Zebra balığı larva geliştirilmiş deneysel manipülasyon için uzun vadeli canlı görüntüleme aygıtı

Bu görüntüleme cihazı üretiminin genel amacı, canlı zebra balığı larvalarında yara iyileşmesinin mikroskobik analizi için değiştirilebilir bir platform oluşturmaktır. Bu yöntem, kollajen lifinin yeniden düzenlenmesinin ve hücresel yanıtların yaralanma sonrası sonraki doku büyümesine katkısı nedir gibi yara iyileşmesi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, yaralama ve görüntülemenin tek bir cihaz içinde gerçekleşmesi ve kuyruğun yeniden büyümesinin cihaz tarafından engellenmemesidir.

Ek olarak, zWEDGI'nin çoklu fonksiyonel bölmeleri, farklı larva aşamalarını ve bir dizi deneysel protokolü barındıracak şekilde bağımsız olarak değiştirilebilir. Başlamak için, cihazın PDMS bileşenini metin protokolüne göre istenen geometriler ve niteliklerle modelleyin. Kalıpları bir fotopolimer 3D yazıcı kullanarak yazdırdıktan sonra, kalıpları ince bir fırça, bir sprey şişesinde denatüre alkol ve basınçlı hava kullanarak temizleyin.

Kürlenmemiş reçineyi, özellikle mikrokanal bölgelerindeki herhangi bir malzemeyi nazikçe ovalayın ve çıkarın. Daha sonra, kürlenmemiş reçine zebra balığı larvaları için toksik olduğundan, kalıpları bir UV kürleme sonrası aparatta her iki tarafta 60 dakika boyunca sertleştirin. 200 kumlu zımpara kağıdı kullanarak, kalıbın boşluk tarafını tüm tavan yüzeyleri zımpara kağıdı ile temas edene kadar düz bir yüzey üzerinde zımparalayın.

400 ve 600 kumlu zımpara kağıdı ile, kalıbın tüm geometri yüzeylerinde pürüzsüz, düz yüzeyler elde etmek için aşamalı olarak hafifçe zımparalayın. Ardından, tasarım derinliğine yakın olduğunu doğrulamak için zımparalamadan sonra boşluğun derinliğini ölçmek için bir kadranlı gösterge kullanın. Kalıpları ve cam kapak disklerini 30 dakika boyunca suyla dolu ultrasonik bir temizleyiciye koyarak veya akan su altında yıkayarak temizleyin.

Kalıpları ve kapakları temizlemek ve kurutmak için izopropil alkol ve filtrelenmiş basınçlı hava kullanın. Havadaki döküntülerden kaynaklanan kontaminasyonu en aza indirmek için cihazları imal etmek için temiz bir tezgah hazırlayın. Tabanı ve aktivatörü 5:1 oranında plastik bir kaba dökerek PDMS'yi yapın.

Tahta bir el işi çubuğuyla iki dakika boyunca iyice karıştırın, jeli ekmek yoğurur gibi kendi üzerine karıştırın. Karışımı, tüm kabarcıklar gidene kadar 25 ila 45 dakika boyunca bir vakumlu desikatörde gazını alın. Daha sonra, 10 mililitrelik bir şırınga kullanarak, her bir 3D baskılı kalıbın boşluğunu, kalıp bir menisküs ile hafifçe taşana kadar yaklaşık 0.75 mililitre PDMS ile doldurun.

Doldururken oluşmuş olabilecek ek kabarcıkları gidermek için doldurulmuş kalıpların gazını 45 dakika boyunca alın. PDMS dolgulu kalıbın üzerine bir cam kapak diski uygulayın ve kabarcıkların sıkışmasını önlemek için diski belirli bir açıyla aşağı doğru bastırın. Cam disk kapağı uygulanırken fazla PDMS'nin dışarı atılmasına izin verin.

Ardından, kapak diskini kalıba sıkıca tutmak için küçük bir cırcır kelepçesi kullanın. Verimlilik için çok kelepçeli bir cihaz kullanılabilir. PDMS cihazını ve kelepçeli kalıpları 100 santigrat derecede bir fırında en az 90 dakika kürleyin.

Ardından kalıpları fırından çıkarın ve kolayca işlenene kadar soğumaya bırakın. Kürlenmiş PDMS cihazını içeren kalıbı, kalıbın geometrileri yukarı bakacak şekilde, çalışma istasyonu tezgahına paralel olacak şekilde bir tezgah mengenesine sıkıştırın. PDMS çekme musluğunu kalıptan çıkarmak için düz uçlu cımbız kullanarak PDMS cihazını çıkarmaya başlayın.

Ardından, cımbızla kalıbın çevresini dolaşın. PDMS, 100 santigrat derecede en az 90 dakika kürlenmelidir, aksi takdirde yapışkan kalır ve kalıba yapışır. Cihazı yeterince uzun süre kürlediğinizin iyi bir göstergesi, kalıp ile PDMS cihazı arasındaki arayüzde aslında bir hava kabarcığı görmenizdir, bu da kolayca çıkarılacağını gösterir.

Çekme tırnağına tutarak ve cihazın altına hava üfleyerek cihazı kalıptan nazikçe kaldırmak için filtrelenmiş, basınçlı hava ve cımbız kullanın. Ardından, PDMS cihazını, kısıtlayıcı tünel takozları plastiğe temas edecek şekilde bir cam tabanlı tabağın kapağının iç kısmına baş aşağı yerleştirin. Ardından, baş aşağı zWEDGI ile bulaşık kapağını ve ilgili cam alt kabı, iç cam yukarı bakacak şekilde bir plazma temizleyiciye yerleştirin.

Basınç 500 militorr'a ulaşana kadar plazma temizleme odasını boşaltın. Radyo frekansını veya RF gücünü yükseğe ayarlayın ve cihazı ve çanağı yaklaşık iki dakika boyunca RF frekansına maruz bırakın. Ardından, haznenin basıncını yavaşça boşaltın ve cihazı ve çanağı temiz oda davlumbazına geri koyun.

PDMS cihazını çanak kapağından çıkarın. Ardından, PDMS zWEDGI'yi cam alt tabağın orta kuyusuna dikkatlice yerleştirerek cam üzerinde doğru yöne çevirin. PDMS'nin cama yapışmasını sağlamak için, cımbızın arka ucunu kullanarak mikro kanalların en küçük geometrilerine baskı uygulayın ve PDMS'yi kenarlara doğru düzleştirin.

Cihazın altında hava kabarcıklarının sıkışmadığından emin olmak için PDMS cihazına hafifçe bastırın. Tabağa %70 etanol ekleyin ve bir mikropipet kullanarak, sınırlama tüneli de dahil olmak üzere kanalları durulayın. Ardından, etanolü çıkarın ve cihazı kurumaya bırakmadan önce iki veya üç kez durulamak için çift damıtılmış su kullanın.

Kanalları yağsız sütle doldurun ve larvaların tabağın cam kapak kızağına yapışmasını en aza indirmek için cihazı oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Ardından, durulamak için cihazı birkaç kez hafifçe çift damıtılmış suya batırın ve baş aşağı kurumaya bırakın. Larvaları metin protokolüne göre uyuşturduktan sonra, cihazın kanallarını önceden ıslatmak için birkaç mikrolitre tricaine E3 kullanın.

Geniş delikli bir pipet ucu kullanarak, tek bir larva alın ve yükleme kanalına bırakın. Daha sonra, bir pipet ucu veya benzeri bir aletle, larvaları, sırt tarafı yükleme odasının daha düz kenarına bakacak ve kuyruk sınırlama tüneline bakacak şekilde yükleme odasına yönlendirin. Larvaların sınırlama tüneline akmasına izin vererek, yara odasından sıvıyı dikkatlice çekin.

Larva etrafındaki nemi korurken sıvının çoğunu çıkarın. Larva, sıvının çoğu uzaklaştırıldığı için sınırlama tüneline uygun şekilde yönlendirilmelidir. Ancak larvaların etrafında yeterli sıvı kalmalıdır.

Oryantasyon, agaroz ilavesinden sonra ayarlanabilir, ancak agaroz katılaşmadan önce gerçekleştirilmelidir. Trikin E3 içinde% 1 LMP agarozu larvanın başının üzerine pipetleyin, yükleme haznesini doldurun ve agarozun larva ile uygun pozisyonda katılaşmasına izin verin. Hidrasyonu korumak için gerektiği kadar trikama E3'ü yara odasına ekleyin.

Ardından, kalan iki kanal için bu yükleme işlemini tekrarlayın. Bir şırınga iğnesi kullanarak, sınırlama tünelinden yaralama odasına sızan herhangi bir agarozu dikkatlice çıkarın. Yaralama, kısa süreli görüntüleme veya yara tedavisi izolasyonu için agarozun üzerine daha fazla tricaine E3 ekleyin.

Larvaları yaralama odasına sarmak için, kuyruk yüzgecini notokordun arkasına geçirmek için steril bir neşter bıçağı kullanın. Gerekirse ilave tricaine E3 ekleyin ve kültür kabı kapağını değiştirin. Anestezi uygulanmış larvalara sahip zWEDGI cihazını, 60 milimetrelik cam alt çanağı barındıracak bir sahne ekinde ters çevrilmiş bir mikroskop üzerine kurun.

Larvaların kuyruğunu en üst kanala yerleştirin ve kuyruğu istenen konuma getirmek için tabağı gerektiği gibi döndürün. Larvaları belirli deney için gerektiği gibi görüntüleyin. Deneyin sonunda, zWEDGI kabını mikroskoptan çıkarın.

Larvaların ve agarın metin protokolüne göre çıkarılmasından sonra, zWEDGI'yi daha önce gösterildiği gibi temizlemek için etanol ve damıtılmış su kullanın ve kuruması için baş aşağı ayarlayın. Kapalı cihazı serin ve kuru bir yerde saklayın. Burada, zWEDGI'nin görüntüleme yeteneklerini göstermek için ikinci harmonik için çoklu foton mikroskobu veya kuyruk yüzgecindeki kollajen liflerinin SHG görüntülemesi kullanılarak gösterilen görüntüler gösterilmektedir.

Yaralanmadan önce, SHG, notokorddan yüzgeç ucuna doğru dışa doğru yayılan kollajen liflerini tespit etti. Yaralamadan kısa bir süre sonra, kasılmış yüzgecin ucu ile yüzgecin merkezi arasındaki mesafe yara gevşemesi ile artar. zWEDGI, zaman içinde üç boyutlu verilerin toplanmasına izin vererek, hücre dışı matrisin yapısında meydana gelen dinamik değişikliklerin daha eksiksiz bir görünümünü sağlar.

Veri toplamanın 3 boyutlu doğası, işleme yazılımı kullanılarak mekansal yeniden yapılandırmaya izin verir. Bu rekonstrüksiyonlar ve müteakip döndürme seçenekleri, yüzgecin büzülmesinin ve gevşemesinin yalnızca görüntü koleksiyonunun XY düzleminde değil, aynı zamanda kuyruk büzülmüş durumun yukarı doğru kıvrılmasından düzleştikçe Z ekseninde de meydana geldiğini göstermektedir. Yeniden kullanılabilir kalıplar basıldıktan sonra, imalat tekniği üç ila dört saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, kürlemeden önce PDMS'de hava kabarcığı sıkışmadığından emin olmayı ve cihazları kalıplardan çıkarmaya çalışmadan önce yeterince uzun süre kürlemeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, ilaçların veya inhibitörlerin varlığının yara iyileşmesini nasıl etkilediği gibi ek soruları yanıtlamak için lokalize ilaç uygulaması, antikor etiketleme veya RNA ve protein saflaştırması gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra bu teknik, yara iyileşmesi alanındaki araştırmacıların zebra balığı larvalarında kollajen dinamiklerini, bağışıklık hücresi tepkisini ve doku büyümesini keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, bir zWEDGI'nin nasıl üretileceğini ve zebra balığı larvalarının yaralanması ve canlı görüntülenmesi için nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız. Fotopolimer 3D baskı reçinelerinin insanlar için tehlikeli ve zebra balıkları için toksik olduğunu unutmayın. Kürlenmemiş 3D baskılı parçaları tutarken eldiven giymek ve yüz maskesi kullanmak gibi önlemler alınmalı ve kalıpları PDMS ile doldurmaya çalışmadan önce baskılarda kalan tüm reçinenin kürlendiğinden emin olunmalıdır.