Name: Zebra balığı larva geliştirilmiş deneysel manipülasyon için uzun vadeli canlı görüntüleme aygıtı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 5 s
Description: Keşfedin zWEDGI cihazı kullanarak Danio rerio larvalarında yara iyileşmesinin uzun vadeli canlı görüntüleme yöntemini. Bu teknik kollajen reorganizasyonu ve doku yenilenmesini gerçek zamanlı incelemeye olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar birincil proje Morgridge Enstitüsü'nden araştırma laboratuvarı için görme duyusuyla ilgili ve hesaplama araçları için finansman ve kabul etmek istiyorum. NIH # R01GM102924 finansman anıyoruz (AH ve KWE). KH, JMS, RS, AH ve KWE gebe ve çalışma tasarlanmış. KH ve JMS desteği ile tüm deneylerin DL, KP ve RS yapılır. KH, JS, RS, AH ve KWE el yazması yazmaya katkıda bulunmuştur.

Not: temel zWEDGI tasarım 2-4 gün sonrası döllenme (dpf) ve University of Wisconsin-Madison araştırma hayvanlar Kaynak Merkezi yönergeleri izleyin Zebra balığı larva için formüle edilmiş.
 1. tasarım ve kalıpları 3D baskı <ol><li>Model PDMS bileşen istenen geometrileri ve özniteliklerle bir 3D modelleme yazılımı 5 cihazın. Boş bir kalıp ve PDMS parçası bir derleme oluşturmak ve PDSM bölgesine karşılık kalıp içinde bir oyuk oluşturarak PDMS bölümü için negatif bir kalıp oluşturun. Kalıp 3D baskı ( 2 rakam, adım 1.1) için bir .stl dosyası olarak kaydedin. 
	Not: Bir Stereolitografi biçimi (.stl) burada sunulan kalıp tasarım ( şekil 1) elde edilebilir için download vasıl https://morgridge.org/designs/ dosyasıdır.</li>
	<li>Baskı kalıpları fotopolimer 3D yazıcı ( Şekil 2, adım 1.2) kullanarak. Birden çok kalıpları yapmak tek bir baskıda mümkünse, böylece birden fazla cihaz kalıp PDMS tek bir toplu işlemle. 
	Not: gösterilen örnek fotopolimer reçine 5 kullanarak bir 0.075 mm ışın çapı ve 0.05 mm kalınlığı ile res modunda basıldı.
	<ol><li>Temiz kalıpları nazikçe fırçalayın ve iyileşmemiş reçine kaldırmak için iyi bir fırça, denatüre alkol bir sprey şişesinde ve basınçlı hava kullanarak. Microchannel bölgelerden herhangi bir malzeme çıkarmak.</li>
		<li>İyileşmemiş istifa Zebra balığı larva 10 için toksik olduğu gibi her iki tarafında 60 dk için bir UV sonrası tedavi aleti kalıpları sonrası tedavi.</li>
	</ol></li> <li>Sızdırmazlık yüzeyler (kanal geometrileri ve kalıp çevre takılması) zımpara ile temas kadar düz bir yüzeye 200 kum zımpara ile kalıp boşluğuna tarafında kum. Hafifçe 400 ve 600 kum zımpara kağıdı ile aşamalı olarak, tüm geometri Balata ( Şekil 2, adım 1.3) arasında düzgün floş yüzeyler üretmek için kum. Yakın tasarlanmış derinliği olduğunu doğrulamak için bir arama göstergesi ile zımpara sonra kavite derinliğini ölçmek.
	<ol><li>Temiz kalıpları ve kapak diskler (1 ¾ inç çap x ¼ inç kalın borosilikat cam veya akrilik; bir cam kalıp örtmek) bir ultrasonik temizleyici 30 dk için su dolu yerleştirerek veya akan suyun altında kızarma.</li>
		<li>Darbe basınçlı hava ile kuru ve her iki kalıpları temiz ve izopropil alkol ve filtre uygulanmış basınçlı hava ile kapsar. Temiz bir Bank havadan enkaz kirlenme en aza indirmek için cihazlar imal etmek bir yer olarak kullanın. Temizlenmiş kalıpları ve cam kapsar temiz tezgah veya kapaklı bir petri gerekinceye kadar tabak bırakın.</li>
	</ol></li></ol> 2. ZWEDGI cihaz imalatı PDMS <ol><li>yapmak PDMS dökme 184 tarafından silikon elastomer polydimethylsiloxane (PDMS) 5:1 (temel harekete geçirmek için) plastik bir kap içine bir oranında. Ekmek yoğurma gibi kendi, üzerine jel üzerinde karıştırarak bir ahşap tekne sopayla de 2 dakika karıştırın. 5 kalıpları için 10 g tabanının ve harekete geçirmek, 2 g kullanın.
	<ol><li>Tüm baloncuklar gitmiş kadar karışımı bir vakum desiccator 25-45 dk için de-gaz.</li>
		<li>Kadar kalıp biraz bir Menisküs ( Şekil 2, adım 2.1) aşan bir 10 mL şırınga kullanarak PDMS yaklaşık 0.75 mL ile her 3D yazdırılan kalıp boşluğuna doldurun.</li>
		<li>Doldururken oluşmuş ek kabarcıklar kaldırmak 45 dk için doldurulan kalıplar de-gaz.</li>
	</ol></li> <li>Cam örtmek yuvarlak yüzey üstünde tepe-in PDMS dolu kalıp uygulamak, kabarcıklar önlemek için bir açıyla aşağı disk tuşuna basarak tuzağa ( Şekil 2, adım 2.2). Aşırı PDMS cam disk kapak uygulandığı gibi okuldan izin.</li>
	Örtmek yuvarlak yüzey için kalıp sıkıca tutmaya <li>kullanım küçük kilit kelepçe. 
	Not: bir kez PDMS tedavi edildi ve 3D yazdırılan geometrileri cam kapak notu ile aynı hizada nerede deliklerden üretir bu düz bir yüzey oluşturur. Alternatif olarak, aynı anda tedavi cihazlarının sayısını artırmak için bir çok kelepçe aygıtı (örn. oluşturmak Şekil 2, adım 2.3).</li>
	<li>100 o C fırında, klempe kalıpları PDMS cihazda 90 dk ( Şekil 2, adım 2.4) için tedavi. Kalıpları fırından çıkarın ve kolayca ele alınması kadar soğumasını bekleyin. Sıkma cihazın metal ise, metal PDMS kalan ısı nedeniyle tedavi devam etmesini önlemek için kelepçe kalıp ve kapak disk montaj kaldırmak. 
	Not: Cihazın hala biraz sıcak ve tam olarak tedavi kalıp kaldırmak kolaydır. Ancak, bir kez kalıp fırın kaldırılır ve örtmek yuvarlak yüzey kaldırılır, bir kaç gün demolding için devam etmeden önce aygıt oturabilirsin. Cihazın kısa bir süre kür fırından çıkardıktan sonra demolded, kirletici tam olarak tedavi için izin verirken en aza indirmek için kapalı bir petri kabına yerleştirin.</li>
</ol> 3. Plazma-bağ zWEDGI cam çanak <ol><li>kelepçe bir tezgah Yardımcısı PDMS aygıtı içeren kalıp böylece kalıp &#39; s geometrileri çalışma istasyonu tezgah için bakan, paralel.
	Düz uçlu cımbız kullanarak kalıp PDMS çekme sekmesinden serbest bırakarak PDMS aygıtı kaldırmak için <ol><li>Başlat. Çevre (gibi bir pasta ( 2 rakam, adım 3.1) bir tava dışarı kaldırma) cımbız ile kalıp ve geçici çözüm.</li>
		<li>Sıkıştırılmış hava ve yavaşça çekme tırnağını tutarak ve cihazın altında hava üfleme kalıp cihazınızdan çekin cımbız kullanın filtre. Yavaş, iş yardım için hava ayrı kalıp üzerinden PDMS izin, ince tünel bölümleri cımbız ipuçları ile özel dikkat.</li>
	</ol></li> <li>Yasaklama tünel dilimleri plastik ( 2 rakam, adım 3.2) dokunuyorsun PDMS aygıt alt üst kapak cam kaynatıp yemeğin içine yerleştirin.</li>
	<li>Ters zWEDGI ve karşılık gelen cam kaynatıp tabak çanak kapağı bir plazma temizleyici yukarı bakacak şekilde iç cam ile ( Şekil 2, adım 3.3) yerleştirin.
	<ol><li>500 mTorr basınç ulaşıncaya kadar odası Temizleme plazma tahliye.</li>
		<li>Set radyo frekansı (RF) gücü yüksek. Cihazın ortaya çıkarmak ve yemek için RF frekans yaklaşık 2 dakika süreyle yavaş yavaş odası de-basınç ve cihaz ve çanak temiz oda kukuIeta döndürür.</li>
	</ol></li> <li>PDMS aygıt çanak kapağı çıkarın. Dikkatle Merkezi de cam alt çanak ( Şekil 2, adım 3.4) <ol><li>üzerine arka uç cımbız kullanarak getirerek PDMS zWEDGI camına doğru şekilde üzerinde flip, hafifçe bastırın PDMS üzerinde Hava kabarcıkları altında sıkışmış değil emin olmak için aygıt. Mikro kanallar dakika geometrileri çevresinde basınç uygulayın ve kenarları ( şekil 5C) PDMS düzgünleştirmek. 
		Not: PDMS ve cam arasında tam temas plazma bağ üzerinden daha iyi uyum sağlar. ZWEDGI aygıt-ebilmek var olmak diğer altlı cam tabak formatlarını altlı cam 6-şey plat üzerine yapıştırılmış plazmae ( şekil 2C).</li>
		<li>Temiz oda hood çıkarmadan önce aygıt çanak üzerinde bir kapak yerleştirin. 
		Not: cihazlar için cam düzelttikten sonra kullanıma hazır olana protokol duraklatılmış.</li>
	</ol></li></ol> 4. Hazırlık ve yükleme larva kanal Not: genel Zebra balığı yetiştiriciliği gerçekleştirilmiştir Zebra balığı kitap elde edilebilir online http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html. Yetişkin Zebra balığı ve embriyo 1 daha önce açıklandığı gibi muhafaza. Vahşi türü AB suşu kullanılmıştır. Kurum izleyin &#8217; s hayvan bakım iletişim kuralı özellikleri canlı larvaları görüntüleme gereksinimleri ile ilgili olarak için.
<ol><li>Durulama kanalları en az 100 µL % 70 etanol yasaklama yoluyla durulama için bir micropipette kullanarak kanal başına bir tünel. Etanol ve 2 veya 3 kez Çift Kişilik distile su ile durulama kaldırın. Hava Kuru izin.</li>
	<li>Kanalları (adlı bir konsantrasyon suda seyreltilmiş % 1) yağsız süt ile larva bağlılık cam coverslip yemeğin için en aza indirmek için oda sıcaklığında 10 dakika için doldurun. Sonra yavaşça durulama için birkaç kez Çift Kişilik distile su cihazda daldırın. Hava için baş aşağı kuru sağlar. 
	Not: İletişim kuralı burada duraklatılmış. Bu hazırlık zWEDGI aygıtı kullanmak için birkaç gün önce yapılabilir. Mağaza oda sıcaklığında kapalı.</li>
	<li>100 µL % 2 erimiş LMP özel 100 µL 2 ile birleştirerek (LMP) özel x Tricaine (0.4 mg/mL Tricaine - etil 3-aminobenzoate) E3 arabellek 11 38 Ey için C. önceden ısındı hazırla % 1 düşük erime noktası % 1 korumak 38 o C gelling önlemek için sıcak bir blok içinde özel/tricaine çözüm. 
	Not: Multiphoton mikroskobu 11, (örneğin casper 12) her iki un Pigmentli Zebra balığı değişikliklerini kullan veya 0.2 mM pigment oluşumunu önlemek için N-phenylthiourea içeren larva E3 içinde korumak yakın kızılötesi dalga boylarında absorpsiyonu pigment ile en aza indirmek için 11. 
	Dikkat: N-phenylthiourea zehirlidir. Kurum izleyin &#39; s kuralları bertarafı için.</li>
	E3 <li>Anesthetize larva içeren 0.2 mg/mL tricaine (Tricaine/E3) 11 tampon. Larvaları hareketsiz ve non-yanıt veren bir dokunmatik uyarana kadar bekleyin.</li>
	<li>Tricaine/E3 birkaç microliters kanallarıyla önceden ıslak.
	<ol><li>Pick kadar geniş orifis pipet ucu kullanarak tek bir larva iken. Larvalar bir yükleme kanala ( şekil 3A) Kasası. Bir pipet ucu veya benzer bir araç kullanarak yükleme odasında larva yükleme odası ve yasaklama tünel ( şekil 3B) doğru kuyruk yüzleri düz kenarına dorsal yüzü öyle ki şark.</li>
		<li>Dikkatle sıvı larva yasaklama tünele ( şekil 3 c) akışı sağlayan yaralama odası geri çekmek--dan. Sıvı çoğu larva ( şekil 3D) çevresinde nemi koruyarak kaldırın. Bu işlem çanak yaralama odası doğru hafifçe eğerek yardımcı olabilir.</li>
	</ol></li> <li>Tricaine/E3 içinde % 1 LMP özel yerleştirin (~ 38 o C) larva üzerinde &#39; s kafa, yükleme Odası ( şekil 3E) doldurma. Uygun pozisyonda larva ile kuvvetlendirmek özel izin. Tricaine/E3 yaralama odasına hidrasyon korumak için gerektiğinde ekleyin. Bu yükleme işlemi kalan 2 kanal için işlemi yineleyin.</li>
	<li>Bir şırınga iğnesi kullanarak dikkatli bir şekilde yasaklama tünelden yaralama Odası ( şekil 3F) seeped herhangi bir özel çıkarın. Biraz özel (için yaralama, kısa vadeli görüntüleme veya yara tedavi yalıtım) üzerinde ek tricaine/E3 ekleyebilirsiniz veya kültür yemek (için uzun vadeli görüntüleme) doldurmak için. Buharlaşma önlemek için kültür çanak kapağı değiştirin. Larva (askerinden) bu noktada yansıma ya da yaralı.</li>
</ol> 5. Yaralama ve görüntüleme larva <ol><li>( şekil 3 G, H) yaralama odasında notochord 11 arka kuyruk yüzgeci transect bir steril neşter bıçak kullanma. Gerekirse ek tricaine/E3 ekleyin ve kültür çanak kapağı değiştirin. 
	Not: Alternatif olarak, faiz gelişimsel saat penceresinin bağlı olarak, larva olabilir yaralı, E3 içinde yeniden elde etmek için izin ve bu noktada onlar gibi kanal içine yüklenebilir istediğiniz görüntüleme zamana kadar bir kuluçka (28,5 o C) muhafaza yukarıda açıklanan.</li>
	<li>60 mm cam alt çanak uygun büyüklükte bir sahne eklemek içinde ters bir mikroskop üzerine imzalat larvaları ile zWEDGI aygıtı yükleyin. Larva kuyruk kuyruk istediğiniz konuma almak için gerektiği gibi çanak dönen üst-çoğu kanalı bulun. Özel deneme için gerektiği gibi görüntü. 
	Not: ZWEDGI geniş widefield floresan ve lazer mikroskobu tarama dahil olmak üzere yüksek çözünürlüklü ışık mikroskobu için geçerlidir. Zebra balığı larva Imaging bir dizi parametre dikkat edilmesi gereken noktalar vardır ancak enstrüman, örnek ve deney bağımlı parametreleri Imaging özeldir. Burada, larva kuyruk aşağıdaki parametreleri kullanan bir özel yapý multiphoton mikroskop 5 , 11 tarihinde görüntüsü: 40 uzun çalışma mesafe su daldırma amaç, 890 nm lazer uyarma, X 445/20 nm emisyon filtre ve 512 x 512 çözüm.</li>
</ol> 6. Deneme sonunda <ol><li>Kaldır zWEDGI çanak--dan mikroskop. Larvalar yanında duvar ilanı zWEDGI bir buz su banyosu veya 4 o C için en az 20 dk, ötenazi ve kalp atışı ve kan dolaşımı yokluğu için değerlendirmek. 
	Not: çünkü larva ayrı bölmeleri tutulur, larvalar ayrı ayrı forseps veya pipet ile agar üzerinde hafifçe çekerek elde edilebilir. Agar-ebilmek var olmak çıkarmak baş bölgesi ve antikor boyama için fiksasyonu gibi ek işlemleri için kullanılan veya RNA veya protein çıkarma için işlenen larva.</li>
	<li>Çıkarılması larva ve agar, zWEDGI etanol ile temiz ve distile su, 4.1. adımda açıklandığı gibi ve baş aşağı hava kuru ayarla. Mağaza serin, Kuru bir yerde kapalı. Yağsız süt (Adım 4.2) ile sonraki kullanımdan önce gerektiği gibi yeniden kat. 
	Not: cam parçalarından uzak gelmek PDMS başlayana kadar zWEDGIs birden çok kez yeniden kullanılabilir.</li>
</ol>

<ol><li>Yoo, S. K., Freisinger, C. M., LeBert, D. C., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+redox%2C+Src+family+kinase%2C+and+calcium+signaling+integrate+wound+responses+and+tissue+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Early redox, Src family kinase, and calcium signaling integrate wound responses and tissue regeneration in zebrafish.</a> J. Cell Biology. 199 (2), 225-234 (2012).</li>
<li>Kawakami, A., Fukazawa, T., Takeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+fin+primordia+of+zebrafish+larvae+regenerate+by+a+similar+growth+control+mechanism+with+adult+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dynam%22%5BJournal%5D)">Early fin primordia of zebrafish larvae regenerate by a similar growth control mechanism with adult regeneration.</a> Dev. Dynam. 231 (4), 693-699 (2004).</li>
<li>Konantz, J., Antos, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+genetic+morpholino+approach+using+cardiac+ventricular+injection+to+transfect+multiple+difficult-to-target+tissues+in+the+zebrafish+larva%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Reverse genetic morpholino approach using cardiac ventricular injection to transfect multiple difficult-to-target tissues in the zebrafish larva.</a> JoVE. (88), (2014).</li>
<li>Hall, C., Flores, M. F., Kamei, M., Crosier, K., Crosier, P. Live Imaging Innate Immune Cell Behavior During Normal Development, Wound Healing and Infection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHall%2C+C+%22Live+Imaging+in+Zebrafish%3A+Insights+into+Development+and+Disease%22">Live Imaging in Zebrafish: Insights into Development and Disease</a>. Sampath, K., Roy, S. , World Scientific Pubs. Singapore. (2010).</li>
<li>Huemer, K., Squirrell, J. M., Swader, R., LeBert, D. C., Huttenlocher, A., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((zWEDGI%3A+Wounding+and+Entrapment+Device+for+Imaging+Live+Zebrafish+Larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">zWEDGI: Wounding and Entrapment Device for Imaging Live Zebrafish Larvae.</a> Zebrafish. , (2016).</li>
<li>Lisse, T. S., Brochu, E. A., Rieger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+tissue+repair+in+zebrafish+larvae+with+time-lapse+brightfield+stereomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy.</a> JoVE. (95), (2015).</li>
<li>Kamei, M., Isogai, S., Pan, W., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+blood+vessels+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging blood vessels in the zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 100, 27-54 (2010).</li>
<li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+the+zebrafish+embryonic+brain+by+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy.</a> JoVE. (26), (2009).</li>
<li>Petzold, A. M., Bedell, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCORE+imaging%3A+specimen+in+a+corrected+optical+rotational+enclosure%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">SCORE imaging: specimen in a corrected optical rotational enclosure.</a> Zebrafish. 7 (2), 149-154 (2010).</li>
<li>Macdonald, N. P., Zhu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+biocompatibility+of+3D+printed+photopolymers+using+zebrafish+embryo+toxicity+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Assessment of biocompatibility of 3D printed photopolymers using zebrafish embryo toxicity assays.</a> Lab Chip. 16 (2), 291-297 (2016).</li>
<li>LeBert, D. C., Squirrell, J. M., Huttenlocher, A., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+harmonic+generation+microscopy+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Second harmonic generation microscopy in zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 133, 55-68 (2016).</li>
<li>White, R. M., Sessa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent+Adult+Zebrafish+as+a+Tool+for+In+Vivo+Transplantation+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transparent Adult Zebrafish as a Tool for In Vivo Transplantation Analysis.</a> Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).</li>
<li>LeBert, D. C., Squirrell, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase+9+modulates+collagen+matrices+and+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase 9 modulates collagen matrices and wound repair.</a> Development. 142 (12), 2136-2146 (2015).</li>
<li>Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+high-resolution+second-harmonic+generation+imaging+of+endogenous+structural+proteins+in+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues.</a> Biophys. J. 82 (1 Pt 1), 493-508 (2002).</li>
<li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

3D zaman atlamalı istikrarı ve yüksek çözünürlüklü mikroskop objektif küçük çalışma uzaklığı içindeki balık yönlendirme tarafından görüntüleme yakalamak için zWEDGI cihazın amacı budur. Bu tasarım özellikleri karşılarken, aynı zamanda bir gelişme canlı görüntüleme için geleneksel agar tabanlı hazırlık bitti. Hangi doğru yapılmazsa arızalı aygıtlar neden olabilir zWEDGI imalatı (aşağıda) üç kritik adım vardır:
PDMS hazırlık (şekil 5A)
Ka...

Zebra balığı larva Danio rerio yeniden üretim kapasitesini yapmak onları bir ideal model organizma yara yanıt yanı sıra1,2,3,4şifa ve büyütme incelenmesi. Transgenik Zebra balığı hatları ve Zebra balığı'nın anatomik şeffaflık daha fazla bir dizi erişim için in vivo çalışmalar yara yanıt olaylar hem de uzun vadeli rejeneratif işlemleri4onların yardımcı geliştirmek. Bu nedenle yüksek çözünürlüklü hızlandırılmış Floresans mikroskobu kullanarak bu biyolojik süreçlerin çalışma yüksek kararlılık ve Zebra balığı larva en az hareketin canlılığı koruyarak sağlar canlı bir görüntü Zebra balığı aygıtı gerektirir. Bu cihazın etkili şifa süre yaralama için izin verir ve rejenerasyon oluşur aygıt tarafından etkilenmemiş anahtarıdır.
Larva özel içinde canlı görüntüleme sırasında katıştırma Standart canlı görüntüleme sabitleme yöntemi büyüme kısıtlar ve rejenerasyon5 yara ve larva dört sonra kalp stres ve doku nekrozu belirtisi göstermeye başlar beri ölüm oranlarını artırabilir Saat4. Bu nedenle, özel ilgi bölgelerinden kaldırılması genellikle normal gelişim izin gereklidir ve rejenerasyon6için özel olarak potansiyel zararı larvalar açığa, kes gitsin. Ayrıca, özel5,6,7katılaşır önce teknik katıştırma özel ile kısa sürede larva kullanıcı yönlendirmek gerekir. Hızla larva manipüle sadece kullanıcının beceri gerektirir, ayrıca larva hasar riski. Her ne kadar canlı görüntüleme için larva stabilize etmek için yöntemler ridged agar wells3 veya divets8gibi bu sakıncaları aşmak için tarif var silikon vakum kullanımı yağ PVC boru veya diğer görüntüleme bir oda oluşturmak için malzemeler6ve dönme tüp9, bu yöntemlerin çoğu vardır emek yoğun, dağınık, sık sık yeniden ve çevre düzenlemesi için izin verme (ilaç tedavileri, yaralama vb.) Balık takıldıktan sonra.
Bu nedenle, zWEDGI cihazı (Resim 1) bazı örnek manipülasyon erişimine izin verme sırasında Zebra balığı larvalar uzun vadeli canlı görüntüleme için montaj agar sakıncaları üstesinden gelmek için tasarlanmıştır. ZWEDGI üç yarı açık bölümlere odaları (izin vermek için,şekil 1A) yükleme, kısıtlama, yaralama ve 2-4 gün sonrası döllenme Zebra balığı larva görüntüleme için oluşur. Cihaz Polydimethylsiloxane (PDMS) imal edilmiştir ve kapak notu bir 60 mm cam alt görüntüleme tabak yerleştirilir. Ancak zWEDGI tasarım modüler tasarım ve standart üretim teknolojileri kullanmanıza değiştirilebilir ve yordamlar için özellikle deneysel prosedürler çeşitli mükellef burada sunulan tasarım yara iyileştirici çalışmalar için amaçlanan oldu bu deneysel manipülasyon ve uzun vadeli görüntüleme ile en az kısıtlama gerektirir.

<table><tbody><tr><td><güçlü>Fabrikasyon kalıpları</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solidworks Professional Accedemic Research 3D modelleme yazılımı</td><td>Dassault Systemes</td><td>SPX0117-01</td><td>Fisher Unitech</td></tr><tr><td>Viper Si2 SLA 3D yazıcı</td><td>3D Systems Inc.</td><td>23200-902</td><td>3D Sistemleri A.Ş.</td></tr><tr><td>Accura 60 fotopolimer reçine</td><td>3D Sistemleri A.Ş.</td><td>24075-902</td><td>3D Sistemleri A.Ş.</td></tr><tr><td>denatüre alkol</td><td>Sunnyside</td><td>5613735</td><td>Menards</td></tr><tr><td>UV kür sonrası aparatı</td><td>3D Systems Inc.</td><td>23363-101-00</td><td>3D Sistemleri A.Ş.</td></tr><tr><td>TouchNTuff nitril eldiven</td><td>Ansell</td><td>92-600</td><td>McMaster Carr</td></tr><tr><td>220B, 400B, 600 kumlu T414 mavi bak zımpara kağıdı&nbsp;</td><td>Norton</td><td>66261139359, 54, 52</td><td>MSC</td></tr><tr><td>borosilikat cam disk, 2 "çap</td><td>McMaster-Carr</td><td>MIL-G-47033</td><td>McMaster-Carr</td></tr><tr><td>ultrasonicator temizleyici</td><td>Branson</td><td>1510R-MTH</td><td></td></tr><tr><td>izopropil sürtünme alkolü %70</td> <td>Hydrox</td><td>54845T43</td><td>McMaster-Carr</td></tr><tr><td>10oz şeffaf plastik bardak</td><td>WNA Başyapıtı</td><td>557405</td><td>Amazon</td></tr><tr><td>6 "zanaat sopa</td><td>Perfect Stix</td><td>Craft WTD-500</td><td>Amazon</td></tr> <tr><td>< güçlü > Adı< güçlü</td> <td>> < güçlü > Şirket < / güçlü ></td> <td>< güçlü > Katalog Numarası< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Yorumlar< / güçlü</td></tr> <tr><td>> < güçlü > zWEDGI PDMS cihazı üretin< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Sylgard 184 silikon elastomerik kit&nbsp;</td><td>Dow-Corning</td><td>4019862</td><td>Ellworth Yapıştırıcıları&nbsp;</td></tr><tr><td>10 mL şırınga</td><td>Becton Dickinson</td><td>305219</td><td>Vitality Medical Inc</td></tr><tr><td>kurutucu</td><td>Bel-Art Scienceware</td><td>F42027-0000</td><td>Amazon</td></tr><tr><td>4 cırcırlı çubuk kelepçesi</td><td>Pittsburgh</td><td>68974</td><td>Harbour Freight</td></tr><tr><td>laboratuvar fırını</td><td>Quincy Lab Inc.</td><td>20GC</td><td>Global Endüstriyel</td></tr><tr><td>cımbız seti</td><td>Aven</td><td>549825</td><td>McMaster-Carr</td></tr><tr><td>basınçlı hava filtreli nozul</td><td>Innotech</td><td>TA-N2-2000FT</td><td>Temiz Oda Kaynağı</td></tr><tr><td>vakum tezgahı mengenesi</td><td>Wilton Tool Group</td><td>63500</td><td>MSC Endüstriyel</td></tr><tr><td>55 mm cam alt tabak; 30mm mikro kuyu # 1.5 kapak camı</td><td>Cellvis</td><td>D60-30-1.5-N</td><td>Cellvis</td></tr><tr><td>plazma temizleyici</td><td>Harrick Plazma</td><td>PDC-001</td><td>Harrick Plazma</td></tr> <tr><td>< güçlü > Adı< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Şirket< ></td> <td>< güçlü > Katalog Numarası< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Yorumlar< / güçlü</td></tr> <tr><td>> < güçlü > Larva Yükleme < / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Pipetteman, P200</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>% 100 etanol (kullanımdan önce su ile% 70'e seyreltilir)</td> <td>Pharmco-aaper</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipeti</td><td>Fisherbrand</td><td>13-711-5A</td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>toz yağsız süt</td><td></td><td>2902887</td><td>MP Biyomedikal</td></tr><tr><td>çift damıtılmış su</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-feniltiorüre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>trikain (etil 3-aminobenzoat)</td><td></td> <td>C-FINQ-UE</td><td>Western Chemical</td></tr><tr><td>düşük erime noktalı agaroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0701</td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>ısı bloğu (kuru banyo inkübatörü)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>11-718-2</td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>E3 tamponu ve nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>büyük delikli pipet ucu, 200 uL</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-134</td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Genel amaçlı pipet ucu, 200 uL</td><td>Fisherbrand</td><td>21-197-8E</td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>#15 neşter bıçağı&nbsp;</td><td>Tüy</td><td>2976</td><td>Amazon</td></tr><tr><td>25G şırınga iğnesi</td><td>BD&nbsp;</td><td>BD305122</td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Imaging</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ters mikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris görüntüleme yazılımı</td><td>Bit düzlemi</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

zebra balığı larva geliştirilmiş deneysel manipülasyon için uzun vadeli canlı görüntüleme aygıtı

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

Zebra balığı larva bir gelişim biyolojisi ve yara iyileşmesi için önemli model organizmadır. Ayrıca, Zebra balığı larva uzay ve zaman ile hücresel kararlılık içinde dinamik biyolojik olayların canlı yüksek çözünürlüklü mikroskobik görüntüleme için değerli bir sistemdir. Ancak, özel saklama geleneksel yöntem canlı görüntüleme için larva geliştirme ve doku büyümesini engelleyebilir. Bu nedenle, bu el yazması zWEDGI açıklar (Zebra balığı Wounding ve tuzak aygıt büyüme ve görüntüleme için), hangi tasarlanmış ve larva yüksek çözünürlüklü mikroskopi için izin ederken yönlendirmek için işlevsel olarak bölümlere bir aygıt olarak fabrikasyon Kaudal fin transeksiyon aygıt ve sonraki kontrolsüz kuyruk geliştirme ve yeniden büyüme içinde. Yaralama ve canlılığı koruyarak uzun vadeli görüntüleme için bu cihaz sağlar. ZWEDGI kalıp baskılı 3D olduğunu göz önüne alındığında, onun geometrileri customizability üstesinden kolaylıkla değiştirilerek farklı Zebra balığı görüntüleme uygulamaları için. Ayrıca, zWEDGI kolay görüntüleme için birden çok larvalar yönünü ve aygıtı yeniden kullanılırlığı reaktifler, uygulanması veya yaralama için deneme sırasında larva erişim gibi çok sayıda avantaj paralellik sunar.

ZWEDGI PDMS mikrosıvısal aygıt Kaudal fin şifa ve büyütme Zebra balığı larva olarak yaralama, canlı görüntüleme ile ilgili dört ana işlevleri (aşağıda listelenmiştir) karşılamak için tasarlanmış işlevsel olarak bölümlere bir aygıttır. Sadece hazır olmadığından ve endüstri standardı Biyouyumluluk, aynı zamanda İnşaat kalıpları içinde de bir PDMS zWEDGI imalat için seçildi. Ayrıca, cihazın oluşan bir kez PDMS aygıtı yeniden kullanılabilir ve sert ve keskin kenarları geçersiz yapar. ZWEDGI ö...

Bu el yazması zWEDGI açıklar (Zebra balığı Wounding ve büyüme ve görüntüleme için tuzak aygıt), şark ve Zebra balığı larva dizginlemek için tasarlanmış bir compartmentalized alet olduğu. Tasarım kuyruk transeksiyon ve yara iyileşmesi ve rejenerasyon yüksek çözünürlüklü floresan mikroskopi görüntüleri uzun vadeli koleksiyonu izin verir.

Zebra balığı larva geliştirilmiş deneysel manipülasyon için uzun vadeli canlı görüntüleme aygıtı

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...

Bu görüntüleme cihazı üretiminin genel amacı, canlı zebra balığı larvalarında yara iyileşmesinin mikroskobik analizi için değiştirilebilir bir platform oluşturmaktır. Bu yöntem, kollajen lifinin yeniden düzenlenmesinin ve hücresel yanıtların yaralanma sonrası sonraki doku büyümesine katkısı nedir gibi yara iyileşmesi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, yaralama ve görüntülemenin tek bir cihaz içinde gerçekleşmesi ve kuyruğun yeniden büyümesinin cihaz tarafından engellenmemesidir.Ek olarak, zWEDGI'nin çoklu fonksiyonel bölmeleri, farklı larva aşamalarını ve bir dizi deneysel protokolü barındıracak şekilde bağımsız olarak değiştirilebilir. Başlamak için, cihazın PDMS bileşenini metin protokolüne göre istenen geometriler ve niteliklerle modelleyin. Kalıpları bir fotopolimer 3D yazıcı kullanarak yazdırdıktan sonra, kalıpları ince bir fırça, bir sprey şişesinde denatüre alkol ve basınçlı hava kullanarak temizleyin.Kürlenmemiş reçineyi, özellikle mikrokanal bölgelerindeki herhangi bir malzemeyi nazikçe ovalayın ve çıkarın. Daha sonra, kürlenmemiş reçine zebra balığı larvaları için toksik olduğundan, kalıpları bir UV kürleme sonrası apa

long-term-live-imaging-device-for-improved-experimental-manipulation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Burada, uzun vadeli görüntüleme, iki foton görüntüleme ve doku hasarı teknikleri ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme zebrafish embriyolar montaj için bir yöntem açıklanmaktadır.

İki foton axotomy ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme canlı zebrafish embriyolar

Organellerin ve diğer hücre altı yapıların dinamik davranışlarını in vivo olarak görüntülemek, fizyolojik ve hastalık durumlarındaki işlevlerine ışık tutabilir. Burada, iki organeli, sentrozomları ve mitokondriyi genetik olarak etiketlemek ve dinamiklerini geniş alan ve konfokal mikroskopi kullanarak canlı zebra balığı embriyolarında görüntülemek için yöntemler sunuyoruz.

Yaşayan Zebra balığı Embriyo Hücre alt yapıları görüntüleme

Işık tabakası floresan mikroskobu, embriyonik gelişimi görüntülemek için mükemmel bir araçtır. Yakın fizyolojik koşullarda canlı embriyoların uzun hızlandırılmış filmlerinin kaydedilmesine izin verir. Geniş uzaysal-zamansal ölçeklerde zebra balığı gözü gelişimini görüntüleme uygulamasını gösteriyoruz ve çok görüntülü veri kümelerinin füzyonu ve evrişiminin çözülmesi için bir boru hattı sunuyoruz.

Görüntü Zebra balığı Göz Geliştirme Işık Sac floresan mikroskobu kullanarak

Burada, normal gelişimi bozmadan canlı zebra balığı embriyolarının arka vücut gelişiminin uzun süreli hızlandırılmış görüntülemesine izin veren çok yönlü bir montaj yöntemi sunuyoruz.

Zebra balığı Kalkınma Uzun Süreli Görüntüleme için A yönlü Montaj Yöntemi

Zebra balığı embriyo ve larva mikroenjeksiyon birçok Zebra balığı modellerinde kullanılan çok önemli ama zorlu bir tekniktir. Burada, Zebra balığı mikroenjeksiyon ve görüntüleme için yönünü ve istikrar içinde yardım etmek için microscale araçlar bir dizi mevcut.

Microstructured cihazlar için en iyi duruma getirilmiş mikroenjeksiyon ve Zebra balığı larva görüntüleme

Bu makalede, uzun zaman atlamalı konfokal mikroskopi için kırılgan zebra balığı embriyoları monte etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu düşük maliyetli yöntem herhangi bir ters mikroskop görüntüleme için düzenli cam alt mikroskopi yemekleri kullanarak gerçekleştirmek kolaydır. Montaj farklı konsantrasyonlarda agarose katmanları yapılır.

Tüm Zebrabalığı Embriyolarının Uzun Zaman Atlamalı Konfokal Mikroskobu için Katmanlı Montaj Yöntemi

Işık tabakası bazlı floresan mikroskopisi gelişim biyolojisinde en değerli araçtır. Karşılaştırmalı çalışmalarda önemli bir konu ortam değişkenliğidir. Protokolümüz, birden fazla örneğin eşzamanlı canlı görüntülenmesi için deneysel bir çerçeveyi açıklar ve bu nedenle bu sorunu pro-aktif olarak ele alıp gidermektedir.

Örnek Oda Bazlı Işık Tabakası Floresan Mikroskoplarında Birden Fazla Böcek Embriyosunun EşZamanlı Canlı Görüntülenmesi

Bu protokol, zebra balığının erken göz gelişiminin toto etiketlemesi ve çok boyutlu görüntülenmesi için bir yaklaşımı açıklar. Lazer tarama konfokal mikroskopisi kullanarak etiketleme, gömme ve dört boyutlu (4D) görüntülemeyi ve optik bardak morfogenezinin diseksiyon mekanizmaları için veri kümelerinin alımını optimize etmek için dikkat edilmesi gereken noktaları açıklıyoruz.

Zebra Balığı Optik Kupası Morfogenezinin 4 Boyutlu Görüntülenmesi

Optik berraklık, zebra balıklarında hücre biyolojik ve fizyolojik çalışmaları için önemli bir avantajdır. Bireysel hayvanlarda hücre büyümesinin ölçülmesi için sağlam yöntemler, iskelet kasının ve komşu dokuların büyümesinin tüm vücut büyümesiyle nasıl bütünleştiğine dair yeni bilgiler sağlayan tanımlanmıştır.

Değiştirilmiş elektriksel aktiviteye maruz kalan bireysel canlı zebra balıklarında iskelet kası büyümesinin gerçek zamanlı ve tekrarlanan ölçümü

Bu protokol, zebra balığı larvalarında kardiyak kasılma fonksiyonunu araştırmak ve hücre izleme ve etkileşimli analiz yoluyla kalp mekaniği hakkında bilgi edinmek için ışık tabakası görüntülemeyi kullanır.

Zebra Balığı Kardiyak Kasılmasının 4D Işık Sayfası Görüntüleme

Keşfedin zWEDGI cihazı kullanarak Danio rerio larvalarında yara iyileşmesinin uzun vadeli canlı görüntüleme yöntemini. Bu teknik kollajen reorganizasyonu ve doku yenilenmesini gerçek zamanlı incelemeye olanak tanır.

Zebra balığı larva geliştirilmiş deneysel manipülasyon için uzun vadeli canlı görüntüleme aygıtı

Daha fazla video keşfet