Name: Mitokondri zar potansiyeli CLIC4 nakavt kaynaklı HN4 hücre Apoptosis Vitro çalışma tespiti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 20 s
Description: Öğrenin, HN4 hücrelerinde CLIC4 nakavt kaynaklı apoptozu incelemek için rodamin 123 kullanarak mitokondri zar potansiyelini gerçek zamanlı izleme yöntemini. Bu teknik, kanser biyolojisinde mitokondri disfonksiyonu araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Lütfen Bay Chao Fang hücre kültürü için teşekkür ederiz. Bu eser hibe Çin doğal Bilim Vakfı (Grant No 81570403, 81371284); tarafından desteklenen Anhui il doğal Bilim Vakfı (Grant No. 1408085MH158); Anhui Tıp Üniversitesi üstün genç araştırmacı; Program Anhui eyaleti üniversitelerde mükemmel genç yetenekleri için destek.

1. hücre kültür ve Transfection
<ol><li>
Hücre kültürü Not: Hastaların HNSCC14ile HN4, bir HNSCC hücre kültürünü türetilmiştir.<ol>
<li>Dulbecco'nın kültür HN4 hücrelerde % 10 fetal Sığır serum ve antibiyotik (100 U/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin) ile desteklenmiş kartal Orta (DMEM, 4,5 g/M glikoz) değiştiren. Hücreleri % 5 CO237 ° C'de kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hücre transfection
	<ol>
<li>Bir gün önce transfection, 5 x 105 hücreleri 2 mL/kültür ortamının de antibiyotik 6-şey plakaları olmadan plaka.</li>
		<li>Yavaşça 100 pmol CLIC4 siRNA veya düşük serum medya, 250 µL şifreli SiRNA oranında seyreltin. 5 µL lipozom reaktif düşük serum medya 250 µL sulandırmak ve 5 dk. birleştirmek ile seyreltilmiş lipozom reaktif seyreltilmiş siRNA kuluçkaya, karışımı yavaşça ve oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya.</li>
		<li>Karışımı her de içeren hücreleri ve orta ekleyin. Karışımı yavaşça ileri geri plaka Rock yaparak. CO2 kuluçka Rh123 etiketleme yordamını işlemine devam etmeden önce 24 h 37 ° C'de hücreler kuluçkaya. Orta transfection sonra normal büyüme orta 4 h ile değiştirin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Rh123 etiketleme
Not: Rh123 HN4 hücreleri1MMP ölçmek için kullanılmıştır.
<ol><li>CLIC4 siRNA tedavi (Bölüm 1) sonra 6-şey plakaları HN4 hücrelerinde aşağıdaki tedavisi için kullanın. Her HN4 hücrelere miktarı de denemeyi 10 kez coverslips tekrarlamak için yeterlidir.</li>
	<li>Dairesel coverslips yeni 12-şey tabak dibinde koymak için cımbız kullanın. Plaka sayısı deneysel tasarım (Şekil 1A) göre ayarlanmıştır.</li>
	<li>12-şey tabak içinde her coverslip ortasında 100 µg/mL polylysine 150 µL koyun ve 2 dk. polylysine coverslips dışında koymak için dikkat bekleyin. Polylysine pipettor tarafından iyice Kaldır (Şekil 1B).</li>
	<li>Kültür orta çanağı içinde HN4 hücrelerinin kaldırın ve 1 mL % 0.25 tripsin hücreleri ayırmak için ekleyin. 6 dakika sonra 2 mL kültür orta tripsin nötralize etmek için ekleyin. HN4 hücreleri pipettor tarafından 5 kez ve tohum 2-6 х için 104 hücreleri üzerinde dairesel coverslips karışımı yavaşça. Kuluçka 37 ° c % 5 CO2 (Şekil 1C) yerleştirin.</li>
	<li>8 h kuluçka sonra 2 µmol/L Rh123 40 dk 37 ° C'de HN4 hücrelerle kuluçkaya Rh123 eşit dağılımı (Şekil 1D) ortamda sağlamak için orta alçalarak birkaç kez karışımı yavaşça.</li>
	<li>Hazırlamak yeterli normal fizyolojik serum çözüm (NPSS); NPSS (mmol/L) yapmak için: 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, 10 glikoz ve 5 HEPES, pH 7,4). Bir su banyosu içinde 37 ° c onceden.</li>
	<li>Coverslips kaldırıp kalan yıkamak için cımbız kullanın kısaca yerleştirerek coverslips onceden NPBS belleğe (Şekil 1E) yolu ile sıvı.</li>
	<li>Coverslips 500 µL paslanmaz çelik odası dibinde yerleştirin (bkz. Tablo reçetesi) ile değiştirilebilir 25 mm cam coverslip alt kapalı yerinde bir o-ring tarafından. Odası (Şekil 1E) kapak sıkma tarafından tamir.</li>
	<li>450 µL monte odası NPSS arabelleğe ısıtılmış ve floresan mikroskop veya floresan mikroskop (Şekil 1E) tarama confocal lazer görme alanı altında banyo koymak ekleyin.</li>
</ol>3. MMP tespiti
<ol><li>
Ortak floresans mikroskobu
	<ol>
<li>Üreticinin yönergelerini izleyerek floresan mikroskop açın. Not: Bir civa lamba fiberoptik ışık kaynağı, Rh123 için ayarla FITC filtre ile ortak floresan mikroskop gerçekleştirilmiştir (480/40 uyarma filtre, 505 LP Dikroik ayna ve 535/40 emisyon filtre) Oda sıcaklığında. 20 X amaç canlı hücre görüntüleme gerçekleştirmek için kullanıldı.</li>
		<li>Görüntüleme sistemi yazılımı açın ve yeni bir deneme (Şekil 2A) başlamak için komut çubuğundan "Yeni" düğmesini seçin.</li>
		<li>Görme alanı ve beyaz ışık hücreleri konumunu bulmak için odağı ayarlayın.</li>
		<li>Işıkları kapat ve beyaz ışık kapatmak için düğmeye bas. Komut çubuğunu "Focus" düğmesine basın ve "Start floresans üzerinde geçmek için odaklanan" seçin. Hücreleri tekrar yolu ile mikroskop 507 nm uyarma ve 529 nm uzun pası emisyon konumunu bulmak dalga boyu (deneme önce Set). Görme alanı ve odak (Şekil 2B) gerekirse yeniden ayarlayın.</li>
		<li>Sadece 20-30 ayrı HN4 hücreleri içeren bir görme alanı seçin. Değiştir hücre içi floresans sinyalinin her hücre için doğru bir şekilde kaydedilir.</li>
		<li>Net görme alanı elde sonra odak çubuğundan "odaklanan yakın"'ı tıklatın. "Alma bir" görüntüleri bir dizi elde etmek için komut çubuğunda seçeneğini tıklatın. "Bölgeler" komut çubuğunu tıklatın ve ölçüm bölgeleri düzenlemek için "Tamam" düğmesini tıklatın. Not: Bölge Düzenle çubuğu'ndan çalışma bağlı olarak farklı bölge şekiller kullanılabilir.</li>
		<li>Tek tek hücreler için farklı şekiller sığdırmak için "İzleme bölgesi" aracını seçin ve bir tek hücre bölge daire ve çift tıkırtı ne zaman tamamlanmak. Tüm hücreleri yordamı (Şekil 2C) Daire yineleyin. "Bitti"'yi tıklatın ve kaydedilmiş konumu bulmak için "görüntüleri Kaydet" seçin.</li>
		<li>Tıklayın "Zeroclock"ve hızlı bir şekilde floresan yoğunluğu değişiklik izlemeye başlamak için F4'e basın. Gerçek zamanlı kayıt değiştirmek floresan yoğunluğu bir kez her 5 s 5 min (Şekil 2D) için.</li>
		<li>Temel istikrarlı olur, 50 ekleyin µL NPSS 100 mmol/l ATP odasına pipettor üzerinden 0.5 µL ile karışık. Görme alanı (Şekil 2E) kaldırma önlemek için odası hatırlıyorum. Not: Floresan görüntü için 20 dk kaydedilir ve sonra deneme el ile işlem sonunda olabilir. Bekleme süresi rutin için 20 dk tüm incelemek için yerleşmiş floresans değiştir. Ancak, beklenmedik etkileri eğrinin veya tüm süreç az 20 dk sürer istikrar etkisi yakalamayı durdurmak için el ile işlem uygulanır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Confocal lazer tarama floresans mikroskobu
	<ol>
<li>Üreticinin yönergelerini izleyerek floresans mikroskobu tarama confocal lazer açmak ve bohça bilgisayar yazılımı açın. Not: Burada, Rh123 488 ayarla bir Argon lazer tarafından heyecan duymuştur nm ve verilmiş sinyal 545-700 nm TD488/543/633 filtre uygulanması yoluyla aralığı boyunca kaydedildi.</li>
		<li>63 X seçmek için "Al" menüsünün altında "Objektif" tıklatın / 1.4 N.A. petrol objektif lens. Numune gözlemlemek ve açık bir görme alanı altında ışık alanını bulun.</li>
		<li>Floresans moduna geçirin ve karanlık yolu ile mikroskop altında hücrenin konumu bulmak için doğru floresan filtre seçmek için "TL/IL" düğmeye bas. "Perde" örnek gözlem bittiği zaman korumak için itin.</li>
		<li>"Ele geçirme" menüsünün altındaki uygun Devresel_ödeme kanal ayarlayın ve "elde" kapatılan optik yol (Şekil 3A) etkinleştirmek için tıklatın. "Yapılandırma" menüsünde'i tıklatın ve "lazer" gerekli lazer türünü belirlemek için seçin. "Argon" Bu Protokolü (Şekil 3B) önerilir.</li>
		<li>"Canlı gerçek zamanlı görüntü almak ve görme alanı sadece 20-30 ayrı HN4 hücreler içerdiğinden emin olun"'yı tıklatın. Değiştir hücre içi floresans sinyalinin her hücre için doğru bir şekilde kaydedilir.</li>
		<li>"Xyt" satın alma modunda (Şekil 3C) "Ele geçirme" menüsü altında "Satın alma" alt menüsünde seçin. 5 s ve 20 dk zaman aralığını ve süresi, anılan sıraya göre ayarlayın. Tıkırtı"Uygula" tüm parametreleri ne zaman yerleşti.</li>
		<li>"Sayabilirsiniz" menüsünün altında kayıt alan her hücrenin etrafında dönmeye "Çoklu çizgi çizmek" aracını kullanın. "Line profili" seçin ve "gözlem yapmak Başlat" ı seçin. Floresan yoğunluğu 5 min (Şekil 3D - E) için gerçek zamanlı değişikliği kaydetmek.</li>
		<li>Temel istikrarlı olur, 50 ekleyin µL NPSS 100 mmol/l ATP odasına pipettor üzerinden 0.5 µL ile karışık. Görme alanı kaldırma önlemek için odası hatırlıyorum. Not: Floresan görüntü-ecek var olmak yazmak için 20 min ve o zaman deneme tamamlanır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. istatistiksel analiz
<ol><li>
Ortak floresans mikroskobu
	<ol>
<li>Rutin olarak operatörün el kitabı takip floresan mikroskop açın. Görüntüleme sistemi yazılımı açın ve komut çubuğu'ndan kaydedilen bir deney açmak için "Aç" düğmesini seçin. "Komut çubuğu' dan" bölgeleri "'i tıklatın ve ölçüm bölgeleri düzenlemek için"Tamam"düğmesini tıklatın.</li>
		<li>"İzleme bölgesi" aracını seçin ve bir tek hücre bölge daire ve çift tıkırtı ne zaman bitmiş. Tüm hücreleri daire içine kadar yordamı yineleyin. "Bitti"'yi tıklatın ve seçin "F4: ileri" düğmesi floresan yoğunluğu gösterilen bir izleme elde etmek için.</li>
		<li>Bir kez bitmiş, grafiğin sağ alt köşesinde yer alan aşağı ok düğmesini tıklatın ve "Grafik verileri göster" (Şekil 2F) seçeneğini tıklatın. Tıkırtı "OK" iki kere ve veri işleme yazılım arabirimini açmak için "Özellikler" düğmesini seçin. "Günlük verilerini" yeniden tıklatın ve gerçek zamanlı dalgalanma floresan yoğunluğu kayıtları elektronik tabloda görünür bulmak. Not: her hücre için MMP değişimler floresan yoğunluğu uygulamadan önce ATP veya TG (F1/F0) göreli oranı olarak sergilendi. Her floresan yoğunluğu veri ortalama 20-30 hücre vardı. Ortalama ± SE. 2 grup sonuçlarından bağımsız iki uçlu t testi ve P değeri tarafından test edildi olarak sunulan verilerin Rh123 için < 0,05 istatistiksel anlamlılık olarak kabul. İstatistiksel analiz yazılımı bu deneyde istatistiksel analizler yapmak için uygulandı.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Confocal lazer tarama floresans mikroskobu
	<ol>
<li>Confocal lazer mikroskobunun açmak ve üreticinin yönergeleri izleyerek bohça bilgisayar yazılımı oturum.</li>
		<li>"Yangın" kaydedilen bir deney açmak için seçin.</li>
		<li>"Sayabilirsiniz" menüsü altında "profil yığını" aracını seçin, "Hepsi bir arada" seçim "Sıralama grafikler kanalları ve ROIs."</li>
		<li>"Çiz Çokgen" aracı daire hücre bölgeleri için gözlem için kullanın.</li>
		<li>"Grafik" menüsünü seçin ve farenin sağ düğmesini tıklayın ve "Excel'e aktar" işaretleyin floresan yoğunluğu değerleri bir e-tabloya eklemek için. Aşağıdaki analizi normal floresans mikroskoplar (Şekil 3F) ile tutarlıdır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Chen, J., Liao, W., Gao, W., Huang, J., Gao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermittent+hypoxia+protects+cerebral+mitochondrial+function+from+calcium+overload%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurol+Belg%22%5BJournal%5D)">Intermittent hypoxia protects cerebral mitochondrial function from calcium overload.</a> Acta Neurol Belg. 113, 507-513 (2013).</li>
<li>Gogol, P., Trzcińska, M., Bryła, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motility%2C+mitochondrial+membrane+potential+and+ATP+content+of+rabbit+spermatozoa+stored+in+extender+supplemented+with+GnRH+analogue+%5Bdes-Gly10%2C+D-Ala6%5D-LH-RH+ethylamide%5BTitle%5D)+AND+%22Pol+J+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">Motility, mitochondrial membrane potential and ATP content of rabbit spermatozoa stored in extender supplemented with GnRH analogue [des-Gly10, D-Ala6]-LH-RH ethylamide.</a> Pol J Vet Sci. 17, (2014).</li>
<li>Machiels, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+management+of+squamous+cell+carcinoma+of+the+head+and+neck%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Prime+Rep%22%5BJournal%5D)">Advances in the management of squamous cell carcinoma of the head and neck.</a> F1000Prime Rep. 6, 44(2014).</li>
<li>Behera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+therapy+with+taxane+versus+non-taxane+containing+regimens+in+locally+advanced+squamous+cell+carcinomas+of+the+head+and+neck+%28SCCHN%29%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Oncol%22%5BJournal%5D)">Concurrent therapy with taxane versus non-taxane containing regimens in locally advanced squamous cell carcinomas of the head and neck (SCCHN): a systematic review.</a> Oral Oncol. 50, 888-894 (2014).</li>
<li>Pancari, P., Mehra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+therapy+for+squamous+cell+carcinoma+of+the+head+and+neck%5BTitle%5D)+AND+%22Surgical+Oncology+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Systemic therapy for squamous cell carcinoma of the head and neck.</a> Surgical Oncology Clinics of North America. 24, 437-454 (2015).</li>
<li>Peretti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride+channels+in+cancer%3A+Focus+on+chloride+intracellular+channel+1+and+4+%28CLIC1+AND+CLIC4%29+proteins+in+tumor+development+and+as+novel+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Chloride channels in cancer: Focus on chloride intracellular channel 1 and 4 (CLIC1 AND CLIC4) proteins in tumor development and as novel therapeutic targets.</a> Biochim Biophys Acta. 1848, 2523-2531 (2015).</li>
<li>Jentsch, T. J., Stein, V., Weinreich, F., Zdebik, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structure+and+physiological+function+of+chloride+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular structure and physiological function of chloride channels.</a> Physiol Rev. 82, 503-568 (2002).</li>
<li>Ponnalagu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+supporting+characterization+of+CLIC1%2C+CLIC4%2C+CLIC5+and+DmCLIC+antibodies+and+localization+of+CLICs+in+endoplasmic+reticulum+of+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Data+Brief%22%5BJournal%5D)">Data supporting characterization of CLIC1, CLIC4, CLIC5 and DmCLIC antibodies and localization of CLICs in endoplasmic reticulum of cardiomyocytes.</a> Data Brief. 7, 1038-1044 (2016).</li>
<li>Fernandez-Salas, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mtCLIC%2FCLIC4%2C+an+Organellular+Chloride+Channel+Protein%2C+Is+Increased+by+DNA+Damage+and+Participates+in+the+Apoptotic+Response+to+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">mtCLIC/CLIC4, an Organellular Chloride Channel Protein, Is Increased by DNA Damage and Participates in the Apoptotic Response to p53.</a> Mol Cell Biol. 22, 3610-3620 (2002).</li>
<li>Suh, K. S., Mutoh, M., Gerdes, M., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLIC4%2C+an+intracellular+chloride+channel+protein%2C+is+a+novel+molecular+target+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Derm+Symp+P%22%5BJournal%5D)">CLIC4, an intracellular chloride channel protein, is a novel molecular target for cancer therapy.</a> J Invest Derm Symp P. 10, 105-109 (2005).</li>
<li>Zhong, J., Kong, X., Zhang, H., Yu, C., Xu, Y., Kang, J., Yu, H., Yi, H., Yang, X., Sun, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+CLIC4+Enhances+Autophagy+and+Triggers+Mitochondrial+and+ER+Stress-Induced+Apoptosis+in+Human+Glioma+U251+Cells+under+Starvation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Inhibition of CLIC4 Enhances Autophagy and Triggers Mitochondrial and ER Stress-Induced Apoptosis in Human Glioma U251 Cells under Starvation.</a> PloS one. 7, 39378(2012).</li>
<li>Ponnalagu, D., Singh, H. Anion Channels of Mitochondria. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPonnalagu%2C+D+%22Handbook+of+Experimental+Pharmacology%22">Handbook of Experimental Pharmacology</a>. , (2016).</li>
<li>Leanza, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+ion+channels+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular ion channels and cancer.</a> Front Physiol. 4, 227(2013).</li>
<li>Kim, S. Y., Chu, K. C., Lee, H. R., Lee, K. S., Carey, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+nine+new+head+and+neck+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Oto-Laryngologica%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of nine new head and neck cancer cell lines.</a> Acta Oto-Laryngologica. 117, 775-784 (1997).</li>
<li>Jia, L., Liu, W., Guan, L., Lu, M., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Calcium-Activated+Chloride+Channel+ANO1%2FTMEM16A+Suppresses+Tumor+Growth+and+Invasion+in+Human+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Calcium-Activated Chloride Channel ANO1/TMEM16A Suppresses Tumor Growth and Invasion in Human Lung Cancer.</a> PloS one. 10, 0136584(2015).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+CLIC4%2FmtCLIC+enhances+hydrogen+peroxide-induced+apoptosis+in+C6+glioma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol+Rep%22%5BJournal%5D)">Suppression of CLIC4/mtCLIC enhances hydrogen peroxide-induced apoptosis in C6 glioma cells.</a> Oncol Rep. 29, 1483-1491 (2013).</li>
<li>Zhu, W., Wang, X., Zhou, Y., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C2-ceramide+induces+cell+death+and+protective+autophagy+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">C2-ceramide induces cell death and protective autophagy in head and neck squamous cell carcinoma cells.</a> Int J Mol Sci. 15, 3336-3355 (2014).</li>
<li>McFarland, R., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neurological+perspective+on+mitochondrial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">A neurological perspective on mitochondrial disease.</a> Lancet Neurol. 9, 829-840 (2010).</li>
<li>Alston, C. L., Rocha, M. C., Lax, N. Z., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+and+pathology+of+mitochondrial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">The genetics and pathology of mitochondrial disease.</a> J Pathol. 241, 236-250 (2017).</li>
<li>Zhang, W., Wang, X., Chen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resveratrol+induces+mitochondria-mediated+AIF+and+to+a+lesser+extent+caspase-9-dependent+apoptosis+in+human+lung+adenocarcinoma+ASTC-a-1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Resveratrol induces mitochondria-mediated AIF and to a lesser extent caspase-9-dependent apoptosis in human lung adenocarcinoma ASTC-a-1 cells.</a> Mol Cell Biochem. 354, 29-37 (2011).</li>
<li>Bernardi, P., Rasola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+cell+death%3A+the+mitochondrial+connection%5BTitle%5D)+AND+%22Subcell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Calcium and cell death: the mitochondrial connection.</a> Subcell Biochem. 45, 481-506 (2007).</li>
<li>Perveen, S., Yang, J. S., Ha, T. J., Yoon, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyanidin-3-glucoside+Inhibits+ATP-induced+Intracellular+Free+Ca%282%2B%29+Concentration%2C+ROS+Formation+and+Mitochondrial+Depolarization+in+PC12+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Korean+J+Physiol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Cyanidin-3-glucoside Inhibits ATP-induced Intracellular Free Ca(2+) Concentration, ROS Formation and Mitochondrial Depolarization in PC12 Cells.</a> Korean J Physiol Pharmacol. 18, 297-305 (2014).</li>
<li>Paddock, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+practices+of+laser+scanning+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Principles and practices of laser scanning confocal microscopy.</a> Mol Biotechnol. 16, 127-149 (2000).</li>
<li>Paddock, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+boldly+glow...+applications+of+laser+scanning+confocal+microscopy+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays+%3A+news+and+reviews+in+molecular%2C+cellular+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">To boldly glow... applications of laser scanning confocal microscopy in developmental biology.</a> BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 16, 357-365 (1994).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Cl− kanalları iç ortam hemostaz sürdürmek için gerekli olan ve hücre proliferasyonu ve Apoptozis15,16önemli rollerde oynamak iyi belgelenmiş. Bu nedenle, iyon kanal hedefli müdahale ve Apoptozis ilişkisi büyük ihtiyaç ve önemi bir daha iyi tedavi yaklaşımı çeşitli kanserlerin17için bulmak için en önemli noktadır. Mitokondri bir hücre normal biyolojik durumunu korumak ve onun fonksiyonu son derece onun membran geçirgenliği ve tra...

Rh123 transmembran potansiyel bir göstergesi olarak hizmet veren bir katyonik floresans boya var. Rh123 hücre zarı delici ve mitokondrial matris bağlı olarak potansiyel farkı iç ve dış membran1girme yeteneğine sahiptir. Apoptozis mitokondrial membran bütünlüğü zarar yol açar. Mitokondri geçirgenliği geçiş gözenek (MPTP) açın ve sırayla mitokondri dışına Rh123 sürümdeki sonuçları MMP, daraltmak için yol. Son olarak, güçlü yeşil floresans sinyali floresan mikroskop altında tespit edilecektir. MMP ve yükseltilmiş membran geçirgenliği tükenmesi hücre apoptosis2erken ibretler vardır iyi belgelenmiştir. Bu nedenle, Rh123 MMP değişiklik algılanması ve hücre apoptosis oluşumu için uygulanabilir.
Dünyada 6 en yaygın Karsinomu, baş ve boyun kanser ciddi bir kişinin sağlık3bozulur. Her ne kadar pek çok yaklaşım son yıllarda geliştirilen, hastalarda baş ve boyun Skuamöz Hücre Karsinomu (HNSCC) için tedavi klinik sonuçlar hala ideal değil4' tür. Yeni tedavi yöntemleri keşfetmek tedavisi için HNSCC5artırabilirsiniz. İyon kanalları çok sayıda biyolojik süreçlerin içeren farklı kanser6gelişiminde önemli bir rol görüntüler. Kısmi veya toplam katılım Cl- kanalları son derece neoplastik dönüştürme etkin geçiş, yüksek orandaki yayılması ve invasiveness dahil olmak üzere çeşitli özelliklerini ilgili vardır. Bunun ışığında, CLIC, roman protein ailesi, kanser tedavi6,7için tedavi hedefleri gelecek vaat eden bir sınıf olarak listelendi. Son yıllarda yapılan çalışmalarda ortaya CLIC1, CLIC4 ve CLIC5, gibi CLIC ailesinin üyeleri kalp mitokondrial yerelleştirmeniz ve reaktif oksijen türleri (ROS) seviyesini mitokondrial bulunan Cl işlevsel rolü gösteren upregulated tarafından CLIC5, - kanalları apoptotik yanıt8. CLIC4, bir ailenin üyesi, CLIC (olarak da bilinen mtCLIC, P64H1 ve RS43) en yaygın kanser hücreleri ve hücre altı yerini Golgi, endoplazmik retikulum ve mitokondri içinde insan gibi onun apoptotik düzenleme özellikleri çalışılmıştır keratinositler7,9,10. CLIC4 ifade profil tümör nekrozis faktör-α (TNF-α), P53 ve dış uyarıcı tarafından düzenlenmiş. Overexpression ve CLIC4 downregülasyon esas olarak dengesizlik Bcl-2 aile üyeleri ile caspase art arda sıralı aktivasyonu ve serbest bırakmak-in sitokrom C11, eşliğinde mitokondrial yolu aracılığıyla bir apoptotik yanıt tetikler 12 , 13. bu nedenle, MMP ölçümdür apoptosis CLIC4 ilgili keşfetmek çok önemli ve Rh123 bir ideal floresans göstergesi olarak hizmet vermektedir.
Bu da çalışmanın CLIC4 nakavt kaynaklı apoptosis HN4 hücrelerdeki çalışmaya MMP tespiti için ayrıntılı bir protokolünü açıklar. Rh123 bir floresan sonda MMP değişimi gözlemlemek için kullanılır. Ortak floresan mikroskop altında ve confocal lazer tarama floresan mikroskop MMP gerçek zamanlı dalgalanma çözülmüş olabilir. Biz tartışın avantajları ve confocal lazer floresan mikroskop ayrıntılı tarama uygulanması sınırlamaları ve ayrıca diğer yöntemleri ile karşılaştırın. Bu iletişim kuralı da apoptozis ile ilgili diğer çalışmalar için uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>HNSCC hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRL-3241</td><td></td></tr><tr><td>Polilisin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P4981</td><td></td></tr><tr><td>İnsan CLIC4 Biyomikleri için spesifik siRNA</td><td></td><td>NM_013943</td><td>(erişim numaraları, NM_013943; cDNA dizisine karşılık gelir 5-GCTGAAGGAGGAGGACAAAGA-3) ve karıştırılmış siRNA (5 ACGCGUAACGCGGGAAUU-3) tasarlanmış ve Biomics Company'den</td></tr> <tr><td>elde edilmiştir.Lipofectamine 2000 Transfeksiyon Reaktifi&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000-015</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Azaltılmış Serum Ortamı, GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51985-042</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine 123, FluoroPure grede</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R22420</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' modifiye edilmiş Eagle ortamı (DMEM, 4.5 g / L glikoz)</td> <td>Gibco</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu, Nitelikli, Avustralya Menşeili</td><td>Gibco</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA Çözeltisi</td><td>Beyotime</td><td>C0201</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotik-Antimikotik, 100X</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Lazer Taramalı Konfokal Mikroskopi</td><td>Leica Microsystems GmbH</td><td>LEICA. SP5-DMI6000-DIC</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE300 Ters Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Metaflour, V7.5.0.0</td><td>Universal Imaging Corporation</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Leica uygulama paketi, v2.6.0.7266</td><td>Leica Microsystems GmbH</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft office Excel 2007</td><td>Microsoft</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sigma Plot 12.5</td><td>Systat Yazılımı</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Attofluor Hücre Odası</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A7816</td><td></td></tr></tbody></table>

mitokondri zar potansiyeli clic4 nakavt kaynaklı hn4 hücre apoptosis vitro çalışma tespiti

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

(MMP, ΔΨm) mitokondri zar potansiyel tükenmesi apoptotik art arda en erken olay olarak kabul edilir. Hatta kromatin yoğunlaşma ve DNA kırılması gibi nükleer apoptotik özellikleri öncesinde ortaya çıkar. Bir kez MMP çöker, hücre apoptosis geri dönüşümsüz başlatacaktır. Lipofilik katyonik boya bir dizi hücre membran geçmek ve mitokondri matriksi içinde toplamak ve MMP değişiklik değerlendirmek için floresans marker olarak hizmet. Cl- hücre içi kanal (klik) Aile, altı üyelerinden biri hücre apoptotik süreci mitokondrial yolu üzerinden olmak üzere CLIC4 katılmaktadır. Burada rodamine 123 (Rh123), hangi aracılığıyla biz apoptosis CLIC4 nakavt tarafından indüklenen çalışma floresans dalgalanma izleme yoluyla MMP ölçmek için detaylı bir protokol açıklayın. Biz tartışın avantajları ve confocal lazer tarama ve normal floresan mikroskop ayrıntılı uygulama sınırlamaları ve ayrıca diğer yöntemleri ile karşılaştırın.

Bu da çalışmanın, Rh123 MMP algılamak için uygulandı. Başlangıçta, HN4 hücreleri aşağıdaki floresans deneyler boyama için kültürlü. Cımbız 6-şey tabak (Şekil 1A) altta dairesel coverslips koymak için kullanılmıştır. Coverslips polylysine 5 min için ile kaplı ve daha sonra polylysine pipettor (Şekil 1B) yolu ile kaldırıldı. O zaman HN4 hücreleri trypsinized ve 6-şey levha altına yerleştirilir cove...

Burada mitokondri zar potansiyel (MMP) belirlemek ve CLIC4 nakavt kaynaklı HN4 hücre apoptosis içinde vitroçalışma rodamine 123 uygulanması için detaylı bir iletişim kuralı mevcut. Ortak floresan mikroskop altında ve confocal lazer tarama floresan mikroskop MMP gerçek zamanlı değişiklik kaydedildi.

Mitokondri zar potansiyeli CLIC4 nakavt kaynaklı HN4 hücre Apoptosis Vitro çalışma tespiti

Depletion of the mitochondrial membrane potential (MMP, &#916;&#936;m) is considered the earliest event in the apoptotic cascade. It even occurs ahead of ...

Bu yöntem, apoptoz ve mitokondri disfonksiyonunun anlaşılması da dahil olmak üzere sitobiyolojik alandaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, araştırmacıların tek bir hücre içinde rodamin-123 aracılığıyla mitokondri zarı potansiyelinin gerçek zamanlı izlenmesini kolayca ve düzgün bir şekilde gerçekleştirebilmeleridir. Metin protokolünde tarif edildiği gibi baş ve boyun hücreli skuamöz karsinomdan bir HN4 hücre hattı kültürü.Transfeksiyondan bir gün önce, altı oyuklu plakalarda antibiyotiksiz kültür ortamı başına iki mililitrede 0.5 milyon hücre plakalayın. 100 pikomol CLIC4 küçük enterferans yapan RNA veya karıştırılmış küçük enterferans yapan RNA'yı 250 mikrolitre indirgenmiş serum ortamında hafifçe seyreltin. Daha sonra beş mikrolitre lipozom reaktifini 250 mikrolitre indirgenmiş serum ortamında seyreltin ve beş dakika inkübe edin.Seyreltilmiş küçük enterferans yapan RNA'yı seyreltilmiş lipozom reaktifi ile birleştirin ve hafifçe karıştırın. Karışımı, ortadaki hücreleri içeren her bir kuyucuğa ekleyin. Plakayı ileri geri sallayarak hafifçe karıştırın.Hücreleri bir CO2 inkübatörde 37 santigrat derecede inkübe edin. Transfeksiyondan dört sa

detection-mitochondria-membrane-potential-to-study-clic4-knockdown

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu protokol, mitokondriyal kalsiyum akıları floresan görüntüleme ile gerçek zamanlı ölçümü için bir yöntem açıklanır. Yöntemi seçici mitokondri ifade dairesel permutated bir çift uyarma YFP tabanlı oranlı metrik kalsiyum sensör (oranlı metrik pericam-mt) yararlanır.

Apoptozis sırasında Mitokondrial Kalsiyum Düzeyleri Dinamik değişiklikler izlenmesi Genetiği Kodlanmış Kalsiyum Sensor Kullanımı

Kaspaz 3 aracılı apopitoz ölümsüzleştirdi N19 oligodendrosit hücre kültürleri Canlı hücre görüntüleme...

İzleme bölünmüş Kaspaz-3 Aktivite ve Potasyum kaynaklı Membran depolarizasyon Canlı hücre Görüntüleme ve Cleaveable EPA-boya Substratlar ölümsüzleştirdi oligodendroglial Hücre Apoptoz

Solunum ve oksidatif fosforilasyon ile ve hücre canlılığı üzerindeki ilişkili mitokondriyal fonksiyonları üzerinde, protein kinaz C (PKC), izozimlerinin aktivasyon etkisi tarif edilmektedir. Yaklaşım seçici olarak mitokondriyal işlev ve hücre enerji durumunu belirlemek için birincil hücre kültürü deneyleri ve çeşitli PKC izozimleri overexpress için adenoviral teknik uyum sağlar.

Böbrek Hücreleri aşırı eksprese eden protein kinaz C izozimlerinin Mitokondriyal Fonksiyonlar ve Hücre Canlılık Değerlendirilmesi

E4orf4 ile uyarılan hücre ölümüne ACF kromatin yeniden faktör katkı ölçüldü. Protokol doksisiklin tedavi ACF alt birimleri ACF1 ve SNF2h koşullu devirme neden olduğu hücre klonlarının seçimi içermektedir, ve indüklenebilir hücre hatlarında E4orf4 ile uyarılan hücre ölümü ölçmek için DAPI tahlil kullanımı.

E4orf4 Bağlı Hücre Ölümü üzerine Nakavt Etkilerinin Gen Ekspresyonu ve Ölçüm Şartlı Nakavt için Hücre hatları hazırlanması

Multiplex deneyleri temel hücresel mekanizmaların için yararlı bilgi sağlamak ve reaktifler ve gereksiz tekrarlı deneyler atık ortadan kaldırabilir. Biz, palmitik asit ile oksidatif karşılaştırmadan sonra, bir in vitro modelde hipotalamik hücre yaşayabilirliğini belirlemek için, flüoresan ve ışıldayan dayalı yöntemler kullanılarak, burada çok katlı bir kaspaz-3/7 aktivite deneyi tarif eder.

Bir Hipotalamik Hücre Modeli Apoptosisi Belirleyen Bir Kaspaz Çoğullama Testi Kullanımı

Burada açıklanan tespit ve akış sitometrisi ile analiz kemirgen doku ve izole mitokondri immün ile mitokondriyal dış membran proteinleri ölçmek için bir yöntemdir. Bu yöntem, mitokondriyal alt popülasyonlarının fonksiyonel özelliklerini değerlendirmek için genişletilebilir.

İzole Mitokondri Akış Sitometrisi ile Dış Zar Proteinleri imüno

Anastaz terimi, ölmekte olan hücrelerin geç bir aşamada hücre intihar sürecini tersine çevirdiği, kendilerini onardığı ve nihayetinde hayatta kaldığı fenomeni ifade eder. Burada, anastaz geçiren hücreleri tespit etmek ve izlemek için protokoller gösteriyoruz.

Takip inişi, Apoptosisi tersine Cep Survival Fenomeni için Stratejiler

Örnekler arasındaki mitokondriyal membran potansiyelinin karşılaştırılması, hücresel durum hakkında değerli bilgiler verir. Mitokondriyi izole etmek ve floresan kullanarak inhibitörlere ve ayrıştırıcılara yanıtı değerlendirmek için ayrıntılı adımlar açıklanmaktadır. Bu protokolün yöntemi ve faydası, bir hücre kültürü ve hücresel stresin hayvan modeli kullanılarak gösterilmiştir.

İzolasyon ve Kültür Hücrelerinin ve Fare Doku gelen Mitokondri Fonksiyonel Analizi

Mitophagy, takas zarar mitokondri, süreci mitokondrial homeostazı ve sağlık bakım için gereklidir. Bu makale en son mitophagy bazılarını algılama yöntemleri insan hücreleri, Caenorhabditis elegansve fareler sunar.

Vitro ve In Vivo insan hücreleri, C. Elegansve fareler Mitophagy tespiti

Çevresel organoklorin pestisitlerinin (OKP) hepatositlerde mitokondriyal fonksiyon üzerindeki etkisinin anlaşılması metabolik bozukluklara neden olan OKP'lerin mekanizmasının araştırılmasında önemlidir. Bu yazıda hepatik mitokondriyal fonksiyonun saptanması nda ayrıntılı yöntemler yer alıyor.

Organoklor Intarımlarına Maruz Kalan Hepatositlerde Mitokondriyal Fonksiyonun Saptanması Için Deneysel Protokol

Burada, FAM83A yıkım prosedürlerini gösteriyoruz; rahim ağzı kanseri hücrelerinin çoğalması, göçü ve istilası üzerindeki etkilerini tespit etmek için yapılan tahliller; ve bu hücrelerin sisplatine duyarlılığı. Bu çalışma, rahim ağzı kanseri için umut verici bir hedef gen ve daha ileri ilaç araştırmaları için bir referans sağlar.

Rahim Ağzı Kanseri Hücre Büyümesi ve Sisplatin Duyarlılığındaki Rolünü Doğrulamak için FAM83A'nın Yıkılması

Öğrenin, HN4 hücrelerinde CLIC4 nakavt kaynaklı apoptozu incelemek için rodamin 123 kullanarak mitokondri zar potansiyelini gerçek zamanlı izleme yöntemini. Bu teknik, kanser biyolojisinde mitokondri disfonksiyonu araştırmalarına katkı sağlar.

Mitokondri zar potansiyeli CLIC4 nakavt kaynaklı HN4 hücre Apoptosis Vitro çalışma tespiti

Daha fazla video keşfet