Amiloid doku Imaging ile Işıksaçan konjuge Oligothiophenes Hyperspectral tarafından Confocal mikroskobu ve floresan ömür boyu görüntüleme lekeli

Bu yöntemin genel amacı, hem klinik hem de bilimsel kurulumlarda protein agregat birikintilerinin tespit edilmesidir. Hepta formil tiyofen asetik asit boyama ve prion hastalığı ve Alzheimer hastalığının hayvan modellerinden doku analizi tarif edilmiştir. Bu yöntem, küçük miktarlarda protein agregatlarının varlığı ve bunların içsel konformasyonel varyasyonları gibi amiloid alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu tekniğin avantajı diğer konvansiyonel tekniklere göre daha seçici ve daha hassas olmasıdır. Bu tekniğin etkileri, probların istenen görselleştirme tekniği için uyarlanması olasılığı nedeniyle çeşitli protein yanlış katlanma hastalıklarının tedavisine veya teşhisine kadar uzanır. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, hFTAA'nın bu kadar düşük boyama konsantrasyonu gerektirmesi nedeniyle mücadele eder.

HFTAA ayrıca geleneksel boyalara kıyasla daha uzun bir uyarma ve emisyon dalga boyu gösterir. Lüminesan konjuge oligoçeten çözeltisini, mililitre başına bir miligram stok çözeltisi hazırlamak için liyofilize hFTAA'yı iki milimolar sodyum hidroksit içinde yeniden süspanse ederek hazırlayın. Stok çözeltisini bir cam şişeye aktarın ve dört santigrat derecede saklayın.

Formalinle sabitlenmiş, parafine gömülü bölümler kullanılıyorsa, gece boyunca ksilen içinde deparafin ekleyin. Boyama gününde, bölümleri her seferinde on dakika boyunca ardışık %99 etanol, %70 etanol, dH2O ve PBS banyolarına daldırın. Ardından, doku bölümlerinin ortam koşullarında kurumasını bekleyin.

Doku kururken, stoğu PBS'de bir ila 10.000 oranında seyrelterek çalışan bir hFTAA çözeltisi hazırlayın. Doku kuruduğunda, üzerini örtmek için her doku bölümüne hFTAA çalışma solüsyonunun damlacıklarını ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.

Boyama solüsyonunu 500 mikrolitre PBS ile durulayın ve ardından slaytı 10 dakika boyunca PBS banyosuna daldırın. Bölümün ortam koşullarında kurumasına izin verdikten sonra, floresan montaj ortamı kullanarak monte edin. Montaj ortamının gece boyunca oturmasına izin verin.

Amiloid tespiti, montajdan hemen sonra veya hatta montaj olmadan gerçekleştirilebilir. Bununla birlikte, deneyin amacı yüksek kaliteli spektral bilgi toplamaksa, gece boyunca inkübasyon tercih edilir. Mikroskop yazılımını açın, projeyi adlandırın, spektral görüntüyü seçin ve edinime başlayın.

436 nanometre uyarma filtresini kullanarak oküler ekrandan ilgilendiğiniz nesneyi seçin ve kameraya giden ışık yolunu kaydırın. Vaka veri yöneticisinde, numune tipi spektralini seçin, numuneyi etiketleyin ve al'a basın. Edinme penceresi açılacaktır.

Spektral görüntüleme altında, ayarlar menüsünü açın, edinme özelliklerini seçin ve spektral aralığı 460 ila 700 olarak, maksimum hızda hız kalitesini ve ölçüm türünü gaz lazer dar filtreler olarak ayarlayın. İletişim kutusunu kapatın. Görüntü menüsünde tam canlı'yı seçin.

Simgenin çubuğunda saçakları kapatın. Görüntülenecek bir bölge seçin ve en yüksek bellek değerinin 800 megabaytın altında olduğundan emin olun. Pozlama süresini 1.000 ile 3.000 arasında toplam görüntü parlaklığı veren bir değere ayarlayın.

Simgenin çubuğunda renkli kameraya basın. Satın alma başlayacak. Görüntü alımı tamamlandığında, spektral görüntü al iletişim kutusunda kaydet'e ve vaka veri yöneticisi iletişim kutusunda yeni hücreye basın.

Vaka veri yöneticisinden, analizi başlat düğmesini kullanarak toplanan görüntüyü açın. Veri analizi penceresi açılacaktır. Spektral bilgiler, spektral ekran iletişim kutusu kullanılarak ROI'ler seçilerek görüntünün her pikselinden toplanabilir.

Görüntünün ilgili alanlarından ROI'leri seçin, tanımlayın ve seçin. Lib düğmesini kullanarak spektral verileri bir metin dosyası olarak kaydedin. Kaydedilen txt dosyası, tercih edilen herhangi bir analiz yazılımına aktarılabilir.

Mikroskop yazılımını açın ve konfokal mikroskobu kurarak başlayın. Lazer yoğunluğunu %0,2'ye, iğne deliğini bir Airy birimine, çerçeve boyutunu 1.024 x 1.024 piksele, tarama hızını 16 taramada ortalama yedi ve bit derinliğini sekiz bit olarak ayarlayın. Emisyon spektrumunu toplamak için lambda modunu seçin ve argon lazeri 488 nanometreye ayarlayın.

32 kanallı gaz dedektöründe 22 kanal kullanarak 499 ile 691 nanometre arasındaki emisyonu toplayın. Kazancı 755 olarak ayarlayın. Canlı düğmesine tıklayın ve paleti aralık göstergesine değiştirin ve kazancı kırmızı renkte aşırı yüklenmemiş piksellere izin verecek şekilde ayarlayın.

Durdur düğmesine tıklayın ve ardından snap düğmesine basarak görüntü yakalayın. Tek kanallı görüntüler elde etmek için akıllı kurulum seçeneğini seçin. FITC ve Alexa 532'yi seçin.

Doğrusal karıştırmayı seçin ve uygulayın. Aşırı yüklenmemiş piksellere izin vermek için kazancı ayarlayın. FITC için kazancı 693 olarak ayarlayın ve Alexa 532 için canlı modda kazancı 433 olarak ayarlayın.

Durdur düğmesine tıklayın ve ardından snap düğmesine basarak görüntü yakalayın. Mikroskobu FLIM moduna geçirin. İğne deliğini 20'ye, uyarma dalga boyunu 490 nanometreye ve lazer yoğunluğunu %0,5'e ayarlayın 40 megahertz'de darbeli lazerler kullanın.

FLIM yazılımında, 550 nanometreden fazla foton saymayı ayarlayın. Ekran parametreleri penceresinde, maksimum sayım yaklaşık 4.000 foton sayımı olana kadar foton sayımını takip edin. Dosyayı kaydedin ve SPC görüntüsü olarak dışa aktarın.

Bu görüntü, DAPI ile karşı boyanmış karaciğer hepatositlerindeki keratin agregatlarından oluşan Mallory-Denk cisimlerini göstermektedir. Burada, sporadik inklüzyon cisimciği miyozit iskelet kası dokusunda P62 pozitif inklüzyonlar gösterilmiştir. Bu görüntü, insan pankreasında adacık amiloid polipeptidinin amiloid dahil edilmesini göstermektedir.

İnsan bağırsağında immünoglobulin hafif zincirinin bir amiloid birikimi burada gösterilmiştir. Bu görüntü, fare beynindeki koyun scrapie'nin prion protein agregatlarının birikintilerini göstermektedir. Kronik israf hastalığı ile enfekte olmuş bir fare beynindeki prion protein agregatları burada gösterilmektedir.

Bu görüntü, APP23 fare beynindeki A-beta-amiloid plaklarını göstermektedir. Ve bu görüntü APP-PS1 fare beynindeki A-beta patolojisini göstermektedir. İnsan hastalarda transtirenin amiloidinin tanısal örneklerinden alınan bu yağ biyopsisi yaymaları, standart Kongo Kırmızısı puanlamasına göre bir ila dört arasında derecelendirildi.

Sarı alanlar hFTAA lekeli transtiretin amiloid birikintilerini gösterir ve mavi adipoz dokudan otofloresandır. Bu prosedürü denerken, yeterince düşük konsantrasyonda lekelemeyi unutmamak önemlidir. Ayrıca, maksimum kontrastı elde etmek için uzun geçiren filtreler kullanmayı ve ayrıca otofloresan ve arka plan lekelenmesi floresansından kaçınmayı unutmayın.

Bu prosedürü takiben, agrega proteini tanımlamak ve koagrege proteinleri tanımlamak için immünofloresan gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, amiloidoz alanındaki araştırmacıların protein agregat yapılarını keşfetmelerinin ve organik kimyanın bu hedefler için yeni problar tasarlamasının yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, her birini farklı tekniklerle görüntülemek için LCO boyamanın nasıl yapılacağını iyi anlamış olmalısınız.