Kornea doku Mühendisliği: İnsan kornea sinir Stromal etkileşimlerin bir Vitro modeli

Bu protokolün genel amacı, insan kornea stromal hücreleri ile nöronal hücreler arasındaki hücresel etkileşimleri doğal hücre dışı matrislerinde araştırmaktır. Protokol, keratokonus, diyabetik keratopati ve Fuchs distrofisi gibi kornea hastalıkları ve distrofilerini incelemek için genişletilebilir. Bu yöntem, belirli bir kornea hastalığı veya distrofisi sırasında stroma sinir etkileşimlerinin altında yatan mekanizmaları ve kusurları belirleyerek insan kornea biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu tekniğin ana avantajı, hücrelerin in vitro olarak gerçek insan kornea dokusunun daha iyi ve daha doğru bir modelini sağlayan in vitro olarak kendi hücre dışı matrislerini salgılamalarına izin verilmesidir. Bu tekniğin etkileri kornea hastalıklarının tedavisine kadar uzanır, çünkü hücre-hücre ve hücre dışı matriks etkileşimlerinin değerlendirilmesi kornea dokusunun doğru bir şekilde temsil edilmesini sağlayacak ve daha hedefli ilaç geliştirilmesine izin verecektir. Şimdi, bu yöntem kornea siniri hasarı ve rejenerasyonu hakkında bilgi sağlayabilir.

İlaç taraması ve geliştirme gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. İnsan kornea dokusu örneklerini aldıktan sonra, dokuları iki mililitre steril Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin içeren 21,5 santimetre karelik bir tabağa aktarın. Kornea kubbesini yüzü yukarı bakacak şekilde konumlandırın ve epitel tabakasını kazımak için 45 derecelik bir açıyla bir tıraş bıçağı kullanın.

Ardından, kornea kubbesini yüzü aşağı bakacak şekilde çevirin ve endotelyumu stromadan iyice kazıyın. Stromal dokuyu DPBS ile yıkayın. Stromal parçaları DPBS ile ıslak tutun ve stromal dokuları küçük parçalara ayırmak için 10 numara cerrahi bıçak kullanın.

Stromal parçaları ortam içermeyen bir T25 kültür şişesine aktarmak için steril forseps kullanın. Eksplantların şişenin dibine 37 santigrat derecede yaklaşık 30 ila 40 dakika yapışmasına izin verin. Stromal dokuyu hassas bir şekilde kestikten sonra, şişeyi dikkatlice inkübatöre aktarın.

30 ila 40 dakika beklemek ve ardından medyayı yavaşça eklemek önemlidir. Bu adım, eksplantların tam olarak yapışmasını sağlamak ve ayrılmalarını önlemek için kritik öneme sahiptir. Yapıştırıldıktan sonra, eksplantları rahatsız etmeden şişeye %10 fetal sığır serumu ve %1 antibiyotik-antimikotik içeren Eagle's Minimum Essential Medium'u yavaşça ekleyin.

Şişeyi yavaşça 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit ile inkübatöre yerleştirin. Hücreler şişede izole olmaya ve göç etmeye başlayana kadar eksplantları rahatsız etmeden bırakın. Yaklaşık iki ila dört hafta sonra, hücreler% 100 birleşmeye ulaşmalıdır.

% 100 birleştikten sonra, doku kültürü ortamını çıkararak ve hücreleri DPBS ile yıkayarak hücreleri geçirin. Hücrelere tripsin ekleyin ve ardından 37 santigrat derecede inkübe edin. Yaklaşık beş dakika sonra, ayrıldıklarını doğrulamak için hücreleri bir ışık mikroskobu altında görüntüleyin.

Taze ortam ekleyerek proteolizi durdurun ve hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Hücreleri peletlemek için tüpleri 1000 x g'da santrifüjleyin. Peleti rahatsız etmeden süpernatanı dikkatlice çıkarın ve hücreleri taze ortamda askıya alın.

Bir hücre sayımı yaptıktan sonra, daha fazla genişleme için taze ortam ile T75 kültür şişesindeki altı hücreye yaklaşık bir kez 10 kez tohumlayın. 3D yapıyı monte etmek için, önce insan kornea fibroblastlarını geçirin ve sayın, ardından 0.4 mikron gözenekli bir polikarbonat membran ekine yaklaşık bir kez 10 ila altı HCF'yi tohumlayın. Yapının üstüne 1,5 mililitre taze ortam ekleyin.

Ardından, her yapının altına aynı ortamdan 1,5 mililitre daha pipetleyin. 24 saat sonra, her yapının üstüne ve altına 0,5 milimolar C vitamini ile desteklenmiş 1,5 mililitre orta ekleyin. Üç hafta boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin ve her gün C vitamini içeren taze ortam ekleyin.

Bu, hücreleri kendi hücre dışı matrislerini salgılamaları ve bir araya getirmeleri için uyaracaktır. Üç hafta sonra, önceden monte edilmiş 3D yapıların üstüne üçüncü SH-SY5Y insan nöroblastom hücrelerine sekiz kez 10 ekleyin. Bu adımda tam hücre sayısını hesaplamak ve hücre farklılaşmasına başlamadan önce 24 saat beklemek çok önemlidir.

24 saatlik inkübasyondan sonra, hücreleri %10 FBS ve 10 mikromolar retinoik asit içeren 1.5 mililitre EMEM ile uyararak SH-SY5Y hücre farklılaşmasını başlatın. Daha sonra yapının altına 1.5 mililitre C vitamini içeren ortam ekleyin. Retinoik asit ışığa duyarlıdır, bu nedenle bu adım karanlıkta yapılmalıdır.

Beş gün sonra, hücreler farklılaşma aşamasına ulaştığında, yapının üstüne iki nanomolar BDNF ve% 1 antibiyotik-antimikotik içeren 1.5 mililitre serum içermeyen ortam ekleyin. Yapının altına taze C vitamini takviyeli ortam ekleyin. Daha fazla analiz için işlemeden önce hücreleri iki gün daha kültürleyin.

Bu, polikarbonat membranı ve üstte oturan kornea stromal hücrelerini gösteren 3D kendinden montajlı yapının yüksek büyütmeli bir transmisyon elektron mikroskobu görüntüsüdür. Bu görüntü, üstte oturan ve stromal-nöronal hücre düzenlemesi sergileyen farklılaşmış nöronal hücreleri göstermektedir. Resimdeki oklar nöronal hücreleri göstermektedir.

Bu prosedürü denerken, eksplantları keserken kornea dokusunu her zaman ıslak tutmayı ve cerrahi aletleri ve bıçakları steril tutmayı unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, insan kornea stromal hücreleri ile nöronal hücreler arasındaki hücre etkileşimlerini doğal hücre dışı matrislerinde araştırmak için bu in vitro modelin nasıl kurulacağını ve kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız. BDNF, retinoik asit ve cerrahi bıçaklarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü uygularken her zaman uygun koruyucu giysi giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.