Metastatik akciğer kolonizasyon pulmoner metastaz tahlil kullanarak osteosarkom içinde eğitim pratik düşünceler
12 Mart 2018
Bu makalede, pulmoner metastaz tahlil (PuMA) Protokolü'nün ayrıntılı bir açıklama sağlamak için hedeftir. Bu model araştırmacılar metastatik osteosarkom (OS) hücre büyümesini widefield floresan veya confocal mikroskop lazer tarama kullanarak akciğer dokusunda çalışmaya izin verir.
Bu pulmoner metastaz testinin genel amacı, canlı akciğer dokusunda metastatik osteosarkom hücrelerinin büyümesini doğrudan görselleştirmek ve incelemektir. Bu yöntem, osteosarkom metastazı alanındaki gerçekten önemli soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Metastatik osteosarkom hücrelerinin akciğer mikro ortamında nasıl adapte olduğu, hayatta kaldığı ve çoğaldığı gibi.
Bu tekniğin temel avantajı, metastatik osteosarkom hücre büyümesinin ilgili üç boyutlu bir mikro ortamda doğrudan görselleştirilmesine izin vermesidir. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, trakeanın kanüle edilmesi ve akciğerin şişirilmesi gibi teknik olarak zorlu adımlar nedeniyle mücadele edeceklerdir. Tümör hücrelerinin kuyruk damarı enjeksiyonu ve fare ötenazisi standart kurumsal yönergelere göre yapılır.
Beş dakika sonra, ötenazi yapılmış fareyi laminer akış başlığındaki steril bir ped üzerine dorsal yaslanma pozisyonuna yerleştirin ve akciğerleri delmeden, trakeanın her iki tarafındaki torasik girişi geçecek şekilde sternumu dikkatlice incelemek için küçük, steril bir makas kullanın. Trakeayı çevreleyen tüm kas ve bağ dokusunun diseke edilmesi, başarılı bir kanülasyon için çok önemlidir. Daha sonra, trakeayı dikkatlice kanüle etmek için 20 gauge IV kateter kullanın ve kateteri ve trakeayı gevşek bir şekilde sabitlemek için steril bir katgüt sütürü kullanın.
Kateterden bir IV uzatma setini bir yerçekimi füzyon aparatının 10 mililitrelik şırıngasına takın ve orta çözelti ile karıştırılmış 37 santigrat derece sıvı agarozu şırıngaya dökün. Akciğerleri tamamen şişirilene kadar agaroz solüsyonu ile doldurun. Daha sonra kanülü çıkarın ve agaroz solüsyonunun sızmasını önlemek için dikişi sıkıca bağlayın.
İnsuflasyon sırasında akciğerin sağlam tutulması önemlidir. Agaroz ile uygun bir insüflasyon ve ardından koparmanın soğutulması, akciğeri genişlemiş bir durumda tutacaktır. Akciğerin yüzeyini delmemeye veya zarar vermemeye dikkat ederek koparmayı, trakeayı, kalbi ve akciğeri hasat edin.
Dokuları antibiyotiklerle desteklenmiş 30 mililitre önceden soğutulmuş PBS'ye yerleştirin ve agarozun katılaşmasına izin verin. Koparmayı 20 dakika boyunca buzun üzerine koyun. 20 dakika sonra, akciğeri 3 x 1,5 milimetrelik parçalar halinde kesmek için ince makas ve cımbız kullanın ve dilimleri, B ortamında önceden ıslatılmış 2 x 2 santimetre jelatin sünger içeren 6 oyuklu bir plakanın ayrı oyuklarına yerleştirin.
Görüntüleme gününde, akciğer dilimlerini 6 oyuklu plakadan, deney gruplarına göre sütunlar halinde steril bir 35 milimetre cam tabanlı yuvarlak tabağa dikkatlice aktarın. Daha sonra, geniş alanlı bir floresan mikroskobunda, 2,5x objektifi seçin ve kontrol dokusu örnek grubundaki floresan tümör hücreleri ile floresan olmayan arka plan dokusu arasında en iyi kontrastı sağlamak için görüntüleme parametrelerini ayarlayın. Kontrol dokuları ile aynı parametreleri kullanarak tüm numuneleri görüntüleyin.
Yazılım ölçek kalibrasyonlu değilse, bir ölçek referansı elde etmek için akciğer dokusuyla aynı amacı kullanarak bir mikrometre görüntüleyin ve tüm görüntüleri tif dosyaları olarak kaydedin. Tüm görüntüler elde edildiğinde, görüntüleri ImageJ'de analiz etmek için ilk dosyayı açın. Toplam akciğer diliminin alanını belirlemek için tüm akciğer diliminin ana hatlarını çizmek için çokgen seçim aracını kullanın.
İşlemi seçin ve arka planı çıkarın. Yuvarlanan top yarıçapını 50 piksellik bir başlangıç değerine ayarlayın. Bu değer, arka plan floresan derecesine bağlı olacaktır ve her veri seti için optimize edilmelidir.
Açık renkli arka planın işaretini kaldırdığınızdan emin olun. Görüntüyü seçin ve yazın, 8 bit, ardından görüntü ve özellikler, pikselleri girin. Uzunluk birimi altında, piksel genişliği, piksel yüksekliği ve voksel derinliği için 1 girin.
Ardından, bu parametreleri sonraki tüm görüntülere uygulamak için genel'i kontrol edin. Ardından, görüntüyü seçin, ardından ayarlayın, ardından eşiği seçin. Varsayılanı ve siyah beyazı vurgulayın ve tümör hücrelerinin çoğunun doğru bir şekilde vurgulanması için görüntüyü eşiklemek için kaydırıcıyı kullanın.
Akciğeri siyaha ve floresan lezyonları beyaza çevirmek için bir kez uygula'ya tıklayın. Ardından, tüm floresan yapıların siyaha dönmesi için görüntüyü ters çevirmek üzere ikinci kez uygula'yı tıklayın. Lezyonların sayısını ve şeklini ölçmek için seçin, analiz edin ve ölçümleri ayarlayın ve alanı kontrol edin.
Diğer tüm kutuların işaretini kaldırın. Ardından, parçacıkları analiz et'i seçin ve boyut alanında, programın numaralandıracağı şekil aralığını ayarlamak için ImageJ tarafından tek hücre olarak belirlenen en küçük lezyonun alanını kullanın. Tek bir tümör hücresi olarak kabul edilen en küçük alanı seçmek için sıfırıncı gün araç grubundan bir görüntü kullanın.
Alt sınır ayarlandığında, Tamam'ı tıklayın. Numaralandırılan tüm şekilleri ve alan ölçümlerini içeren bir sonuç penceresi açılacaktır. Ardından, sonuçlar penceresindeki verileri kopyalayıp bir elektronik tabloya yapıştırın ve söz konusu akciğer dilimi için metastatik lezyonların tüm alanlarını eklemek için toplam matematiksel işlevi kullanın.
Yüksek ve düşük metastatik hücre hatları için metastatik eğilimler, ilerleyici zaman noktalarında görsel olarak belirgindir. Daha spesifik olarak, bu mikroskopi görüntüleri, yüksek metastatik hücrelerin akciğeri düşük metastatik hücre hatlarından daha verimli bir şekilde kolonize edebildiğini göstermektedir. Görüntü analizi, nicelleştirme ve görüntü verilerinin istatistiksel analizi, yüksek metastatik tümör hücrelerinin akciğer dokusunu verimli bir şekilde kolonize edebileceğini doğrular.
Oysa düşük metastatik hücreler hiç büyüyemez. Yüksek büyütmeli konfokal floresan mikroskobu, EGFP eksprese eden tümör hücrelerine kıyasla akciğer parankim hücrelerinin büyük uzamsal ayrıntılarla görüntülenmesini sağlar. Bu mitokondri gibi hücre altı yapıların analizini kolaylaştırır.
Kullanılan fare sayısına bağlı olarak, bu teknik uygun şekilde yapılırsa dört saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, temiz, steril cerrahi ekipmanla çalışmayı unutmamak önemlidir. Geliştirildikten sonra, teknik, kanser araştırmaları alanındaki araştırmacıların farelerin akciğerlerindeki metastaz ilerlemesini keşfetmelerinin yolunu açtı.
Bu prosedürü takiben, gen yıkımı veya ilaç tedavisinin kanser hücreleri üzerindeki etkileri hakkında ek soruları yanıtlamak için in vitro hücre kültürü tahlilleri ve western blotlama gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, pulmoner metastaz testinin nasıl yapıldığını iyi anlamış olmalısınız. İnsan kanser hücreleri ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman biyolojik düzeyde güvenlik iki laboratuvarında çalışmak gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, akciğer dokusunda metastatik osteosarkom hücre büyümesinin görselleştirilmesine ve incelenmesine olanak tanıyan pulmoner metastaz deneyi (PuMA) protokolünü açıklamaktadır. Bu yöntem, söz konusu hücrelerin üç boyutlu bir mikroçevrede nasıl adapte oldukları ve çoğaldıkları hakkında bilgiler sunmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Onkoloji
- Metastaz Araştırmaları
Arka Plan
- Metastatik osteosarkom, çalışılması zor bir kanser türüdür.
- Akciğer mikroçevresindeki hücre davranışını anlamak kritik öneme sahiptir.
- PuMA modeli, bu tür çalışmalar için uygun bir platform sunar.
- Analizin uygulanmasında teknik zorluklar bulunmaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Metastatik osteosarkom hücre büyümesini görselleştirmek.
- Akciğer dokusundaki hücre adaptasyonunu ve sağkalımını incelemek.
- Osteosarkom metastazına dair anlayışı geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Akciğer insüflasyonu için trakeanın kanüle edilmesi.
- Tümör hücrelerinin kuyruk venine enjeksiyonu.
- Geniş alan floresan veya konfokal lazer tarama mikroskobunun kullanımı.
- Hayvan ötanazisine yönelik kurumsal yönergelere uyulması.
Temel Sonuçlar
- Metastatik hücre büyümesinin doğrudan görselleştirilmesi sağlanmıştır.
- Üç boyutlu bir ortamda hücre proliferasyonuna dair öngörüler elde edilmiştir.
- Akciğerdeki temel sağkalım mekanizmaları tanımlanmıştır.
- Yeni araştırmacılar için karşılaşılan teknik zorluklar vurgulanmıştır.
Sonuçlar
- PuMA analizi, osteosarkom metastazını incelemek için değerli bir araçtır.
- Metastatik davranış hakkında kritik bilgiler sağlar.
- Gelecekteki çalışmalar, kanser metastazını daha iyi anlamak için bu metodolojiyi temel alabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluğu
Pulmoner metastaz analizi (PuMA), osteosarkom hücrelerinin akciğer dokusundaki kolonizasyonunun doğrudan görselleştirilmesine olanak tanıyarak, metastatik potansiyelin ve terapötik müdahalenin değerlendirilmesi için fizyolojik olarak ilgili bir model sunar. Bu ex vivo sistem, tümör hücresinin üç boyutlu bir mikroortamdaki adaptasyonunun, sağkalımının ve proliferasyonunun gerçek zamanlı değerlendirilmesine imkan vererek mekanistik risk azaltmaya destek olur. Fenotipik sonuçları hastalıkla ilgili bir sistemde ilaç etkileriyle ilişkilendirerek, hedef doğrulaması ve öncü bileşik belirlemedeki öngörü güvenilirliğini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Metastatik osteosarkom hücrelerinin akciğer mikroçevresine nasıl adapte olduğunu ve burada nasıl hayatta kaldığını görselleştirerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Tümör hücresi davranışının ilgili bir doku bağlamında doğrudan gözlemlenmesi yoluyla biyolojik risklerin azaltılmasını destekler.
- Stratejik Değer: Genetik veya farmakolojik pertürbasyonları, metastatik kolonizasyondaki ölçülebilir değişikliklerle ilişkilendirerek hedef güvenini kolaylaştırır.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Bilimsel Değer: Lezyon alanı ve sayısı hakkında görüntü tabanlı kantitatif veriler sağlayarak, farklı deneysel koşullar arasında metastatik büyümenin standartlaştırılmış değerlendirmesine olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Geniş alanlı ve konfokal floresan mikroskopi ile uyumlu olup bileşik tarama işlemleri için ölçeklenebilir görüntüleme iş akışlarına imkan verir.
- Stratejik Değer: Anti-metastatik terapötiklerin zaman içindeki etkinliğini değerlendirmek için kullanılabilecek tekrarlanabilir ve ölçülebilir çıktılar üreterek assay hazırlık sürecini destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Osteosarkom metastatik nişini modellemek için fare akciğer dokusu kullanarak hastalıkla olan ilgiyi korur ve mikroçevresel etkileşimlerin incelenmesine olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Tümör büyümesindeki dinamik değişiklikleri ve müdahaleye verilen yanıtı değerlendirmek için boylamsal görüntülemeye imkan verir.
- Stratejik Değer: In vitro modeller ile in vivo metastaz arasında bir köprü kurarak, keşif aşamasındaki bulguları preklinik doğrulamaya bağlar.
İş Akışı ve İşlem Hattı Entegrasyonu
PuMA modeli, hedef doğrulamadan öncü bileşik tanımlamaya ve preklinik değerlendirmeye kadar uzanan keşif sürekliliğine uyum sağlayarak, adayların metastatik fenotipe göre önceliklendirilmesi için bir platform sunmaktadır.
- Keşif Biyolojisi: Osteosarkom hücrelerinin akciğer dokusini nasıl kolonize ettiğinin ve mikroçevresel ipuçlarına nasıl yanıt verdiğinin görselleştirilmesini sağlayarak hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Metastatik lezyon alanı gibi, ImageJ gibi görüntü analiz araçları kullanılarak ölçülebilen ve tedavi grupları arasında karşılaştırılabilen kantitatif çıktılar sunar.
- Analitik: Tümör hücresi proliferasyonu ve uzaysal dağılımı hakkında ölçülebilir veriler oluşturarak, yüksek ve düşük metastatik hatlar arasındaki farkları doğrulamak için istatistiksel analizi destekler.
- Translasyonel Araştırma: Metastatik hücrelerde gen fonksiyonunu, promotor aktivitesini ve hücre altı yapıları incelemek için sağlam akciğer eksplantları kullanarak preklinik süreklilikle uyum sağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Tutarlı ve standardize edilmiş bir sistemde birden fazla terapötik adayı veya genetik modifiyeriyi değerlendirmek için yeniden kullanılabilir bir platform sunar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Kolonizasyonun doğrudan görsel onayı yoluyla metastatik potansiyeldeki belirsizliği azaltarak öngörü güvenilirliğini artırır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış doku hazırlama, görüntüleme parametreleri ve nicelleştirme protokolleri aracılığıyla tekrarlanabilirliği geliştirir.
- Stratejik Değer: Anti-metastatik etkinlik hakkında erken ve mekanistik içgörü sağlayarak geç aşama başarısızlık riskini azaltır ve devam/dur kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Bileşiklerin, hastalıkla ilişkili bir akciğer mikroortamında kolonizasyonu inhibe etme yeteneklerine göre riskle uyumlu önceliklendirilmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Akciğer bütünlüğünü korumak için fare doku diseksiyonu, trakeal kanülasyon ve agaroz insufflasyonu konularında uzmanlık gerektirir.
- Kuantifikasyon için floresan mikroskopi sistemlerine (geniş alan veya konfokal) ve ImageJ gibi görüntü analiz yazılımlarına erişime bağlıdır.
- Sonuçların karşılaştırılabilirliğini sağlamak amacıyla doku dilimleme, plakalama ve görüntüleme koşullarında ekipler arası standardizasyon gereklidir.
- Modelin farklı hücre hatlarına veya genetik arka planlara uygulanmasında, özellikle partikül analizi için tek hücre eşiklerinin belirlenmesinde adaptasyon değerlendirmelerini içerir.
- İşlem hacmini etkileyebilecek ve tutarlı uygulama için eğitim gerektirebilecek olan akciğer diseksiyonu ve insufflasyonunun teknik karmaşıklığı ile sınırlıdır.
