Monosit/makrofajlar tümör Microenvironment için işe alım çalışmaya kanser hücre hatlarında gen ifadesinin koşullu nakavt
23 Kasım 2017
Bu iletişim kuralı olarak bir düzeni kanser hücre satırları ve sonraki kullanımı, işlevsel bir Tet-ON sistemi kurmak için özellikle monosit/makrofajlar tümör microenvironment için işe alım içinde tümör hücre kaynaklı proteinlerin rolü eğitimi için hizmet vermektedir.
Bu protokolün genel amacı, monositlerin ve makrofajların in vitro olarak tümör mikroçevresine alımını incelemek için kanser hücrelerinde gen ekspresyonunun koşullu yıkımını kullanmaktır. Bu yöntem, kanser hücreleri ile bağışıklık sistemi hücreleri arasındaki çapraz stokun doğası ile ilgili tümör mikroçevre alanındaki önemli soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, burada kullanılan sistemin tek vektör klonlaması gerektirmesi, birden fazla klonun hızlı bir şekilde üretilmesine izin vermesi ve çok düşük kalınlık seviyeleri sergilemesidir.
Ayrıca, insan monositlerinin antikorlarla doğrudan temas etmeden saflaştırılması için bir yöntem de gösterilmiştir, bu da kazara aktivasyonu önlerken %95'ten fazla saf insan monosit popülasyonu ile sonuçlanır. Viral partiküller üretmek için, HEK-293 hücrelerinin %70'ini 150 milimetrelik tabakları 25 mikrogram pLKO-tet-on shRNA, 25 mikrogram psPAX ambalaj plazmidi ve beş mikrogram zarf eksprese eden plazmit pMD2 ile birleştirin. G, standart protokollere göre transfeksiyon reaktifi kullanarak.
Karışımı 150 milimetrelik tabaklara ekleyin. Ertesi gün, ortamı 10 milimolar sodyum bütirat ve 20 milimolar HEPES ile desteklenmiş DMEM'e değiştirerek hücrelerde Lentiviral üretimini indükleyin. 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte sekiz saat kültür.
Sekiz saat sonra, hücreleri PBS ile yıkayın ve 20 milimolar HEPES ve sodyum bütirat olmadan 25 mililitre taze DMEM ortamı ekleyin. 48 saat inkübasyondan sonra, virüs içeren ortamı bir pipetle dikkatlice toplayın. Kararlı hücre hatları oluşturmak için, HCT-116 kolon kanseri hücrelerini ve MDA-MB-231 meme kanseri hücrelerini 12 oyuklu bir plakaya ve kuyu başına 50.000 hücreye tohumlayarak başlayın.
37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Hücreler% 60-70 birleştiğinde, hücreleri PBS ile yıkayın ve her oyuğa bir mililitre virüs içeren ortam ekleyin. Ertesi gün, virüs içeren ortamı aspirasyon ile dikkatlice çıkarın.
Daha sonra hücreleri PBS ile yıkadıktan sonra, tetrasiklin içermeyen FBS içeren ortamı ekleyin. 72 saat sonra, hücreleri daha önce olduğu gibi yıkayın ve virüs transfekte edilmiş hücrelerin seçimi için mililitre başına bir mikrogram puromisin ile takviye edilmiş ortam ekleyin. Hücreleri üç ila 14 gün boyunca puromisin varlığında kültürleyerek virüs ile transdüksiyon yapılan hücreleri seçin.
Virüs ile transdüksiyonlu hücrelere sahip hücrelerde kuyucukların puromisin tarafından kısmen öldürülmesini gözlemleyin. Transdüksiyon yapılmamış hücreler puromisin varlığında büyümez. Bu kontrol hücreleri öldüğünde, şartlı olarak düzenlenmiş hücre hatlarını oluşturmak için antibiyotiklerin varlığında iki hafta boyunca şartlı olarak düzenlenmiş hücre hatlarının kültürüne devam edin.
Puromisine dirençli HCT-116 kolon kanseri ve MDA-MB-231 meme kanseri hücrelerinde, farklı konsantrasyonlarda doksisiklin içeren ortam ekleyerek ve hücreleri 72 saat boyunca kültürleyerek koşullu yıkımın etkinliğini doğrulayın. Hücre lizatını hazırladıktan sonra, western blot analizi ile yıkım seviyesini doğrulayın. PAI-1 seviyeleri burada gösterilmektedir.
Periferik kan monositlerini izole etmek için, önce 15 mililitre yoğunluk gradyan çözeltisi içeren üç adet 50 mililitrelik tüp hazırlayın. Ardından, yoğunluk gradyan çözeltisi üzerine 30 mililitre seyreltilmiş kanı yavaşça katmanlamak için yerçekimi akışına ayarlanmış bir pipet kontrolörü kullanın. Döner rotorda 400 g'da oda sıcaklığında 25 dakika ara vermeden santrifüjleyin.
Santrifüjlemeyi takiben, üst tabakayı atın ve periferik kan mononükleer hücrelerini içeren orta tabakayı 50 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve 50 mililitreye kadar FBS takviyeli PBS ekleyin. 120 g'da oda sıcaklığında 10 dakika santrifüjleyin. Döndürmeden sonra, içeren trombosit içeren süpernatanı çıkarın.
Son santrifüjleme ve toplamanın ardından, peleti 50 mililitre FBS takviyeli PBS içinde yeniden süspanse edin ve bir hemositometre kullanarak periferik kan mononükleer hücrelerini sayın. Hücreleri 120 g'da santrifüjledikten sonra, bir milimolar EDTA içeren FBS takviyeli PBS'deki peleti, mililitre başına 50 milyon hücrelik bir nihai konsantrasyona yeniden süspanse edin. Daha sonra her mililitre hücre süspansiyonu için 50 mikrolitre negatif seçim antikor kokteyli ekleyerek monositler için zenginleştirmeye başlayın ve karıştırın.
Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, mililitre başına 50 mikrolitre manyetik boncuk ekleyin, karıştırın ve 10 dakika daha inkübe edin. Daha sonra 25 mililitreye kadar FBS ve EDTA ile PBS ekleyin ve periferik kan mononükleer karışımını 50 mililitrelik bir tüpü barındırabilecek bir mıknatısa yerleştirin.
Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edildikten sonra, manyetik boncuklar tüpün duvarlarına yapışacak ve monositik olmayan hücreleri çözeltiden ayıracaktır. Monosit içeren çözeltiyi tüpten çıkarmak için 25 mililitrelik bir pipet kullanın ve tüpün kenarlarına pipetle dokunmamaya dikkat edin. Süpernatanı santrifüjledikten ve çıkardıktan sonra, pelet içeren monositleri %10 TET içermeyen FBS ve %1 pen-strep içeren RPMI ortamında yeniden süspanse edin.
Teste, 40.000 HCT-116 veya MDA-MB-231 hücresini, üç parçalı 24 oyuklu bir plakanın oyuklarında 0.5 mililitrelik bir hacimde tohumlayarak başlatın. Ertesi gün, kuyuya bir filtre ekleyin. Daha sonra, 0.3 mililitrelik bir hacimde 8.000 monositi, kanser hücrelerinin üstüne yerleştirilmiş BSA ile muamele edilmiş gözenekli bir zar ekine yerleştirin ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.
Ekleri 48 saat sonra toplayın. Fazla ortamı silkeleyin ve göç etmeyen hücreleri çıkarmak için iç yüzeyi pamuk uçlu bir aplikatörle hassas bir şekilde kaydırın. Ek parçanın dış tarafını Wright-Giemsa yöntemini kullanarak boyayın.
Filtreleri, taşınan makrofajlar yukarı bakacak şekilde monte ettikten sonra, slaytları 20 güç objektifine sahip bir ışık mikroskobu kullanarak görüntüleyin. Filtre başına dokuz alanın resimlerini çekin ve tüm alanlardaki taşınan makrofajları sayın. Boyden Odası Testi, monositlerin kanser hücrelerine doğru göçünü ölçmek için kullanıldı.
MDA-MB-231 meme kanseri hücrelerinin varlığında, PAI-1'i aşağı regüle etmek için ko-kültüre doksisiklin eklendikten sonra monositlerin göçü% 33 oranında inhibe edildi. Monosit göçünün bu inhibisyonu, doksisiklin uygulaması ile PAI-1'in yıkılmasının monosit göçünü %74 oranında azalttığı HCT-116 kolon kanseri hücrelerinin varlığında daha belirgindi. Bu videoyu izledikten sonra, kanserden türetilen salgılanan protein PAI-1'in insan monositleri üzerindeki kemoatraktan etkisini incelemek için insan kanser hücre hatlarında gen ekspresyonunun yıkılması için işlevsel bir tet-on sisteminin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, kanser hücre hatları için işlevsel bir Tet-ON sistemini tasvir eder ve tümör mikroçevresine monosit/makrofaj işe alımında tümör hücresinden türetilen proteinlerin rolüne odaklanır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre Biyolojisi
- İmmünoloji
- Kanser Araştırmaları
Arka Plan
- Kanser hücreleri ve bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimi anlamak, kanser araştırmaları için çok önemlidir.
- Monositler ve makrofaglar tümör mikroçevresinde önemli roller oynar.
- Koşullu knockdown teknikleri bu etkileşimlere dair içgörüler sağlayabilir.
- İnsan monositlerin arıtma yöntemleri doğru çalışmalar için esastır.
Çalışmanın Amacı
- Bağışıklık hücrelerinin tümörlere işe alım mekanizmalarını araştırmak.
- Kanser hücrelerinde koşullu gen ekspresyonu için bir Tet-ON sistemini kullanmak.
- Tümör-bağışıklık hücresi etkileşimlerini daha iyi anlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Kanser hücrelerinde gen ekspresyonunun koşullu knockdown'u.
- Birden fazla klonun hızlı üretimi için tek vektör klonlama.
- Antikor teması olmadan insan monositlerin arıtılması.
- Viral partiküller üretmek için HEK-293 hücrelerinin transfeksiyonu.
Ana Sonuçlar
- Kanser hücre hatlarında bir Tet-ON sistemi başarıyla kuruldu.
- İnsan monosit popülasyonlarında %95'ten fazla saflık elde edildi.
- In vitro bağışıklık hücrelerinin etkili işe alımının gösterilmesi.
- Tümör mikroçevresindeki dinamikler hakkında içgörüler sağlandı.
Sonuçlar
- Tet-ON sistemi, kanser-bağışıklık etkileşimlerini incelemek için değerli bir araçtır.
- Koşullu knockdown teknikleri, belirli genlerin rolünü açıklayabilir.
- Monosit işe alımının anlaşılması, terapötik stratejiler hakkında bilgi sağlayabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Conditional gene knockdown in cancer cell lines enables mechanistic interrogation of tumor-immune interactions, specifically the role of secreted factors like PAI-1 in monocyte recruitment. This approach supports target validation by allowing time-dependent modulation of gene expression to avoid lethal phenotypes and assess functional contributions to the tumor microenvironment. The method provides predictive confidence in de-risking immunomodulatory targets by linking gene suppression to measurable immune cell migration in vitro.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by conditionally regulating gene expression to assess impact on monocyte recruitment without confounding cytotoxic effects.
- Operational Value: Supports functional target validation through inducible knockdown that clarifies pathway involvement in tumor-immune crosstalk.
- Predictive Value: Enhances confidence in target selection by linking gene suppression to reduced monocyte migration, informing go/no-go decisions in immunomodulatory programs.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates validated cancer cell lines with inducible shRNA expression for consistent, reproducible assessment of chemoattractant activity.
- Operational Value: Enables standardization of monocyte migration assays using purified primary cells and Boyden chamber readouts for quantitative comparison across conditions.
- Scalability: Facilitates platform reuse across cancer models (e.g., HCT-116, MDA-MB-231) and secreted factors beyond PAI-1.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Bridges discovery and preclinical work by modeling human tumor-monocyte interactions in a controlled, reproducible system.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether secreted proteins act as direct chemoattractants, reducing ambiguity in biomarker or target prioritization.
- Predictive Continuity: Supports risk-adjusted advancement by providing functional data on immune modulation before in vivo validation.
Pipeline & Workflow Integration
The Tet-ON conditional knockdown system fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, enabling iterative testing of immunomodulatory mechanisms in physiologically relevant cancer cell models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by allowing temporal control of gene expression to dissect dynamic tumor-stroma interactions.
- Screening: Delivers assay-ready, inducible cell lines that produce quantifiable outputs (e.g., migrated macrophage counts) for compound or genetic perturbation screening.
- Analytics: Generates measurable dependent variables (monocyte migration inhibition %) that enable statistical comparison between control and knockdown conditions.
- Translational Research: Models human-relevant tumor microenvironment dynamics using primary monocytes and cancer cell lines, supporting biomarker alignment studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular platform for studying various secreted factors in immune recruitment, adaptable across oncology indications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in tumor-immunology studies by enabling conditional, reversible gene suppression.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized viral transduction, selection, and induction protocols across cell lines.
- Strategic Value: Improves target prioritization by providing functional evidence of gene contribution to immune evasion or infiltration.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted resource allocation by validating targets whose modulation alters monocyte behavior in vitro.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lentiviral vector production, cell culture, and antibiotic selection for stable line generation.
- Dependent on transfection efficiency and viral titer for consistent transduction in cancer cell lines.
- Necessitates validation of knockdown efficiency via Western blot or qPCR post-induction to confirm on-target effects.
- Requires optimization of doxycycline concentration and timing to avoid leaky expression or cytotoxicity.
- Relies on aseptic technique and density gradient centrifugation for high-purity monocyte isolation without activation.
