Name: Kornea doku Mühendisliği: İnsan kornea sinir Stromal etkileşimlerin bir Vitro modeli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Keşfedin, korneal stromal hücreler ve nöronal hücreler arasındaki hücre etkileşimlerini doğal ekstraselüler matriste incelemek için üç boyutlu bir in vitro model. Bu yöntem, korneal sinir hasarı ve rejenerasyonu hakkında bilgi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. Ben Fowler sayesinde bizim samimi-TEM deneyleri ile onun teknik yardım için genişletmek istiyorum.

Bu iletişim kuralı Üniversitesi Oklahoma Sağlık Bilimleri Merkezi/Kurumsal inceleme Kurulu (IRB #4509) kuralları izler. İletişim kuralının tüm parçaları Helsinki Bildirgesi ilkelerinin bir araya geldi. Kornea örnekleri ulusal kalkınma ve Araştırma Enstitüsü (NDRI) ve Oklahoma Lions göz Bankası elde edilmiştir.
1. Primer hücre izolasyon
<ol><li>İnsan kornea doku örneği alınması üzerine, dokularda bir 21,5 cm2 Petri dish 2 mL steril Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz (DPBS) içeren naklet (1 x).</li>
	<li>Scrape ve kornea epitel kornea kubbe yukarı doğru konumlandırma tarafından kaldırın. Tümüyle kaldırılmasını sağlamak için iyice bir 45 ° açıyla bir jilet kullanarak epitel tabaka kapalı kazımak. Ardından, kornea kubbe aşağı doğru çevirmek ve iyice endotel stroma tümüyle kaldırılmasını sağlamak için bir 45 ° açıyla bir tıraş bıçağı ile gelen kapalı kazımak. Stromal doku DPBS ile yıkayın.</li>
	<li>Stromal dokuları at DPBS kullanarak sürekli ıslak stromal parçaları tutmak bir 10 numara cerrahi bıçak kullanarak küçük parçalar halinde kesin. Stromal adet steril forseps ve yer ile bir T25 kültür şişesi ezelî kitle iletişim araçları (4 veya 5 adet şişe başına 2 x 2 mm dokusunun) içine al.</li>
	<li>Explants şişesi yaklaşık 30-40 dk 37 ° C'de altına bağlı kalmak izin verir. Bir kez yapıştırılır, yavaş yavaş % 10 fetal sığır serum (FBS) ve % 1'i içeren kartal'ın en az gerekli orta (EMEM) eklemek antibiyotik/Antimycotic explants bozmadan şişesi için.</li>
	<li>Yavaşça kuluçka 37 ° c, % 5 CO2şişeye koyun. Hücreleri izole başlayana explants rahatsız bekletin ve şişeye geçiş yapma. Yaklaşık 2-4 hafta sonra hücrelerin % 100 izdiham ulaştırılması gerekmektedir. % 100 izdiham, üzerine hücreleri doku kültürü medya kaldırarak geçiş ve DPBS hücrelerle yıkayın.</li>
	<li>Tripsin hücrelere ekleme ve sonra onları 37 ° C'de kuluçkaya Yaklaşık 5 dk sonra onlar ayırdıktan onaylamak için ışık mikroskobu altında hücreler görüntüleyin ve sonra taze medya ekleyerek proteolizis durdurmak.</li>
	<li>Santrifüjü 1000 x g. adlı için çıkarmak süpernatant dikkatle Pelet bozmadan hücre süspansiyon 15 mL konik tüp içine aktarmak ve taze EMEM hücrelerde % 10 askıya FBS % 1 antibiyotik. Hücreleri saymak ve T75 kültür şişesi için daha fazla genişleme ile taze EMEM hücrelerde yaklaşık 1 x 106 %1 tohum FBS % 1 antibiyotik.</li>
</ol>2. birincil HCFs kültür ve 3D birleştirme oluşturur
<ol><li>3D bir araya gelen yapıları explants daha önce yetişen EMEM % 10 FBS %1 antibiyotik/Antimycotic, geçit ve sayısı HCFs.</li>
	<li>Yaklaşık 1 x 106 hücreler/kuyu polikarbonat membran ekler ile birlikte 1.5 mL taze EMEM 3D yapılar üzerinden 0,4-µm gözenekleri üzerinde birincil HCFs % 10 tohum FBS % 1 antibiyotik/Antimycotic yapı dön. Aynı medya başka bir 1,5 mL her yapı altýna ekleyin.</li>
	<li>Hücre tohum 24 saat sonra % 10 EMEM hücrelerle kültür FBS % 1 antibiyotik/Antimycotic, ekleyerek 1,5 mL üstünde belgili tanımlık tepe ve her yapı altındaki 1,5 mL 0.5 mM 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic asit (C vitamini) ile uyarılmış.</li>
	<li>37 ° c, % 5 CO2 3 hafta için bir kuluçka kültürlerde korumak ve taze medya tüm çalışma süresi boyunca her gün verin. Daha fazla geçiş yok gereklidir.</li>
</ol>3. hücre farklılaşma ve ortak kültürler
<ol><li>3 hafta sonra 8 x 103 hücreleri/iyi SH-SY5Y insan Nöroblastom hücre önceden birleştirilmiş 3D üst yapıları içeren 1,5 mL % 10 içeren EMEM eklemek FBS, % 1 antibiyotik/Antimycotic ve 0,5 mM 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic asit (C vitamini).<ol>
<li>SH-SY5Y Nöroblastom hücreleri hücre farklılaşması işlemini başlatmadan önce en az 24 saat için kornea stromal hücreler üzerine büyümeye izin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>SH-SY5Y hücre farklılaşması ile EMEM %1 FBS ve 10 µM 1,5 mL içeren hücreleri uyararak başlatmak retinoik asit üzerine inşa. EMEM % 10 FBS % 1 antibiyotik/Antimycotic 0,5 mM 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic asit (C vitamini) 1,5 mL yapı altýna ekleyin. Retinoik asit adım karanlıkta içermesi gerektiğini unutmayın.<ol>
<li>Bu farklılaşma medya hücrelerde 5 gün boyunca kültür devam ediyor.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücrelere farklılaşma aşama ulaşmak, hücreleri için 1,5 mL serum-Ücretsiz medya içeren 2 geçiş beyin kaynaklı Nörotrofik faktör (BDNF) ve % 1 nM antibiyotik/Antimycotic eklendi EMEM için inşa en üstüne ekleyerek. EMEM % 10 FBS % 1 antibiyotik/Antimycotic 0,5 mM 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic asit (C vitamini) 1,5 mL yapı altýna ekleyin. BDNF adım karanlıkta içermesi gerektiğini unutmayın.</li>
	<li>Tablo 1' de gösterildiği gibi başka herhangi bir analiz için 2 ek gün önce işleme için hücreleri kültür.</li>
</ol>

<ol><li>Pascolini, D., Mariotti, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+estimates+of+visual+impairment%3A+2010%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Global estimates of visual impairment: 2010.</a> Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).</li>
<li>Rönkkö, S., Vellonen, K. -S., Järvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+corneal+cell+culture+models+for+drug+toxicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Delivery+and+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Human corneal cell culture models for drug toxicity studies.</a> Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).</li>
<li>Ghezzi, C. E., Rnjak-Kovacina, J., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+tissue+engineering%3A+recent+advances+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Corneal tissue engineering: recent advances and future perspectives.</a> Tissue Eng Part B Rev. 21 (3), 278-287 (2015).</li>
<li>Shafaie, S., Hutter, V., Cook, M. T., Brown, M. B., Chau, D. Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Cell+Models+for+Ophthalmic+Drug+Development+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22BioResearch+Open+Access%22%5BJournal%5D)">In Vitro Cell Models for Ophthalmic Drug Development Applications.</a> BioResearch Open Access. 5 (1), 94-108 (2016).</li>
<li>Shaheen, B. S., Bakir, M., Jain, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+nerves+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Surv+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Corneal nerves in health and disease.</a> Surv Ophthalmol. 59 (3), 263-285 (2014).</li>
<li>Beuerman, R. W., Schimmelpfennig, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+denervation+of+the+rabbit+cornea+affects+epithelial+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Sensory denervation of the rabbit cornea affects epithelial properties.</a> Exp Neurol. 69 (1), 196-201 (1980).</li>
<li>Heigle, T. J., Pflugfelder, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aqueous+tear+production+in+patients+with+neurotrophic+keratitis%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Aqueous tear production in patients with neurotrophic keratitis.</a> Cornea. 15 (2), 135-138 (1996).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+3D+corneal+tissue+model+with+epithelium%2C+stroma%2C+and+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">In vitro 3D corneal tissue model with epithelium, stroma, and innervation.</a> Biomaterials. 112, 1-9 (2017).</li>
<li>Ross, R. A., Spengler, B. A., Biedler, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+morphological+and+biochemical+interconversion+of+human+neuroblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Coordinate morphological and biochemical interconversion of human neuroblastoma cells.</a> J Natl Cancer Inst. 71 (4), 741-747 (1983).</li>
<li>Griffith, L. G., Naughton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+-+Current+challenges+and+expanding+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering - Current challenges and expanding opportunities.</a> Science. 295 (5557), (2002).</li>
<li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+characterization+of+organized+extracellular+matrix+deposition+by+ascorbic+acid-stimulated+human+corneal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Morphologic characterization of organized extracellular matrix deposition by ascorbic acid-stimulated human corneal fibroblasts.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (9), 4050-4060 (2007).</li>
<li>Karamichos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+tissue+engineering%3A+current+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Funct+Biomater%22%5BJournal%5D)">Ocular tissue engineering: current and future directions.</a> J Funct Biomater. 6 (1), 77-80 (2015).</li>
<li>Karamichos, D., Brown, R. A., Mudera, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+stiffness+regulates+cellular+contraction+and+matrix+remodeling+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Collagen stiffness regulates cellular contraction and matrix remodeling gene expression.</a> J Biomed Mater Res A. 83 (3), 887-894 (2007).</li>
<li>Ruberti, J. W., Zieske, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prelude+to+corneal+tissue+engineering+-+gaining+control+of+collagen+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Prelude to corneal tissue engineering - gaining control of collagen organization.</a> Prog Retin Eye Res. 27 (5), 549-577 (2008).</li>
<li>Karamichos, D., Guo, X. Q., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+corneal+fibrosis%3A+an+in+vitro+model%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Human corneal fibrosis: an in vitro model.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (3), 1382-1388 (2010).</li>
<li>Chen, F. M., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+biomaterials+of+human+origin+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Polym+Sci%22%5BJournal%5D)">Advancing biomaterials of human origin for tissue engineering.</a> Prog Polym Sci. 53, 86-168 (2016).</li>
<li>Priyadarsini, S., Sarker-Nag, A., Rowsey, T. G., Ma, J. X., Karamichos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+3D+In+Vitro+Model+to+Accelerate+the+Development+of+Human+Therapies+against+Corneal+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Establishment of a 3D In Vitro Model to Accelerate the Development of Human Therapies against Corneal Diabetes.</a> PLoS One. 11 (12), e0168845(2016).</li>
<li>Karamichos, D., Hjortdal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratoconus%3A+tissue+engineering+and+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Funct+Biomater%22%5BJournal%5D)">Keratoconus: tissue engineering and biomaterials.</a> J Funct Biomater. 5 (3), 111-134 (2014).</li>
<li>Wilson, S. L., Yang, Y., El Haj, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+Stromal+Cell+Plasticity%3A+In+Vitro+Regulation+of+Cell+Phenotype+Through+Cell-Cell+Interactions+in+a+Three-Dimensional+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Corneal Stromal Cell Plasticity: In Vitro Regulation of Cell Phenotype Through Cell-Cell Interactions in a Three-Dimensional Model.</a> Tissue Engineering Part A. 20 (1-2), 225-238 (2014).</li>
<li>Proulx, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+a+human+cornea+by+the+self-assembly+approach+of+tissue+engineering+using+the+three+native+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of a human cornea by the self-assembly approach of tissue engineering using the three native cell types.</a> Molecular Vision. 16 (234-236), 2192-2201 (2010).</li>
<li>Gonzalez-Andrades, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+novel+in+vitro+model+of+stratified+epithelial+wound+healing+with+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Establishment of a novel in vitro model of stratified epithelial wound healing with barrier function.</a> Sci Rep. 6, 19395(2016).</li>
<li>Hopkins, A. M., DeSimone, E., Chwalek, K., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+in+vitro+modeling+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">3D in vitro modeling of the central nervous system.</a> Prog Neurobiol. 125, 1-25 (2015).</li>
<li>Schulz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+Corneal+Cell-Based+Microenvironment+as+Prerequisite+for+Balanced+3D+Corneal+Epithelial+Morphogenesis%3A+A+Promising+Animal+Experiment-Abandoning+Tool+in+Ophthalmology%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C-Methods%22%5BJournal%5D)">Natural Corneal Cell-Based Microenvironment as Prerequisite for Balanced 3D Corneal Epithelial Morphogenesis: A Promising Animal Experiment-Abandoning Tool in Ophthalmology.</a> Tissue Engineering Part C-Methods. 20 (4), 297-307 (2014).</li>
<li>Gao, J., Wang, Y., Zhao, X., Chen, P., Xie, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-204-5p-Mediated+Regulation+of+SIRT1+Contributes+to+the+Delay+of+Epithelial+Cell+Cycle+Traversal+in+Diabetic+Corneas%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-204-5p-Mediated Regulation of SIRT1 Contributes to the Delay of Epithelial Cell Cycle Traversal in Diabetic Corneas.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (3), 1493-1504 (2015).</li>
<li>Koulikovska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+regeneration+of+corneal+tissue+via+a+bioengineered+collagen+construct+implanted+by+a+nondisruptive+surgical+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Enhanced regeneration of corneal tissue via a bioengineered collagen construct implanted by a nondisruptive surgical technique.</a> Tissue Eng Part A. 21 (5-6), 1116-1130 (2015).</li>
<li>Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+corneal+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+retinal+and+eye+research%22%5BJournal%5D)">Progress in corneal wound healing.</a> Progress in retinal and eye research. 49, 17-45 (2015).</li>
<li>Zieske, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+and+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix and wound healing.</a> Curr Opin Ophthalmol. 12 (4), 237-241 (2001).</li>
<li>Karamichos, D., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor-beta3+regulates+assembly+of+a+non-fibrotic+matrix+in+a+3D+corneal+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor-beta3 regulates assembly of a non-fibrotic matrix in a 3D corneal model.</a> J Tissue Eng Regen Med. 5 (8), e228-e238 (2011).</li>
<li>Karamichos, D., Lakshman, N., Petroll, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+model+for+assessing+fibroblast+migration+in+3-D+collagen+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">An experimental model for assessing fibroblast migration in 3-D collagen matrices.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66 (1), 1-9 (2009).</li>
<li>Karamichos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+in+Vitro+Model+for+Keratoconus+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Funct+Biomater%22%5BJournal%5D)">Novel in Vitro Model for Keratoconus Disease.</a> J Funct Biomater. 3 (4), 760-775 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.

Çeşitli çalışmalarda de kornea hastalıkları daha iyi bir anlayış geliştirmelerine yardımcı olarak tedavileri keşfetmek çeşitli hayvan modelleri geliştirilmesi üzerinde duruldu. Ancak, bu çalışmalar insanlar için önemli bir değer doğrulanmadı. Bugüne kadar çeşitli vitro modelleri geliştirilmiş ve onların olağanüstü klinik önemi nedeniyle yaygın olarak araştırıldı. Bizim daha önce kurulan 3D vitro modeli önemli ölçüde vizyon araştırma gelişmeler tıp biliminin katkıda bulunur ve in vivo olaylar <e...

İnsan vücudunda kornea en yoğun innervated dokudur. Sinirleri dokunma, ağrı, sıcaklık gibi çeşitli duyumlar sorumludur ve iyileşmesi, refleksleri yanıp, gözyaşı üretim ve salgı5,6,7önemli bir rol olarak da mevcuttur. Kornea, stromal sinir mayo limbal pleksus ortaya ve periferik Korneal stroma Radyal girin. Stromal sinir organizasyonu için kollajen lamellae paralel ve daha fazla içine doğru yüzeysel stroma5,8devam ederken daha küçük fascicles şube. Sinir lifleri daha da epitel tabakası nüfuz ve böylece, innervasyon yaygın olarak kornea epitel ve stroma üzerinden dışarı yayılır. Bu nedenle, innervasyon kornea sağlıklı ve hastalıklı durumda önemli bir rol vardır. Bu protokol için in vivo sinir stromal etkileşimleri taklit etmek için kendi türünde ilk roman 3D vitro manken ilerlemesi ortaya koyuyor. Nöronal büyüme çalışırdım en köklü, iyi karakterize satırlardan birini olduğu gibi SH-SY5Y hücre kültürünü bu çalışma için kullanıldı. SH-SY5Y hücre kültürünü her iki substrat yapışık (S-type) üretmek için tanımlanmıştır ve neuroblastic (N-tipi) hücreleri transdifferentiation9tabi olabilir. Sonuç olarak, bu hücre kültürünü N-tipi hücre Çift Kişilik birbirini izleyen subclone seçimden türetilmiştir olsa bile, ayrıca S-type hücrelerin nöronlar aracılığıyla retinoik asit ve beyin kaynaklı içine farklılaşma geçiren küçük bir dizi içerir Nörotrofik faktör9. Bu kornea komplikasyon diabetik retinopati (DM) ve diğer göz hastalıkları ile ilgili daha iyi bir anlayış neden olabilir bir araç sağlar. Alma ve oküler hastalığı olan hastalarda neurons kültür ile ilgili nedenlerden dolayı nöronal etkileşimleri eğitim ve Korneal stroma ile sinyal önemli etkileri bu 3D vitro modeli sağlar.
Hastalıklı koşulları kez güvenliği aşılan bir yaşam kalitesi için önde gelen bir çok büyük ölçekli, vücudun çeşitli dokuları etkiler. Oküler dystrophies ortak komplikasyonlar genellikle sistemik hastalıklar ve kurşun görme keskinliği kaybı veya hatta kalıcı görme kaybı ile ilişkili vardır. Kapsamlı çalışmalar çoğu kez daha iyi hastalık durumu gibi Bazal hücresel düzeyde etkilerini anlamak için gerekli. Gibi hastalıklar etkileri çalışmaya, doku mühendisliği uygulamaları yardımıyla çeşitli in vivo ve in vitro modelleri geliştirilmiştir. Kornea doku mühendisliği uygulamaları bilim10,11,12,13,14çeşitli alanlarda büyük ilgi topladı var ama sırasında hala önemli sınırlamaları vardır fiili uygulama, kornea dahil greft reddi, enfeksiyonlar ve skarlasma10,11,12,13,14. Başarılı bir şekilde geliştirilen ve çeşitli vitro modelleri3,15,16,17,18, kurulan birçok çalışma vardır 19,20,21,22,23,24,25,26. 3D vitro en umut verici ve büyük bilimsel ilgi modeller. 3D modelleri daha iyi fibrozis sırasında kritik olan ve şifa15,27,28,29yara vivo içinde hücresel ve fizyolojik olaylar ayna olduğu bilinmektedir. Bu vitro modelleri kornea komplikasyonlar da dahil olmak üzere farklı hastalık tedavi için yeni tedavi yaklaşımları bulma konusunda önemli bir rol oynamak. İnnervasyon kornea işlevlerinde önemli rol rağmen küçük bir çaba periferik sinirleri yayılması kornea dokusu mühendislik yapıları2,3içinde tanıtmak için yapılmıştır. Ancak, önerilen 3D vitro hücre yapıları istenen doku işlevselliği elde etmek için hedef doku taklit.
Diyabetik keratopathy nöronal kusurları nedeniyle burada açıklanan model için bariz bir uygulama olmakla birlikte, Keratokonus ve Fuchs dystrophies de dahil olmak üzere bir insan vitro modelinden yararlanabilir birçok kornea hastalıkları vardır. Bizim 3D modeli bu umudu ortaya çıkar ve vitro gösterilişinin ilaç dağıtım değerlendirmek için kornea dokusunun ve Emanet yeni oküler ilaçların geliştirilmesi öneriyor.

<table><tbody><tr><td>Sağlıklı kornea dokusu</td><td>NDRI</td><td></td><td>Oküler travma veya sistemik hastalığı olmayan donörlerden alınan örnekler</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Çözelti (1X)</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Steril forseps</td><td>Fischer Scientific</td><td>13-812-42</td><td>Fisherbrand Diseksiyon Ekstra İnce Sivri Kıymık Forseps</td></tr><tr><td>Tek kenarlı tıraş bıçağı</td><td>Personna</td><td>270100</td><td></td></tr><tr><td>Steril cerrahi neşter bıçakları No.10</td><td>Tüy Cerrahi Bıçak</td><td>2976#10</td><td></td></tr><tr><td>Eagle' s Minimum Esansiyel Orta ATCC</td><td></td><td>30-2003</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır</td><td>Serumu Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td>Besiyerin hazırlanması için %10 FBS gereklidir</td></tr><tr><td>Antibiyotik-Antimikotik (100X)</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>Besiyeri hazırlamak için %1 Antibiyotik-Antimikotik gereklidir</td></tr><tr><td>%0,05 Tripsin EDTA(1X)</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>0.4-&mu ile polikarbonat membran ekler; m gözenekler</td><td>Corning Costar</td><td>3412</td><td></td></tr><tr><td>2-O-&alfa;-Dglukopiranosil-L-askorbik asit (C Vitamini)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SMB00390-14</td><td>Çalışma için 0,5 mM'lik bir konsantrasyon kullanılmalıdır</td></tr><tr><td>Balmumu bloğu</td><td>VWR</td><td>50-949-027</td><td></td></tr><tr><td>SH-SY5Y Nöroblastom hücreleri</td><td>ATCC</td><td>SHSY5YATCC CRL-2266</td><td></td></tr><tr><td>Retinoik Asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SRP3014-10UG</td><td>10uM'lik nihai konsantrasyon kullanılmalıdır</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625-100MG</td><td>2nM'lik nihai konsantrasyon kullanılmalıdır</td></tr><tr><td>Dimetil Sülfoksit (DMSO)</td> <td>VWR-Alfa Aesar</td><td>67-68-5</td><td>Ultra Saf Derece-Steril DMSO</td></tr> kullanılacak <tr><td>Thermo Scientific Nunc Hücre Kültürü İşlem Görmüş EasYFlask (T25)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>12-565-351</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nunc Hücre Kültürü İşlem Görmüş EasYFlask (T75)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-349</td><td></td></tr></tbody></table>

kornea doku mühendisliği: İnsan kornea sinir stromal etkileşimlerin bir vitro modeli

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

Doku Mühendisliği ile yaklaşık 10 milyon kişi kornea vizyon kaybı1ile acı dünya çapında insan kornea replasmanları için yüksek talep nedeniyle önemli tanıma kazanmıştır. Uygun insan kornealar, üç boyutlu (3D) doku içinde önemli bir ilerleme için talep adrese Mühendisliği2,3,4yapılmıştır. Bu kornea modelleri arasında değişir basit monolayer sistemleri çok katmanlı modelleri, 3D tam-kalınlık kornea eşdeğerleri2' ye lider.
Ancak, çok katmanlı 3D kornea dokusu yapı, fonksiyon ve farklı hücre türleri (örneğin, sinir, ağ için tarihi yoksun benzerlik için bir 3D doku Mühendisliği kornea vitro hastalık modelleri bağlamında kullanımı eğitimi epitel, stroma ve endotel)2,3. Buna ek olarak, talep vitro kornea dokusu modelleri için bir girişim için eczacılık ürünleri hayvan test azaltmak için artmıştır. Böylece, daha gelişmiş modeller daha iyi sistemleri insan fizyolojik gereksinimleri için maç için gerekli olan ve daha çok hasta popülasyona ilgili bir model geliştirilmesi kesinlikle gereklidir. Birden fazla hücre türü kornea hastalıkları ve dystrophies, Keratokonus, diyabetik Keratopathy ve Fuchs, gibi etkilenir verilen bu birincil insan kornea fibroblastlar (HCFs) sağlıklı bağış ve neurons 3D ortak kültür modeli bu modeli içerir SH-SY5Y hücre satırı. Bu bizim için ilk kez insan kornea dokusu içinde iki hücre tipleri arasındaki etkileşimler araştırmak için izin verir. Biz bu model potansiyel sinir hasar oluşturan kornea hastalıkları sinir stromal etkileşimleri ile ilgili temel mekanizmaları incelemek inanıyoruz. Bu 3D model kornea dokusu içinde vivo temel anatomik ve fizyolojik doğasını yansıtır ve gelecekte kornea kusurları araştıran yanı sıra çeşitli ajanların etkinliği hayvan test etmeden önce eleme için bir araç olarak kullanılabilir.

Şekil 1 çalışma 3D vitro modeli hakkında adım adım bir temsilcisi görüntüdür. İlk adımda, insan kornealar izole hücrelerdir. O zaman, onlar bir polikarbonat membran üzerinde yetiştirilen ve kendini salgılanan 3D matris montajı için C vitamini ile uyarılmış. Bu 3D yapı sistemi çok katmanlı bir hücresel vivo içindesentezi indükler-stromal matris gibi. Bundan sonra Nöroblastom hücreleri nöronal hücre farklılaşması başlatarak takip stromal hücre...

Bu iletişim kuralı muayene ve etkileşimleri iki hücre tiplerinin anlayış yardımcı olmak için nerede kornea stromal hücreler ve farklılaştırılmış nöronal hücre birlikte kültürlü bir roman üç boyutlu vitro modeli, açıklar.

Kornea doku Mühendisliği: İnsan kornea sinir Stromal etkileşimlerin bir Vitro modeli

Tissue engineering has gained substantial recognition due to the high demand for human cornea replacements with an estimated 10 million people worldwide ...

Bu protokolün genel amacı, insan kornea stromal hücreleri ile nöronal hücreler arasındaki hücresel etkileşimleri doğal hücre dışı matrislerinde araştırmaktır. Protokol, keratokonus, diyabetik keratopati ve Fuchs distrofisi gibi kornea hastalıkları ve distrofilerini incelemek için genişletilebilir. Bu yöntem, belirli bir kornea hastalığı veya distrofisi sırasında stroma sinir etkileşimlerinin altında yatan mekanizmaları ve kusurları belirleyerek insan kornea biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bu tekniğin ana avantajı, hücrelerin in vitro olarak gerçek insan kornea dokusunun daha iyi ve daha doğru bir modelini sağlayan in vitro olarak kendi hücre dışı matrislerini salgılamalarına izin verilmesidir. Bu tekniğin etkileri kornea hastalıklarının tedavisine kadar uzanır, çünkü hücre-hücre ve hücre dışı matriks etkileşimlerinin değerlendirilmesi kornea dokusunun doğru bir şekilde temsil edilmesini sağlayacak ve daha hedefli ilaç geliştirilmesine izin verecektir. Şimdi, bu yöntem kornea siniri hasarı ve rejenerasyonu hakkında bilgi sağlayabilir.İlaç taraması ve geliştirme gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. İnsan kornea dokusu örneklerini aldıktan sonra, dokuları iki mililitre steril Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin içeren 21,5 santimetre karelik bir tabağa aktarın. Kornea kubbesini yüzü yukarı bakacak şekilde konumlandırın ve epitel tabakasını kazımak için 45 derecelik bir açıyla bir tıraş bıçağı kullanın.Ardından, kornea kubbesini yüzü aşağı bakacak şekilde çevirin ve endotelyumu stromadan iyice kazıyın. Stromal dokuyu DPBS ile yıkayın. Stromal parçaları DPBS ile ıslak tutun ve stromal dokuları küçük parçalara ayırmak için 10 numara cerrahi bıçak kullanın.Stromal parçaları ortam içermeyen bir T25 kültür şişesine aktarmak için steril forseps kullanın. Eksplantların şişenin dibine 37 santigrat derecede yaklaşık 30 ila 40 dakika yapışmasına izin verin. Stromal dokuyu hassas bir şekilde kestikten sonra, şişeyi dikkatlice inkübatöre aktarın.30 ila 40 dakika beklemek ve ardından medyayı yavaşça eklemek önemlidir. Bu adım, eksplantların tam olarak yapışmasını sağlamak ve ayrılmalarını önlemek için kritik öneme sahiptir. Yapıştırıldıktan sonra, eksplantları rahatsız etmeden şişeye %10 fetal sığır serumu ve %1 antibiyotik-antimikotik içeren Eagle's Minimum Essential Medium'u yavaşça ekleyin.Şişeyi yavaşça 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit ile inkübatöre yerleştirin. Hücreler şişede izole olmaya ve göç etmeye başlayana kadar eksplantları rahatsız etmeden bırakın. Yaklaşık iki ila dört hafta sonra, hücreler% 100 birleşmeye ulaşmalıdır.% 100 birleştikten sonra, doku kültürü ortamını çıkararak ve hücreleri DPBS ile yıkayarak hücreleri geçirin. Hücrelere tripsin ekleyin ve ardından 37 santigrat derecede inkübe edin. Yaklaşık beş dakika sonra, ayrıldıklarını doğrulamak için hücreleri bir ışık mikroskobu altında görüntüleyin.Taze ortam ekleyerek proteolizi durdurun ve hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Hücreleri peletlemek için tüpleri 1000 x g'da santrifüjleyin. Peleti rahatsız etmeden süpernatanı dikkatlice çıkarın ve hücreleri taze ortamda askıya alın.Bir hücre sayımı yaptıktan sonra, daha fazla genişleme için taze ortam ile T75 kültür şişesindeki altı hücreye yaklaşık bir kez 10 kez tohumlayın. 3D yapıyı monte etmek için, önce insan kornea fibroblastlarını geçirin ve sayın, ardından 0.4 mikron gözenekli bir polikarbonat membran ekine yaklaşık bir kez 10 ila altı HCF'yi tohumlayın. Yapının üstüne 1,5 mililitre taze ortam ekleyin.Ardından, her yapının altına aynı ortamdan 1,5 mililitre daha pipetleyin. 24 saat sonra, her yapının üstüne ve altına 0,5 milimolar C vitamini ile desteklenmiş 1,5 mililitre orta ekleyin. Üç hafta boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin ve her gün C vitamini içeren taze ortam ekleyin.Bu, hücreleri kendi hücre dışı matrislerini salgılamaları ve bir araya getirmeleri için uyaracaktır. Üç hafta sonra, önceden monte edilmiş 3D yapıların üstüne üçüncü SH-SY5Y insan nöroblastom hücrelerine sekiz kez 10 ekleyin. Bu adımda tam hücre sayısını hesaplamak ve hücre farklılaşmasına başlamadan önce 24 saat beklemek çok önemlidir.24 saatlik inkübasyondan sonra, hücreleri %10 FBS ve 10 mikromolar retinoik asit içeren 1.5 mililitre EMEM ile uyararak SH-SY5Y hücre farklılaşmasını başlatın. Daha sonra yapının altına 1.5 mililitre C vitamini içeren ortam ekleyin. Retinoik asit ışığa duyarlıdır, bu nedenle bu adım karanlıkta yapılmalıdır.Beş gün sonra, hücreler farklılaşma aşamasına ulaştığında, yapının üstüne iki nanomolar BDNF ve% 1 antibiyotik-antimikotik içeren 1.5 mililitre serum içermeyen ortam ekleyin. Yapının altına taze C vitamini takviyeli ortam ekleyin. Daha fazla analiz için işlemeden önce hücreleri iki gün daha kültürleyin.Bu, polikarbonat membranı ve üstte oturan kornea stromal hücrelerini gösteren 3D kendinden montajlı yapının yüksek büyütmeli bir transmisyon elektron mikroskobu görüntüsüdür. Bu görüntü, üstte oturan ve stromal-nöronal hücre düzenlemesi sergileyen farklılaşmış nöronal hücreleri göstermektedir. Resimdeki oklar nöronal hücreleri göstermektedir.Bu prosedürü denerken, eksplantları keserken kornea dokusunu her zaman ıslak tutmayı ve cerrahi aletleri ve bıçakları steril tutmayı unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, insan kornea stromal hücreleri ile nöronal hücreler arasındaki hücre etkileşimlerini doğal hücre dışı matrislerinde araştırmak için bu in vitro modelin nasıl kurulacağını ve kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız. BDNF, retinoik asit ve cerrahi bıçaklarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü uygularken her zaman uygun koruyucu giysi giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.

corneal-tissue-engineering-an-vitro-model-stromal-nerve-interactions

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu video, birincil insan kornea fibroblastları ve farklılaşmış nöronal hücrelerden oluşan üç boyutlu bir ko-kültür model sistemi oluşturma tekniğini göstermektedir. Bu ko-kültür sistemi, stromal-sinir etkileşimlerini incelemek için kullanılabilir.

İnsan Kornea Fibroblastları ve Nöronlarının 3 Boyutlu Ko-Kültür Modelinin Oluşturulması

Biz hücre davranışlarını incelemek için hangi electrospun zarlar içinde mikrocepler imalatı için bir teknik rapor. Özellikle, PLGA (poli (laktid-ko-glikolid)) microfeatures ile donatılmış kornea biyomalzeme cihazların üretimi için microstereolithography ve üretebilmektedir bir kombinasyonunu tarif eder.

Microstereolithography ve ELEKTROÜRETİM kombinasyonu Kornea Yenilenme Nişli ile donatılmış Membranlarını Üretiliyor

sığır endotel hücrelerinin ana bir kültürü kornea endotelial-mezenkimal geçiş mekanizmasını araştırmak için kullanıldı. Ayrıca, bir fare endotel cryoinjury modeli in vivo olarak endotel-mezenkimal geçiş göstermek için kullanılmıştır.

Vitro ve in vivo Modelleri Kornea Endotel-mezenkimal Geçiş Çalışması için

Eski bir protokol vivo kornea organ kültür model çalışmaları şifa yara açıklanan için yararlı. Bu modeli sistem rejeneratif iyileşmesine katkıda bulunmak üzere ajanlar veya ilaç toksisitesi organize 3D çok hücreli ortamında etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir.

Ex vivo kornea Organ kültür modeli için yaranın çalışmaları

Burada domuz eti bölünmüş kornea düğmelerinin hazırlanması ve yetiştirilmesi için adım adım bir protokol sunulmuştur. Bu organo-tipik ekili organ kültürü modeli 15 gün içinde hücre ölüm oranlarını gösterir gibi, insan donör kornea karşılaştırılabilir, toksik dekstran eklemeden insan dışı kornea uzun vadeli ekimi sağlayan ilk modeli temsil eder.

Split Korneal Düğmeleri Kullanarak Bir Domuz Korneal Endotel Organ Kültür Modeli

Burada kornea endotel hücrelerinin (MSK) neodimyum kullanarak Descemet zarından (DM) ayrılması için bir protokol sunuyoruz:YAG (Nd:YAG) lazer, büllöz keratopati (BK) için eksvivo hastalık modeli olarak.

Kornea Endotel Hücre Kaybının Noninvaziv, Lazer Destekli Deneysel Modelinin Geliştirilmesi

Bu protokol, insan veya koyun dokusu eksbitkilerinden kornea endotel hücre kültürleri kurmak ve büyümek için gerekli kritik adımları açıklar. Membranöz biyomalzemeler üzerinde kornea endotel hücrelerinin subculturing için bir yöntem de sunulmaktadır.

Biyomalzeme Membranlar Üzerinde İnsan ve Koyun Korneal Endotel Hücre Tabakalarının Büyümesi

Burada, kornea epitelinin mekanik ve kimyasal hasarı için fare ve tavşana dayalı hayvan modelleri, yeni terapötikleri ve altta yatan mekanizmayı taramak için geliştirilmiştir.

Kornea Epitelinin Mekanik ve Kimyasal Yaralanmaları için Ex Vivo ve In Vivo Hayvan Modelleri

Descemet's Stripping Only, Fuchs Endotelyal Kornea Distrofisinden kaynaklanan merkezi kornea guttası olan hastalarda, periferik hücrelerin endotel tabakasını yenilemesi için Descemet'in zarının sıyrıldığı deneysel bir prosedürdür. Bu yazıda, eFGF1 (NM141) tarafından uyarılan hızlandırılmış iyileşme ile distrofik insan kornealarında ex vivo'da DSO'yu simüle eden yeni metodoloji sunulmaktadır.

Descemet'in Sadece Mühendislik Fibroblast Büyüme Faktörü 1 Tarafından Uyarılan Hızlandırılmış İyileşme ile Sıyırılmasının İnsan Kornea Organ Kültürü Modeli

Mevcut protokol, ovo'daki embriyonik bir civcivin korneasının yaralanmasında yer alan farklı adımları göstermektedir. Rejenere veya tamamen restore edilmiş kornealar, yaralama prosedürünü takiben çeşitli hücresel ve moleküler teknikler kullanılarak rejeneratif potansiyel açısından analiz edilebilir.

Embriyonik Yaralı Civciv Kornealarında İzsiz Doku Rejenerasyonunun İncelenmesi

Burada, korneayı innerve eden duyu liflerine zarar vermek için üç farklı yöntem öneriyoruz. Bu yöntemler, farelerde akson rejenerasyonunun incelenmesini kolaylaştırır. Diğer hayvan modellerine uyarlanabilen bu üç yöntem, kornea innervasyon fizyolojisi ve rejenerasyonunun incelenmesi için idealdir.

Murin Korneasında Nörotrofik Keratit ve Sinir Rejenerasyonunu İndüklemek için Üç Strateji

Keşfedin, korneal stromal hücreler ve nöronal hücreler arasındaki hücre etkileşimlerini doğal ekstraselüler matriste incelemek için üç boyutlu bir in vitro model. Bu yöntem, korneal sinir hasarı ve rejenerasyonu hakkında bilgi sağlar.

Kornea doku Mühendisliği: İnsan kornea sinir Stromal etkileşimlerin bir Vitro modeli

Daha fazla video keşfet