Sonraki nesil sıralama kullanarak CtDNA nadir mutasyonların tespiti

Bu tekniğin genel amacı, klinik doktorlara tümörleri teşhis etmek ve tedaviye yanıt olarak tümör dinamiklerini izlemek için güçlü bir araç sağlamak için dolaşımdaki tümör veya ctDNA'daki düşük frekanslı mutasyonları tespit etmektir. ctDNA'yı test etme yöntemi, bir hastanın tek nükleer tip varyasyon, ekleme silme, kopya sayısı varyasyonu ve yapısal varyasyon gibi ne tür mutasyonlar taşıdığına dair temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, ctDNA'daki düşük frekanslı mutasyonların hassas bir şekilde tespit edilmesini sağlayan yüksek hassasiyet ve özgüllüktür.

Prosedürleri göstermek, laboratuvarımdan bir teknisyen olan Yuliang Yang olacak. Başlamak için, bir toplama tüpüne 10 mililitre periferik kan çekin ve içeriği karıştırmak için tüpü altı ila sekiz kez hafifçe yukarı ve aşağı çevirin. Kan örneklerini toplama tüplerinde altı ila 37 santigrat derecede 72 saate kadar saklayın.

Toplama tüpünü oda sıcaklığında 1.600 kez g'da 10 dakika santrifüjleyin. Ardından, süpernatanı veya plazmayı tüpten peleti bozmadan dört temiz, iki mililitrelik, uygun şekilde etiketlenmiş santrifüj tüplerine aktarmak için bir atık pipeti kullanın. Hücrelerin bir mililitresini uygun şekilde etiketlenmiş iki mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarmak için temiz bir atık pipeti kullanın.

Hücreleri genomik veya gDNA izolasyonundan önce eksi 20 santigrat derece veya daha soğukta saklayın. Daha sonra, plazmayı 10 dakika boyunca dört santigrat derecede 1.600 kez g'de santrifüjleyin. Daha sonra plazmayı, kontaminasyonu önlemek için altta yaklaşık 0,1 mililitre artık hacim bırakarak plazma olarak uygun şekilde etiketlenmiş temiz santrifüj tüplerine aktarın.

Ayırma işlemi sırasında buffy coat plazmadan kaçınılmalıdır. Aksi takdirde, hücrelerden ekstrakte edilen büyük DNA parçaları ctDNA'yı seyreltebilir ve testin duyarlılığını etkileyebilir. Ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanarak, üreticinin talimatlarını izleyerek toplanan plazmanın üç mililitresinden cfDNA'yı izole edin.

Daha sonra bir kit ile, üreticinin talimatlarını izleyerek 200 mikrolitre beyaz kan hücresinden gDNA'yı izole edin. GDNA kontrol örneğini sonikasyonla parçalamak için, temiz bir sonikasyon tüpünde 100 mikrolitre Tris-EDTA tamponunda bir mikrogram gDNA örneği hazırlayın. Sonikasyon programını toplam 12 dakika boyunca 12 döngü için 30 saniye açık ve 30 saniye kapalı olarak ayarlayın.

Ürünün 200 ila 250 baz çifti parçası içerdiğini onayladıktan sonra, tüm parçalanma ürünlerini 150 mikrolitre manyetik boncuk içeren yeni bir 1,5 mililitrelik tüpe aktarın ve doğru parçaları seçmek için numuneyi beş dakika inkübe edin. Ardından, tüpü 30 saniye boyunca manyetik bir rafa yerleştirin ve süpernatanı çıkarın. Daha sonra tüpü rafta tutarken, boncukları yıkamak için 200 mikrolitre taze hazırlanmış% 80 etanol ekleyin.

Süpernatanı çıkarmadan önce boncukları 30 saniye inkübe edin ve yıkamayı tekrarlayın. Boncukları havayla kurutmak için tüpü kapağı açık olarak rafta tutun. Daha sonra boncuklara 32 mikrolitre 10 milimolar Tris-HCL ekleyerek DNA parçalarını elüte edin.

Üreticinin talimatlarını izleyerek son hazırlık reaksiyonunu gerçekleştirmek için steril nükleaz içermeyen bir tüpe yedi mikrolitre reaksiyon tamponu, üç mikrolitre enzim karışımı, 30 nanogram cfDNA ve toplam 60 mikrolitre hacim için iki kez damıtılmış su ekleyin. Ayrı bir tüpte, aynı bileşenleri cfDNA yerine bir mikrogram gDNA ile ekleyin. Karışımı bir termal döngüleyicide 20 santigrat derecede 30 dakika, ardından kapak ısıtılmadan 30 dakika 65 santigrat derecede inkübe edin.

İnkübasyonun hemen ardından, tüpe 30 mikrolitre ligasyon ana karışımı, bir mikrolitre ligasyon arttırıcı ve dört mikrolitre benzersiz sıralama adaptörü ekleyin. Reaksiyonu, kapak ısıtılmadan 15 dakika boyunca 20 santigrat derecede termal döngüleyicide inkübe edin. Manyetik boncukları yeniden askıya almak için girdap yapın ve boncukları en az 30 dakika oda sıcaklığında bırakın.

Daha sonra ligasyon reaksiyonuna 87 mikrolitre yeniden askıya alınmış manyetik boncuk ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın ve ardından numuneyi oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Boncukları yıkadıktan ve havayla kuruttuktan sonra, 20 mikrolitre 10 milimolar Tris-HCL ekleyerek DNA hedefini boncuklardan ayırın.

20 mikrolitre adaptör bağlı DNA fragmanı, beş mikrolitre indeks primer i7, 25 mikrolitre kütüphane amplifikasyon ana karışımı ve toplam 50 mikrolitre hacme kadar iki kat damıtılmış su ekleyin. PCR, bağlı cfDNA veya gDNA'yı adaptörle çoğaltır. Daha sonra PCR ile zenginleştirilmiş DNA'ya 45 mikrolitre asılı manyetik boncuk ekleyin.

Numuneyi yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın ve beş dakika inkübe edin. Süpernatanı çıkardıktan ve boncukları yıkadıktan sonra, DNA parçalarını adaptörlerle ayırmak için 30 mikrolitre 10 milimolar Tris-HCL kullanın. Hedeflenen DNA yakalamayı gerçekleştirmek için, steril bir tüpte, 1.5 mikrogram havuzlama kütüphanesi, P5 blok 100P ve P7 blok 100P'nin her biri sekiz mikrolitre ve mikrolitre başına bir mikrogram beş mikrolitre ekleyerek numuneyi bloke edin.

Tüpün içeriğini 60 santigrat dereceye ayarlanmış bir vakum yoğunlaştırıcı kullanarak kurutun. 8.5 mikrolitre 2X hibridizasyon tamponu, 2.7 mikrolitre hibridizasyon arttırıcı ve 1.8 mikrolitre nükleaz içermeyen çift damıtılmış su ekleyerek DNA yakalama problarını kütüphane ile hibritleştirin. Yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın ve termal karıştırıcıda 95 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin.

Ardından hemen dört mikrolitre özel prob ekleyin. Numuneleri 65 santigrat derecede bir termal karıştırıcıda inkübe edin, kapak dört saat boyunca 75 santigrat dereceye kadar ısıtılır. Hibritleştirilmiş hedef DNA'yı streptavidin boncukları ile inkübe edin, ardından bağlanmamış DNA'yı çıkarmak için boncukları yıkayın.

Yakalanan DNA parçalarına sahip son 20 mikrolitre yeniden askıya alınmış boncuk elde etmek için ticari kiti üreticinin talimatlarına göre kullanın. Streptavidin boncuklarından bağlanmamış DNA'nın yıkama aşaması hızlı olmalıdır. Aksi takdirde, hedeflenen DNA'nın yakalama verimliliği etkilenebilir.

Yakalanan DNA parçalarını, üreticinin talimatlarına göre iki mikromolar omurga oligonükleotidi içeren ticari bir kit kullanarak PCR gerçekleştirerek amplifiye edin. Son olarak, 45 mikrolitre askıda boncukları doğrudan PCR ürününe ekleyin ve boncuklara elüsyon yoluyla bağlanan amplifiye edilmiş hedef DNA fragmanlarını 30 mikrolitre 10 milimolar Tris-HCL ile zenginleştirin. Parçaları nicelleştirin ve metin protokolüne göre sıralama ve veri analizi yapın.

Bu tablo, ER-seq'in geleneksel yönteme kıyasla kapsama derinliğini nasıl %23 oranında iyileştirdiğini özetlemektedir. Bunun nedeni, cfDNA moleküllerinin verimli bir şekilde geri kazanılması ve böylece nadir mutasyonların analizini büyük ölçüde geliştirmesidir. ER-seq'te kullanılan benzersiz dizileme adaptörlerinin, doğal ve PCR kaynaklı duplikasyonların kolayca ayırt edilmesini sağladığı da açıktır.

Arama sonuçlarıyla ilgili bu tabloda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, ER-seq'e dayalı analiz, EGFR pL858R tespiti için %100 tutarlıydı ve algılama sıklığı, geleneksel bir analizle karşılaştırıldığında biraz daha yüksekti. Daha da önemlisi, ER-seq analizi, yüksek arka plan gürültüsü nedeniyle geleneksel analiz tarafından tanınmayan EGFR pT790M dahil olmak üzere diğer nispeten düşük frekanslı mutasyonların tespit edilmesini sağladı. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa 48 saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, hibridizasyondan sonra ekstraksiyon, kütüphane hazırlığı ve boncuk yıkama sırasında çok düşük miktarda cfDNA kaybını önlemeyi unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, hastadan alınan ctDNA'nın dizileme için tanımlanan benzersiz verilere dayalı olarak nasıl toplandığını, hazırlandığını ve hedeflendiğini iyi anlamış olmalısınız. Bu teknik, geliştirildikten sonra likit biyopsi alanındaki araştırmacıların klinik karar vermede daha iyi uygulamaları keşfetmelerinin önünü açmıştır.