Name: Prostat kanseri hücre modelleri Anti-Mitotik Ajan Docetaxel direnç üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-08T12:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: Öğrenin, DU145 ve 22Rv1 prostat kanseri hücrelerinde artan Docetaxel dozlarıyla dirençli hücre hatları üretme yöntemini. Bu protokol, anti-mitotik tedavi direncinin moleküler mekanizmalarını incelemek için güvenilir bir platform sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

V.R.-D. ABD Sağlık Bakanlığı fon alır &#38; İnsan Hizmetleri, NIH, Ulusal Kanser Enstitüsü vermek 1 numaralı K22 CA207458-01 ve J.D.-ö. ABD Sağlık Bakanlığı fon alır &#38; İnsan Hizmetleri, NIH, Ulusal Kanser Enstitüsü vermek 1 numaralı R01 CA207311-01.

1. % 50 neden Docetaxel konsantrasyonu tayini azaltmak koloni oluşumu yeteneği (IC50) Not: Bu protokol için koloni oluşumu kullanarak Docetaxel IC50 konsantrasyon değerlendirilmiştir yetenek. Hücre canlılığı (Yani, MTS deneyleri) değerlendirmek için kullanılan bir alternatif yöntem-ebilmek var olmak kullanılmış müfettişler üzerinde dayalı &#39; tercihleri.
<ol><li>Büyümek DU145 veya 22Rv1 hücreleri bir 75 cm 2 şişesi ve 10 mM gelecek deneylerde kullanılmak üzere DMSO içinde seyreltilmiş Docetaxel yeterli stok hazırlayın.</li>
	<li>Hücre Docetaxel IC50 tespiti için plaka medya balonun kaldırmak dikkatle hücreleri 5 mL PBS ile yıkayın ve 2 mL %0,05 ile kuluçkaya tripsin-EDTA 3-5 dk 37 ° C'de hücreler şişesi yüzeyinden ayırmak için.</li>
	<li>5 mL taze medya kullanarak balonun trypsinized hücreleri durulama ve hücre süspansiyon 15 mL tüp içinde toplamak. Santrifüjü (300 x g, 3 dk, oda sıcaklığında (RT)) tarafından hücreleri cips.</li>
	<li>Süpernatant kaldırmak, hücre Pelet 5 mL taze medya resuspend ve hücreleri saymak. 2-2,5 10 5 hücre/mL DU145 için x ve 4-4.5 x 10 5 hücre/mL 22Rv1 için hücre süspansiyon sulandırmak, mix de yukarı ve aşağı pipetting ve 2 mL süspansiyon iki 6-şey plakaların her iyi tohum.</li>
	<li>Sonra 24 h, hücreleri % 70-80 izdiham ne zaman eklemek Docetaxel konsantrasyonları doz tırmanan 1 nM, 2.5 nM, 5 nM, 10 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 250 nM, 500 nM ve 1000 nM her şey için. Docetaxel ( şekil 2A) için kullanılan en yüksek ses seviyesinde denetim DMSO ile iyi tedavi.</li>
	<li>Sonra 72 h, ortamı içeren ilaç Aspire edin ve 2 mL taze medya ekleyin. Yaklaşık 4-5 gün içinde tabakları boyama için hazır olacak.</li>
	<li>Koloniler leke için onları hafifçe 2-3 mL PBS ile yıkamak ve bunları 2-3 mL kristal violet solüsyonu (% %0,1 10 formalin içinde w/v) doku kültürü hood veya bir duman başlık içinde 20 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>H 2 O 2-3 mL ile boyama çözüm ve yıkama plakalar kaldırmak, H 2 O kaldırmak ve kurumasına plakaları.</li>
	<li>Hangisinde hücre canlılığı (IC50) % 50 oranında azalır Docetaxel konsantrasyonu belirlemek için kuyu görselleştirme tarafından sonuçları çözümleyebilirsiniz. El ile (iki kez aynı kolonilerin sayımı) önlemek için bir işaretleyici kalem yardımı ile kolonileri saymak ve hücre canlılığı grafik ( şekil 2A) yüzdesini temsil eder. Son olarak, şekil gösterimi için plakaların dijital görüntüler ( şekil 3A içinde gösterildiği gibi) tutar.</li>
</ol> 2. Docetaxel dayanıklı prostat kanser hücrelerinin üretimi Not: hücre tedavileri IC50 ilaç konsantrasyonu tayini için kullanılan aynı Docetaxel çözüm hisse senedi kullanarak gerçekleştirmek (yeterli stok için şimdiden hazırlamak deneysel kullanın). Her zaman bir şey iyi çalışmaz diye küçük bir şişeye hücre önceki adımından tutun. Ebeveyn hücreleri paralel tüm prosedürü boyunca küçük bir şişe olarak yetiştirilen ve araç (DMSO) karşılık gelen cilt tedavi Docetaxel şişeler içinde kullanılan tutarlar taklit olarak maruz.
<ol><li>20 mL medya içeren 150 cm 2 şişeler plaka DU145 veya 22Rv1 hücrelerinde (3,5 x 10 DU145 ve 6,5 * 10 için 6 hücreler şişe 22Rv1 için şişe başına 6 hücre). 10-20 şişe hücre kullanımı Protokolü'nün sonunda yeterince hücre için önerilir.</li>
	<li>Hücreleri yaklaşık % 70-80 olduğunda 24 saat sonra izdiham ( şekil 2B, daha önce Docetaxel), 1. adımda Protokolü'nün tespit IC50 konsantrasyonu, Docetaxel Ekle (5 nM bu iletişim kuralında tanımlanan hücreler için).</li>
	<li>Sonra 72 h, ortamı içeren ilaç Aspire edin ve taze, Docetaxel-özgür medya ( şekil 2B, 72 h Docetaxel sonra) ekleyin. Medya her 3-4 gün değiştirin. Yaklaşık 1-2 hafta içinde dayanıklı klonlar ( şekil 2B, 7 ila 14 gün sonra Docetaxel) mikroskop altında belirgin görünecektir.</li>
	<li>Aspire medya, dikkatle 15 mL PBS hücrelerle yıkayın ve 4 mL %0,05 ile kuluçkaya tripsin-EDTA 3-5 dk 37 ° C'de hücreler şişesi yüzeyinden ayırmak için.</li>
	<li>Trypsinized 8 mL taze medya kullanarak şişeye hücrelerden resuspend. Tüm tedavi şişeler hücrelerden havuz. Cips hücreleri tarafından Santrifüjü (300 x g, 3 dk, RT).</li>
	<li>Süpernatant kaldırmak, hücre Pelet 20 mL taze medya resuspend ve 150 cm 2 şişeler hücrelerde plakası (3,5 x 10 DU145 ve 6,5 * 10 için 6 hücreler şişe 22Rv1 için şişe başına 6 hücre).</li>
	<li>Sonra 24 h hücre yaklaşık % 70-80 olduğunda, izdiham, 5 ekleyin nM Docetaxel (ilk IC50 konsantrasyonu) yeniden.</li>
	<li>2.3-2.6 üzerinde gün 3 adımları yineleyin.</li>
	<li>Sonra 24 h hücre yaklaşık % 70-80 olduğunda, izdiham, 2 X IC50 Docetaxel konsantrasyon hücrelerle tedavi (10 nM bu iletişim kuralında tanımlanan hücreler için).</li>
	<li>Tekrar 2,3 2,8, Docetaxel konsantrasyonlarının artması doz takip adımlar (25 nM, 50 nM, 100 nM ve 250 nM), şişeler son en yoğun altında büyüyen hücreler istikrarlı bir nüfusa oluşturmak için. Daha yüksek konsantrasyonlarda için ilâ 6 ay 1.000 nM konsantrasyonu ( şekil 1A) ulaşılana kadar doz-yükseltme iletişim kuralı uygulanabilir.</li>
</ol> 3. Fonksiyonel karakterizasyonu elde Docetaxel direnç koloni oluşumu tahlil tarafından Not: Bu protokol için chemoresistance koloni oluşumu deneyleri kullanılarak değerlendirilmiştir. Hücre canlılığı (Yani, MTS deneyleri) değerlendirmek için kullanılan bir alternatif yöntem-ebilmek var olmak kullanılmış müfettişler üzerinde dayalı &#39; tercihleri.
<ol><li>Plaka 2000 hücreleri (DU145 veya 22Rv1, ebeveyn ve Docetaxel dayanıklı) 6-şey tabak kuyuda, medya 2 mL iyi kullanarak.</li>
	<li>Sonra 24 h, eklemek Docetaxel artan konsantrasyonları (ebeveyn hücreleri: 0,25, 0.5, 1, 2.5 ve 5 nM; DR hücreleri: 50, 125, 250, 500 ve 1000 nM). DU145 ve 22Rv1 hücre hatlarında. DMSO sadece bir şey için en yüksek Docetaxel doz için kullanılan aynı ses denetimi olarak eklemek.</li>
	<li>72 h sonra Aspire ortamı içeren ilaç ve taze Docetaxel Ücretsiz medya ekleyin.</li>
	<li>1-2 kolonileri mikroskop altında görünür hale gelene kadar hafta plakalar kuluçkaya.</li>
	<li>Koloniler leke için onları hafifçe 2-3 mL PBS ile yıkamak ve bunları 2-3 mL kristal violet solüsyonu (% %0,1 10 formalin içinde w/v) doku kültürü hood veya bir duman başlık içinde 20 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>H 2 O 2-3 mL ile boyama çözüm ve yıkama plakalar kaldırmak, H 2 O kaldırmak ve kurumasına plakaları.</li>
	<li>Kuyu görselleştirme ve el ile (iki kez aynı kolonilerin sayımı) önlemek için bir işaretleyici kalem yardımı ile kolonilerin sayımı sonucu analiz ve hücre canlılığı grafikteki yüzdesini temsil eder. Plakaların rakam gösterimi ( şekil 3A) için dijital görüntü alabilir.</li>
</ol> 4. Fenotipik karakterizasyonu ve Docetaxel direnç elde fenotip qRT-PCR analiz yoluyla Not: Docetaxel dayanıklı (DR) hücreleri sergilemek için onların ebeveyn hücre hatları ile karşılaştırıldığında farklı ifade profil 28 , 29. bu nedenle, seçim başarısı qRT-PCR tarafından doğrulanabilir için belirli işaretleri primerler kullanılarak (astar sıralarının başvurmak için malzeme kısım; ayrıntılı bilgi için sonuçlar bölümüne bakın). Bu seçimin üçüncü turdan sonra başlayan her turdan sonra yapılmalıdır. Alternatif olarak, Docetaxel dayanıklı fenotip Western Blot tarafından değerlendirilmesi de mümkündür.
<ol><li>Ayıklamak RNA bir RNA ekstraksiyon kiti kullanarak ve aşağıdaki üretici ebeveyn ve Docetaxel dayanıklı hücrelerden &#39; s yönergeleri (Tablo malzemeleri ve Kimyasalları Ayrıntılar için bakınız). 1-2 x 10 6 hücreler en az kullanılması önerilir.</li>
	<li>Miktarını RNA 260 nm Absorbans, bir Spektrofotometre kullanarak. En iyi saflık için 260 nm/280 nm Absorbans oranları 2.0 yakın olmalıdır.</li>
	<li>PerfoRM ters transkripsiyon ters transkripsiyon seti kullanarak ve aşağıdaki üretici Tamamlayıcı DNA (cDNA) elde etmek için &#39; s yönergeleri (Tablo malzemeleri ve Ayrıntılar kimyasalları, RNA 1 µg 20 µL içinde bkz: kullanma) (cDNA daha yüksek bir miktarda, buna göre tepki karıştırmak ölçekli gerekiyorsa) tepki mix.</li>
	<li>Hazırlamak qPCR tepki nüsha olarak faiz her gen için aşağıdaki gibi: - 2 µL 10 µM ileri astar - 2 µL 10 µM ters astar - 10 µL SYBR yeşil PCR ana mix - 5 µL H 2 O -in 1 µL Yeni hazırlanan cDNA adım 4.3. 
	Not: Bu protokol için kullanılan astar serileri için Malzemeler tablo bkz.</li>
	<li>Kümesi PCR programı aşağıdaki gibi: - 95 ° C 15 dakika - 94 ° C 30 s | 
	-40 56 ° C s | 40 kere - 72 ° C 30 s |</li>
	QPCR sonuçlarını analiz ve gen ekspresyonu arasında ebeveyn değişiklikleri belirlemek için <li>ve DR örnekleri, her gen ilgi için döngüsü eşik (Ct) değerlerini nüsha belirlenir ve ortalama normalleştirilmiş yükleme denetimine (aktin onaylatılacak ortalama ) DR (Ct DR) ve ebeveyn hücreler (Ct ebeveyn) için. Ebeveyn hücrelerdeki değerleri 1 olarak normalleştirilmiş. ΔCt (Ct DR - Ct ebeveyn) son mRNA kat değişiklikleri almak için kararlı ve grafik olarak temsil etti. Bir artış &#62; 2 veya bir azalma &#60; 0,5 önemli kabul edilen ve Docetaxel kurulması iyi bir doğrulama dayanıklı fenotip ( şekil 3B) satın aldı.</li>
</ol>

<ol><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21376230">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li>
<li>Lapenna, S., Giordano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+kinases+as+therapeutic+targets+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Drug+discovery%22%5BJournal%5D)">Cell cycle kinases as therapeutic targets for cancer.</a> Nature reviews. Drug discovery. 8 (7), 547-566 (2009).</li>
<li>Jackson, J. R., Patrick, D. R., Dar, M. M., Huang, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+anti-mitotic+therapies%3A+can+we+improve+on+tubulin+agents%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeted anti-mitotic therapies: can we improve on tubulin agents?</a> Nature reviews. Cancer. 7 (2), 107-117 (2007).</li>
<li>Dumontet, C., Jordan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-binding+agents%3A+a+dynamic+field+of+cancer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Drug+discovery%22%5BJournal%5D)">Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics.</a> Nature reviews. Drug discovery. 9 (10), 790-803 (2010).</li>
<li>Schiff, P. B., Fant, J., Horwitz, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promotion+of+microtubule+assembly+in+vitro+by+taxol%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol.</a> Nature. 277 (5698), 665-667 (1979).</li>
<li>Schiff, P. B., Horwitz, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taxol+stabilizes+microtubules+in+mouse+fibroblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Taxol stabilizes microtubules in mouse fibroblast cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (3), 1561-1565 (1980).</li>
<li>Musacchio, A., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spindle-assembly+checkpoint+in+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The spindle-assembly checkpoint in space and time.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 8 (5), 379-393 (2007).</li>
<li>Kops, G. J. P. L., Weaver, B. A. A., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+road+to+cancer%3A+aneuploidy+and+the+mitotic+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">On the road to cancer: aneuploidy and the mitotic checkpoint.</a> Nature reviews. Cancer. 5 (10), 773-785 (2005).</li>
<li>Derry, W. B., Wilson, L., Jordan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substoichiometric+binding+of+taxol+suppresses+microtubule+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Substoichiometric binding of taxol suppresses microtubule dynamics.</a> Biochemistry. 34 (7), 2203-2211 (1995).</li>
<li>Jordan, M. A., Wendell, K., Gardiner, S., Derry, W. B., Copp, H., Wilson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+block+induced+in+HeLa+cells+by+low+concentrations+of+paclitaxel+%28Taxol%29+results+in+abnormal+mitotic+exit+and+apoptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Mitotic block induced in HeLa cells by low concentrations of paclitaxel (Taxol) results in abnormal mitotic exit and apoptotic cell death.</a> Cancer research. 56 (4), 816-825 (1996).</li>
<li>Orth, J. D., Kohler, R. H., Foijer, F., Sorger, P. K., Weissleder, R., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitosis+and+antimitotic+drug+responses+in+tumors+by+in+vivo+microscopy+and+single-cell+pharmacodynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitosis and antimitotic drug responses in tumors by in vivo microscopy and single-cell pharmacodynamics.</a> Cancer research. 71 (13), 4608-4616 (2011).</li>
<li>Zasadil, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxicity+of+paclitaxel+in+breast+cancer+is+due+to+chromosome+missegregation+on+multipolar+spindles%5BTitle%5D)+AND+%22Science+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Cytotoxicity of paclitaxel in breast cancer is due to chromosome missegregation on multipolar spindles.</a> Science translational medicine. 6 (229), (2014).</li>
<li>Dominguez-Brauer, C., Thu, K. L., Mason, J. M., Blaser, H., Bray, M. R., Mak, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Mitosis+in+Cancer%3A+Emerging+Strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">Targeting Mitosis in Cancer: Emerging Strategies.</a> Molecular cell. 60 (4), 524-536 (2015).</li>
<li>Torre, L. A., Bray, F., Siegel, R. L., Ferlay, J., Lortet-Tieulent, J., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+cancer+statistics%2C+2012%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+a+cancer+journal+for+clinicians%22%5BJournal%5D)">Global cancer statistics, 2012.</a> CA: a cancer journal for clinicians. 65 (2), 87-108 (2015).</li>
<li>Petrylak, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Docetaxel+and+estramustine+compared+with+mitoxantrone+and+prednisone+for+advanced+refractory+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Docetaxel and estramustine compared with mitoxantrone and prednisone for advanced refractory prostate cancer.</a> The New England journal of medicine. 351 (15), 1513-1520 (2004).</li>
<li>Tannock, I. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Docetaxel+plus+prednisone+or+mitoxantrone+plus+prednisone+for+advanced+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Docetaxel plus prednisone or mitoxantrone plus prednisone for advanced prostate cancer.</a> The New England journal of medicine. 351 (15), 1502-1512 (2004).</li>
<li>Sweeney, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemohormonal+Therapy+in+Metastatic+Hormone-Sensitive+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Chemohormonal Therapy in Metastatic Hormone-Sensitive Prostate Cancer.</a> The New England journal of medicine. 373 (8), 737-746 (2015).</li>
<li>Mahon, K. L., Henshall, S. M., Sutherland, R. L., Horvath, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+of+chemotherapy+resistance+in+castration-resistant+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine-related+cancer%22%5BJournal%5D)">Pathways of chemotherapy resistance in castration-resistant prostate cancer.</a> Endocrine-related cancer. 18 (4), R103-R123 (2011).</li>
<li>Follit, C. A., Brewer, F. K., Wise, J. G., Vogel, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico+identified+targeted+inhibitors+of+P-glycoprotein+overcome+multidrug+resistance+in+human+cancer+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+research+%26+perspectives%22%5BJournal%5D)">In silico identified targeted inhibitors of P-glycoprotein overcome multidrug resistance in human cancer cells in culture.</a> Pharmacology research & perspectives. 3 (5), e00170(2015).</li>
<li>Ranganathan, S., Benetatos, C. A., Colarusso, P. J., Dexter, D. W., Hudes, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+beta-tubulin+isotype+expression+in+paclitaxel-resistant+human+prostate+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22British+journal+of+cancer%22%5BJournal%5D)">Altered beta-tubulin isotype expression in paclitaxel-resistant human prostate carcinoma cells.</a> British journal of cancer. 77 (4), 562-566 (1998).</li>
<li>Martello, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+levels+of+microtubule+destabilizing+factors+in+a+Taxol-resistant%2Fdependent+A549+cell+line+with+an+alpha-tubulin+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Elevated levels of microtubule destabilizing factors in a Taxol-resistant/dependent A549 cell line with an alpha-tubulin mutation.</a> Cancer research. 63 (6), 1207-1213 (2003).</li>
<li>Lee, A. J. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+instability+confers+intrinsic+multidrug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Chromosomal instability confers intrinsic multidrug resistance.</a> Cancer research. 71 (5), 1858-1870 (2011).</li>
<li>Sansregret, L., Swanton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Aneuploidy+in+Cancer+Evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+perspectives+in+medicine%22%5BJournal%5D)">The Role of Aneuploidy in Cancer Evolution.</a> Cold Spring Harbor perspectives in medicine. 7 (1), (2017).</li>
<li>Grasso, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mutational+landscape+of+lethal+castration-resistant+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mutational landscape of lethal castration-resistant prostate cancer.</a> Nature. 487 (7406), 239-243 (2012).</li>
<li>Taylor, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomic+profiling+of+human+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">Integrative genomic profiling of human prostate cancer.</a> Cancer cell. 18 (1), 11-22 (2010).</li>
<li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li>
<li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).</li>
<li>Domingo-Domenech, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+acquired+docetaxel+resistance+in+prostate+cancer+through+depletion+of+notch-+and+hedgehog-dependent+tumor-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">Suppression of acquired docetaxel resistance in prostate cancer through depletion of notch- and hedgehog-dependent tumor-initiating cells.</a> Cancer cell. 22 (3), 373-388 (2012).</li>
<li>Vidal, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+targetable+GATA2-IGF2+axis+confers+aggressiveness+in+lethal+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">A targetable GATA2-IGF2 axis confers aggressiveness in lethal prostate cancer.</a> Cancer cell. 27 (2), 223-239 (2015).</li>
<li>Marín-Aguilera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+docetaxel+resistance+genes+in+castration-resistant+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cancer+therapeutics%22%5BJournal%5D)">Identification of docetaxel resistance genes in castration-resistant prostate cancer.</a> Molecular cancer therapeutics. 11 (2), 329-339 (2012).</li>
<li>Zhao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+candidate+biomarkers+of+therapeutic+response+to+docetaxel+by+proteomic+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Identification of candidate biomarkers of therapeutic response to docetaxel by proteomic profiling.</a> Cancer research. 69 (19), 7696-7703 (2009).</li>
<li>Lin, H. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+are+associated+with+docetaxel+chemotherapy+outcome+in+castration-resistant+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22British+journal+of+cancer%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs are associated with docetaxel chemotherapy outcome in castration-resistant prostate cancer.</a> British journal of cancer. 110 (10), 2462-2471 (2014).</li>
<li>Puhr, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-to-mesenchymal+transition+leads+to+docetaxel+resistance+in+prostate+cancer+and+is+mediated+by+reduced+expression+of+miR-200c+and+miR-205%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Epithelial-to-mesenchymal transition leads to docetaxel resistance in prostate cancer and is mediated by reduced expression of miR-200c and miR-205.</a> The American journal of pathology. 181 (6), 2188-2201 (2012).</li>
<li>Rodriguez-Bravo, V., Carceles-Cordon, M., Hoshida, Y., Cordon-Cardo, C., Galsky, M. D., Domingo-Domenech, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+GATA2+in+lethal+prostate+cancer+aggressiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Urology%22%5BJournal%5D)">The role of GATA2 in lethal prostate cancer aggressiveness.</a> Nature reviews. Urology. 14 (1), 38-48 (2017).</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Bu makale, chemoresistance fenotip edinimi için katkıda mekanizmaları incelenmesi için izin veren Docetaxel dayanıklı prostat kanseri hücre modeli sistemleri oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım son derece güvenilir ve tekrarlanabilir olmakla birlikte, potansiyel bazı kısıtlamalar dikkate alınmalıdır. Beri sadece hücre toplu nüfusun küçük bir kısmı chemoresistance28sergileyecek, tavsiye edilir hücrelerinin büyük nüfusuyla başlatmak için (genellikle yaklaşık 1.2 x 10 için hesap 20 şişe 150 cm2, plaka8 hücreleri). Protokolü'nün önemli adımlar yordamın başarılı olmasını sağlamak için düşünülmelidir. İlk olarak, taze için uzun vadeli kullanım (10 mM hisse senedi aliquots için yıllar düzgün-80 ° C'de depolanan kullanılabilir) hisse senedi hazırlanan aynı Docetaxel kullanmak çok önemlidir. Aliquot Docetaxel hafif değişiklikler IC50, hücre satırı zamanlama nesil sonuçlarını ve koloni oluşumu sonuçları etkileyebilir. İkinci olarak, varyasyonları hücre yeni bir toplu işlemi kullanarak oluşabilir bu yana her tek hücre doğrultusunda IC50 belirleme Protokolü başlatmak çok önemlidir. Üçüncü olarak, hücrelerin mikroskop altında hataları hızlı bir şekilde algılanabilir ve düzeltilmiş bu yüzden sık sık kontrol ederek uyuşturucu tedavisi etkilidir izlemek için önemlidir. Son olarak, her zaman bir hisse senedi kirlenme veya protokol ortasında hücrelerin canlılık etkileyebilecek beklenmedik sorunlar durumunda ara adımlardan tutmak için önerilir. Önemlisi, bizim iletişim kuralı amaçlayan Docetaxel yüksek dozda 72 h ilacın sürekli düşük konsantrasyonlarda yerine uzun iyileşme dönemleri tarafından bir girişim en iyi taklit etmek için takip için prostat kanser hücrelerinin açarak ilaç direnci modelleri oluşturmak için klinik Bu taxane Ajan15,16ile prostat kanseri tedavisi için senaryo bildirdi.
Ayrıca, bu ilaca dirençli hücreler zamanla Edinsel direnç özellikleri ilerici bir kaybına yol açabilecek bir yüksek plastisite sergi unutulmamalıdır. Bu nedenle, bu hücre kullanımı için 2-3 aydan fazla kültürde genişletme önerilmez. Kalıcı bir tedarik gerekiyorsa, sürekli olarak yeni toplu dayanıklı hücre oluşturmak için tavsiye edilir. Hücreleri toplu halde uzun süre kültürlü, ancak, koloni oluşumu deneyleri ve qPCR direnişleri yeniden değerlendirmek için kullanılabilir. Yüksek doz Docetaxel 72 h (500-1000 nM) için hücrelerle davranarak azalan direnci artırmak için başka bir alternatiftir. Bir iki hafta sonra bir iyileşme döneminde, fenotip qPCR ve koloni oluşumu ile yeniden sınanabilir deneyleri. Her ne kadar aliquots tedavi hücrelerinin sıvı azot (içinde FBS, % 10 DMSO) depolamak için tavsiye edilmez, mümkündür. Donma-çözülme döngüsü sonra chemoresistance fenotip her zaman yukarıda belirtilen yöntemlerle yeniden değerlendirilmesi gerekir olduğunu unutmayın.
Bu uyarılar rağmen biz28,29 ve diğerleri30,31,32,33 başarıyla anahtar roman hücresel tanımlamak için bu modeli sistemleri istihdam başardık ve Moleküler mekanizmalar önde gelen tümör başlatılıyor kapasite, hücre hayatta kalma ve saldırganlık Docetaxel dayanıklı hücrelerdeki yüksek. Bu kanser hücre modeli sistemleri kullanarak, biz bu hücreleri epitel ve prostat ile ilgili ayırt etme belirteçleri yokluğu ve overexpression targetable, gelişimsel ile karakterize bir farklılaşmamış fenotip sergilenmesi keşfetti (çentik ve Kirpi) sinyal yolları, kemoterapötik pozlama28hayatta. İkinci bir çalışmada, bu modeller ile birlikte kamuya hasta gen veri kümeleri24,25, kullanarak biz öncü transkripsiyon faktörü GATA2 son derece içinde metastatik kastrasyon dayanıklı overexpressed da ortaya çıkardı Kemoterapi dayanıklı prostat kanseri hücreleri. GATA2 doğrudan ağ29sinyal bir IGF2 bağlı aşağı akım kinaz aktive ederek hücre yaşama artırır. Özellikle, bu çalışmalar gelişmiş metastatik prostat kanseri saldırganlık34GATA2 roman anahtar rolleri tanımlamak için yardımcı oldu.
Diğer birçok türde bir yelpazeye kemoterapötik ilaçlar ile tedavi kanserler arasında yaygın olduğu gibi ilaç direnci gelişimi Docetaxel ve prostat kanseri, sınırlı değil bir sorundur. Nitekim, deneysel modeller kullanılabilirliği hakkında benzer kısıtlamalar geçerlidir ve bu bizim iletişim kuralı diğer kanser türleri ve onların anılan sıraya göre chemoresistance mekanizmaları çalışmaya adapte edilebilir akla yatkın.
Bu protokol için açıklandığı gibi Docetaxel dayanıklı hücre üretimi chemoresistance roman ilgili moleküler ve hücresel mekanizmaları tanımlamak için işlevsel bir araç kullanılabilir. Bu yeni hedefler, bunun üzerine son derece kötü huylu prostat kanseri için yeni tedavi gelişimi, bir kez daha bu hastalık hakkında ne biliyoruz ve nasıl onun hasta tedavi sınırları iterek ifade bulmak için kapıyı açar.

Hücre döngüsü kontrol kaybına neden nükleer silahların yayılmasına karşı bir artış oranı kanseri1bir özelliğidir. Bu işlev özellik kanser hücrelerinin sırasında S - ve M-hangi çeşitli hücre döngüsü DNA hasar veya Mitotik kusurları neden uyuşturucu perturbing gelişmesine yol açmıştır aşamaları, benzersiz hücre cycle'nın temel süreçleri sadakat bağımlı işler. Motor proteinler, ve Mitotik kinaz inhibitörleri gibi çok sayıda anti-Mitotik aracıları şu anda geliştirilmekte ve klinik olarak test edilmiş olmakla birlikte, eski Mikrotubul hedefleme ajanlar (MTAs) tek klinik olarak onaylanmış yaklaşım için olmaya devam mitoz kanser2,3,4hedefleme. MTAs ya istikrarsızlaştırmak (Vinblastine, Vincristine, Vinorelbine) veya (taxane elde edilen aracıları Paklitaksel, Docetaxel veya Cabazitaxel) mikrotübüller stabilize etmek ve böylece işleyen Mitotik iğ5,6oluşumunu önlemek. Bu ajanlar bir uzun süreli Mitotik tutuklama ve nihai hücre ölümü kültürlü hücreleri9,10 ve Mitotik ekranlarda bulunan tümörler11 iğ derleme denetim noktası7,8, tetik ,12 ve vardır bu nedenle prostat kanseri13kanserleri, aralarında büyük bir çeşitlilik tedavisinde yararlı.
Prostat kanseri tanısı en sık kanser ve kanser önde gelen nedenidir erkekler14ölümle ilgili. Docetaxel gibi antimitotic ajanlar prostat kanseri hastanın hayatta kalma geliştirmek ve bu hastalığı15,16,17tedavisinde bir dayanak noktası vardır. Ne yazık ki ilk tümör büzülme rağmen tümör hücreleri kez tedavisi sırasında ilaç direnci gelişir. Çeşitli Hücresel mekanizmalar deregülasyon apoptotik ve inflamatuar yollar veya harekete geçirmek/overexpression uyuşturucu sızma pompalar ATP-bağlayıcı kaset ışınlama gibi de dahil olmak üzere chemoresistance, gelişimi neden karıştığı olmuştur P-glikoprotein (P-gp/ABCB1), ikincisi olan hücreleri18,19dışına kemoterapötik ajanlar ihracat sonuçlanır. Taxanes direnç de tübülin isotypes veya ilaç ve onun hedef 20,21arasındaki etkileşimi önlemek tübülin mutasyonlar ifade değişiklikler gibi diğer nedenleri ile bağlantılı olmuştur. Ayrıca, direnç genom istikrarsızlık birikimi ve tümör heterojenite22,23ilgili olmuştur. Ancak, katkıda taxane direnç mekanizmaları tamamen, belirgin olduğu görünümünü önlemek tedavi stratejileri yokluğunda tarafından anlaşılır değil. Bu nedenle, bu mekanizmalar diseksiyon içinde yardımcı deneysel modelleri oluşturma ve bu ilaçların direnç gelişimini önlemek yeni tedavi yaklaşımları belirlemek için acil bir ihtiyaç vardır.
Bu makalede biz prostat kanseri hücreleri Docetaxel dayanıklı (DR) oluşturulmasını sağlayan bir yöntem açıklanmaktadır. Daha fazla koloni oluşumu deneyleri ve kantitatif RT-PCR kullanarak bu hücreler direnç durumunu doğrulamak nasıl anlatacağım. Bu yöntemle üretilen hücreler kamuya insan tümör örnek veritabanları üzerinde çok çeşitli deneysel deneyleri gerçekleştirmeye çok yönlülük sağlayan yararı ile bulunan moleküler özelliklerinin çoğunu recapitulating avantajı var. süre tümör örnekleri tarafından izin verilenden daha uzun süre. Bu kanser modelleri terapi direnç birçok hafta doku kültürü ve diğer yaklaşımlar arasında için genişletilmiş, genetik olarak manipüle, mikroskobu yöntemler tarafından görüntülenir ve gen ekspresyonu için analiz. Ayrıca, onlar daha fazla tümör oluşumu ve büyüme içinde vivoetkileri analiz farelerde xenotrasplanted olabilir. Şu anda, ilaç direnci prostat kanseri bağlamında incelemek için ana alternatif yöntem tümör örnekleri doğrudan analizidir. Bu örnekler gen ekspresyonu ve verilen tümörlerin mutational durumu hakkında bilgi toplamak için çok güçlü bir sistem mevcut iken, onlara erişim çok sınırlı olabilir ve onlar için başka işlemler ve deneysel analizi, sürdürmek zor olan kolayca bu protokolü24,25ile oluşturulan hücre hatları ile yapılabilir. Hastalardan doğrudan insan türetilmiş organoids nesil bir çok güçlü bir araç ve mevcut yöntemi26,27için alternatif olacaktır gibi önemlisi, gelecekte, alternatif yaklaşımlar. Ne bir tümör onun orijinal ortamında yapıldı bir 3D bağlamda özetlemek, organoids hücre satırları ve insan tümörler arasında mükemmel modeli olabilir. Henüz, bu protokol için açıklanan deneysel hücre modelleri hala daha korumak için uygun fiyatlı ve daha hızlı analiz için uygundur. Bu hücre satırları inceleyerek elde edilen sonuçlar için yaygınlaştırılması ve insan örnekleri ve 3D kültürlerde doğruladı. Bu nedenle, bu iletişim kuralı için bizim iletişim kuralı diğer uyuşturucu ve kanser türleri çalışmaya adapte edilebilir beri chemoresistance mekanizmaları herhangi bir hücre doğrultusunda çalışmaya araştırmacılar hücre modelleri Aradığınız ilgi olabilir. Burada açıklanan yöntemlerden herhangi bir laboratuvar, uygun fiyatlı uygulayın ve ilaç direnci moleküler ve hücresel mekanizmaların ön çalışmalar izin kolaydır.

<table><tbody><tr><td>DU145 hücreleri</td><td>ATCC</td><td>HTB-81</td><td></td></tr><tr><td>22Rv1 hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRL-2505</td><td></td></tr><tr><td>DMSO'da Docetaxel</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1148</td><td>(10mM)</td></tr> <tr><td>Doku kültürü şişesi 150cm2</td><td>Falcon</td><td>355001</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu doku kültürü plakaları</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Orta</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>%10 FBS ve %1 Penisilin / Streptomisin ile Desteklenmiş</td></tr><tr><td>Temel B Fetal Sığır Serumu</td><td>İkizler</td><td>900208</td><td></td></tr><tr><td>1X Fosfat Tamponlu Salin (PBS)</td> <td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>%0.05 Tripsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III, RT-PCR</td><td>Invitrogen</td><td>18080051</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green PCR Master Mix</td><td>Invitrogen</td><td>4367659</td><td></td></tr> Crystal Violet için ilk iplikçik sentez sistemi <tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0775</td><td></td></tr><tr>qRT-PCR için<td>%10 Formalin Çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Primerleri:</td> <td>Hayat teknolojiler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CK19 F: CTGCGGGACAAGATTCTTGGT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CK19 R: CCAGACGGGCATTGTCGAT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CDH1 F: GGAAGTCAGTTCAGACTCCAGCC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CDH1 R: AGGCCTTTTGACTGTAATCACACC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ABCB1 F: TGTTCAAACTTCTGCTCCTGA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ABCB1 R: CCCATCATTGCAATAGCAGG</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GATA2 F: CATCAAGCCCAAGCGAAGA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GATA2 R: TTTGACAGCTCCTCGAAGCA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AKTIN F: CATGTACGTTGCTATCCAGGC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AKTIN R: CTCCTTAATGTCACGCACGAT</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

prostat kanseri hücre modelleri anti-mitotik ajan docetaxel direnç üretimi

Generation of Prostate Cancer Cell Models of Resistance to the Anti-mitotic Agent Docetaxel

Mikrotubul hedefleme ajanları (MTAs) çok çeşitli tümör tedavisinde bir dayanak noktası vardır. Ancak, alınan kemoterapötik ilaçlara hastalık progresyon ortak bir mekanizma ve prognostik belirleyici özelliği Malign tümörlerin dirençtir. Prostat kanseri (PC), taxane Docetaxel gibi MTAs karşı direnç başarısız tedavi gibi bir kötü prognoz ve yüksek mortalite oranları tarafından tanımlanan hastalık ölümcül aşamaları doğru ilerleme belirler. Yıllardır okudu da, Edinsel direnç katkıda mekanizmaları dizi değil tamamen anlaşılır ve böylece bu aşamaları gelişmiş hastalarda faydalı olacağını yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için önemli bir sınırlama poz hastalık. Bu protokol için biz taklit son aşama prostat kanserinin öldürücü özellikleri ve bu nedenle mekanizmaları incelemek için kullanılan Docetaxel dayanıklı prostat kanseri hücre hatları nesil tarif tarafından alınan hangi chemoresistance doğar. Olası sınırlamalar içsel direnç özellikleri zamanla kaybı gibi bir hücre tabanlı modeline rağmen bu yöntemle üretilen Docetaxel dayanıklı hücre satırları başarıyla son çalışmalarda kullanılan ve ilerlemek için fırsat bizim öldürücü prostat Kanserinde Edinsel chemoresistance moleküler anlayışı.

Bu iletişim kuralı Docetaxel dayanıklı (DR) prostat kanseri hücrelerinin üretimi için yol açacaktır. Zaman çizelgesi tamamlanması için 4'ten 7 ay için şekil 1A ve şekil 1BProtokolü adımda şematik gösterimi özetlenen aralığı. Zaman yatırım seçtiğiniz hücre kültürünü ve ilaç konsantrasyonları iletişim kuralında taşıdıkları çeşitli bağlı olarak farklı olabilir. Önemlisi, her hücre kültürünü Docetaxel IC50 konsantrasyonu tayini iletişim kuralında seçim (şekil 2A) hücreler için kullanmak konsantrasyon aralığı artan ilaç tasarımı sağlar. Protokol başladıktan sonra DU145 ve 22Rv1 hücreleri üzerinde ilk Docetaxel etkileri Protokolü düzgün çalışıp çalışmadığını izlemek için mikroskop altında farklı zaman noktalarda görülebilir. Docetaxel tedavi sürecini izlemek için zaman Puan önerilir: Docetaxel maruz kalma (temel), 72 h, 7 gün ve 14 gün için Docetaxel maruz kaldıktan sonra önce. Sadece bir azınlık tümör hücrelerinin Docetaxel pozlama hayatta kalmak ve mikroskop (2B rakam) altında gözlenen klonlar oluşturmak unutmayın.
Temsilcisi koloni oluşumu deneyleri ve miktar grafikleri ebeveyn ve yeni oluşturulan Docetaxel dayanıklı (DR) hücre şekil 3Aiçinde gösterilir. Oluşturulan Docetaxel dayanıklı hücreleri ilaç konsantrasyonları daha ebeveyn hücre kadar 1000 kat daha fazla yüksek hayatta olabilir unutmayın.
Son olarak, Docetaxel dayanıklı fenotip qRT-PCR (şekil 3B) tarafından doğrulanabilir. Not Docetaxel dayanıklı hücreleri, ebeveyn hücrelere kıyasla, karakteristik up-düzenleme, ABCB1 ve GATA2 ve CK19 ve CDH1 aşağı-düzenlemesi görüntüler. Biz zaten deneysel olarak daha önce yayımlanmış çalışma GATA2 upregulation ve CK19 CDH1 ile birlikte downregülasyon her iki DR hücre modelleri28,29göstermiştir çünkü bu genlerin doğrulama için seçildi. ABCB1 gene aynı zamanda diğerleri sürekli ilaca dirençli hücreleri18,19upregulated olmak tarafından gösterilen bir elyaf gen olarak seçilmiştir. Ancak, diğer genler edebiyat göre ve hücre modelleri ve dayanıklı hücreleri üretmek için araştırmacı tarafından seçilen uyuşturucu bağlı olarak seçmiş olabilirsiniz unutmamak gerekir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56327/56327fig1.jpg"> 
Şekil 1: Docetaxel dayanıklı prostat kanseri hücre modelleri üretimi için zaman çizelgesi. (A)Docetaxel dayanıklı cep modelleri nesil için protokol zaman çizelgesinin temsilcisi diyagramı. Resimde Docetaxel tedavi, doğrulama adımları ve her bölümü için gerekli zamanı gösteriyor. (B) fonksiyonel koloni oluşumu deneyleri için 72 h (kırmızı) içinde belirtilen Docetaxel konsantrasyonları ile tedavi ebeveyn ve Docetaxel dayanıklı hücrelerinin de dahil olmak üzere iletişim kuralı doğrulama adımları şematik gösterimi temsilcisi Koloni yüzde ve qRT-PCR fenotipik doğrulama için grafiği. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56327/56327fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56327/56327fig2.jpg"> 
Resim 2: Docetaxel dayanıklı prostat kanseri hücre modeli sistemleri nesil. Docetaxel IC50 DU145 ve 22Rv1 ebeveyn prostat kanseri hücre hatlarında belirlenmesi tasvir eden(a)diyagramı (Adım 1 iletişim kuralı). Hücre canlılığı ve dozu artan konsantrasyonları gerekli Docetaxel beklenen yüzdeleri dahil edilir. Temsilcisi DU145 ve 22Rv1 hücre canlılığı grafikleri gösteren 5 nM IC50 Docetaxel maruz kalma 72 h sonra dahil olarak. Deneyler triplicates ve veri DU145 ortalama ± SD (B) temsilcisi parlak alan mikroskobu görüntülerini temsil eder ve 22Rv1 hücreleri kez Docetaxel direnç (Adım 2 iletişim kuralı) oluşturma sırasında gösterilir. İletişim kuralı tamamlandıktan sonra Kırmızı oklar Docetaxel dayanıklı bir klon gösterir. Ölçek çubukları = 50 nm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56327/56327fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56327/56327fig3.jpg"> 
Şekil 3: Docetaxel dayanıklı cep modelleri fonksiyonel ve fenotipik karakterizasyonu. (A)temsilcisi koloni oluşumu deneyleri ebeveyn ve Docetaxel dayanıklı hücre her tedavi toplama dahil grafik olarak temsil edilir için 72 h. kolonileri yüzdesi için belirtilen Docetaxel konsantrasyonları ile tedavi. Deneyler triplicates ve veri temsil SD ölçek barlar ortalama ± 5 mm. (B) DR/ebeveyn göreli mRNA kat artış = sayısal qRT-PCR tarafından ABCB1, GATA2, CK19 ve CDH1 gösterilir. Tüm qPCR ham veri aktin için normalleştirilmiş (Ayrıntılar için Protokolü Bkz:). Deneyler triplicates ve veri temsil ortalama ± SD * p &lt; 0,05. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56327/56327fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Kanser tedavileri için direnç hastalık ilerleme ve ölüm katkıda bulunmaktadır. Direnci mekanik temelleri belirleme terapötik yanıt artırmak için önemlidir. Prostat kanseri (PC) yolları dissekan yardımcı olmak için taxane dayanıklı cep modelleri oluşturmak için protokol Docetaxel direnç PC hastalarda ilerleme dahil bu el yazması ayrıntılar.

Prostat kanseri hücre modelleri Anti-Mitotik Ajan Docetaxel direnç üretimi

Microtubule targeting agents (MTAs) are a mainstay in the treatment of a wide range of tumors. However, acquired resistance to chemotherapeutic drugs is a ...

Bu prosedürün genel amacı, anti-mitotik tedavi direncini yönlendiren moleküler mekanizmaları incelemek için bir platform olarak Docetaxel'e dirençli kanser hücresi deneysel modelleri oluşturmaktır. Bu yöntem, hastalığın ilerlemesine katkıda bulunan sinyal yollarının belirlenmesi ve potansiyel hedeflenebilir stratejilerin belirlenmesi gibi kanser hücresi biyolojisi ve genomatik alanlardaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hasta tümör örneklerini ve hayvan modellerini kullanmanın yanı sıra, anti-kanser ilaç tepkilerini incelemek için deneysel modeller oluşturmanın güvenilir ve kolay bir yolu olmasıdır.Prosedürü gösterenler, laboratuvarımdan bir doktora sonrası araştırmacı olan Lisa Mohr ve ekibimizdeki başka bir doktora sonrası araştırmacı olan Jungreem Woo olacak. Bu işleme başlamak için, 20 mililitre ortam içeren 150 santimetre karelik şişelerde DU145 veya 22Rv1 hücrelerini plakalayın. 24 saat sonra, hücreler yaklaşık% 70 ila 80 birleşim noktasındayken, beş nanomolar da dosetaksel ekleyin.72 saat sonra, ilaç içeren ortamı aspire edin ve taze Dosetaksel içermeyen ortam ekleyin. Medyayı her üç ila dört günde bir değiştirin. Şişede klonlar görünene kadar bir ila iki hafta bekleyin.Ortamı aspire edin, hücreleri 15 mililitre PBS ile dikkatlice yıkayın ve hücreleri şişe yüzeyinden ayırmak için 37 santigrat derecede üç ila beş dakika boyunca dört mililitre% 0.05 Tripsin-EDTA ile inkübe edin. Ardından, sekiz mililitre taze ortam kullanarak Tripsinizli hücreleri şişeden yeniden süspanse edin. Hücreleri işlenmiş tüm şişelerden çekin ve santrifüjleme ile peletleyin.Bunu takiben, süperna-den'i çıkarın, hücre peletini 20 mililitre taze ortamda yeniden süspanse edin ve hücreleri 150 santimetre karelik şişelere yerleştirin. 24 saat sonra, hücreler yaklaşık% 70 ila 80 birleşimde olduğunda, tekrar beş nanomolar Docetaxel ekleyin. Klonlar şişede görünene kadar prosedürleri daha önce gösterildiği gibi tekrarlayın.Daha sonra hücreleri tekrar 150 santimetre karelik şişelere koyun. 24 saat sonra, hücreler yaklaşık% 70 ila 80 birleşim noktasındayken, onlara 10 nanomolar Docetaxel uygulayın. Dosetaksel dozu artan şekilde aynı adımları tekrarlayın ve her konsantrasyon işleminden sonra hayatta kalan klonları bir araya getirmeye devam edin.İşlemin sonunda, deneysel kullanıma hazır bir dirençli hücre havuzu elde edeceksiniz. Bu prosedürde, altı kuyucuklu plakada oyuk başına 2 mililitre ortam kullanan plaka 2.000 hücre. 24 saat sonra, hem DU145 hem de 22Rv1 hücre hatları için artan konsantrasyonlarda Docetaxel ekleyin.DMSO'yu yalnızca bir kuyucuğa ve en yüksek Docetaxel dozu için kullanılan aynı hacimde bir kontrole ekleyin. 72 saat sonra, ilaç içeren ortamı aspire edin ve taze Dosetaksel içermeyen ortam ekleyin. Koloniler mikroskop altında görünene kadar plakaları bir ila iki hafta inkübe edin.Kolonileri lekelemek için, iki ila üç mililitre PBS ile nazikçe yıkayın. İki ila üç mililitre kristal viyole solüsyonu ile doku kültürü başlığı veya çeker ocak içinde 20 dakika inkübe edin. Daha sonra, duran çözeltiyi çıkarın ve plakaları iki ila üç mililitre su ile yıkayın.Sonra suyu çıkarın ve plakaları havayla kurutun. Şekil temsili için plakaların dijital görüntülerini alın. Kuyuları görselleştirerek ve bir işaretleyici kalem yardımıyla kolonileri manuel olarak sayarak sonucu analiz edin.Ve bir grafikteki hücre canlılığının yüzdesini temsil eder. Burada, ebeveyn prostat kanseri hücre hatları DU145 ve 22Rv1'de Docetaxel IC50'nin belirlenmesini gösteren bir diyagram bulunmaktadır. İhtiyaç duyulan Docetaxel dozu artan konsantrasyonlarda beklenen hücre canlılığı yüzdeleri burada gösterilmektedir.Ve burada, Dosetaksel direncinin oluşumu sırasında belirtilen zamanlarda DU145 ve 22Rv1 hücrelerinin temsili Brightfield mikroskobu görüntüleri bulunmaktadır. Kırmızı oklar, protokol tamamlandıktan sonra Docetaxel'e dirençli bir klonu gösterir. Burada gösterilenler, Docetaxel'e dirençli hücrelerin fonksiyonel doğrulamasına karşılık gelen temsili koloni oluşum testleridir.Hücreler artan Docetaxel konsantrasyonlarına maruz bırakıldı ve sağkalım kristal viyole boyama ile değerlendirildi. Bu videoyu izledikten sonra, ilaca dirençli hücre dizilerinin nasıl oluşturulacağını ve doğrulanacağını iyi anlamış olmalısınız, bu daha sonra gen ekspresyon analizi ve genetik manipülasyonlar gibi seçtiğiniz incelemeler ve prosedürler için kullanılabilir. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.

generation-prostate-cancer-cell-models-resistance-to-anti-mitotic

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu videoda, prostat kanserinin taksana dirençli hücre modellerinin oluşturulması için bir protokol açıklanmaktadır. Bu modeller, prostat kanseri hastalarında dosetaksel direncine ilerlemede rol oynayan yolların incelenmesine yardımcı olabilir.

Kemodirençli Prostat Kanseri Hücrelerinin Oluşturulması: İn Vitro İlaca Dirençli Kanser Hücrelerinin Elde Edilmesi İçin Bir Prosedür

Bu videoda, koloni oluşumu testi kullanılarak prostat kanseri hücrelerinde kemoterapötik ilaç direncini değerlendirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu test, kanser hücrelerinde kemorezistansın yeni moleküler ve hücresel mekanizmalarını tanımlamak için fonksiyonel bir araç olarak kullanılabilir.

Fonksiyonel Kemorezistans Karakterizasyonu: Klonojenik Test Kullanarak Kanser Hücrelerinde İlaç Direncini Değerlendirmek İçin Bir Yöntem

Bu videoda, kemoterapötik ilaca dirençli kanser hücreleri için kristal viyole boyama prosedürü kullanan bir hücre canlılığı testi gösteriyoruz.

Kristal Menekşe Boyama: Koloni Oluşumu Deneylerini Kullanarak İlaca Dirençli Kanser Hücrelerini Görselleştirme Tekniği

Insan prostat kanser ortotopik bir model akciğer tümör hücreleri ve farklı metastaz oluşumu dolaşan tümör boyutu ölçümü sağlar. Hücreler birincil organı kaçmak gerekir gibi, kan dolaşımına girerek, ve bir ikincil site içine implant, bu modeli etkin insanlarda senaryo tartışıldı.

İnsan Prostat Kanser metastaz Ortotopik fare modeli

Bu makale, dolaşımdaki tümör hücrelerinden (CTC'ler) prostat kanseri hastasından türetilen ksenogreftler (PDX'ler) oluşturmak için kullanılan bir yöntemi detaylandırmaktadır. CTC'lerden PDX modellerinin oluşturulması, prostat kanserini incelemek için alternatif bir deneysel model sağlar; En sık teşhis edilen tümör ve erkeklerde kanserden sık görülen bir ölüm nedenidir.

Prostat Kanseri Hasta Üretimi Tümör Hücreleri Sirkülasyon gelen Xenograftlarında Modeller Türetilmiş

Prostat kanseri, Amerika Birleşik Devletleri'nde kansere bağlı ölümlerin en sık ikinci nedenidir. Ortotopik bir kanser modeli, prostat kanserinin biyolojisini anlamak ve terapötik rejimlerin etkinliğini değerlendirmek için yararlı bir yaklaşım sağlar. Bu protokol, ortotopik bir prostat kanseri fare modeli oluşturmak için gerekli ayrıntılı adımları açıklar.

İnsan Prostat Kanseri klinik öncesi Ortotopik murin modeli

Bu yazıda, dosetaksele dirençli meme kanseri hücrelerinde (MCF-7TXT) mikrotübül dinamik kararsızlığını ölçmek için in vivo bir yöntemi tanımlayan bir protokol sunuyoruz. Bu yöntemde, hedef hücrelerde GFP-tubulin ekspresyonunu tespit etmek için bir dekonvolüsyon mikroskobu görüntüleme sistemi kullanılır.

Canlı Görüntüleme taksan dirençli Meme Kanserlerinde Mikrotubul dinamik dengesizlik Eğitim için

Bu iletişim kuralı, prostat kanseri hücreleri, sonraki kastrasyon içi Prostatik enjeksiyon göstermek için hedeftir. Orthotopic önceden klinik androjen bağlı ve kısırlaştırma dayanıklı prostat kanseri hastalığı klinik tümör microenvironment ve immün bir ana bilgisayar bağlamında incelemek için kritik modellerdir.

Kollarındaki ve floresan Orthotopic Syngeneic fare modeli androjen bağlı ve kısırlaştırma dayanıklı prostat kanseri

Biz prostat tümörü diseksiyon odaklanmak, fare prostat kanseri modellerinin otopsi ve diseksiyon için bir yöntem göstermektedir. Fare prostat tümörü organoidlerin oluşturulması için adım adım bir protokol de sunulmaktadır.

Prostat kanseri genetiği Işlenmiş fare modelleri tümör Organoids üretimi

Burada sunulan prostat epitel organoidleri farmakolojik yanıtları çalışma için bir protokoldür. Organoidler vivo biyolojiye çok benzer ler ve hasta genetiğini yeniden özetlerler, bu da onları çekici model sistemleri haline getirir. Prostat organoidleri wildtype prostatlar, genetiği değiştirilmiş fare modelleri, iyi huylu insan dokusu ve ileri prostat kanserinden kurulabilir.

Genotipleri ve Mutasyonel Profilleri Farmakolojik Tepkilere Çeviren Araçlar Olarak Prostat Organoid Kültürleri

Öğrenin, DU145 ve 22Rv1 prostat kanseri hücrelerinde artan Docetaxel dozlarıyla dirençli hücre hatları üretme yöntemini. Bu protokol, anti-mitotik tedavi direncinin moleküler mekanizmalarını incelemek için güvenilir bir platform sunar.

Prostat kanseri hücre modelleri Anti-Mitotik Ajan Docetaxel direnç üretimi

Daha fazla video keşfet