Tek adımlı protokol modu Floresans mikroskobu tarafından radyasyon kaynaklı klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü değerlendirilmesi için
23 Ekim 2017
İyonizan radyasyon (IR) araştırma-indüklenen klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü Malign tümörler ve normal dokuların IR etkileri anlamak için önemlidir. Burada, biz büyük modları IR kaynaklı klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar hücre ölümü morfolojisi 4', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) üzerinde dayalı değerlendirmek için bir tek adımlı tahlil tarif-floresan mikroskopi tarafından görüntülenmiştir çekirdeği lekeli.
Bu testin genel amacı, DAPI ile boyanmış çekirdeklerin karakteristik morfolojilerine dayalı olarak iyonlaştırıcı radyasyonun neden olduğu klonojenik hücre ölümlerinin ana modlarını değerlendirmektir. Bu yöntem, radyasyon biyolojisi alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu hızlı ve uygun maliyetli tekniğin ana avantajı, iyonlaştırıcı radyasyonun neden olduğu klonojenik hücre ölümünün ana modlarının aynı anda değerlendirilebilmesidir.
Genel olarak, radyasyon biyolojisine yeni olan bireyler, radyasyonun neden olduğu klonojenik hücre ölümünü değerlendirmek için mücadele edeceklerdir, çünkü her hücre ölümü modunu değerlendirmek için farklı tahliller gereklidir. Bu yöntem için ilk olarak, çoklu hücre hatları ve radyasyon dozları kullanarak radyasyona bağlı klonojenik hücre ölümünün büyük ölçekli taramasını yaptığımızda aklımıza geldi. Bu yöntem radyasyon biyolojisi hakkında bilgi verebilse de, kanser için kemoterapi gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.
Prosedürü gösteren işbirlikçimiz Atsushi Shibata olacak. Bir neşteri %70 etanol ile nemlendirilmiş kağıt havlularla sterilize ederek başlayın. Ardından, 35 milimetrelik bir hücre kültürü kabına bir kapak fişi yerleştirmek için neşteri kullanın.
Kapak fişi ile kültür kabına bir mililitre kültür ortamı ekleyin. Şimdi kapak kaymasının ortasını steril forseps ile nazikçe tutun ve kültür ortamını tabaktan tamamen aspire edin. Daha sonra, 15 mililitrelik bir tüpte kültür ortamında üç mililitrelik bir hücre süspansiyonu hazırlayın.
Hücre süspansiyonunu kültür kabına ekleyin. Ve gece boyunca 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de inkübe edin. Hücrelerin kapak kızağına bağlı olduğundan ve ters çevrilmiş faz kontrast mikroskobu altında inceleyerek canlı olduğundan emin olun.
Şimdi çanağı altı gri X-ışını radyasyonu ile ışınlayın. Işınlamadan sonra, hücreleri bir inkübatörde 72 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de inkübe edin. Şimdi hücreleri inkübatörden alın ve kültür ortamını kültür kabından aspire edin.
1.000 mikrolitrelik bir mikro pipet ucunun ucunu makas kullanarak uçtan yaklaşık beş milimetre kesin. Ve kültür kabına bir mililitre fiksasyon çözeltisi eklemek için kullanın. Hücrelere verilen zararı en aza indirmek için sabitleme solüsyonunu kültür kabının duvarları boyunca uygulayın.
Daha sonra bu kültür kabını kare bir kültür kabına aktarın ve sabitleme solüsyonunu kapak fişi üzerine eşit şekilde dağıtmak için hafifçe sallayın. Bundan sonra, çanağı oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Sabitleme çözeltisini çanaktan aspire edin.
Şimdi yemeğin duvarları boyunca iki mililitre PBS ekleyin. Ve sonra PBS'yi aspire edin. DAPI boyamaya hazırlanmak için, bir cam slayt üzerine beş mikrolitre DAPI boyama reaktifi ekleyin.
Ardından bir neşter kullanarak kapak fişini tabaktan çıkarın. Ve kapak fişinin kenarına bir kağıt havluyla dokunarak kapak fişindeki fazla PBS'yi boşaltın. Şimdi, hücrelerin DAPI boyama reaktifine maruz kalması için kapak kızağını cam slayt üzerindeki DAPI boyama reaktifinin damlasına baş aşağı monte edin.
Son olarak, lekeli hücreleri bir DAPI filtresi ile donatılmış bir floresan mikroskobu altında inceleyin. Üç hücre ölümü modunun her birindeki nükleer morfolojiler gösterilmiştir. Apoptotik hücrelerin yoğunlaştırılmış çekirdeklere sahip olduğu görülür.
Mitotik felaket geçiren hücrelerin çekirdeklerinde çoklu loblar gözlenir. Yaşlanma geçiren hücrelerin karakteristik yaşlanma ile ilişkili heterokromatin odakları sergilediği görülmektedir. Sahte ışınlanmış çekirdeklerin ve altı gri X-ışını ile ışınlanmış çekirdeklerin karşılaştırmalı bir gözlemi gösterilmiştir.
Daireler apoptoz geçiren çekirdekleri gösterir ve oklar mitotik felaket geçiren çekirdekleri gösterir. Sahte ile karşılaştırıldığında ışınlamaya maruz kalan yaklaşık 300 çekirdeğin değerlendirilmesi gösterilmiştir. Altı gri X-ışını ışınlamasının yaklaşık %25 oranında daha sık mitotik felakete neden olduğu, ardından yaklaşık %5 oranında apoptoz ve çok nadir yaşlanma olaylarına neden olduğu görülmektedir.
Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa bir saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, solüsyonları doğrudan kapak fişlerine uygulayarak hücrelere zarar vermemeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, her bir klonojenik hücre ölümü modunu daha iyi anlamak için akış sitometrik analizi veya hücre ölümü belirteç proteinleri gibi diğer yöntemler ve yaşlanmayı değerlendirmek için yaşlanma ile ilişkili beta-galaktosidaz boyaması gerçekleştirilebilir.
Genel Bakış
Bu makale, iyonlaştırıcı radyasyon (IR) tarafından indüklenen klonojen hücre ölümünün ana modlarını değerlendirmek için tek adımlı bir tahlili sunmaktadır. Yöntem, nükleer morfolojileri görselleştirmek için DAPI boyamasını kullanarak radyasyon biyolojisi hakkında bilgiler sağlamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Radyasyon biyolojisi
- Hücre ölüm mekanizmaları
- Floresan mikroskopi
Arka Plan
- IR ile indüklenen klonojen hücre ölümünü anlamak, kanser araştırmaları için kritik öneme sahiptir.
- Her hücre ölüm modunu değerlendirmek için tipik olarak farklı tahlil gerekebilir.
- Bu yöntem, birden fazla modun eşzamanlı değerlendirmesine izin verir.
- Ayrıca kemoterapi çalışmalarına da uygulanabilir.
Çalışmanın Amacı
- IR ile indüklenen hücre ölümünü değerlendirmek için hızlı ve maliyet-etkin bir tahlili geliştirmek.
- Radyasyonun malign tümörler ve normal dokular üzerindeki etkilerini anlamayı kolaylaştırmak.
- Radyasyon biyolojisine yeni başlayanlar için erişilebilir bir yöntem sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Hücre kültürlerinin hazırlanması ve X-ışınları ile ışınlama.
- Nükleusların sabitlenmesi ve DAPI boyama.
- Boyanmış hücrelerin floresan mikroskopi kullanılarak görselleştirilmesi.
- Hücre ölüm modlarını tanımlamak için nükleer morfolojilerin değerlendirilmesi.
Ana Sonuçlar
- Yoğunlaşmış nükleuslu apoptotik hücrelerin tanımlanması.
- Loblu nükleuslar aracılığıyla mitotik katastrof gözlemlenmesi.
- Heterokromatin fokuslu senesan hücrelerin karakterize edilmesi.
- Apoptoza kıyasla daha yüksek mitotik katastrof oranlarını gösteren kantitatif analiz.
Sonuçlar
- Tahlil, klonojen hücre ölümünü incelemek için basit bir yaklaşım sunmaktadır.
- Bu, iyonlaştırıcı radyasyona hücresel yanıtı anlamayı geliştirir.
- Gelecekteki uygulamalar, kemoterapi gibi diğer tedavi yöntemlerine kadar genişletilebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Rapid, simultaneous evaluation of radiation-induced clonogenic cell death modes is critical for de-risking early oncology discovery and optimizing therapeutic strategies. This one-step fluorescence microscopy protocol enables high-throughput, quantitative assessment of apoptosis, mitotic catastrophe, and senescence, supporting predictive confidence in target and pathway interrogation. The approach streamlines mechanistic studies and informs portfolio triage decisions in radiobiology and related therapeutic modalities.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization and quantification of distinct cell death mechanisms post-irradiation.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing apoptosis, mitotic catastrophe, and senescence in a single workflow.
- Facilitates rapid hypothesis testing for target engagement and pathway modulation in oncology models.
- Provides actionable data for prioritizing targets and refining therapeutic hypotheses.
Screening & Assay Development
- Delivers a standardized, reproducible assay for evaluating cell death phenotypes across multiple cell lines and conditions.
- Generates quantitative outputs suitable for screening compound libraries or radiation dose responses.
- Reduces assay complexity by consolidating multiple readouts into a single imaging-based protocol.
- Enables scalable, cost-effective screening for functional cell death endpoints.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro cell death phenotypes with translational biomarkers relevant to radiotherapy response.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling cross-comparison of treatment modalities.
- Informs risk-adjusted advancement decisions by quantifying mechanistic cell death outcomes.
- Provides a platform for integrating additional biomarker or functional assays as needed.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol fits at the intersection of early discovery, lead identification, and preclinical mechanistic studies, enabling seamless integration into oncology R&D pipelines.
- Discovery Biology: Facilitates null hypothesis testing and pathway clarification by directly measuring cell death modes post-irradiation.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for comparing treatment conditions and optimizing assay parameters.
- Analytics: Supports statistical analysis of cell death frequencies, enabling robust comparison across experimental arms.
- Translational Research: Bridges in vitro mechanistic findings with preclinical biomarker strategies when aligned with downstream assays.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, adaptable platform for diverse cell lines, treatments, and mechanistic studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell death pathway analysis.
- Operational Value: Streamlines workflows through assay standardization, reproducibility, and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management by clarifying cell death mechanisms.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of oncology assets based on mechanistic data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and nuclear morphology interpretation.
- Needs access to irradiation equipment and DAPI-compatible imaging infrastructure.
- Demands cross-team standardization for consistent scoring of cell death phenotypes.
- Adaptable to various cell lines and treatment regimens with protocol optimization.
- May require complementary assays for deeper mechanistic or biomarker validation.
