gibi primer murin beyin mikrovasküler endotel hücrelerinin izolasyonu, BBB'nin ayrıntılı in vitro çalışmalarını mümkün kılar.

İlköğretim Kemirgen Beyin mikrovasküler endotel hücreleri İzolasyonu

Burada, aktive edilmiş T hücreleri ile etkileşim üzerine endotel hücre bütünlüğü ve geçirgenliği üzerindeki sonuçlara odaklanarak, empedans hücre spektroskopisini kullanan kan-beyin bariyerinin in vitro bir murin modelini açıklıyoruz.

bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Empedans Spektroskopisi kullanarak kan-beyin bariyerinin Model: T Hücre-endotelyal hücre Etkileşim Üzerine Bir Odak

İnsan kan-beyin bariyeri seçici hidrofilik moleküllerin ve patojenlerin beyne penetrasyon engeller. Menenjit ve postoperatif deliryum da dahil olmak üzere çeşitli patolojiler, kan-beyin bariyerinin artan geçirgenliği ile ilişkilidir. Burada, bariyer geçirgenliğini mikrobiyal geçiş le test etmek için bir endotel hücre kültür modelini tanımlıyoruz.

Mikrovasküler Endotel Hücreleri Ile Mikrobiyal Traversal ile Kan-Beyin Bariyerinin Geçirgenliğinin Analizi

Kan-beyin bariyeri (BBB) sıkı beyin homeostazı düzenleyen bir çok hücreli nörovasküler birimdir. İnsan iPSC'leri ve çip üzerine organ teknolojilerini birleştirerek, hastalık modellemesi ve CNS ilaç penetrite tahminleri için uygun kişiselleştirilmiş bir BBB çipi ürettik. BBB çipinin üretimi ve işletimi için ayrıntılı bir protokol açıklanmıştır.

İnsan iPSC Tabanlı Kan-Beyin Bariyer Chip Üretimi

Bu protokol, in vitro model bir insan kan-beyin bariyeri (BBB) oluşturmak için bir yöntem açıklar. Endotel hücreleri ve perisitler bir kesici uç filtrenin (kan bölmesi) her iki tarafına ekilir ve astrositler alt kuyucuğa (beyin bölmesi) ekilir. Karakterize edilen model, nanopartikül taşıma deneyleri için kullanılmıştır.

İnsan Kan-Beyin Bariyerini Modelleyen Üçlü Kültür Hücre Sistemi

Kan-beyin bariyeri (BBB), istikrarlı ve sağlıklı bir beyin ortamının sürdürülmesinde çok önemli bir role sahiptir. BBB disfonksiyonu birçok nörolojik hastalıkla ilişkilidir. Serebrovasküler patolojiyi, BBB bütünlüğünü ve BBB'nin genetik ve hastalık tarafından nasıl değiştirildiğini araştırmak için BBB'nin 3 boyutlu, kök hücre türevli bir modelini geliştirdik.

Nörolojik Hastalığı Modellemek ve Terapötik Olarak Hedeflemek için İn Vitro Kan-Beyin Bariyerinin Yeniden Yapılandırılması

Keşfedin, domuz beyin endotel hücreleri kullanarak yüksek TEER değerli ve düşük geçirgenlikli in vitro kan-beyin bariyeri modeli kurma yöntemini. Bu protokol ilaç teslimatı ve reseptör trafikleme araştırmaları için sağlam bir araç sunar.

Yöntem bir Vitro kan - beyin bariyerini modeli domuz beyin endotel hücreleri temel alan kurulması için geliştirilmiş

Daha fazla video keşfet