Name: Sonraki nesil sıralama kullanarak CtDNA nadir mutasyonların tespiti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Keşfedin, ctDNA'daki düşük frekanslı mutasyonları ER-Seq yöntemiyle yüksek hassasiyet ve özgüllükle tespit etme tekniğini. Bu yöntem, klinik karar verme ve tedavi yanıtı izleme için değerli bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Geneplus – Beijing Enstitüsü tarafından desteklenir.

tümör örnekleri ve kan örnekleri Etik Komitesi, Pekin Üniversitesi insanlar tarafından onaylanmış bir protokolüne göre elde &#39; s hastane. Yazılı Onam saldırganın saklanıp örnekleri kullanmak için hastalardan elde edildi. Katılımcılar aşağıdaki kriterlere göre ekranlı: erkek, Gelişmiş sigara-küçük hücreli akciğer kanseri, EGFR p.L858R mutasyon belirtilen önceki Sanger sıralama tarafından hastalık ilerleme EGFR iki oturumu takip hedefli tedavi Erlotinib ile ve ER-ctDNA direnç nedeninin çözümlemek ve yeni hedef uyuşturucu bulmak için uygulanan Seq.
 1. DNA çekme--dan cfDNA ve genomik DNA (gDNA) için periferik kan <ol><li>periferik kan toplama tüp 10 mL toplamak, yavaşça yukarı ve aşağı 6 - 8 kez için tersine çevirin karıştırın. Hücre kesme önlemek. Kan örnekleri saklanabilir toplama tüp 6-37 ° c ilâ 72 saat.</li>
	<li>Toplama tüp, oda sıcaklığında 10 dakika santrifüj kapasitesi 1600'de (±150) x g.</li>
	<li>Dört temiz 2 mL uygun şekilde santrifüj tüpleri Pelet Katmanı (beyaz kan hücreleri) bozmadan bir tek kullanımlık damlalıklı kullanarak etiketli koleksiyonu tüpünden süpernatant (plazma) transfer.</li>
	<li>Transfer1 mL 2 ml temiz tek kullanımlık damlalıklı uygun kullanarak hücre santrifüj tüpü etiketli. Hücreler saklı-20 ° c veya daha önce adım 1.8 daha soğuk olabilir.</li>
	<li>(Kimden adım 1.3) plazma 4 ° C'de 10 dakika ve 16000 (±150) için santrifüj kapasitesi g. x</li>
	<li>Transfer düzgün olarak etiketli santrifüj tüpleri temizlemek için plazma &#34; plazma &#34;, kirlenmesini önlemek için alt kısmında kalan birim ~0.1 mL bırakın. Adım 1,7 kadar plazma-80 ° C'de depolayın.</li>
	<li>Plazma adım 1.6 3 mL cfDNA (içeren ctDNA) belirlemek için kullanın üretici takip piyasada bulunan bir seti kullanarak &#39; s yönergeleri.</li>
	<li>Kullanım 200 µL üretici takip piyasada bulunan bir seti kullanarak gDNA yalıtmak için adım 1.3 beyaz kan hücrelerinin &#39; s yönergeleri. 
	Not: Her ikisi de cfDNA ve gDNA-20 ° c kullanmadan önce saklanabilir.</li>
	<li>CfDNA ve gDNA (Tablo 2) için farklı kalite denetimleri uygulanır. Kalite kontrol için örnek yıkımı ve/veya gDNA kirlenme düzeylerini belirlemek bioanalyzer standart bir yöntem yerine getirilir. CfDNA ayıklama kalitesini analizini tepe şekil 1 ' e benzer görünmelidir. 
	Not: CfDNA en yüksek boyutu yaklaşık 170 olduğunu bp. Not cfDNA nadir mutasyonların etkili tespiti için daha yüksek bir kalite kitaplığındaki DNA miktarını artırarak sonuçlanır. En az 30 ng cfDNA (30.000 kopya) kullanmanızı öneririz.</li>
</ol> 2. Kütüphane hazırlık Not: temel Kütüphane inşaat parçalanmış DNA ile ilgili olarak cfDNA en yüksek boyut ~ 170 bp ile parçaları bulunmaktadır ve böylece birleştirilmesi gerekmez.
<ol><li>Parça denetimi örneği (gDNA) tarafından sonication 200-250 bp parçaları elde etmek için.
	<ol><li>Hazırlamak 1 µg Tris-EDTA arabelleği bir temiz sonication tüp 100 µL gDNA örneğinin.</li>
		<li>Sonication programı 30 küme s 12 dk. toplam 12 döngüleri için kapalı açık ve 30 s</li>
		<li>Ürün (5 µL) içeren 200-250 bp parçaları % 2 özel jel ile bir analiz çalıştırarak sonication sonra onaylamak.</li>
		<li>Tüm parçalanma ürünleri için yeni bir 1,5 mL tüp aktarmak ve 150 µL doğru parçaları seçmek 5 min için manyetik boncuklar ile kuluçkaya.</li>
		<li>Süpernatant kaldırmak için 30 manyetik bir raf üzerinde tüp koyarak s.</li>
		<li>Manyetik raf kalan tüp boncuk 200 µL % 80 etanol (taze hazırlanmış) ile yıkayın. 30 için kuluçkaya süpernatant kaldırmadan önce s. Bir kez yineleyin.</li>
		<li>Hava kuru manyetik raf kalırken açık tüp kapaklı boncuk. DNA hedef de kurtarır emin olmak için overdried boncuk kaçının. DNA parçaları boncuk boncuk miktar tarafından UV/Vis spektroskopisi tarafından takip DNA parçalarının gidermek için 10 mm Tris-HCl (pH 8) 32 µL ekleyerek elute. 
		Not: en az 200 ng aşağıdaki deneyler için gerekli.</li>
	</ol></li> <li>Son hazırlık tepki Not: takip üretici &#39; s öğretim ve gerektiği gibi değiştirin. CfDNA kullanım 30 ng; ve gDNA denetim olarak 1 µg.
	CfDNA steril nükleaz ücretsiz tüp, <ol><li>eklemek 7 µL tepki arabelleği, enzim karışımı 30 3 µL ng ve GKD 2 O 60 µL toplam hacmi ekleyin. Ayrı bir tüp içinde yukarıdaki bileşenleri eklemek ama gDNA cfDNA yerine 1 µg.</li>
		<li>Mix ve karışımı 30 dk 65 ° C 30 dk içinde bir thermocycler için ısıtmalı kapağı takip için 20 ° C'de kuluçkaya. Hemen bir sonraki adıma devam.</li>
	</ol></li> <li>Bağdaştırıcısı ligasyonu <ol><li>ekleyin 30 µL ligasyonu ana karışımı, 1 µL ligasyonu artırıcı ve 4 µL karışıma benzersiz sıralaması bağdaştırıcısı adım 2.2.</li>
		<li>Incubate bir thermocycler ısıtmalı kapağı olmadan içinde 15 dakika 20 ° C'de.</li>
		<li>Manyetik boncuklar resuspend ve boncuklar, oda sıcaklığında en az 30 dk önce bir sonraki adım için bırakmak için girdap.</li>
		<li>87 µL resuspended manyetik boncuklar daha önce sözünü ettiğimiz karışıma ekleyin; de yukarı ve aşağı pipetting karıştırın ve sonra 5 dakika süreyle oda sıcaklığında kuluçkaya</li>
		<li>Yıkama ve hava kuru boncuk adım 2.1 içinde açıklandığı gibi.</li>
		<li>10 mm Tris-HCl (pH 8) 20 µL ekleyerek boncuk DNA hedeften elute.</li>
	</ol></li> <li>Bağdaştırıcısıyla bakmaksızın zenginleştirme DNA parçalarının <ol><li>Ekle 20 µL bakmaksızın bağdaştırıcısı DNA parçaları, dizin astar/i7 5 µL (2.5 µL astar-P7 (10 pM) ve astar-P5 (10 pM), 2,5 µL sıralama amaçları için), 25µL, Kütüphane amplifikasyon ana mix ve GKD 2 O toplam hacmiyle 50 µL.</li>
		<li>PCR yükseltmek bakmaksızın bağdaştırıcısı DNA ve termal döngüsü aşağıdaki gibi: 45 için 98 ° C'de ilk denatürasyon ardından 8 döngüsü (cfDNA) veya 4 döngüleri (gDNA) tavlama 15 ° C, s, s, 65 ° C 30 s, 30 72 ° C s) ve son bir uzantısı 60 72 ° C'de s sonra sıcaklık 4'te holding ° C.</li>
		<li>Alınan parçaları almak için PCR zenginleştirilmiş DNA için askıya alınmış manyetik boncuklar eklemek 45 µL.</li>
		<li>Elute DNA parçaları 10 mm Tris-HCl (pH 8) 30 µL bağdaştırıcılarla.</li>
	</ol></li> <li>Kütüphane kalite kontrol <ol><li>üretici takip &#39; s protokolü için bağdaştırıcı ölçmek ticari teçhizat bakmaksızın DNA toplama. Bioanalyzer DNA kalitesini belirlemek için kullanın.</li>
	</ol></li></ol> 3. Hedef DNA yakalama Not: hedef zenginleştirme bilinen tümör ilişkili sürücü mutasyonlar 12 kapsayan bir 1021 kb hedef zenginleştirme bölge için bir özel sıra yakalama-sonda özel olarak tasarlanmış kullanarak gerçekleştirilen yapıldı. tümör farklı türleri. Üretici değişiklikler &#39; s protokolü aşağıdaki adımları ayrıntılı.
<ol><li>Kütüphaneler havuz engelleme <ol><li>eklemek 1.5 µg (havuzu cfDNA için kitaplıklarına en fazla sayısı 6, gDNA 20) adım 2, P5 Block(100P), P7 Block(100P) 8 µL ve karyolası-1 DNA'ın 5 µL 8 µL (1 µg/µL) steril bir tüp. 60 dakikaya ayarla vakum yoğunlaştırıcı kullanarak tüp içeriğini kuru ° C.</li>
	</ol></li> <li>DNA yakalama probları ile kütüphane Hybridize.
	<ol><li>3.1: 8.5 µL 2 X hibridizasyon arabellek, hibridizasyon artırıcı, ve 1.8 µL GKD nükleaz ücretsiz 2 O. 2.7 µL adım tüpünden için aşağıdaki bileşenleri ekleyin</li>
		<li>Mix tarafından yukarı ve aşağı pipetting ve bir thermomixer 10 dakika süreyle 95 ° C'de kuluçkaya</li>
		<li>Kuluçka hemen özel yoklama, 4 µL ekleyin. 65 ve #17, termal cycler örneklerinde kuluçkaya6; C kapak ile ısıtılan 75 ° c 4 h için</li>
	</ol></li> <li>DNA parçaları yakalama <ol><li>streptavidin boncuk boncuk ilişkisiz DNA çıkarmak için yıkama tarafından takip ile melezleşmiştir hedef DNA kuluçkaya. Üretici göre ticari setini kullanın &#39; resuspended boncuk yakalanan DNA ile son 20 µL almak için s yönergeleri parçaları.</li>
	</ol></li> <li>Yakalanan DNA amplifikasyon parçaları <ol><li>gerçekleştirmek ticari kullanarak PCR kiti 2 µM omurga oligonucleotides ile üretici göre &#39; s yönergeleri.</li>
		<li>Ne zaman PCR reaksiyon tamamlandığında, askıya alınan boncuk 45 µL PCR ürüne doğrudan ekleme ve boncuk için 10 mM Tris-HCl (pH 8) ile 30 µL elüsyon tarafından bağlı güçlendirilmiş hedef DNA parçalarının zenginleştirmek.</li>
	</ol></li> <li>Sayısal Kütüphane miktar kiti ile DNA parçalarının ve Bioanalyzer ( Şekil 2) ortalama parça boyla belirlemek.</li></ol>
 4. sıralama <ol><li>sıra multiplexed 18 h. toplam veri üretilen 60 gigabayt için 75 bp eşleştirilmiş uç ishal üstünde bir benchtop sequencer kullanarak kütüphaneleri, 15 G hasta örnek cfDNA ve 1 G için denetim örnek gDNA için gerekli.</li></ol>
 5. veri analizi iş akışı Not: şekil 3 genel iş akışı ve veri analiz süreci görüntüler. Veri analiz parametrelerini ve komutları aşağıda gösterilir.
<ol><li>Filtre düşük kaliteli okuma ve hataları ve NCfilter kullanarak UID maskeleme için doğru. 
	NCfilter(own) NCfilter filtre -l 5 - q 0,5 -n 0.1 -T 3 - G -1 fastq1-2 fastq2 realSeq(own) python bin/realRealSeq MaskUID -1 fq1-2 fq2 -o çıkış dir -p önek -u 4 -s 7 - m 3 -i uidFile-f.</li>
	<li>Referencing genom hg19 (insan genomu 19), BWA (sürüm 0.7.12-r1039) mem kullanarak sıralama sonuçları bulun ve genom analizi Toolkit (GATK) (sürüm 3.4-46-gbc02625) yeniden hizalayın. 
	BWA mem -t 3 hg19 fastq1 fastq2 java-d64-sunucu - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g - Xmx10g - Djava.io.tmpdir=/tmp/-kavanoz GenomeAnalysisTK.jar -T RealignerTargetCreator -R hg19 -L targetRegion-dbsnp bilinen &#8212; 
	allowPotentiallyMisencodedQuals -nt 10 - ı cancerBam-ı normalBam java-d64-sunucu - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g &#8212; Djava.io.tmpdir=/tmp/-kavanoz GenomeAnalysisTK.jar -T IndelRealigner -R hg19-dbsnp bilinen - allowPotentiallyMisencodedQuals &#8212; targetIntervals aralıkları-ı cancerBam-ı normalBam</li>
	<li>Küme UID ve üsleri PCR/sıralama tarafından tanıtıldı ve temel kalite değiştirmek hata düzeltmek üzere şablon parçaları konumunu göre çoğaltmaları. 
	realSeq(own) python realSeq/bin/realSeq - p -b unmarkdup_sort_merge.bam - r chipRegion -o output_dir küme -m 6 önek</li> <li>BWA mem. tarafından kümelenmiş çoğaltmaları yeniden Hizala 
	BWA mem -t 3 hg19 fastq1 fastq2</li> <li>temel kalite puanı GATK (sürüm 3.4-46-gbc02625) kullanarak ayarlamayı tarafından takip yerel bir yeniden düzenlenmesi gerçekleştirmek. 
	Loacal yeniden düzenlenmesi: java-d64-sunucu - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-kavanoz GenomeAnalysisTK.jar -T RealignerTargetCreator -R hg19 -L targetRegion-dbsnp - allowPotentiallyMisencodedQuals bilinen -nt 10 -CancerBam-ı normalBam java-d64-sunucu - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-kavanoz GenomeAnalysisTK.jar -T IndelRealigner -R hg19-dbsnp - allowPotentiallyMisencodedQuals - targetIntervals bilinen aralıkları-ı cancerBam-ı normalBam temel kalite puanı ayarlamayı: java-d64-sunucu - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/ - kavanoz GenomeAnalysisTK.jar -T BaseRecalibrator -R hg19 -L targetRegion - knownSites dbsnp - knownSites kozmik - allowPotentiallyMisencodedQuals - nct 10 - ben bam -o grp java-d64-sunucu - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-GenomeAnalysisTK.jar -T kavanoz PrintReads-ben bam - BQSR CTP -o outbam -R hg19 - nct 8 - allowPotentiallyMisencodedQuals</li> <li>(tek nükleotid varyant) SNV ve INDEL (küçük eklemelerin veya silmelerin) arama için düşük frekans mutasyonlar doğruluğunu daha da GSR (iyi destek okur) tarafından her ikisi ile doğrulanır ileriye ve geriye doğru strand çiftleri ve filtrasyon kontrol grubu (germline mutasyonlar) ve temel veritabanı aracılığıyla okuyun. 
	realDcaller(own) python realDcaller -f hg19 - r chipRegion - C baselineDB - O -L 2 cancerBam normalBam -p 30</li> <li>KNV (kopya numarası varyasyon) çağrıları yapmak için bir denetim olarak temel örnekleri kullanır. 
	NCcnv(own) python NCcnv -o cnvdir -t tmpdir - r chipRegion KNV--normgt normalBam tumgt--cancerBam--repdb repeatMarsk</li> <li>klipler ve SV (yapısal farklılıklar) aramak için uyumsuz çift okuma eşlenmemiş, Realigned. 
	NCsv(own) python NCsv -t tmpdir - r hg19 -o outputdir - x transkript -w bwapath -n 4 normalBam cancerBam</li></ol>

<ol><li>Kennedy, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+ultralow-frequency+mutations+by+Duplex+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detecting ultralow-frequency mutations by Duplex Sequencing.</a> Nat. Protoc. 9, 2586-2606 (2014).</li>
<li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Next-generation DNA sequencing.</a> Nat Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).</li>
<li>Bettegowda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+circulating+tumor+DNA+in+early-+and+late-stage+human+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies.</a> Sci. Transl. Med. 6, (2014).</li>
<li>Bratman, S. V., Newman, A. M., Alizadeh, A. A., Diehn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+clinical+utility+of+ultrasensitive+circulating+tumor+DNA+detection+with+CAPP-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Potential clinical utility of ultrasensitive circulating tumor DNA detection with CAPP-Seq.</a> Expert Rev. Mol. Diagn. 15, 715-719 (2015).</li>
<li>Diaz, L. A. Jr, Bardelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+biopsies%3A+genotyping+circulating+tumor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Liquid biopsies: genotyping circulating tumor DNA.</a> J. Clin. Oncol. 32, 579-586 (2014).</li>
<li>Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+biopsy%3A+monitoring+cancer-genetics+in+the+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood.</a> Nat. Rev. Clin. Oncol. 10, 472-484 (2013).</li>
<li>Su, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+platform+for+rapid+detection+of+multiple+oncogenic+mutations+with+relevance+to+targeted+therapy+in+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">A platform for rapid detection of multiple oncogenic mutations with relevance to targeted therapy in non-small-cell lung cancer.</a> J. Mol. Diagn. 13, 74-84 (2011).</li>
<li>Kukita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fidelity+target+sequencing+of+individual+molecules+identified+using+barcode+sequences%3A+de+novo+detection+and+absolute+quantitation+of+mutations+in+plasma+cell-free+DNA+from+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Res%22%5BJournal%5D)">High-fidelity target sequencing of individual molecules identified using barcode sequences: de novo detection and absolute quantitation of mutations in plasma cell-free DNA from cancer patients.</a> DNA Res. 22, 269-277 (2015).</li>
<li>Schmitt, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequencing+small+genomic+targets+with+high+efficiency+and+extreme+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sequencing small genomic targets with high efficiency and extreme accuracy.</a> Nat. Methods. 12, 423-425 (2015).</li>
<li>Schmitt, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+ultra-rare+mutations+by+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 14508-14513 (2012).</li>
<li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultrasensitive+method+for+quantitating+circulating+tumor+DNA+with+broad+patient+coverage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage.</a> Nat. Med. 20, 548-554 (2014).</li>
<li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+digital+error+suppression+for+improved+detection+of+circulating+tumor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA.</a> Nat Biotechnol. 34 (5), 547-555 (2016).</li>
<li>Alix-Panabières, C., Schwarzenbach, H., Pantel, K. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/profile/Catherine_Alix-Panabieres/publication/51770394_Circulating_Tumor_Cells_and_Circulating_Tumor_DNA/links/00b4953b6621e29429000000.pdf">Circulating tumor cells and circulating tumor DNA.</a> Annu. Rev. Med. 63, 199-215 (2012).</li>
<li>Dawson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+circulating+tumor+DNA+to+monitor+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer.</a> N. Engl. J. Med. 368, 1199-1209 (2013).</li>
<li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+short-read+alignment+with+Burrows-+Wheeler+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate short-read alignment with Burrows- Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).</li>
<li>Youn, A., Simon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+cancer+driver+genes+in+tumor+genome+sequencing+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Identifying cancer driver genes in tumor genome sequencing studies.</a> Bioinformatics. 27, 175-181 (2011).</li>
<li>Forshew, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+identification+and+monitoring+of+cancer+mutations+by+targeted+deep+sequencing+of+plasma+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA.</a> Sci. Transl. Med. 4, (2012).</li>
<li>Kobayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR+mutation+and+resistance+of+non-small-cell+lung+cancer+to+gefitinib%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">EGFR mutation and resistance of non-small-cell lung cancer to gefitinib.</a> N. Engl. J. Med. 352, 786-792 (2005).</li>
<li>Kuang, Y., Rogers, A., Yeap, Y., Wang, L., Makrigiorgos, M., Vetrand, K., Thiede, S., Distel, R. J., Jänne, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+detection+of+EGFR+T790M+in+gefitinib+or+erlotinib+resistant+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Noninvasive detection of EGFR T790M in gefitinib or erlotinib resistant non-small cell lung cancer.</a> Clin. Cancer Res. 15, 2630-2636 (2009).</li>
<li>Taniguchi, K., Uchida, J., Nishino, K., Kumagai, T., Okuyama, T., Okami, J., Higashiyama, M., Kodama, K., Imamura, F., Kato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+detection+of+EGFR+mutations+in+circulating+tumor+DNA+derived+from+lung+adenocarcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative detection of EGFR mutations in circulating tumor DNA derived from lung adenocarcinomas.</a> Clin. Cancer Res. 17, 7808-7815 (2011).</li>
<li>Leary, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+personalized+tumor+biomarkers+using+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Development of personalized tumor biomarkers using massively parallel sequencing.</a> Sci. Transl. Med. 2, (2010).</li>
<li>Forshew, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+identification+and+monitoring+of+cancer+mutations+by+targeted+deep+sequencing+of+plasma+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA.</a> Sci. Transl. Med. 4, (2012).</li>
<li>Bratman, S. V., Newman, A. M., Alizadeh, A. A., Diehn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+clinical+utility+of+ultrasensitive+circulating+tumor+DNA+detection+with+CAPP-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Potential clinical utility of ultrasensitive circulating tumor DNA detection with CAPP-Seq.</a> Expert Rev. Mol. Diagn. 15, 715-719 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

CtDNA analizleri hala değil rutin klinik uygulamada uygulamadır ancak tümör DNA (ctDNA) dolaşan varlığını daha 30 yıl önce keşfedilmiştir. İlgi ctDNA yöntemleri pratik uygulama geliştirme teknolojileri ctDNA algılama ve çözümleme ile artmıştır. Tümör ctDNA ile izleme mikroskopik rezidüel hastalığı, tedavisi ve tümör moleküler profilleri altında arka plan tümör gelişimi ve intratumoral heterojenlik13Yanıt değerlendirilmesi için minimal invaziv bir yaklaşım sunuyor, 14<...

Yeni nesil sıralama (NGS), soykırım, sırlarını araştırmak için güçlü bir araç genetik değişiklikler ortaya çıkarabilir bilgi büyük miktarda sağlayabilir. NGS analizde klinik uygulama özellikle kişiselleştirilmiş tıp daha yaygın hale gelmiştir. NGS, en büyük sınırlamaları ancak, yüksek hata oranı biridir. Eğitim devralınan mutasyonlar için uygun sayılır, özellikle DNA analiz "sıvı biyopsisi" elde edilen nadir mutasyon analizi büyük ölçüde sınırlı1,2, olsa da.
Tümör dolaşan DNA (ctDNA) boş hücre DNA (cfDNA) tümör hücreleri döken kan var. Çoğu durumda ctDNA onun algılama ve analiz zorlayıcı olun son derece düşük miktarıdır. Ancak, ctDNA çok çekici özelliklere sahiptir: onun yalıtım minimal invaziv, tümör büyüme erken dönemlerinde algılanabilir, ctDNA düzeyi terapötik etkinlik yansıtır ve ctDNA içeren birincil ve metastatik lezyonlar bulunan DNA mutasyonları 3 , 4 , 5. bu nedenle, hızlı bir gelişme NGS tekniği ve analiz göz önüne alındığında, başvuru ctDNA algılama daha cazip oldu.
Farklı kitlesel paralel sıralama yaklaşımlar ctDNA tespiti için kullanılan ama bu yaklaşımlardan hiçbiri kliniklerde sınırlamaları nedeniyle rutin kullanım için kabul edildi: düşük duyarlılık, çok yönlülük eksikliği ve nispeten yüksek maliyetli6 ,7,8. Örneğin, bir benzersiz tanımlayıcı etiketi (UID), temel çift yönlü sıralama Art arda sıralama hatalarının en takviyeli-fikir birliği uzmanlığından hataları düzeltir. Ancak, bu yöntemin fizibilite düşük veri kullanımı9,10ve yüksek maliyet nedeniyle kaybolur. Doğruluk ve evrensellik bu yöntemlerin geliştirilmesi gerekir rağmen benzer şekilde, CAPP Seq ve geliştirilmiş, yineleme, CAPP-IDE11,12, büyük pratiklik cfDNA algılama var.
Doğru ctDNA algılama ve çözümlemesi geçerli ihtiyacını karşılamak için yeni bir strateji, nadir mutasyon zenginleştirmek (ER-Seq) sıralama geliştirdi. Bu yaklaşım aşağıdaki birleştirir: Çift yönlü hata düzeltmesi ve dışarı-in tek bir mutasyon ayırt yeteneği ile ctDNA molekülleri verimli bir şekilde kurtarmak için benzersiz sıralaması bağdaştırıcısı &#62; 1 × 107 vahşi tipi nükleotit; kapak üzerinde hedef bölgeleri ölçümü zenginleştirmek 1021 kb probları %95 12 tümörler akciğer kanseri, kolorektal kanser, mide kanseri, meme kanseri, böbrek kanseri, pankreas kanseri, karaciğer kanseri, tiroid kanseri, dahil olmak üzere, gelen tümör ile ilgili mutasyonların Rahim ağzı kanseri, yemek borusu kanseri ve rahim Karsinomu (tablo 1); ve verimli ve nadir mutasyonlar ctDNA içinde tam olarak algılamak kolay hale temel veritabanı eleme.
Temel veritabanı oluşturmak için ER-Seq tarafından tüm gen mutasyonlarının örnekleri (~ 1000 başına) aynı türde bir dizi bulmak. Bu gerçek mutasyonlar diğer çeşitli güvenilir algılama yöntemleri ve analiz tarafından doğrulanması gerekir. Daha sonra yanlış mutasyonların desen özetlemek ve tüm yanlış mutasyonlar ilk temel veritabanı oluşturmak için küme. Yanlış mutasyonlar sonraki sıralama deneylerden buldum bu veritabanına eklemeye devam edin. Bu nedenle, bu temel veritabanı sıralama doğruluğu önemli ölçüde artıran bir Dinamik Genişletilmiş veritabanı olur.
Tümör tanısı ve takibi devam teşvik etmek, ER-Seq, evrensel veri edinimi için düşük maliyetli ve uygulanabilir bir yöntem mevcut. Biz ER-Seq analizi, uygulanan bir vaka nadir mutasyonlar ve fizibilite kullanmak için klinikte algılama doğruluğunu gösteren mevcut.

<table><tbody><tr><td>QIAamp Dolaşımdaki Nükleik Asit Kiti</td><td>Qiagen</td><td>55114</td><td>cfDNA için Periferik Kandan DNA Ekstraksiyonu</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Kan Mini Kiti</td><td>Qiagen</td><td>51105</td> gDNA Quant-iT dsDNA HS Test Kiti için <td>Periferik Kandan DNA Ekstraksiyonu</td></tr><tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td>cfDNA konsantrasyonunu ölçün</td></tr><tr><td>Quant-iT dsDNA BR Test Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>Q32853</td><td>Ölçümü kütüphane konsantrasyonu</td></tr><tr><td>Agilent DNA 1000 Reaktifleri</td><td>Agilent</td><td>5067-1504</td><td>cfDNA ve kütüphane parçalarını ölçün</td></tr><tr>Illumina <td>NEB</td><td>E7645L</td><td>Kütüphane Hazırlığı</td><td>için NEBNext UltraII DNA Kütüphanesi Hazırlık Kiti</td></tr><tr><td>Agencourt SPRIselect Reaktifi</td><td>Beckman</td><td>B23317</td><td>DNA fragmanı tarama ve saflaştırma</td></tr><tr><td>Tris-HCl (10 mM, pH 8.0)-100ML</td><td>Sigma</td><td>93283</td><td>dağılma</td></tr><tr><td>xGen Kilitleme Probları</td><td>IDT</td> <td>ve mdash; &mdash;</td><td>xGen Özel Probu</td></tr><tr><td>İnsan Cot-1 DNA</td><td>Life</td><td>15279-011</td><td>Hedeflenen DNA yakalama</td></tr><tr><td>Dynabeads M-270 Streptavidin</td><td>Life</td><td>65305</td><td>Hedefli DNA yakalama</td></tr><tr><td>xGen Kilitleme Reaktifleri</td><td>IDT</td><td>1072281</td><td>Hedefli DNA yakalama</td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td><td>KAPA</td><td>KK2602</td><td>yakalama sonrası PCR zenginleştirme kitaplıkları</td></tr><tr><td>KAPA Kütüphane Miktar Belirleme Kiti</td><td>KAPA</td><td>KK4602</td><td>Kitaplık konsantrasyonunu ölçün</td></tr><tr><td>SonrakiSeq 500 Yüksek Çıkış Kiti v2 ((150 döngü)</td> <td>illumina</td><td>FC-404-2002</td><td>Dizi</td></tr><tr><td>Santrifüjü5810</td><td>eppendorf</td><td>5810</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop8000</td><td>Thermo Scientific</td><td>8000</td><td>gDNA konsantrasyonunu ölçün</td></tr><tr><td>Qubit 2.0</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Quantify</td></tr><tr><td>Agilent 2100 Biyoanalizör</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>eppendorf</td><td></td><td>İnkübasyon</td></tr><tr><td>16 tüplü DynaMagTM-2 Mıknatıs Ömrü</td><td></td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Konsantratör artı</td><td>eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR</td><td>AB</td><td>simplyamp</td><td></td></tr><tr><td>QPCR</td><td>AB</td><td>7500Dx</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq 500</td><td>illumina</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

sonraki nesil sıralama kullanarak ctdna nadir mutasyonların tespiti

Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing

Tümör DNA (ctDNA) yeni nesil sıralama (NGS) kullanarak dolaşan analiz klinik Onkoloji gelişimi için değerli bir araç haline gelmiştir. Ancak, bu yöntem uygulama ctDNA kan eser miktarda analiz onun düşük duyarlılık nedeniyle zordur. Ayrıca, yöntem bu sıralama ve sonraki analiz yanlış pozitif ve negatif sonuçlar oluşturabilir. Fizibilite ve ctDNA algılama klinikte güvenilirliğini artırmak için burada sıralama, nadir mutasyon sıralama (ER-Seq) zenginleştirmek için nadir mutasyonlar zenginleştiren bir tekniği mevcut. ER-Seq son derece düşük frekanslı genetik değişiklikleri algılamak için umut verici bir araçtır ve böylece hastalık heterogenicity okumak çok yararlı olacak tek bir mutasyon 1 x 107 vahşi tipi nükleotit, dışarı ayırabilirsiniz. Benzersiz sıralaması bağdaştırıcısı'nın ligasyonu sayesinde bu yöntem aynı zaman hataları uzmanlığından (anlam ve Antisens) için düzeltme iken, ctDNA molekülleri, verimli bir kurtarma sağlar. 1021 kb sondalar bizim seçim kapak üzerinde hedef bölgeleri ölçümü zenginleştiren 12 tümör tümör ile ilgili sürücü mutasyonların % 95'i. Bu maliyet-etkin ve evrensel yöntem genetik veri benzersiz olarak başarılı bir birikimi sağlar. Verimli bir şekilde arka planda hata filtreleme sonra ER-seq nadir mutasyonlar tam olarak algılayabilir. Bir örnek çalışma kullanarak, sonda tasarım, Kütüphane yapı ve hedef DNA yakalama yöntemleri, veri analizi iş akışı da dahil olmak üzere süre gösteren ayrıntılı bir iletişim kuralı mevcut. Genellikle bu yöntem taşımak için işlem 1-2 gün sürer.

ER-Seq içinde kullanılan zenginleştirilmiş hedef bölgeleri tablo 1' de gösterilen 1021 kb probları hangi kapakları 12 ortak tümörler gen mutasyonlarının % 95'den fazla. Bu sondalar çeşitli kanser hastalarının çoğunluğu için geçerli bu işlem sağlar. Ayrıca, bizim benzersiz sıralaması bağdaştırıcısı ve temel veritabanı tarama nadir mutasyonlar kesin olarak tespit etmek mümkün kılar.
GDNA ve perif...

Bu el yazması mutasyonlar düşük frekans ctDNA, ER-Seq. algılamak için bir teknik anlatılmaktadır Bu yöntem iki yönlü hata düzeltmesi, özel arka plan filtre ve verimli moleküler acquirement eşsiz kullanımı tarafından ayrıştırılan.

Sonraki nesil sıralama kullanarak CtDNA nadir mutasyonların tespiti

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. ...

Bu tekniğin genel amacı, klinik doktorlara tümörleri teşhis etmek ve tedaviye yanıt olarak tümör dinamiklerini izlemek için güçlü bir araç sağlamak için dolaşımdaki tümör veya ctDNA'daki düşük frekanslı mutasyonları tespit etmektir. ctDNA'yı test etme yöntemi, bir hastanın tek nükleer tip varyasyon, ekleme silme, kopya sayısı varyasyonu ve yapısal varyasyon gibi ne tür mutasyonlar taşıdığına dair temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, ctDNA'daki düşük frekanslı mutasyonların hassas bir şekilde tespit edilmesini sağlayan yüksek hassasiyet ve özgüllüktür.Prosedürleri göstermek, laboratuvarımdan bir teknisyen olan Yuliang Yang olacak. Başlamak için, bir toplama tüpüne 10 mililitre periferik kan çekin ve içeriği karıştırmak için tüpü altı ila sekiz kez hafifçe yukarı ve aşağı çevirin. Kan örneklerini toplama tüplerinde altı ila 37 santigrat derecede 72 saate kadar saklayın.Toplama tüpünü oda sıcaklığında 1.600 kez g'da 10 dakika santrifüjleyin. Ardından, süpernatanı veya plazmayı tüpten peleti bozmadan dört temiz, iki mililitrelik, uygun şekilde etiketlenmiş santrifüj tüplerine aktarmak için bir atık pipeti kullanın. Hücrelerin bir mililitresini uygun ş

detection-of-rare-mutations-in-ctdna-using-next-generation-sequencing

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Biz Barkodlanan DNA kütüphaneleri ve büyük ölçüde paralel "yeni nesil" dizisi ile klinik tümör numunelerinde önemli kanserle ilişkili mutasyonların saptanması için olan hibridizasyon-bazlı sonraki ekson yakalama hazırlanmasını tarif etmektedir. Hedefli ekson dizileme nedenle düşük frekanslı mutasyonları tespit etmek için yüksek duyarlılık verimli, yüksek verimlilik, düşük maliyet ve derin dizisi kapsama avantajlar sunmaktadır.

Ekson yakalama ve Devasa Paralel Dizilimine tarafından Tümör Örneklerinin somatik genetik değişiklikler tespit

Bu el yazması, iki yeni nesil dizileme paneli için klinik protokolleri açıklamaktadır. Bir panel hematolojik maligniteleri sorgularken, diğer panel solid tümörlerde sıklıkla mutasyona uğrayan genleri hedef alır. İnsan malignitelerindeki sürücü mutasyonlarının moleküler sınıflandırması, değerli prognostik ve öngörücü bilgiler sunar.

Katı ve Sıvı Tümörlerinde harekete geçirici Mutasyonlar Tespiti için Yeni Nesil Dizi

Onkoloji örneklerinin hedeflenen yeni nesil dizilimi için entegre bir sistem tanımlanmıştır. Bu çapraz platform sistemi, düşük kaliteli ve düşük miktarlı tümör biyopsileri için optimize edilmiştir, düşük DNA girdilerini barındırır, iyi karakterize edilmiş çok varyantlı kontroller içerir ve kantitatif pre-analitik kalite kontrol önlemleriyle bilgilendirilen yeni bir varyant arayan içerir.

Düşük kaliteli ve düşük miktar Tümör Biyopsilerinde ve Islak ve kuru Bench Süreçleri Entegrasyonu Hedefli optimize eder nesil Sıralama

Vahşi tip blokaj PCR ve ardından doğrudan dizileme, çeşitli numune türlerinde düşük frekanslı somatik mutasyonlar için oldukça hassas bir tespit yöntemi sunar.

Yabani tip PCR Düşük Frekanslı Somatik Mutasyonlar Tespiti için oldukça hassas bir yöntem olarak doğrudan bölme imkanı Kombine Engelleme

El yazması bir nadir CDH1 transkript değişken (CDH1a) taze donmuş normal ve mide kanseri olan hastalarda elde edilen tümör doku algılamak için bir çip tabanlı dijital PCR tahlil açıklar.

Bir CDH1 nadir transkript değişken mide kanseri taze donmuş dokularda çip tabanlı dijital PCR tarafından algılanması

Yeni nesil sıralama (NGS) platformu (~0.5–2.0%) yüksek hata oranı tarafından sınırlı genomik karakterizasyonu için güçlü bir araçtır. NGS hata oranı önlemek ve mutasyonlar varyant alleli kesirler 0,0001 nadir, tespit etmemize izin bizim hata düzeltilmiş sıralama yöntemleri açıklanmaktadır.

Nadiren de olsa algılama hatası düzeltildi DNA ve RNA sıralama

Burada, doğru bir şekilde birden fazla genetik değişiklikler hedef bölge teslim ddPCR ve hidroliz probları benzersiz bir çift kullanarak tek bir tepki olarak ölçmek için bir protokol mevcut.

Tek damlacık dijital polimeraz zincir tepkimesi mutasyonlar Hotspot bölgelerde kapsamlı ve eşzamanlı algılanması için

Burada, hastanın biyolojik sıvılarında (biyoluidler) bulunan DNA 'Yı dolaşarak tümör somatik mutasyonları tespit etmek için bir protokol sunuyoruz. Damlacık dijital polimeraz zincir reaksiyonu (dPCR) tabanlı yöntem, tümör mutasyonu allelik frekansının (MAF) ölçülmesini sağlar ve tümör yanıtının tanı ve temporal izlenmesi için minimal invaziv bir tamamlayıcı kolaylaştırır.

Hasta Biofluidinde tümör Ilişkili sirkülasyon DNA 'Sı tespiti ve Izlenmesi

Burada sunulan sgRNA / CAS9 endonükleaz ve CD4 promotörünün yakınındaki çift iplikçik kopması onarımı ile ilişkili mutasyonları tanımlamak için kullanılabilecek yeni nesil dizileme protokolüdür.

CD4 promotörünün yakınında CAS9 kaynaklı çift iplikçik kopmasının onarımıyla ilişkili mutasyonları tanımlamak için yeni nesil dizilemenin kullanılması

Bu protokol, küçük hücreli dışı akciğer kanseri (KHDAK) formalinle sabitlenmiş parafine gömülü dokularda hedeflenebilir genomik değişiklikleri tespit etmek için otomatik, ISO15189 onaylı yeni nesil dizileme iş akışını açıklar.

Küçük Hücreli Dışı Akciğer Kanserinde Hedeflenebilir Değişikliklerin Yeni Nesil Dizileme Kullanılarak Saptanması

Keşfedin, ctDNA'daki düşük frekanslı mutasyonları ER-Seq yöntemiyle yüksek hassasiyet ve özgüllükle tespit etme tekniğini. Bu yöntem, klinik karar verme ve tedavi yanıtı izleme için değerli bir araç sunar.

Sonraki nesil sıralama kullanarak CtDNA nadir mutasyonların tespiti

Daha fazla video keşfet