Tek adımlı protokol modu Floresans mikroskobu tarafından radyasyon kaynaklı klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü değerlendirilmesi için

Bu testin genel amacı, DAPI ile boyanmış çekirdeklerin karakteristik morfolojilerine dayalı olarak iyonlaştırıcı radyasyonun neden olduğu klonojenik hücre ölümlerinin ana modlarını değerlendirmektir. Bu yöntem, radyasyon biyolojisi alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu hızlı ve uygun maliyetli tekniğin ana avantajı, iyonlaştırıcı radyasyonun neden olduğu klonojenik hücre ölümünün ana modlarının aynı anda değerlendirilebilmesidir.

Genel olarak, radyasyon biyolojisine yeni olan bireyler, radyasyonun neden olduğu klonojenik hücre ölümünü değerlendirmek için mücadele edeceklerdir, çünkü her hücre ölümü modunu değerlendirmek için farklı tahliller gereklidir. Bu yöntem için ilk olarak, çoklu hücre hatları ve radyasyon dozları kullanarak radyasyona bağlı klonojenik hücre ölümünün büyük ölçekli taramasını yaptığımızda aklımıza geldi. Bu yöntem radyasyon biyolojisi hakkında bilgi verebilse de, kanser için kemoterapi gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.

Prosedürü gösteren işbirlikçimiz Atsushi Shibata olacak. Bir neşteri %70 etanol ile nemlendirilmiş kağıt havlularla sterilize ederek başlayın. Ardından, 35 milimetrelik bir hücre kültürü kabına bir kapak fişi yerleştirmek için neşteri kullanın.

Kapak fişi ile kültür kabına bir mililitre kültür ortamı ekleyin. Şimdi kapak kaymasının ortasını steril forseps ile nazikçe tutun ve kültür ortamını tabaktan tamamen aspire edin. Daha sonra, 15 mililitrelik bir tüpte kültür ortamında üç mililitrelik bir hücre süspansiyonu hazırlayın.

Hücre süspansiyonunu kültür kabına ekleyin. Ve gece boyunca 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de inkübe edin. Hücrelerin kapak kızağına bağlı olduğundan ve ters çevrilmiş faz kontrast mikroskobu altında inceleyerek canlı olduğundan emin olun.

Şimdi çanağı altı gri X-ışını radyasyonu ile ışınlayın. Işınlamadan sonra, hücreleri bir inkübatörde 72 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de inkübe edin. Şimdi hücreleri inkübatörden alın ve kültür ortamını kültür kabından aspire edin.

1.000 mikrolitrelik bir mikro pipet ucunun ucunu makas kullanarak uçtan yaklaşık beş milimetre kesin. Ve kültür kabına bir mililitre fiksasyon çözeltisi eklemek için kullanın. Hücrelere verilen zararı en aza indirmek için sabitleme solüsyonunu kültür kabının duvarları boyunca uygulayın.

Daha sonra bu kültür kabını kare bir kültür kabına aktarın ve sabitleme solüsyonunu kapak fişi üzerine eşit şekilde dağıtmak için hafifçe sallayın. Bundan sonra, çanağı oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Sabitleme çözeltisini çanaktan aspire edin.

Şimdi yemeğin duvarları boyunca iki mililitre PBS ekleyin. Ve sonra PBS'yi aspire edin. DAPI boyamaya hazırlanmak için, bir cam slayt üzerine beş mikrolitre DAPI boyama reaktifi ekleyin.

Ardından bir neşter kullanarak kapak fişini tabaktan çıkarın. Ve kapak fişinin kenarına bir kağıt havluyla dokunarak kapak fişindeki fazla PBS'yi boşaltın. Şimdi, hücrelerin DAPI boyama reaktifine maruz kalması için kapak kızağını cam slayt üzerindeki DAPI boyama reaktifinin damlasına baş aşağı monte edin.

Son olarak, lekeli hücreleri bir DAPI filtresi ile donatılmış bir floresan mikroskobu altında inceleyin. Üç hücre ölümü modunun her birindeki nükleer morfolojiler gösterilmiştir. Apoptotik hücrelerin yoğunlaştırılmış çekirdeklere sahip olduğu görülür.

Mitotik felaket geçiren hücrelerin çekirdeklerinde çoklu loblar gözlenir. Yaşlanma geçiren hücrelerin karakteristik yaşlanma ile ilişkili heterokromatin odakları sergilediği görülmektedir. Sahte ışınlanmış çekirdeklerin ve altı gri X-ışını ile ışınlanmış çekirdeklerin karşılaştırmalı bir gözlemi gösterilmiştir.

Daireler apoptoz geçiren çekirdekleri gösterir ve oklar mitotik felaket geçiren çekirdekleri gösterir. Sahte ile karşılaştırıldığında ışınlamaya maruz kalan yaklaşık 300 çekirdeğin değerlendirilmesi gösterilmiştir. Altı gri X-ışını ışınlamasının yaklaşık %25 oranında daha sık mitotik felakete neden olduğu, ardından yaklaşık %5 oranında apoptoz ve çok nadir yaşlanma olaylarına neden olduğu görülmektedir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa bir saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, solüsyonları doğrudan kapak fişlerine uygulayarak hücrelere zarar vermemeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, her bir klonojenik hücre ölümü modunu daha iyi anlamak için akış sitometrik analizi veya hücre ölümü belirteç proteinleri gibi diğer yöntemler ve yaşlanmayı değerlendirmek için yaşlanma ile ilişkili beta-galaktosidaz boyaması gerçekleştirilebilir.