Mitokondri zar potansiyeli CLIC4 nakavt kaynaklı HN4 hücre Apoptosis Vitro çalışma tespiti

Bu yöntem, apoptoz ve mitokondri disfonksiyonunun anlaşılması da dahil olmak üzere sitobiyolojik alandaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, araştırmacıların tek bir hücre içinde rodamin-123 aracılığıyla mitokondri zarı potansiyelinin gerçek zamanlı izlenmesini kolayca ve düzgün bir şekilde gerçekleştirebilmeleridir. Metin protokolünde tarif edildiği gibi baş ve boyun hücreli skuamöz karsinomdan bir HN4 hücre hattı kültürü.

Transfeksiyondan bir gün önce, altı oyuklu plakalarda antibiyotiksiz kültür ortamı başına iki mililitrede 0.5 milyon hücre plakalayın. 100 pikomol CLIC4 küçük enterferans yapan RNA veya karıştırılmış küçük enterferans yapan RNA'yı 250 mikrolitre indirgenmiş serum ortamında hafifçe seyreltin. Daha sonra beş mikrolitre lipozom reaktifini 250 mikrolitre indirgenmiş serum ortamında seyreltin ve beş dakika inkübe edin.

Seyreltilmiş küçük enterferans yapan RNA'yı seyreltilmiş lipozom reaktifi ile birleştirin ve hafifçe karıştırın. Karışımı, ortadaki hücreleri içeren her bir kuyucuğa ekleyin. Plakayı ileri geri sallayarak hafifçe karıştırın.

Hücreleri bir CO2 inkübatörde 37 santigrat derecede inkübe edin. Transfeksiyondan dört saat sonra ortamı normal büyüme ortamı ile değiştirin. Rodamin-123 etiketleme prosedürüne devam etmeden önce hücreleri 20 saat daha inkübe etmeye devam edin.

Altı oyuklu plakalarda HN4 hücrelerinin CLIC4 küçük enterferans yapan RNA işleminden sonra, yeni 12 oyuklu plakaların altına dairesel lameller koymak için cımbız kullanın. 12 oyuklu plakaların içindeki her bir lamel ortasına mililitre polilisin başına 150 mikrolitre 100 mikrogram pipetleyin. İki dakika sonra, polilizini pipetleyici ile iyice çıkarın.

Daha sonra, tabağın içindeki HN4 hücrelerinin kültür ortamını çıkarın ve hücreleri ayırmak için bir mililitre% 0.25 tripsin ekleyin. Altı dakika sonra, tripsini nötralize etmek için iki mililitre kültür ortamı ekleyin. HN4 hücrelerini pipetleyici ile beş kez nazikçe karıştırın ve hücreleri dairesel lameller üzerine tohumlayın.

Hücreleri% 5 CO2 ile 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin. Sekiz saatlik inkübasyondan sonra, litre rodamin-123 başına iki mikromol ekleyin ve ortamda eşit dağılımı sağlamak için ortamı birkaç kez yukarı ve aşağı hafifçe karıştırın. HN4 hücrelerini 37 santigrat derecede 40 dakika inkübe edin.

Lamelleri çıkarmak için cımbız kullanın ve kalan sıvıyı yıkamak için önceden ısıtılmış NPSS tamponuna kısa bir süre aktarın. Lamelleri, bir O-ring ile yerine kapatılmış, değiştirilebilir 25 milimetre cam lamel tabanı ile 500 mikrolitrelik paslanmaz çelik haznenin altına yerleştirin. Haznenin kapağını sıkarak lamelleri yerine sabitleyin.

Monte edilen hazneye 450 mikrolitre önceden ısıtılmış NPSS tamponu ekleyin. Ardından banyoyu floresan mikroskobunun veya konfokal lazer taramalı floresan mikroskobunun görüş alanının altına yerleştirin. Üreticinin talimatlarını izleyerek floresan mikroskobunu açın.

Görüntüleme sistemi yazılımını açın ve yeni bir deney başlatmak için komut çubuğundan yeni düğmesini seçin. Beyaz ışıktaki hücrelerin konumunu bulmak için görsel alanı ayarlayın ve odaklanın. Ardından ışığı kapatın ve beyaz ışığı kapatmak için düğmeye basın.

Komut çubuğundan odak düğmesine tıklayın ve floresansı açmak için odaklamayı başlat'ı seçin. 507 nanometre uyarma ve 529 nanometre uzun geçiren emisyon dalga boyu ile mikroskop aracılığıyla hücrelerin yerini tekrar bulun. Görme alanını ayarlayın ve gerekirse tekrar odaklanın.

Yalnızca 20 ila 30 ayrı HN4 hücresi içeren bir görsel alan seçin. Net bir görüş alanı elde edildiğinde, odak çubuğundan yakın odaklamaya tıklayın. Ardından, bir dizi görüntü almak için komut çubuğundan bir tane al'ı tıklayın.

Ardından, komut çubuğundan bölgelere tıklayın ve ölçüm bölgelerini düzenlemek için Tamam düğmesine tıklayın. Tek tek hücrelerin farklı şekillerine sığdırmak için, izleme bölgesi aracını seçin. Tek bir hücrenin bölgesini daire içine alın ve işiniz bittiğinde çift tıklayın.

Tüm hücreler daire içine alınana kadar işlemi tekrarlayın. Bitti'yi tıklayın ve kaydedilen konumu bulmak için görüntüleri kaydet'i seçin. Sıfır saatine tıklayın ve floresan yoğunluğunun değişimini izlemeye başlamak için hızlıca F4 tuşuna basın.

Floresan yoğunluğunun gerçek zamanlı değişimini beş dakika boyunca her beş saniyede bir kaydedin. Taban çizgisi stabil hale geldiğinde, litre başına 0,5 mikrolitre 100 milimol ATP ile karıştırılmış 50 mikrolitre NPSS'yi pipetleyici aracılığıyla hazneye ekleyin. Üreticinin talimatlarını izleyerek konfokal lazer taramalı floresan mikroskobunu açın ve birlikte verilen yazılımı açın.

63X 1.4 sayısal diyafram açıklığına sahip yağ objektifi lensini seçmek için edinme menüsü altındaki objektife tıklayın. Numuneyi gözlemleyin ve ışık alanının altında net bir görme alanı bulun. Floresan moduna geçmek için ışık seçim düğmesine basın ve mikroskop aracılığıyla hücrenin karanlıktaki konumunu bulmak için doğru floresan filtrelerini seçin.

Gözlem bittiğinde numuneyi korumak için deklanşöre basın. Edinme menüsü altında, uygun PMT kanalını ayarlayın ve yerleşik optik yolu etkinleştirmek için elde et'e tıklayın. Konfigürasyon menüsüne tıklayın ve gerekli lazer tipini belirlemek için lazeri seçin.

Gerçek zamanlı görüntüler elde etmek için canlı yayına tıklayın ve görsel alanın yalnızca 20 ila 30 ayrı HN4 hücresi içerdiğinden emin olun. Ardından, edinme menüsünün altındaki edinme alt menüsündeki alım modunda XYT'yi seçin. Zaman aralığı için beş saniye ve süre için 20 dakika ayarlayın.

Tüm parametreler ayarlandığında uygula'ya tıklayın. Niceleme menüsünün altında, her hücrenin kayıt alanını daire içine almak için çoklu çizgi çizme aracını kullanın. Çizgi profilini seçin ve gözlem yapmak için başlat'ı seçin.

Floresan yoğunluğunun gerçek zamanlı değişimini beş dakika boyunca kaydedin. Taban çizgisi stabil hale geldiğinde, bir pipetleyici aracılığıyla hazneye litre ATP başına 0,5 mikrolitre 100 milimol ile karıştırılmış 50 mikrolitre NPSS ekleyin. Yaygın bir floresan mikroskobu kullanarak istatistiksel analiz yapmak için, görüntüleme sistemi yazılımını açın ve kaydedilmiş bir deneyi açmak için komut çubuğundan aç düğmesini seçin.

Komut çubuğundan bölgelere tıklayın ve ölçüm bölgelerini düzenlemek için Tamam düğmesine tıklayın. İzleme bölgesi aracını seçin. Tek bir hücrenin bölgesini daire içine alın ve bittiğinde çift tıklayın.

Tüm hücreler daire içine alınana kadar işlemi tekrarlayın. Bitti'ye tıklayın ve floresan yoğunluğunu gösteren bir iz elde etmek için F4 ileri düğmesini seçin. Bitirdikten sonra, grafiğin sağ alt köşesinde bulunan aşağı ok düğmesine tıklayın ve grafik verilerini göster'e tıklayın.

İki kez Tamam'a tıklayın ve veri işleme yazılımının arayüzünü açmak için günlük verileri düğmesini seçin. Ardından, elektronik tabloda görünen gerçek zamanlı floresan yoğunluğu dalgalanma kayıtlarını bulmak için günlük verilerini tekrar tıklayın. Burada, yaygın floresan mikroskobu ile çözüldüğü gibi, farklı müdahaleler altında HN4 hücresinde ATP'nin neden olduğu mitokondriyal depolarizasyon değişikliklerini gösteren temsili sonuçlar gösterilmiştir.

Mitokondriyal membran depolarizasyonu ATP tedavisini takiben hızla artmış ve her iki grupta da yavaş yavaş normal seviyeye geri dönmüştür. Rodamin-123 floresan yoğunluğunun temsili izleri, CLIC4 küçük enterferans yapan RNA'nın MMP tedavisinin, kontrol grubuna kıyasla mitokondriyal depolarizasyonu arttırdığını göstermektedir. Temsili bir histogram ayrıca, CLIC4'ün yıkılmasının, kontrol grubuna kıyasla mitokondriyal depolarizasyonu arttırdığını ortaya koydu.

Burada, temsili konfokal lazer tarama mikroskobu sonuçları, farklı müdahaleler altında HN4 hücresinde ATP'nin neden olduğu mitokondriyal depolarizasyon değişikliklerini de göstermektedir. Mitokondriyal membran depolarizasyonu ATP tedavisini takiben hızla artar ve her iki grupta da yavaş yavaş normal seviyeye geri döner. Rodamin-123 floresan yoğunluğunun temsili izleri, CLIC4 küçük enterferans yapan RNA'nın MMP tedavisinin, kontrol grubuna kıyasla mitokondriyal depolarizasyonu arttırdığını göstermektedir.

Benzer şekilde, temsili histogram ayrıca, CLIC4'ün yıkılmasının, kontrol grubuna kıyasla mitokondriyal depolarizasyonu arttırdığını ortaya koydu. Bu videoyu izledikten sonra, hem normal floresan mikroskobu hem de konfokal lazer tarama mikroskobu ile mitokondriyal membran potansiyelinin gerçek zamanlı izlenmesini sağlamak için rodamin-123'ün nasıl kullanılacağını daha iyi anlayacaksınız. Bir kez ustalaştıktan sonra, rodamin-123 ile yapılan bu mikroskopi tekniği, uygun şekilde yapılırsa bir numune için 20 dakikadan daha kısa sürede yapılabilir.

Bu işlemi denerken, tarama işlemini beklerken enjeksiyon ile herhangi bir temas etmemeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, apoptoz veya nekrozun meydana gelip gelmediği gibi daha fazla soruyu cevaplamak için Western Blot ve akış sitometrisi gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, canlı bilim alanındaki araştırmacıların mitokondriyal disfonksiyonu keşfetmelerinin ve çeşitli canlı hücrelerde hücre apoptozu için sağlam kanıtlar bulmalarının yolunu açtı.

Rodamin-123 ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman eldiven ve yüz maskesi takmak gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.