Gerçek zamanlı depremin dönüşüm tahlil CWD Prionlar fekal madde olarak algılanması için kaynaklı

Gerçek zamanlı sarsıntı kaynaklı dönüşüm testi için bu protokolün genel amacı, servid dışkı örneklerinde kronik israf hastalığı prionlarının hassas tespitine izin vermektir. Bu yöntem, dışkıda cervid CWD prionlarının ne zaman enfekte olduğu gibi CWD araştırma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, spesifik, hassas olması ve yüksek numune verimi sağlamasıdır.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir laboratuvar teknisyeni olan Ginny Cheng olacak. Bu işleme başlamak için, 10 mililitre dışkı özü tamponu içeren bir tüpe bir gram dışkı materyali ekleyin. Proteinler için önceden ayarlanmış bir programa sahip bir ayrıştırıcı kullanarak, dışkı peletlerini oda sıcaklığında bir dakika boyunca homojenize edin.

Dışkı örnekleri tamamen homojen hale gelene kadar bunu iki ila üç kez tekrarlayın. Daha sonra tüpleri kapatmak için parafilm kullanın ve oda sıcaklığında bir saatlik inkübasyon için sallanan bir platform veya döner çalkalayıcı üzerine yerleştirin. Bundan sonra, oda sıcaklığında beş dakika boyunca 18.000 g'da santrifüjleyin.

Süpernatanları toplayın ve 1.5 mililitrelik tüplere ayırın. Kullanıma hazır olana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Sodyum fosfotungstik asit çökeltme yöntemine başlamak için, bir mililitre dışkı protein ekstraktına 250 mikrolitre sarkosil ekleyin.

Parafilm kullanarak tüpü kapatın. Tüpü bir termal karıştırıcıya yerleştirin ve 1.400 rpm'de sürekli çalkalayarak 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Bundan sonra, %10 sodyum fosfotungstik asit ve 170 milimolar magnezyum klorür içeren bir stok çözeltisi ekleyin, böylece numunelerdeki nihai sodyum fosfotungstik asit konsantrasyonu %3 olur, numuneleri termal karıştırıcıya aktarın ve 400 rpm'de sürekli çalkalama ile iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Daha sonra, 14 santigrat derecede 30 dakika boyunca 15.800 g'da santrifüjleyin. Süpernatanları dikkatlice çıkarın ve peletleri yıkama tamponunda yeniden süspanse ederek yıkayın. Daha sonra 14 santigrat derecede 15 dakika boyunca 15.800 g'da santrifüjleyin.

Süpernatanları dikkatlice çıkarın ve peletleri 100 mikrolitre RT-QuIC seyreltme tamponunda yeniden süspanse edin. İşlem görmüş numuneleri RT-QuIC testini gerçekleştirmeye hazır olana kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın. Başlamak için, taze bir 10 milimolar Thioflavin T stok çözeltisi hazırlamak için 10 mililitre çift damıtılmış suya 0.032 gram Thioflavin T ekleyin.

Daha sonra, bir milimolar Thioflavin T'nin nihai konsantrasyonu ile sonuçlanan stok çözeltisinin bir ila 10 seyreltmesini yapmak için çift damıtılmış su kullanın, 0.2 mikrometre Acro disk filtresi ile donatılmış bir şırınga kullanarak, bir milimolar Thioflavin T çözeltisini filtreleyin. Daha sonra en rekombinant prion protein substratını çözün. Bir seferde 500 mikrolitre rekombinant prion protein substratını 100 kilo Dalton boyutunda dışlama filtresi mikrotüplerine yükleyin.

Oda sıcaklığında beş dakika boyunca 14.000 g'da santrifüjleyin. Bundan sonra, ayrıştırılmış substratı steril 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Kullanıma hazır olana kadar dört santigrat derecede saklayın.

Ardından, depolanan RT-QuIC seyreltme tamponunu çözün. Tohumu seyreltin ve metin protokolünde belirtildiği gibi stok çözeltilerini ve RT-QuIC reaksiyon karışımını hazırlayın. Filtre uçlu bir pipet kullanarak, reaksiyon karışımını yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.

Karışımı 50 mililitrelik tek kullanımlık pipetleme haznesine dökün. Çok kanallı bir pipet kullanarak, 96 oyuklu optik alt plakanın her bir oyuğuna 98 mikrolitre RT-QuIC reaksiyon karışımı yükleyin. Her reaksiyona, seyreltilmemiş veya 10 kat seri olarak seyreltilmiş dışkı proteini ekstraktından iki mikrolitre ekleyin.

Ardından plakayı kapatmak için sızdırmazlık bandı kullanın. 42 santigrat derecede bir plaka okuyucuda 25 saat boyunca inkübe edin, 700 rpm'de bir dakikalık çift orbital sallama ve inkübasyon boyunca bir dakika dinlenme döngüleri tekrarlandı. Bu arada, floresan ölçüm ayarlarını metin protokolünde belirtildiği gibi tanımlayın.

25 saat sonra plakayı plaka okuyucudan çıkarın. Kuyucuklar arasında olası kontaminasyonu önlemek için plakayı üç dakika boyunca 3.000 g'da döndürün. Ardından, contayı plakadan çıkarın.

Taze substrat ve taze Thioflavin T floresan boyası içeren 90 mikrolitre RT-QuIC reaksiyon karışımı ekleyerek yeni bir plaka hazırlayın. İlk plakanın her bir oyuğundan 10 mikrolitreyi yeni hazırlanan 96 oyuklu plakaya aktarın. Yeni plakayı kapatmak için sızdırmazlık bandı kullanın.

Floresan ölçüm ayarlarını tanımladıktan sonra, teste 50 saat daha devam edin. Her 15 dakikada bir her kuyucuk için Thioflavin T floresan sinyalini okuyun ve belgeleyin. Ardından verileri metin protokolünde belirtildiği gibi toplayın ve çizin.

Bu çalışmada, enfekte olmamış geyik veya katır geyiğinden elde edilen dışkı materyali, %10'luk bir nihai numune konsantrasyonu elde etmek için dışkı özü tamponunda homojenize edilir. Bazı homojenatlar daha sonra işlenir ve sodyum fosfotungstik asit çökeltme ile 10 kez konsantre edilir. Saflaştırılmış örneklerde spontan dönüşümlerde bir azalma görülürken, tüm örneklerde CWD pozitif dışkı örneklerinde düşük floresan sinyalleri görüldü. Prionların amplifikasyonunu iyileştirmek ve algılama hassasiyetini artırmak için bir substrat değiştirme adımı dahil edilmiştir.

RT-QuIC protokolünün bir parçası olarak substrat replasmanı yapılan numuneler, 18 numuneden 14'ünün pozitif olması ve negatif kontrollerin hiçbirinin yanlış pozitif olarak kaydedilmemesi ile tespitin hassasiyetinde ve özgüllüğünde bir artış göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, dışkı ekstraktı hazırlığı ve PRP / SCRP konsantrasyonu yaklaşık dört saat içinde yapılabilir ve RT-QuIC testi, uygun şekilde gerçekleştirilirse yaklaşık 1 / 1-2 saat içinde ayarlanabilir. Prosedürü denerken, alt tabakayı filtrelemeyi unutmamak önemlidir, ancak asla girdap yapmamak önemlidir.

Prosedürü takiben, ortaya çıkan ürünlerin ne kadar dirençli proteazlar olduğu gibi ek soruları yanıtlamak için western blotlama gibi diğer yöntemler kullanılabilir. Geliştirilmesinden sonra bu teknik, prion araştırmaları alanındaki bilim adamlarının dışkı örneklerini test ederek canlı hayvanlarda prionların varlığını keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, dışkı ekstraktlarından PRP/SCRP'nin nasıl hazırlanacağını ve konsantre edileceğini ve hassas ve spesifik prion tespiti elde etmek için modifiye edilmiş bir RT-QuIC testinin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.

Prionlarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve prosedürü gerçekleştirirken uygun KKD'lerin giyilmesinin ve bir biyogüvenlik kabini altında çalışmanın önemli olduğunu unutmayın.