Name: Tek adımlı protokol modu Floresans mikroskobu tarafından radyasyon kaynaklı klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü değerlendirilmesi için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Öğrenin, iyonize radyasyon kaynaklı klonojenik hücre ölümünün ana modlarını DAPI boyama ve floresans mikroskobu ile değerlendirmeyi. Bu hızlı yöntem, radyasyon biyolojisi ve kanser araştırmalarında faydalıdır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bayan Akiko Shibata teknik yardım için teşekkür ederiz. Bu eser önde gelen Enstitüler, ağır iyon Therapeutics ve mühendislik Global liderleri yetiştirilmesi için programlar için Milli Eğitim Bakanlığı, kültür, spor, bilim ve teknoloji Japonya dan Grants-in-Aid tarafından desteklenmiştir.

1. hazırlık malzemeleri <ol><li>otoklav kapak notları.
	<ol><li>Bir cam kabı kapak paket fişi yerleştirin.</li>
		<li>Cam kabı folyo ile kapak.</li>
		<li>Otoklav 121 ° C'de 15 psi 20 dakika süreyle</li>
		<li>Kuru bir kültür başlıklı oda sıcaklığında 50 ° C. mağazasında.</li>
	</ol></li> <li>Hazırlamak fiksasyon çözüm: %3 paraformaldehyde + % 2 Sükroz içinde fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS).
	<ol><li>700 mL PBS ve 30 g paraformaldehyde bir 1000 mL cam şişe ekleyin. 
		Dikkat: Paraformaldehyde aşındırıcı, uygun eldiven giymek.</li>
		<li>Isıtma ile 80 ° C arasında bir mikrodalga kullanarak tarafından tamamen erime paraformaldehyde. 
		Dikkat: Paraformaldehyde dumanı zehirlidir, maske takmak.</li>
		<li>Oda sıcaklığında gece bırakın.</li>
		<li>20 g Sükroz ekleyin.</li>
		<li>Ekleme toplam Cilt 1 yapmak için PBS L.</li>
		<li>Aliquot 50 ml tüpler. Fiksasyon çözüm-20 ° C'de 3 yıldır veya 4 3 ay saklanabilir ° C.</li>
	</ol></li></ol> 2. Hücre kültürü hazırlanması Not: Bu yordamları bir kültür mahallede gerçekleştirilmelidir.
<ol><li>Kültür ve geçit U2OS insan osteosarkom hücreleri Logaritmik büyüme 5 korumak için. 
	Not: Optimum ışınlama doz belirledikten sonra diğer hücre tipleri kullanılabilir.</li>
	<li>Kağıt havlu % 70 etanol ile nemlendirilmiş bir neşter silin. Neşteri, kullanarak bir 35 mm hücre kültür çanak üzerinde bir kapak notu yer (bundan sonra sadece olarak da adlandırılır &#34; çanak &#34;). 
	Not: Bir tabak içinde kapak paket fişi numarası deneysel göre arttırılabilir (konuya bakın) Tasarla.</li>
	<li>Ekleyin 1 mL kültür medya: % 10 fetal sığır serum ile desteklenmiş DMEM. 
	Not: Seçilen hücre türüne göre diğer medya kullanılabilir.</li>
	<li>Temizleme işlemi forseps kağıt havlu ile % 70 etanol ile nemlendirilmiş. Forseps kullanarak, yavaşça kapak notu ortasına tutun. Yemek kültürü ortamdan tamamen, bir tutun kapak notu üzerindeki koruyarak Aspire edin. 
	&#8203; Not: Bu adımı immobilizasyon çanak için kapak fişinin teşvik.</li>
	<li>Yapisan kültürlü hücreleri tripsin 5 kullanarak ayırın.
	<ol><li>Çanak kültür ortamından Aspire edin.</li>
		<li>1 mL PBS ekleyin ve çanağı hafifçe çalkalanır.</li>
		<li>Aspire PBS üzerinden yemek.</li>
		<li>Yemek için 1 mL tripsin [0.25w/v% tripsin-1mmol/M EDTA] ekleyin.</li>
		<li>Incubate % 5 CO 2 içeren bir ortamda 37 ° C'de 5 min için.</li>
		<li>Yemek için 9 mL kültür ortamı ekleyin.</li>
		<li>1000 μL micropipette kullanarak bir tek hücre süspansiyon hazırlamak.</li>
	</ol></li> <li> 5 hücreleri saymak.
	<ol><li>0.9 mL hücre süspansiyon ve 0.1 mL %0,4 1,5 mL tüp içinde ekleyin Trypan mavi çözüm.</li>
		<li>Bir hemasitometre için 10 geçerli μL.</li>
		<li>Sayısını inceleyin (Yani, canlı) hücreleri bir ters faz mikroskop altında günahı.</li>
	</ol></li> <li>3 mL hücre süspansiyon kültürü medya bir yoğunluğu 0,5 x 10 5 hücre/mL, bir 15 mL tüp hazırlayın. 
	Not: hücre yoğunluğu deneysel göre değiştirilebilir gerekir (konuya bakın).</li>
	<li>Yavaşça yemek için hücre süspansiyon 2 mL ekleyin.</li>
	<li>Gecede 37 ° C'de % 5 CO 2 içeren bir ortamda Incubate.</li>
</ol> 3. Işınlama dikkat: x-ışını irradiator üreticiye göre dikkatle ele &#39; s yönergeleri.
<ol><li>Hücreleri bir ters faz mikroskop altında incelemek. Hücreleri kapak kayma ve canlı bağlı onaylayın.</li>
	<li>6 Gy x-ışınları ile çanak ışınlatayım (1.4 Gy/dk, 300 KVP, 20 mA).</li>
	<li>Incubate % 5 CO 2 içeren bir ortamda 37 ° C'de 72 h için. 
	Not: Kuluçka zaman deneysel göre değiştirilebilir (konuya bakın) Tasarla.</li>
</ol> 4. Fiksasyon <ol><li>çanak kültür ortamından Aspire edin.</li>
	1000 μL micropipette ucu kesilmiş <li>kullanma makas, ipucu sondan 5 mm. 
	Not: Kesme ipucu sorunsuz fiksasyon çözümü uygulamak için yardımcı olur.</li>
	<li>Kesme ipucu kullanarak ekleyin 1 mL (1.2 adımda hazırlanan) fiksasyon çözüm yemek için yemek yan duvardan. 
	Not: Bu adım zaman duyarlı ve bu nedenle birden fazla örnekleri işlerken micropipette ipuçları değiştirmeden yapılmalıdır. Uygulama fiksasyon çözümün çanak dibine doğrudan hücrelere zarar verebilir.</li>
	<li>Bir kare kültür tabak çanak yerleştirin. Yavaşça fiksasyon çözüm kapak slip üzerinde eşit olarak dağıtmak için kare kültür çanak sallamak.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 10 dk Incubate.</li>
	<li>Aspire fiksasyon eriyik--dan yemek.</li>
	<li>Çanak yan duvardan yemek için PBS 2 mL ekleyin. 
	Not: PBS uygulama doğrudan dibine çanağı hücreleri zarar verebilir.</li>
	<li>Aspire PBS üzerinden yemek.</li>
	<li>Yinele adımları 4.7 ve iki kez 4.8. 
	Not: Çanak 4 ° C'de 1 hafta 2 mL PBS banyo kapak makbuzları ile saklanabilir.</li>
</ol> 5. DAPI boyama <ol><li>5 μL 1 μg/mL DAPI boyama slayt kadeh uygulamak reaktif. 
	Not: reaktif boyama DAPI 6 ay boyunca stabildir korunuyorsunuz ışık veya altında -20 ° c</li>
	<li>Bir neşter kullanarak kaldırmak kapak notu yemek.</li>
	<li>Kenarına bir kağıt havlu ile kapak fişinin dokunarak ile ilgili kapak formu aşırı PBS çizin.</li>
	<li>Montaj kapak fişi ters DAPI hücreleri reaktif boyama DAPI maruz kalır böylece slayt camına reaktif boyama damla üzerine. 
	Not: Bu zamana duyarlı adımdır. DAPI kurutma reaktif boyama suboptimal boyama için açabilir.</li>
	<li>Örnekleri-ebilmek var olmak stok için 1 yıl, -20 ° c</li>
</ol> 6. Görüntü alma <ol><li>inceleyin örnek üzerinde floresan mikroskop. Çekirdeği görselleştirildiği DAPI filtresini kullanarak. 
	Not: Ya bir 20 X 60 X Petrol mercek, araştırmacı göre kullanılacak ve &#39; s ilgi. Bir 60 X Petrol lens kullanırken, bir damla yağ üzerine kapak notu ekleyin. Örnekleri objektif dokunmayın dikkatli olun; Aksi takdirde, objektifin zarar.</li>
	<li>Çekirdek bir CCD kamera ve dijital görüntü alma yazılımı aşağıdaki ayarları ve parametreleri kullanarak görüntüleri: DAPI filtre, monolayer görüntüleri, kazanç 1 X ve otomatik pozlama.</li>
	<li>Bitiş görüntü edinme: 20 X objektif lens temizleyici nemlendirilmiş kağıt havlu ile silin. 60 X Petrol objektif kloroform ile nemlendirilmiş kağıt havlu ile silin.</li>
</ol> 7. Klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölüm modu değerlendirilmesi <ol><li>rasgele seçilen Albümdeki sayılan çekirdek sayısı 300 ulaşıncaya kadar apoptosis, Mitotik felaket ve hücresel yaşlanma için ölçütleri karşılayan çekirdeği saymak. Nüsha deneysel her ayar için bu adımda yapmak.
	<ol><li>Apoptosis ölçütlerini: apoptotik organları (Yani, yoğun ve parçalanmış çekirdeği) 6 , 7 varlığı.</li>
		<li>Ölçütü Mitotik felaket için: iki veya daha fazla ayrı LOB veya micronucl gösteren çekirdeği varlığıei 8 , 9 , 10.</li>
		<li>Hücresel yaşlanma için ölçüt: heterochromatic foci (SAHF) (Yani, nükleer DNA 30-50 parlak, yoğun foci içeren) yaşlanma ilişkili varlığı 2 , 11.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Wouters, B. G. Cell death after irradiation: how, when and why cells die. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWouters%2C+BG+%22Basic+Clinical+Radiobiology.+4th+ed%22">Basic Clinical Radiobiology. 4th ed</a>. Joiner, M. C., van der Kogel, A. J. , Hodder Education. London. 27-40 (2009).</li>
<li>Aird, K. M., Zhang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+senescence-associated+heterochromatin+foci+%28SAHF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of senescence-associated heterochromatin foci (SAHF).</a> Methods Mol. Biol. 965, 185-196 (2013).</li>
<li>Kobayashi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+catastrophe+is+a+putative+mechanism+underlying+the+weak+correlation+between+sensitivity+to+carbon+ions+and+cisplatin%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Mitotic catastrophe is a putative mechanism underlying the weak correlation between sensitivity to carbon ions and cisplatin.</a> Sci. Rep. 7, 40588(2017).</li>
<li>Amornwichet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon-ion+beam+irradiation+kills+X-ray-resistant+p53-null+cancer+cells+by+inducing+mitotic+catastrophe%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Carbon-ion beam irradiation kills X-ray-resistant p53-null cancer cells by inducing mitotic catastrophe.</a> PLoS One. , 115121(2014).</li>
<li>Masters, J. R., Stacey, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changing+medium+and+passaging+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Changing medium and passaging cell lines.</a> Nat. Protoc. 2, 2276-2284 (2007).</li>
<li>Sawai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+sulforaphane+as+a+radiosensitizer+for+murine+osteosarcoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol.+Rep%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of sulforaphane as a radiosensitizer for murine osteosarcoma cells.</a> Oncol. Rep. 29, 941-945 (2013).</li>
<li>Cummings, B. S., Wills, L. P., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+cell+death+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Measurement of cell death in mammalian cells.</a> Curr. Protoc. Pharmacol. , Suppl. 56, Chapter 12: Unit 12.8 (2012).</li>
<li>Oike, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C646%2C+a+selective+small+molecule+inhibitor+of+histone+acetyltransferase+p300%2C+radiosensitizes+lung+cancer+cells+by+enhancing+mitotic+catastrophe%5BTitle%5D)+AND+%22Radiother.+Oncol%22%5BJournal%5D)">C646, a selective small molecule inhibitor of histone acetyltransferase p300, radiosensitizes lung cancer cells by enhancing mitotic catastrophe.</a> Radiother. Oncol. 111, 222-227 (2014).</li>
<li>Oike, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+lethality-based+strategy+to+treat+cancers+harboring+a+genetic+deficiency+in+the+chromatin+remodeling+factor+BRG1%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A synthetic lethality-based strategy to treat cancers harboring a genetic deficiency in the chromatin remodeling factor BRG1.</a> Cancer Res. 73, 5508-5518 (2013).</li>
<li>Russo, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+radiosensitization+of+glioblastoma+cells+by+the+poly+%28ADP-ribose%29+polymerase+inhibitor+E7016%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo radiosensitization of glioblastoma cells by the poly (ADP-ribose) polymerase inhibitor E7016.</a> Clin. Cancer Res. 15, 607-612 (2009).</li>
<li>Di Micco, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+oncogene-induced+DNA+damage+response+and+heterochromatin+in+senescence+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Interplay between oncogene-induced DNA damage response and heterochromatin in senescence and cancer.</a> Nat. Cell Biol. 13, 292-302 (2011).</li>
<li>Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonogenic+assay+of+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Clonogenic assay of cells in vitro.</a> Nat. Protoc. 1, 2315-2319 (2006).</li>
<li>Vakifahmetoglu, H., Olsson, M., Zhivotovsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Death+through+a+tragedy%3A+mitotic+catastrophe%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Death through a tragedy: mitotic catastrophe.</a> Cell Death Differ. 15, 1153-1162 (2008).</li>
<li>Imreh, G., Norberg, H. V., Imreh, S., Zhivotovsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+breaks+during+mitotic+catastrophe+trigger+%CE%B3H2AX-ATM-p53-mediated+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Chromosomal breaks during mitotic catastrophe trigger γH2AX-ATM-p53-mediated apoptosis.</a> J. Cell Sci. 129, 1950(2016).</li>
<li>Torres-Roca, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+assay+of+tumor+radiosensitivity%3A+a+roadmap+towards+biology-based+personalized+radiation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Per.+Med%22%5BJournal%5D)">A molecular assay of tumor radiosensitivity: a roadmap towards biology-based personalized radiation therapy.</a> Per. Med. 9, 547-557 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Protokol içindeki kritik adımlar aşağıdaki gibidir. DAPI lekeli çekirdeği morfolojik bir değerlendirme yapılması çok katmanlı hücreler için zor olduğu için ilk olarak, hücre kültür çanak üzerinde monolayer yetiştirilmeye. Bu amaçla, adım 2.9, dikkatli transferi kültür bulaşık kuluçka önerilir; Kültür fincan sallayarak konsantrasyonu hücre kültür yemeğin ortasına yol açar bir girdap askıya alınan hücre üretir. Buna ek olarak, çok katmanlı hücrelere önde gelen overconfluence-meli var olmak kaçmak. Bu amaçla, adım 2.7, kültür çanak üzerinde seribaşı hücre sayısı zaman ve ışınlama ve fiksasyon arasındaki süreyi iki katına popülasyon temelinde değiştirilebilir. Yaklaşık 80 fiksasyon zaman izdiham önerilir. İkinci olarak, hız fiksasyon ve DAPI boyama (Yani, 4 ve 5) önemlidir. Aşağıdaki adımları için geçen süre açısından arası örnek tutarsızlık heterojenite için morfolojik değerlendirme belirsiz çekirdekleri, DAPI sinyal şiddeti yol açabilir.
2.2. adımda kapak fişleri bir tek kültür tabak sayısı artırılabilir; En fazla dört kapak paket fişi bir 35 mm tabak içinde yerleştirilebilir ve sayısı daha da büyük yemekler kullanarak artırılabilir. Her kültür tabak içinde birden fazla kapak paket fişi yerleştirerek saat ders değerlendirmesi (örneğin, paket fişi bir kültür yemek ilgi teker teker birden fazla zaman noktalarda toplanabilir kapak) belirli bir tedavi için verimli çalışmasını sağlar.
3.2. adımda ışınlama doz araştırmacıların ilgi göre değiştirilebilir. Tutarlı bir doz uygulama için birden çok hücre hatları her modu hücre satırları arasında klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü için duyarlılık karşılaştırması sağlar. Öte yandan, ISO-klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hayatta kalma doz kullanımı her hücre satırı için klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölüm profilleri hücre satırları arasında karşılaştırma sağlar. ISO-klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hayatta kalma doz klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hayatta kalma tahlil12tarafından belirlenebilir. D10 değeri, % 10 klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hayatta kalma, sağlar doz ISO-klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hayatta kalma doz için ortak bir bitiş noktası olur.
Adım 3.3, saat ışınlama fiksasyon ile araştırmacıların ilgi göre değiştirilebilir; en yoğun zaman IR kaynaklı apoptosis, Mitotik felaket ve hücresel yaşlanma için hücre kültürünü ve tedavi göre değiştiğinden bu önemlidir. Bu makalede, biz 72 h sonra ışınlama klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölüm profilleri, bizim grup tabanlı üzerinde birden fazla çalışmaları başlangıç tarama için en yararlı olacaktır zaman noktası olarak kullanılan ve diğerleri aşağıda açıklanan1,2, 3 , 4 , 8 , 9: (i) solid tümör çoğunlukla kurulan hücrelerde apoptoz X x-ray kaynaklı bir kaç gün sonra ışınlama oluşur. (ii) X-x-ray kaynaklı Mitotik felaket kanser hücrelerinde oluşur en belirgin ikinci veya üçüncü mitoz serbest bırakmak--dan geçici hücre döngüsü tutuklama sonra ışınlama tarafından indüklenen. Belgili tanımlık serbest bırakmak genellikle yaklaşık 24 saat takip ışınlama sonra ortaya çıkar yaklaşık 24 h (III) aralıklarla tekrarlanan mitoses tarafından X-ray-indüklenen hücresel yaşlanma söz konusu hücre kültürünü bağımlı bir zaman aralığından sonra belli olur: 2 gün sonra Işınlama için bazı erken durumlarda ve 7 gün sonra ışınlama çoğu hücre hatları için. Klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre genel bir resim ölüm profilleri üzerinden başlangıç tarama elde ettikten sonra zaman ders deneyler en yoğun zaman belirli hücre satır ve/veya durumu klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü her modu için daha ayrıntılı bir aydınlatma sağlar faiz4.
Bu tahlil ve klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hayatta kalma tahlil boyama DAPI, radyasyon duyarlılık değerlendirmesi için altın standart yöntem değildir değiştirilebilir olması gerekmektedir. Apoptozis ve Mitotik felaket sadece son saat için. Böylece, bir zaman noktası için tahlil boyama DAPI Apoptozis ve değerlendirme zaman noktada oluşur Mitotik felaket algılar. Öte yandan, belirli bir zamanda noktası dahil toplam tutarı Apoptozis ve genellikle 10-14 gün sonra ışınlama gerçekleşmişti için kuluçka döneminde Mitotik felaket klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hayatta kalma sonuçlarını tahlil. Apoptozis ve Mitotik felaket, senescent hücreler farklı kültür çanak üzerinde kalır; onlar yavaş yavaş ışınlama sonra zamanla birikir. Bu nedenle, her ikisi de sonuçlarını tahlil ve klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hayatta kalma tahlil boyama DAPI kuluçka dönemi sırasında oluştu yaşlanma toplam tutarı yansıtır. Önemlisi, Apoptozis, Mitotik felaket ve ışınlama tarafından indüklenen yaşlanma oranı çok hücre göre farklılık gösteriyorsa çizgi ve ışınlama dozu. Birlikte ele alındığında, teorik olarak, bir tahlil sonuçlarını doğrudan o diğer tahlil çevrilemez.
Tahlil boyama DAPI birkaç sınırlaması vardır. İlk olarak, Mitotik felaket hücre ölümü farklı bir mod olup tartışmalı kalır. Radyasyon Biyoloji alanında, Mitotik felaket klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölüm1diğer mekanizmaları farklıdır IR indüklenen hücre ölümü büyük bir modu olarak kabul edilir. Öte yandan, diğerleri Mitotik o felaket hücre ölümü ancak13,14Apoptozis ve nekroz dahil olmak üzere hücre ölüm önce gelir bir süreç oldukça farklı bir mod değildir savunuyorlar. Böylece, Apoptozis ve Mitotik felaket bir ölçüde çakışabilir. İkincisi, önceki çalışmalar hücresel yaşlanma bazı hücre satırları ve tedavi ayarları2SAHF, yokluğunda meydana gelebilir öneririz. Her klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre için özel olarak tasarlanmış mevcut, diğer deneyleri, ölüm modu belirli bir deney sonuçlarını sağlamlığı artırmak için kullanılmalıdır. Üçüncü olarak, DAPI tahlil boyama modları klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü Apoptozis, Mitotik felaket ve hücresel yaşlanma (örneğin, nekroz ve autophagy) dışındaki değerlendirmek değildir. Dördüncü olarak, tümör yanıt radyoterapi için bir tahmin olarak tahlil boyama DAPI yarar klinikte aydınlatılmamıştır değil. Bu bakış açısından klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü toplam miktarı değerlendiriyor, klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hayatta kalma tahlil bir korelasyon SF2, hücreleri ile 2 Gy radyasyona maruz kalan kısmını arasında kurulan çünkü tahlil boyama DAPI üstündür X-ışınları ve radyoterapi15tümör yanıtı. Yine de, bu klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hayatta kalma tahlil yaygın klinikte özellikle yüksek derecede uzmanlık ve zaman (Yani, 14 gün) uzun bir süre için gereklilik nedeniyle veri toplama için kullanılmaktadır değil ki dikkat çekicidir. Buna karşılık, yordamı tahlil boyama DAPI için basit ve önemli ölçüde sonuçlar üretmek için daha az zaman, yaklaşık 3-4 gün sürer. DAPI boyama yardımcı programıtahlil tümör yanıt radyoterapi için bir tahmin olarak klinikte yakın gelecekte test edilecektir.
Özetle, tahlil boyama DAPI aynı anda üç büyük modu IR kaynaklı klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü değerlendirmek için bir düşük maliyetli tek adımlı tahlil olduğunu. Bu yaklaşım bir kolayca klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü için çeşitli hücre hatları, tedavi ayarları ve zaman puan, modları hücre ölümü mekanizmaları hedef hücreleri ve vade farkı şartları elucidating amacı ile için ekran izin verir.

İyonizan radyasyon (IR) çoklu modları klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü neden olmaktadır. IR kaynaklı klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümünü araştırmaya IR toksisite normal dokulara anlamak için hem de kanser radyoterapi tedavisi etkinliğini artırmak için yöntemler geliştirmek için önemlidir. Apoptozis, Mitotik felaket ve hücresel yaşlanma IR1tarafından indüklenen klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü büyük modları vardır. Apoptozis hücre ölümü DNA hasar1ile başlatılan düzenlenmiş bir moddur. Mitotik felaket Düzeltilmemiş DNA çift iplikli kırılmalara1ile sonuçlanan anormal mitoz nedeniyle oluşur hücre ölümdür. Hücresel yaşlanma geri dönüşü olmayan hücre büyüme tutuklama2bir devlet olarak tanımlanır; Not hücresel yaşlanma hücre ölümü başına değil, ancak bir modu klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü senescent hücre klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar yaşama onuntemsilcilerini içindir.
Çeşitli hücre tabanlı deneyleri apoptosis, Mitotik felaket ve hücresel yaşlanma ayrı ayrı değerlendirmek için geliştirilmiştir. Apoptozis Akış Sitometresi1tarafından terminal deoksinükleotidil transferaz dUTP nick uç (tünel) etiketleme boyama, annexin V boyama, DNA parçalanma deneyleri ve alt-G1 hücre döngüsü aşama belirlenmesi tarafından tespit edilebilir. Mitotik felaket Mitotik işaretler için MPM2, tünel boyama ve elektron mikroskobu1de dahil olmak üzere, boyama ayirt tarafından tespit edilebilir. Hücresel yaşlanma yaşlanma ilişkili β-galaktozidaz (SA-β-Gal) Boyama, büyüme-tutuklama deneyleri ve elektron mikroskobu1tarafından tespit edilebilir. Önemlisi, baskın modu klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü hücre satırları ve tedavi ayarları3,4arasında farklı. Bu nedenle, belirli bir deneysel ayarı için klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü genel profili aydınlatmak için tüm bu modu ölüm kapsayan birden çok deneyleri birlikte, işgücü ve maliyet yoğun olduğu yürütülmelidir.
Bu makalede, biz aynı anda apoptosis, Mitotik felaket ve IR3,4tarafından indüklenen hücresel yaşlanma değerlendirmek için hızlı ve uygun maliyetli tek adımlı tahlil tanımlamak. Bu yöntemde, bir kapak fişinde yetiştirilen hücrelerin x-ışınları ile ışınlanmış ve 4' ile 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) lekeli. Floresans mikroskobu kullanılarak, Apoptozis, Mitotik felaket ve hücresel yaşlanma her ilgili karakteristik türleri Morfoloji, DAPI lekeli çekirdeği üzerinde göre tanımlanır. Bu yaklaşım çeşitli hücre hatları, tedavi ayarları ve hücre ölümü mekanizmaları hedef hücreleri ve koşullarının araştırılması amacı ile zaman Puan klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölüm profilleri için tarama dahil olmak üzere uygulamaların yararlı olacaktır faiz.

<table><tbody><tr><td>kapak kayma</td><td>Matsunami</td><td>C013001</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-1KG</td><td></td></tr><tr><td>sükroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097-250G</td><td></td></tr><tr><td>fosfat tamponlu salin</td><td>Cosmo Bio</td><td>16232000</td><td></td></tr><tr><td>neşter</td><td>Kai Medical</td><td>No.20, 520-A</td><td></td></tr><tr><td>35 mm hücre kültürü kabı</td><td>Falcon</td><td></td><td></td>353001</tr><tr><td>tripsin</td><td>Wako</td><td>201-16945</td><td></td></tr><tr><td>ters faz mikroskobu</td><td>Shimazu</td><td>114-909</td><td></td></tr><tr><td>X-ışını ışınlayıcı</td><td>Faxitron Bioptics</td><td>Faxitron RX-650</td><td></td></tr><tr><td>kare kültür kabı</td><td>Corning</td><td>431110</td><td></td></tr><tr><td>sürgülü cam</td><td>Matsunami</td><td>Pro-11</td><td></td></tr><tr><td>DAPI boyama reaktifi</td><td>Hücre Sinyalizasyonu</td><td>8961S</td><td></td></tr><tr><td>floresan mikroskobu</td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE Ni</td><td></td></tr><tr><td>floresan mikroskobu DAPI filtresi</td><td>Nikon</td><td>U-FUW, BP340-390, BA420IF, DM410</td><td></td></tr><tr><td>floresan mikroskop lensi (20 kez;)</td><td>Nikon</td><td>Plan Apo &lambda; 20X/0.75</td><td></td></tr><tr><td>floresan mikroskop lensi (60 kez;, yağlı)</td><td>Nikon</td><td>Plan Apo &lambda; 60X/1.40 yağ</td><td></td></tr><tr><td>yağı</td><td>Olympus</td><td>N5218600</td><td></td></tr><tr><td>CCD fotoğraf makinesi</td><td>Nikon</td><td>DS-Qi2</td><td></td></tr><tr><td>dijital görüntü elde etme yazılımı</td><td>Nikon</td><td>NIS-Elements Belge</td><td></td></tr><tr><td>lensi temizleyici</td><td>Olympus</td><td>OT0552</td><td></td></tr><tr><td>kloroform</td><td>Wako</td><td>035-02616</td><td></td></tr></tbody></table>

tek adımlı protokol modu floresans mikroskobu tarafından radyasyon kaynaklı klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü değerlendirilmesi için

One-step Protocol for Evaluation of the Mode of Radiation-induced Clonogenic Cell Death by Fluorescence Microscopy

İyonizan radyasyon (IR) araştırma-indüklenen klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü IR Malign tümörler ve normal dokuların üzerindeki etkisini anlamak için önemlidir. Burada, aynı anda IR, Yani, Apoptozis, Mitotik felaket ve hücresel yaşlanma tarafından indüklenen klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü büyük modları değerlendirmek için hızlı ve uygun maliyetli tek adımlı tahlil açıklayın. Bu yöntemde, bir kapak fişinde yetiştirilen hücrelerin x-ışınları ile ışınlanmış ve 4' ile 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) lekeli. Floresans mikroskobu kullanılarak, Apoptozis, Mitotik felaket ve hücresel yaşlanma DAPI lekeli çekirdeği karakteristik türleri Morfoloji üzerinde göre tanımlanır. Apoptozis apoptotik organları (Yani, yoğun ve parçalanmış çekirdeği) varlığı ile belirlenir. Mitotik felaket sergi iki veya daha fazla ayrı LOB ve micronuclei çekirdeği varlığı ile belirlenir. Hücresel yaşlanma yaşlanma ilişkili heterochromatic foci (Yani, nükleer DNA 30-50 parlak, yoğun foci içeren) varlığı ile belirlenir. Bu yaklaşım deneyci kolayca çeşitli hücre hatları, tedavi ayarları, ve/veya zaman puan, hücre ölümü mekanizmaları hedef hücreleri ve vade farkı şartları elucidating amacı ile kullanarak klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölüm modları için ekran sağlar.

Örnek olarak, U2OS insan osteosarkom hücreleri 6 Gy x-ışınları ile tedavi, 72 saat inkübe ve tahlil protokolüne göre boyama DAPI tabi. Şekil 1 gösterir apoptosis, Mitotik felaket ve 60 × petrol lens ile elde edilen hücresel yaşlanma ile ilgili tipik nükleer türleri Morfoloji için Yakınlaştırılmış görüntü. Adımları 7.1.1-7.1.3 karakteristik türleri Morfoloji klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü her modu için başvurun. Şekil 2 çekirdek bir 20 X lens ile elde edilen görüntülerin genel bakış gösterir. Işınlama 6 Gy x-ışınları ile indüklenen Mitotik felaket sık, daha az sıklıkla Apoptozis ve hücresel yaşlanma nadiren. Bu şekilde, muayene düşük-büyütme alanında bir bir bakışta klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölüm profili verilen bir deneysel ortamda genel resim yakalamak izin verir. Şekil 3 gösterir quantified verileri grafik olarak gösterilmesi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56338/56338fig1.jpg"> 
Şekil 1: Yakınlaştırılmış DAPI lekeli çekirdeği apoptosis, Mitotik felaket ve hücresel yaşlanma tipik türleri Morfoloji gösterilen görüntülerini. U2OS hücreleri 6 Gy x-ışınları ile ışınlanmış. 72 saat sonra hücreleri sabit ve DAPI ile lekeli. Nükleer görüntüleri bir 60 X Petrol objektifi kullanarak elde. Ölçek çubuğu 20 mikron =. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56338/56338fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56338/56338fig2.jpg"> 
Şekil 2: hücre çekirdeği DAPI lekeli genel bakış görüntüler x-ışınları ile tedavi. U2OS hücreleri 6 Gy x-ışınları ile ışınlanmış veya sahte radyasyona maruz. 72 saat sonra hücreleri sabit ve DAPI ile lekeli. Çekirdeklerin görüntüleri 20 X lens ile elde. Daireler, Apoptozis; okları, Mitotik felaket. Ölçek çubuğu 50 mikron =. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56338/56338fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56338/56338fig3.jpg"> 
Şekil 3: apoptosis, Mitotik felaket ve hücresel yaşlanma için Quantified veri indüklenen x-ışınları ile tedavi hücrelerdeki. U2OS hücreleri 6 Gy x-ışınları ile ışınlanmış veya sahte radyasyona maruz. 72 saat sonra hücreleri sabit ve DAPI ile lekeli. Çekirdeklerin görüntüleri 20 X lens ile elde. Rastgele alanlar, toplam 300 çekirdeği apoptosis (Ap), Mitotik felaket (MC) ve hücresel yaşlanma (Sns) için değerlendirilmiştir. Değerlendirme nüsha gerçekleştirilmiştir. Ortalama değerler gösterilir ve hata çubukları standart sapmalar gösterir. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56338/56338fig3large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

İyonizan radyasyon (IR) araştırma-indüklenen klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü Malign tümörler ve normal dokuların IR etkileri anlamak için önemlidir. Burada, biz büyük modları IR kaynaklı klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü morfolojisi 4', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) üzerinde dayalı değerlendirmek için bir tek adımlı tahlil tarif-floresan mikroskopi tarafından görüntülenmiştir çekirdeği lekeli.

Tek adımlı protokol modu Floresans mikroskobu tarafından radyasyon kaynaklı klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü değerlendirilmesi için

Research on ionizing radiation (IR)-induced clonogenic cell death is important for understanding the effect of IR on malignant tumors and normal tissues. ...

Bu testin genel amacı, DAPI ile boyanmış çekirdeklerin karakteristik morfolojilerine dayalı olarak iyonlaştırıcı radyasyonun neden olduğu klonojenik hücre ölümlerinin ana modlarını değerlendirmektir. Bu yöntem, radyasyon biyolojisi alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu hızlı ve uygun maliyetli tekniğin ana avantajı, iyonlaştırıcı radyasyonun neden olduğu klonojenik hücre ölümünün ana modlarının aynı anda değerlendirilebilmesidir.Genel olarak, radyasyon biyolojisine yeni olan bireyler, radyasyonun neden olduğu klonojenik hücre ölümünü değerlendirmek için mücadele edeceklerdir, çünkü her hücre ölümü modunu değerlendirmek için farklı tahliller gereklidir. Bu yöntem için ilk olarak, çoklu hücre hatları ve radyasyon dozları kullanarak radyasyona bağlı klonojenik hücre ölümünün büyük ölçekli taramasını yaptığımızda aklımıza geldi. Bu yöntem radyasyon biyolojisi hakkında bilgi verebilse de, kanser için kemoterapi gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.Prosedürü gösteren işbirlikçimiz Atsushi Shibata olacak. Bir neşteri %70 etanol ile nemlendirilmiş kağıt havlularla sterilize ederek başlayın. Ardından, 35 milimetrelik bir hücre kültürü kabına bir kapak fişi yerleştirmek için neşteri kullanın.Kapak fişi ile kültür kabına bir mililitre kültür ortamı ekleyin. Şimdi kapak kaymasının ortasını steril forseps ile nazikçe tutun ve kültür ortamını tabaktan tamamen aspire edin. Daha sonra, 15 mililitrelik bir tüpte kültür ortamında üç mililitrelik bir hücre süspansiyonu hazırlayın.Hücre süspansiyonunu kültür kabına ekleyin. Ve gece boyunca 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de inkübe edin. Hücrelerin kapak kızağına bağlı olduğundan ve ters çevrilmiş faz kontrast mikroskobu altında inceleyerek canlı olduğundan emin olun.Şimdi çanağı altı gri X-ışını radyasyonu ile ışınlayın. Işınlamadan sonra, hücreleri bir inkübatörde 72 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de inkübe edin. Şimdi hücreleri inkübatörden alın ve kültür ortamını kültür kabından aspire edin.1.000 mikrolitrelik bir mikro pipet ucunun ucunu makas kullanarak uçtan yaklaşık beş milimetre kesin. Ve kültür kabına bir mililitre fiksasyon çözeltisi eklemek için kullanın. Hücrelere verilen zararı en aza indirmek için sabitleme solüsyonunu kültür kabının duvarları boyunca uygulayın.Daha sonra bu kültür kabını kare bir kültür kabına aktarın ve sabitleme solüsyonunu kapak fişi üzerine eşit şekilde dağıtmak için hafifçe sallayın. Bundan sonra, çanağı oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Sabitleme çözeltisini çanaktan aspire edin.Şimdi yemeğin duvarları boyunca iki mililitre PBS ekleyin. Ve sonra PBS'yi aspire edin. DAPI boyamaya hazırlanmak için, bir cam slayt üzerine beş mikrolitre DAPI boyama reaktifi ekleyin.Ardından bir neşter kullanarak kapak fişini tabaktan çıkarın. Ve kapak fişinin kenarına bir kağıt havluyla dokunarak kapak fişindeki fazla PBS'yi boşaltın. Şimdi, hücrelerin DAPI boyama reaktifine maruz kalması için kapak kızağını cam slayt üzerindeki DAPI boyama reaktifinin damlasına baş aşağı monte edin.Son olarak, lekeli hücreleri bir DAPI filtresi ile donatılmış bir floresan mikroskobu altında inceleyin. Üç hücre ölümü modunun her birindeki nükleer morfolojiler gösterilmiştir. Apoptotik hücrelerin yoğunlaştırılmış çekirdeklere sahip olduğu görülür.Mitotik felaket geçiren hücrelerin çekirdeklerinde çoklu loblar gözlenir. Yaşlanma geçiren hücrelerin karakteristik yaşlanma ile ilişkili heterokromatin odakları sergilediği görülmektedir. Sahte ışınlanmış çekirdeklerin ve altı gri X-ışını ile ışınlanmış çekirdeklerin karşılaştırmalı bir gözlemi gösterilmiştir.Daireler apoptoz geçiren çekirdekleri gösterir ve oklar mitotik felaket geçiren çekirdekleri gösterir. Sahte ile karşılaştırıldığında ışınlamaya maruz kalan yaklaşık 300 çekirdeğin değerlendirilmesi gösterilmiştir. Altı gri X-ışını ışınlamasının yaklaşık %25 oranında daha sık mitotik felakete neden olduğu, ardından yaklaşık %5 oranında apoptoz ve çok nadir yaşlanma olaylarına neden olduğu görülmektedir.Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa bir saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, solüsyonları doğrudan kapak fişlerine uygulayarak hücrelere zarar vermemeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, her bir klonojenik hücre ölümü modunu daha iyi anlamak için akış sitometrik analizi veya hücre ölümü belirteç proteinleri gibi diğer yöntemler ve yaşlanmayı değerlendirmek için yaşlanma ile ilişkili beta-galaktosidaz boyaması gerçekleştirilebilir.

one-step-protocol-for-evaluation-mode-radiation-induced-clonogenic

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

50 yıldan fazla üreme canlılığını değerlendirmek için clonogenic testin uygulanabilirliği için kurulmuştur. Burada yapışık hücrelere clonogenic tahlil yapmak için genel prosedür göstermektedir.

Clonogenic Testi: yapışkan Hücreler

E4orf4 ile uyarılan hücre ölümüne ACF kromatin yeniden faktör katkı ölçüldü. Protokol doksisiklin tedavi ACF alt birimleri ACF1 ve SNF2h koşullu devirme neden olduğu hücre klonlarının seçimi içermektedir, ve indüklenebilir hücre hatlarında E4orf4 ile uyarılan hücre ölümü ölçmek için DAPI tahlil kullanımı.

E4orf4 Bağlı Hücre Ölümü üzerine Nakavt Etkilerinin Gen Ekspresyonu ve Ölçüm Şartlı Nakavt için Hücre hatları hazırlanması

Bu video, DAPI boyama testi kullanarak iyonlaştırıcı radyasyonun (IR) neden olduğu kanser hücre hatlarında ana hücre ölümü profillerini tarama metodolojisini göstermektedir. Hücre ölümü geçiren hedef hücrelerin DAPI ile boyanmış çekirdekleri farklı morfolojiler sergiler ve floresan mikroskobu ile kolayca tanımlanabilir.

DAPI Boyama Kullanılarak Hücre Ölümü Taraması: Kanserli Hücre Hatlarında IR ile İndüklenen Klonojenik Hücre Ölümünün Hızlı Taraması İçin Bir Yöntem

Biyomoleküllerin in vivo çalışmaları, biyolojik bağlamda moleküler işlevi anlamak için çok önemlidir. Burada, DNA veya proteinler gibi floresan biyomoleküllerin canlı mikroorganizmalara içselleştirilmesine izin veren yeni bir yöntemi açıklıyoruz. Floresan mikroskobu ile kaydedilen in vivo verilerin analizi de sunulmakta ve tartışılmaktadır.

Elektroporasyon yoluyla Yaşam Mikroorganizmalar içinde içselleştirilmesi ve Floresan biyomoleküllerin Gözlem

Burada mitokondri zar potansiyel (MMP) belirlemek ve CLIC4 nakavt kaynaklı HN4 hücre apoptosis içinde vitroçalışma rodamine 123 uygulanması için detaylı bir iletişim kuralı mevcut. Ortak floresan mikroskop altında ve confocal lazer tarama floresan mikroskop MMP gerçek zamanlı değişiklik kaydedildi.

Mitokondri zar potansiyeli CLIC4 nakavt kaynaklı HN4 hücre Apoptosis Vitro çalışma tespiti

Canlı hücre görüntüleme bilgi hazinesi tek hücreler veya tüm nüfus üzerinde ulaşılamaz olan sabit hücre tek başına Imaging tarafından sağlar. Burada, hücre kader kararlar tedavi Anti-Mitotik uyuşturucu Paklitaksel ile aşağıdaki değerlendirmek için canlı hücre görüntüleme iletişim kuralları açıklanır.

Uzun vadeli canlı hücre kader Paklitaksel karşılık olarak değerlendirmek için Imaging hücreli

Biz burada pre-harekete geçirmek CD8 sitotoksisite araştırmak için bir protokol tarif+ T hücreleri kanser hücrelerine karşı apoptotik kanser hücreleri aracılığıyla gerçek zamanlı mikroskobu tespit ederek. Bu protokol mekanizmaları myeloid hücre kaynaklı T hücre bastırma arkasında araştırmak ve T hücreleri ile abluka bağışıklık baskılayıcı myeloid hücre yenileyici amaçlı bileşikler değerlendirmek.

Gerçek zamanlı hafiye-in Vitro tümör hücre Apoptosis içinde CD8 tarafından indüklenen+ T hücreleri Myeloid hücrelerin tümör infiltre bağışıklık baskılayıcı işlevlerini çalışmaya

Burada, hayatta kalma tek hücre olarak izlemek ve önemli ölçüde hücre ölümünü tahmin değişkenleri tanımlamak için bir iletişim kuralı mevcut.

Boyuna floresans mikroskobu ile nöronal hayatta kalma izleme

İn vitro mikronükleus tahlil genotoksisite ve sitotoksisite değerlendirmek için iyi kurulan bir yöntemdir ama manuel mikroskobik kullanarak tahlil Puanlama zahmetli ve subjektif ve inter-scorer değişkenlik muzdariptir. Bu yazıda, multispektral görüntüleme akışı sitometrisi kullanılarak testin tam otomatik bir sürümünü gerçekleştirmek için geliştirilen protokol açıklanmaktadır.

Multispectral görüntüleme akışı sitometrisi kullanarak In vitro micronucleus assay gerçekleştirmek için otomatik bir yöntem

Burada, tek hücrelerde çoklu yaşlanma ile ilişkili belirteçlerin görselleştirilmesi ve nicelleştirilmesi için akış sitometrisine dayalı bir yöntem sunuyoruz.

Tedaviye Bağlı Yaşlanan Kanser Hücrelerinde Çoklu Floresan Yaşlanma Belirteçlerinin Eşzamanlı Görüntüleme ve Akış Sitometrisine Dayalı Tespiti

Bu protokol, sitokinler gibi sitotoksik pertürbagenlere yanıt olarak insan kolonik organoidlerinde hücre ölümünü araştırmak ve ölçmek için basit ve uygun maliyetli bir yöntemi tanımlar. Yaklaşım, sitotoksik uyaranlara tek organoid tepkileri ölçmek için bir floresan hücre ölüm boyası (SYTOX Yeşil Nükleik Asit Boyası), canlı floresan mikroskobu ve açık kaynaklı görüntü analiz yazılımı kullanır.

Canlı Floresan Mikroskobu Kullanılarak İnsan Kolonik Organoidlerinde Sitokin ile İndüklenen Hücre Ölümünün Miktar Tayini

Öğrenin, iyonize radyasyon kaynaklı klonojenik hücre ölümünün ana modlarını DAPI boyama ve floresans mikroskobu ile değerlendirmeyi. Bu hızlı yöntem, radyasyon biyolojisi ve kanser araştırmalarında faydalıdır.

Tek adımlı protokol modu Floresans mikroskobu tarafından radyasyon kaynaklı klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü değerlendirilmesi için (Video) | JoVE Journal

Tek adımlı protokol modu Floresans mikroskobu tarafından radyasyon kaynaklı klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü değerlendirilmesi için

Daha fazla video keşfet