Metastatik akciğer kolonizasyon pulmoner metastaz tahlil kullanarak osteosarkom içinde eğitim pratik düşünceler

Bu pulmoner metastaz testinin genel amacı, canlı akciğer dokusunda metastatik osteosarkom hücrelerinin büyümesini doğrudan görselleştirmek ve incelemektir. Bu yöntem, osteosarkom metastazı alanındaki gerçekten önemli soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Metastatik osteosarkom hücrelerinin akciğer mikro ortamında nasıl adapte olduğu, hayatta kaldığı ve çoğaldığı gibi.

Bu tekniğin temel avantajı, metastatik osteosarkom hücre büyümesinin ilgili üç boyutlu bir mikro ortamda doğrudan görselleştirilmesine izin vermesidir. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, trakeanın kanüle edilmesi ve akciğerin şişirilmesi gibi teknik olarak zorlu adımlar nedeniyle mücadele edeceklerdir. Tümör hücrelerinin kuyruk damarı enjeksiyonu ve fare ötenazisi standart kurumsal yönergelere göre yapılır.

Beş dakika sonra, ötenazi yapılmış fareyi laminer akış başlığındaki steril bir ped üzerine dorsal yaslanma pozisyonuna yerleştirin ve akciğerleri delmeden, trakeanın her iki tarafındaki torasik girişi geçecek şekilde sternumu dikkatlice incelemek için küçük, steril bir makas kullanın. Trakeayı çevreleyen tüm kas ve bağ dokusunun diseke edilmesi, başarılı bir kanülasyon için çok önemlidir. Daha sonra, trakeayı dikkatlice kanüle etmek için 20 gauge IV kateter kullanın ve kateteri ve trakeayı gevşek bir şekilde sabitlemek için steril bir katgüt sütürü kullanın.

Kateterden bir IV uzatma setini bir yerçekimi füzyon aparatının 10 mililitrelik şırıngasına takın ve orta çözelti ile karıştırılmış 37 santigrat derece sıvı agarozu şırıngaya dökün. Akciğerleri tamamen şişirilene kadar agaroz solüsyonu ile doldurun. Daha sonra kanülü çıkarın ve agaroz solüsyonunun sızmasını önlemek için dikişi sıkıca bağlayın.

İnsuflasyon sırasında akciğerin sağlam tutulması önemlidir. Agaroz ile uygun bir insüflasyon ve ardından koparmanın soğutulması, akciğeri genişlemiş bir durumda tutacaktır. Akciğerin yüzeyini delmemeye veya zarar vermemeye dikkat ederek koparmayı, trakeayı, kalbi ve akciğeri hasat edin.

Dokuları antibiyotiklerle desteklenmiş 30 mililitre önceden soğutulmuş PBS'ye yerleştirin ve agarozun katılaşmasına izin verin. Koparmayı 20 dakika boyunca buzun üzerine koyun. 20 dakika sonra, akciğeri 3 x 1,5 milimetrelik parçalar halinde kesmek için ince makas ve cımbız kullanın ve dilimleri, B ortamında önceden ıslatılmış 2 x 2 santimetre jelatin sünger içeren 6 oyuklu bir plakanın ayrı oyuklarına yerleştirin.

Görüntüleme gününde, akciğer dilimlerini 6 oyuklu plakadan, deney gruplarına göre sütunlar halinde steril bir 35 milimetre cam tabanlı yuvarlak tabağa dikkatlice aktarın. Daha sonra, geniş alanlı bir floresan mikroskobunda, 2,5x objektifi seçin ve kontrol dokusu örnek grubundaki floresan tümör hücreleri ile floresan olmayan arka plan dokusu arasında en iyi kontrastı sağlamak için görüntüleme parametrelerini ayarlayın. Kontrol dokuları ile aynı parametreleri kullanarak tüm numuneleri görüntüleyin.

Yazılım ölçek kalibrasyonlu değilse, bir ölçek referansı elde etmek için akciğer dokusuyla aynı amacı kullanarak bir mikrometre görüntüleyin ve tüm görüntüleri tif dosyaları olarak kaydedin. Tüm görüntüler elde edildiğinde, görüntüleri ImageJ'de analiz etmek için ilk dosyayı açın. Toplam akciğer diliminin alanını belirlemek için tüm akciğer diliminin ana hatlarını çizmek için çokgen seçim aracını kullanın.

İşlemi seçin ve arka planı çıkarın. Yuvarlanan top yarıçapını 50 piksellik bir başlangıç değerine ayarlayın. Bu değer, arka plan floresan derecesine bağlı olacaktır ve her veri seti için optimize edilmelidir.

Açık renkli arka planın işaretini kaldırdığınızdan emin olun. Görüntüyü seçin ve yazın, 8 bit, ardından görüntü ve özellikler, pikselleri girin. Uzunluk birimi altında, piksel genişliği, piksel yüksekliği ve voksel derinliği için 1 girin.

Ardından, bu parametreleri sonraki tüm görüntülere uygulamak için genel'i kontrol edin. Ardından, görüntüyü seçin, ardından ayarlayın, ardından eşiği seçin. Varsayılanı ve siyah beyazı vurgulayın ve tümör hücrelerinin çoğunun doğru bir şekilde vurgulanması için görüntüyü eşiklemek için kaydırıcıyı kullanın.

Akciğeri siyaha ve floresan lezyonları beyaza çevirmek için bir kez uygula'ya tıklayın. Ardından, tüm floresan yapıların siyaha dönmesi için görüntüyü ters çevirmek üzere ikinci kez uygula'yı tıklayın. Lezyonların sayısını ve şeklini ölçmek için seçin, analiz edin ve ölçümleri ayarlayın ve alanı kontrol edin.

Diğer tüm kutuların işaretini kaldırın. Ardından, parçacıkları analiz et'i seçin ve boyut alanında, programın numaralandıracağı şekil aralığını ayarlamak için ImageJ tarafından tek hücre olarak belirlenen en küçük lezyonun alanını kullanın. Tek bir tümör hücresi olarak kabul edilen en küçük alanı seçmek için sıfırıncı gün araç grubundan bir görüntü kullanın.

Alt sınır ayarlandığında, Tamam'ı tıklayın. Numaralandırılan tüm şekilleri ve alan ölçümlerini içeren bir sonuç penceresi açılacaktır. Ardından, sonuçlar penceresindeki verileri kopyalayıp bir elektronik tabloya yapıştırın ve söz konusu akciğer dilimi için metastatik lezyonların tüm alanlarını eklemek için toplam matematiksel işlevi kullanın.

Yüksek ve düşük metastatik hücre hatları için metastatik eğilimler, ilerleyici zaman noktalarında görsel olarak belirgindir. Daha spesifik olarak, bu mikroskopi görüntüleri, yüksek metastatik hücrelerin akciğeri düşük metastatik hücre hatlarından daha verimli bir şekilde kolonize edebildiğini göstermektedir. Görüntü analizi, nicelleştirme ve görüntü verilerinin istatistiksel analizi, yüksek metastatik tümör hücrelerinin akciğer dokusunu verimli bir şekilde kolonize edebileceğini doğrular.

Oysa düşük metastatik hücreler hiç büyüyemez. Yüksek büyütmeli konfokal floresan mikroskobu, EGFP eksprese eden tümör hücrelerine kıyasla akciğer parankim hücrelerinin büyük uzamsal ayrıntılarla görüntülenmesini sağlar. Bu mitokondri gibi hücre altı yapıların analizini kolaylaştırır.

Kullanılan fare sayısına bağlı olarak, bu teknik uygun şekilde yapılırsa dört saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, temiz, steril cerrahi ekipmanla çalışmayı unutmamak önemlidir. Geliştirildikten sonra, teknik, kanser araştırmaları alanındaki araştırmacıların farelerin akciğerlerindeki metastaz ilerlemesini keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu prosedürü takiben, gen yıkımı veya ilaç tedavisinin kanser hücreleri üzerindeki etkileri hakkında ek soruları yanıtlamak için in vitro hücre kültürü tahlilleri ve western blotlama gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, pulmoner metastaz testinin nasıl yapıldığını iyi anlamış olmalısınız. İnsan kanser hücreleri ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman biyolojik düzeyde güvenlik iki laboratuvarında çalışmak gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.