Name: Gerçek zamanlı depremin dönüşüm tahlil CWD Prionlar fekal madde olarak algılanması için kaynaklı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Öğrenin, RT-QuIC yöntemiyle geyik dışkı örneklerinde kronik israf hastalığı priyonlarını hassas şekilde nasıl tespit edeceğinizi. Bu protokol, yüksek verimli analiz ve spesifik sonuçlar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Eğitim ve cervid PrP bakteriyel ifade plazmid sağlamak için Dr Byron Caughey (NIH kayalık dağ laboratuvarları) için minnettarız. SG Kanada araştırma sandalye program tarafından desteklenir. Genom Kanada, Alberta Prion Araştırma Enstitüsü ve Alberta tarım ve Ormancılık genom Alberta ve University of Calgary Bu eser destek için SG bu araştırma için fon kabul. Bir araştırma hibe hayvan araştırma için Margaret Gunn temelden anıyoruz.

1. kullanarak RT zlı fekal madde <ol><li><ol><li>yapmak cervid dışkı hazırlanması ayıklar fekal homogenate 10 mL olarak dışkı fekal madde 1 g ekleyerek ayıklamak arabellek (20 mM sodyum fosfat, pH 7.1, 130 mM NaCl, % 0.05 ara 20, 1 mM PMSF ve 1 x tamamlamak proteaz inhibitörleri, EDTA içermeyen) bir son konsantrasyonu % 10 (w/v) vermek. Homojenizasyon tampon kullanımı öncesinde hazırlanan ve depolanan -20 ° c</li>
		<li>Homogenize dışkı granül (1 g) ve proteinler için oda sıcaklığında 1 dk. için üretici önceden belirlenmiş bir program ile bir dissociator kullanarak arabellek (10 mL) tüpler (örneğin, gentleMACS M tüpler). 2-3 kez dışkı örnekleri tamamen arabellekte homojenize kadar bu adımı yineleyin.</li>
		<li>Parafilm tüplerini mühür ve oda sıcaklığında 1 h kuluçka için sallanan bir platform veya rotary shaker üzerine koyun.</li>
		<li>Oda sıcaklığında 5 min için 18.000 x g de tüpler santrifüj kapasitesi.</li>
		Protein içeren supernatants <li>toplamak ayıklar ve aliquot onları içine 1,5 mL tüpler. Aliquots daha fazla uygulamalar için-80 ° C'de depolanan.</li>
	</ol></li> <li>Konsantrasyon PrP Sc dışkı ayıklar Not: böylece tarafından RT zlı, algılama hassasiyeti artırma dışkı ayıklayın örneklerinde CWD Prionlar konsantre için protein yağış adım eklenir iletişim kuralı için.
	<ol><li>NaPTA yağış yöntemi</li> <li>eklemek 250 µL % 10 (w/v) dışkı protein 1 ml N-loril sarcosinate (sarkosyl) hulâsa sarkosyl % 2 (v/v) son bir konsantrasyon vermek.</li>
		<li>Parafilm ile örnekleri içeren ve bir thermomixer 1400 rpm sabit sallayarak altında 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya tüpler mühür.</li>
		<li>Dışkı protein özü ve sarkosyl karışımı ile sodyum phosphotungstic asit ve magnezyum klorür, pH %7,4 0,3 (w/v) sodyum phosphotungstic asit örneklerde son bir konsantrasyon elde etmek için 170 mM (w/v) % 10 içeren bir hisse senedi çözüm ayarlamak.</li>
		<li>Örnekleri için 2 h 37 ° C'de sabit 400 devir / dakikada sallayarak ile kuluçkaya.</li>
		<li>İçin 15,800 x g., 30 dk çıkarmak supernatants dikkatle örnekleri 14 ° C'de santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Granül yıkama yıkama arabellekte resuspending tarafından (10 mM Tris-Cl, pH 7.5, 100 mM NaCl, % 0.5 Triton-X 100, 10 mM EDTA, % 0.5 sodyum deoxycholate (w/v) ve % 0,1 sarkosyl (w/v)).</li>
		<li>İçin 15,800 x g., 15 dk çıkarmak supernatants dikkatle örnekleri 14 ° C'de santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Resuspend granül 100 µL (1/10 orijinal hacminin dışkı protein özü) RT zlı seyreltme arabelleği. 
		Not: RT zlı seyreltme arabellek (20 mM sodyum fosfat, pH 6,9, 130 mM NaCl, % 0,1 SDS (w/v) ve 1 X N2 ek) kullanımı önce hazırlanır. 10 mL toplam hacmi bir Ģırınga kullanarak 0.2 µm acrodisc şırınga filtreden filtre ve kadar kullanmak-20 ° C'de depolanan.</li>
		<li>RT zlı tahlil kullanan kadar tedavi NaPTA örnekleri-20 ° C'de depolayın.</li>
	</ol></li> <li>RT zlı tahlil <ol><li>taze 10 mM Th-T stok çözüm (0,032 g Th-t Çift Kişilik distile H 2 O 10 mL) hazırlayın.</li>
		<li>1:10 Th-t çift hisse senedi çözümde distile Th-T 1 mm son bir konsantrasyon 0.2 µm acrodisc şırınga aracılığıyla filtre kullanarak filtre yapmak için H 2 O bir seyreltme olun.</li>
		<li>Buz üzerinde-80 ° C'de depolanan fare rekombinant PrP (rPrP, aa 23-231) substrat (10 µg/mL RT zlı tepki başına) çözme</li>
		<li>RPrP substrat 100 kDa boyutu dışlama filtresi mikrotüpler içine bir anda ve 14.000 x g, santrifüj (bir tüp/filtre ilâ iki kere kullanılabilir) oda sıcaklığında 5 min için yük 500 µL.</li>
		<li>Eluted substrat steril 1,5 mL tüp içine aktarmak ve 4 ° C'de kullanımda kadar devam.</li>
		<li>-20 depolanan çözülme RT-zlı seyreltme arabellek ° C.</li>
		<li>Yapmak dilutions RT zlı içinde tohum (fekal protein özü) seyreltme arabellek: 
		Su katılmamış örnek: su katılmamış dışkı protein özü kullanın 2 x 10 -1 seyreltilmiş 2 x 10 -2 seyreltilmiş 2 x 10 -3 seyreltilmiş</li> <li>hisse senedi çözümleri için RT zlı tepki karışım hazırlamak: fosfat tamponlu tuz () PBS): 5 X NaCl: 2 M Çift Kişilik distile H 2 ' O. hazırlanan NaCl çözeltisi stok 
		EDTA: 100 mM EDTA içinde çift hazırlanan stok çözeltisi distile H 2 O.</li>
		<li>Tüm çözümleri (Adım 1.3.8) kullanımı önce her çözüm ayrı ayrı bir Ģırınga kullanarak 0.2 µm acrodisc şırınga filtreden filtre ve oda sıcaklığında steril tutmak.</li>
		<li>RT zlı tepki karışımı (örnek başına bir tepki 98 µL hacmi ve dört örnek çoğaltır) örnek sayısına göre toplam hacmi yeterli karışım bütün tepkiler var emin olmak için bu birim yüzde 10'u kullanılacak hazır olun.
		RT zlı tepki karışım hazırlamak için <ol><li>kullanımı 15 mL tüp (20 mM sodyum fosfat, pH 6,9, 300 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 µM Th-T, 10 µg/mL rPrP substrat ve Çift Kişilik distile su rPrP son konsantrasyonu tepki olarak ayarlamak için) hisse senedi sol kullanarak utions.</li>
			<li>De bir pipet ile filtre ucu kullanarak yukarı ve aşağı pipetting tarafından tüm çözümler karıştırın. Mümkün olduğu kadar girdap kaçının.</li>
			<li>50 mL tek kullanımlık pipetting rezervuar karışımı dökmek.</li>
			<li>98 µL RT zlı tepki karışımı bir 96-şey optik alt plaka her kuyunun içine yüklemek için bir çok kanallı pipet kullanın.</li>
		</ol></li> <li>Her RT zlı tepki 2 µL, su katılmamış veya 10 kat seri olarak seyreltilmiş dışkı protein özü ekleme. Her örnek içinde dört çoğaltır sınama. 
		Not: her deneyde CWD-negatif ve doğrulanmış CWD-pozitif hayvanların dışkı örnekleri (--dan su katılmamış için 2 x 10 -3 arasında değişen) seri dilutions negatif ve pozitif denetim, sırasıyla kullanılır.</li>
		<li>Bir plaka okuyucu için yinelenen döngüleri 1 min Çift Kişilik yörünge (700 rpm) sallayarak ve 1 dk. kuluçka dinlenme ile 25 h 42 ° C'de kuluçka önce sızdırmazlık bandı ile plaka mühür.</li>
		<li>Tanımla Floresans ölçüm ayarlarını: 
		Uyarma: 450 nm emisyon: 480 nm okumak, alt sayısını basması: 20 el ile kazanç: 1000 (makineye bağlıdır) entegrasyon zaman: 20 µs</li> <li>plaka okuyucu 25 h. sonundaki plaka kaldırmak</li>
		<li>Plaka 3000 x g kuyular arasında potansiyel kirlenmesini önlemek için 3 dakika için de aşağı spin.</li>
		<li>Mühür plaka kaldırmak.</li>
		<li>RT zlı tepki karışımı taze substrat ve taze Floresans içeren 90 µL boya Th-T 1.3.1-1.3.6 bölümünde açıklandığı gibi ekleyerek yeni bir 96-şey tabak hazırlamak.</li>
		<li>De ilk plaka her kuyudan transfer 10 µL yeni hazırlanan 96 plakalı.</li>
		<li>Yeni plaka mühür ve RT zlı tahlil için ek 50 h 1.3.13 adımda anlatılan adımları izleyerek devam edin. Bu ek adım 50 h / toplam reaksiyon süresi 75 h yapacak 
		Not: RT zlı testin tüm prosedürleri altında Biyogüvenlik kabini yapılır.</li>
		<li>Veri toplayabilir.
		<ol><li>Okuma ve belge her şey her 15 dk. Th-T Floresans sinyalinin</li>
			<li>Toplamak veri transferi bir elektronik tabloya ve veri analizi yazılımı quadruplicate tepki ortalamasıyla kullanarak toplam döngüleri.</li>
			<li>Veri Ortalamalar arsa. X ekseni için reaksiyon süresi, RT-zlı (h) karşılık gelen ve y ekseni göreli Floresans birimleri (RFU) karşılık gelir. Her eğrinin bilinen bir örnek bir seyreltme için karşılık gelen.</li>
			<li>Negatif kontrol en yüksek ortalama değerlerini hesaplayarak her deneyde, bir eşik ayıran artı 5 standart sapmalar akım açıklandığı gibi Yayınlanan edebiyat 41. 
			NOT: Tanımlanmış eşiğin geçti bütün çoğaltır pozitif olarak kabul edilir. En az iki dört çoğaltır çapraz, örnek sonra pozitif kabul edilir.</li>
		</ol></li></ol></li></ol> 2. Arıtma rekombinant Prion protein (rPrP) <ol><li>bakteriyel hisse senedi ve ifade rPrP büyüme Not: Escherichia coli (e.coli) zorlanma vektör evde beslenen hayvan-24 kodlama ile dönüştürülmüş Rosetta (DE3) fare PrP (artıkları 23-231) rPrP hazırlamak için kullanıldı.
	<ol><li>Gliserol stokunun buzun üstünde evde beslenen hayvan-24 mPrP(23-231) ile dönüştürülmüş Rosetta (DE3) çözme</li>
		<li>Çizgi LB (Luria Bertani) olarak 50 µg/mL sefaloridin son bir konsantrasyon ile tabaklar ve gecede 37 ° C kuluçka makinesine kuluçkaya. Tabakları baş aşağı nem yoğunlaşma bakteri içeren katı medya önlemek için olduğundan emin olun. Büyüme en az bir iki tabak var emin olmak için iki tabak hazırlayın.</li>
		<li>1 L LB ve basınçlı kap hazırlamak bu steril başaramayacak.</li>
		<li>Özel sayı: 1 L ile 1 mL sefaloridin (50 mg/mL) ve kloramfenikol (34 mg/mL), 1 mL steril LB medya.</li>
		<li>Sefaloridin ve kloramfenikol içeren LB orta 3 mL aşılamak için bir tek kullanımlık aşılama döngü kullanarak her plaka bir koloni seçin.</li>
		<li>Yer bir kuluçka 37 ° C'de sabit 5-6 h. için 225 rpm'de sallayarak ile mini kültürlerde</li>
		<li>Mini-kültürler LB medya ile birlikte Autoinduction sistem 1 hızlı indüksiyon protein ifade için orijinal 1 litre geri kalanını ekleyin.</li>
		<li>Yer 2 lt şişeye, veya daha büyük bir kuluçka 37 ° C'de 20-24 h. için 200 devirde sabit sallayarak ile Kültür</li>
		<li>1 L kültür 4 x 250 mL santrifüj tüpler içine split.</li>
		<li>Kültür 3.750 x g oda sıcaklığında 20 dakika için de içeren tüpler aşağı spin.</li>
		<li>Süpernatant atmak ve 50 mL santrifüj tüpleri bakteriyel granül toplamak, sonra bunları daha fazla işleme kadar-80 ° C'de dondurmak. Elde edilen granül iyi protein verim için 3-4 g tartılır.</li>
	</ol></li> <li>Dahil vücut hazırlanması <ol><li>donmuş Pelet (3-4 g) kaç dakika 37 ° C'de erimek.</li>
		<li>-80 ° C'de 10 dakika için bir kez daha Pelet donma ve yeniden çözülme. Dondurma ve iki kez daha çözdürme bu adımı yineleyin.</li>
		<li>Resuspend bakteriyel Pelet 1 X lizis reaktif (örneğin BugBuster Master Mix) tarafından iyice pipetting. 5 mL reaktif bakteriyel Pelet 1 g için kullanın. Tamamen homojenize mix emin olun.</li>
		<li>Homogenate bir rock'çı, oda sıcaklığında 20 dakika için üzerinde kuluçkaya.</li>
		<li>Homogenate 16.000 x g için oda sıcaklığında 20 dk, santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Dikkatli bir şekilde kapalı dökme tarafından supernatants atmak</li>
		<li>Granül 1 önceki adımda kullanılan lizis reaktif X aynı birimdeki homojenize.</li>
		<li>Homogenate 15 dakika oda sıcaklığında bir rocker üzerinde kuluçkaya.</li>
		<li>Eklemek yeterli hacim 1:10 (0.1 x) lizis reaktif 40 mL toplam homogenate hacmi elde etmek için. Karıştırmak yanında inversiyon de homojenize emin olmak için.</li>
		<li>Homogenate 7,900 x g 15dk için de 4'te santrifüj kapasitesi ° C.</li>
		<li>Dikkatle onu dökme tarafından süpernatant atmak</li>
		<li>Pelet 40 ml 0.1 x lizis reaktif resuspend.</li>
		<li>Homogenate 16.000 x g 15dk için de 4'te santrifüj kapasitesi ° C.</li>
		<li>Süpernatant dikkatle bu dökerek atmak ve başka işleme kadar dahil organları-20 ° C'de içeren Pelet depolamak.</li>
	</ol></li> <li>Protein arıtma <ol><li>dahil cesetleri oda sıcaklığında erimek.</li>
		<li>Dağıtılması çözdürülen dahil cesetleri 14 ml 8 M guanidin-HCL (38 g guanidin hidroklorür 0.1 M NaPO 4 pH 8.0 ve dolgu ile H 2 O 50 ml; süspansiyon, nihai çözüm pH ayarlama değil) proteinler solubilize için.</li>
		<li>De yukarı ve aşağı pipetting homojenize emin olun.</li>
		<li>Incubate lysate bir rock'çı, oda sıcaklığında 50 dakika süreyle üzerinde</li>
		<li>Hazırlamak 18 g Ni-NTA reçine (18 g için 3-4 g bakteriyel pelet) boncuk; 100 mL vakum ve 100 mL 0,22 µm şişe en iyi filtre kullanarak su ile yıka.
		<ol><li>Ni-NTA reçine boncuk 18 g 50 mL tüp içinde yerleştirin ve son hacim yapmak için arabellek (100 mM sodyum fosfat, 10 mM Tris, pH 8.0, 6 M guanidin hidroklorür, pH 8) denaturing, yeterli hacim katmak ilâ 50 mL.</li>
			<li>Boncuk oda sıcaklığında bir rocker üzerinde 50 dk denaturing tampon equilibrate.</li>
		</ol></li> <li>Lysate 16.000 x g çözünmez enkaz kaldırmak 5 min için de eklenmesi vücut santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Süpernatant dengelenmiş boncuk ekleyin ve granül atın.</li>
		<li>Bir rock'çı protein bağlayıcı Ni-NTA reçine için izin vermek için oda sıcaklığında 40 min için mix giy. 
		Not: Nikel chelate boncuk, nikel benzeşimi tarafından PrP arındırmak için kullanılır. PrP histidin zengini N-terminal bölgesi benzeşimi için nikel iyonları onun herhangi bir etiketi olmadan bağlamak protein sağlar nickel(II) işler.</li>
		<li>Su ile yıkama her iki çizgileri (A ve B) temizlemek için FPLC.</li>
		<li>Denaturing arabellek (100 mM sodyum fosfat, 10 mM Tris, pH 8.0, 6 M guanidin hidroklorür, pH 8) her iki hatları (A ve B) (sütun henüz eklenir.) sistem Prime üzerinden çalıştırmak</li>
		<li>Reçine sütuna yerleştirin. Hava kabarcıkları en aza indirmek emin olun.</li>
		<li>İçin FPLC sütun eklemek ve arabellek denaturing % 0 ve %100 yanında belgili tanımlık son arabellek refolding için arabellek A denaturing % 100 ve % 0 refolding arabelleği B (100 mM sodyum fosfat, 10 mM Tris, pH 8.0) başta doğrusal gradyan çalıştırın. Bu kademeli değişim 0.75 mL/dak 240 min için akış hızında çalıştırmak ve uygun PrP katlama için gereklidir. 
		Not: Kromatografik arıtma işlemi sırasında denatüre PrP ilk yavaş yavaş bağlı denaturing tampon yerine refolding arabelleği doğrusal gradyan uygulayarak refolded. Bu adım, aynı zamanda chaotropic guanidin-HCl kaldırır.</li>
		<li>% 100 refolding arabellek sütunu için 0.75 mL/dak., ek bir 30 dk boyunca akmaya devam ediyor emin olun</li>
		<li>Durulama hat A elüsyon arabellek (100 mM sodyum fosfat, 10 mM Tris, 500 mM imidazole, pH 5,8) tarafından takip su ile sütun yan yol. Bu şimdi elüsyon arabellek tarafından AKTA sistemdeki yerini almıştır denaturing tampon temizlemek.</li>
		<li>Elute protein tampon B ve %0 elüsyon tampon A ilk 0 tampon ve % 100 elüsyon tampon refolding % refolding % 100'den 40 min için doğrusal gradyan çalıştırarak 2 mL/dk. 
		Not: PrP imidazole elüsyon arabelleği yüksek yoğunlukta yarışacak &#39; nickel(II) s bağlama. Birincil protein zirve yaklaşık 1/3'ü geçişin yoldan elute başlayacaktır.
		<ol><li>İzle Kromatografik artırmak OD 280 nm için.</li>
		</ol></li> <li>Sadece büyük tepe ortasındaki protein içeren tüpler toplamak. 
		Not: 2 mL eluted kesirler 15 mL tüpler içine toplanır.</li>
		<li>Diyaliz arabellek (10 mM sodyum fosfat, pH 5,8) yaklaşık 1/3 cilt (1 mL) hemen tüplerini içerdiği protein sulandırmak.</li>
		<li>Hemen buz üzerine boruları yerleştirin</li>
		<li>Eluted protein tüplerde bulunan havuz.</li>
		<li>Zavallı diyaliz kaset (moleküler ağırlık kesme 10 kDa) protein.</li>
		<li>Kaset 4 ° C'de 2 h için önceden soğutulmuş diyaliz arabellek (3.6 M) koymak, sonra kasetleri bir taze diyaliz arabelleğe (3.6 M) gece için transfer. Yapmak Diyaliz tampon altında sürekli ajitasyon olduðundan emin.</li>
		<li>Filtre protein diyaliz sonra bir Ģırınga kullanarak 0.2 µm acrodisc şırınga filtreden.</li>
		<li>Bir BCA protein tahlil kit kullanarak protein konsantrasyonu ölçmek.</li>
		<li>Konsantre veya protein konsantrasyonu 0.3 mg/ml ayarlamak gerekirse sulandırmak. 
		Not: SDS-sayfa ve Coomassie boyama mavi saflık onaylayın.</li>
		<li>1 mL aliquots protein microcentrifuge tüplerde yapıp hemen-80 ° C'de RT zlı protokolünde açıklandığı gibi daha fazla kullanmak kadar saklamak.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

RT zlı daha önce idrar ve dışkı özleri sözlü olarak enfekte Ak kuyruklu geyik ve katır geyiği 38CWD Prionlar algılamak için istihdam edildi. Bu el yazması gösterilen sistem RT zlı tahlil adapte bir yöntemdir. Ek adımlar algılama ve tahlil CWD Prionlar enfekte hayvanların dışkı malzeme için duyarlılığını artırmak için "klasik" RT zlı tahlil içine dahil edilmiştir.
Algılama dışkı özleri ile düşük duyarlılık bizi RT zlı protokol gelişmesine yol açtı. Hassas vitro ...

Prion hastalıkları veya bulaşıcı spongiform Encephalopathy (TSE) insanlarda, bovine spongiform encephalopathy (BSE) içinde sığır, koyun ve keçi ve kronik boşa büyük nörodejeneratif hastalıklar Creutzfeldt - Jakob hastalığı (CJD) dahil olmak üzere çoğu hastalığı (CWD) cervids 1,2. TSE'ler ayırt edici spongiform görünüm ve beyindeki nöronların kaybı ile karakterizedir. "Sadece protein" hipotezi göre Prionlar esas olarak PrPSc (büyük için ' Sc') 3/, ev sahibi olarak kodlanmış hücresel prion protein, PrPCmisfolded izoformu oluşmaktadır. PrPSc PrPC dönüştürme bağlamak ve diğer PrPC molekülleri dönüştürmek için bir çekirdek hareket edebilir ᵦ-yaprak 4,5,6 zenginleştirilmiş bir uyum içine kaynaklanır. Yeni oluşturulan PrPSc moleküllerin daha küçük reaksiyonlar, bulaşıcı çekirdekleri daha yüksek sayıda sonuçlanan bölen bir büyüyen polimer 7,8 içine dahil edilmiştir. PrPSc toplamak için eğilimli ve proteaz 9,10' a kısmen dayanıklıdır.
CWD etkiler vahşi ve çiftlik geyik (Cervus canadensis), katır geyiği (Odocoileus hemionus), Ak kuyruklu geyik (WTD; Odocoileus virginianus), geyik (Alces alces) ve Ren geyiği (Rangifer tarandus tarandus) 11,12,13. Bu yatay şanzıman cervid etkileşimleri ve çevre sebat infektivite 14,15ile en bulaşıcı deli dana hastalığı kabul edilir. Nerede PrPSc birikimi ve infektivite beyne sınırlı olan diğer prion hastalıkları CWD içinde bunlar da periferik doku ve vücut sıvıları örneğin tükürük, idrar ve dışkı 16,17, bulunur 18.
İmmünhistokimya PrPSc dağıtım ve süngerimsi lezyonlar 19,20algılamak CWD tanısı için altın standart olarak kabul edilir. ELISA ve daha nadir olarak, Batı leke de CWD teşhis için kullanılır. Böylece, geçerli deli dana hastalığı tanı çoğunlukla Prionlar içinde post-mortem doku tespit üzerinde temel alır. Ante-mortem tanı için CWD bademcikler veya recto anal mukoza ilişkili lenfoid doku (RAMALT) biyopsi alarak mevcuttur; Bununla birlikte, bu yordamı invaziv ve hayvanların yakalanması gerekir. Böylece, idrar ve dışkı, gibi kolayca erişilebilir örneklerin kullanımı CWD prion algılama için pratik bir yol olacaktır. Ancak, bu salgılarının liman nispeten Prionlar geçerli tanı yöntemleri algılama sınırın altındaki konsantrasyonları düşük. Sonuç olarak, daha hassas ve yüksek üretilen iş tanı aracı gereklidir. Döngüsel amplifikasyon misfolding protein gibi vitro Dönüşüm Sistemleri (PMCA) 21, tahlil ve gerçek zamanlı dönüşüm (RT zlı) gökyüzünden kaynaklı tahlil 22,23, tohum amiloid tahlil 24 deli dana dönüştürme işleminin vitro taklit etmek için PrPSc kendi kendine yayılıyor yeteneği yararlanmak ve böylece dakika PrP algılanamaz düzeyleri 25Sc miktarda varlığı yükseltmek için çok güçlü araçlar vardır ,26. RT zlı yöntemi, ancak, β-yapraklık ikincil yapısında zenginleştirilmiş dönüşüm ürün özellikle thioflavin T (Th-T) bağlayabilirsiniz aslında yararlanır. Bu nedenle, rekombinant PrP (rPrP) numaralı seribaşı dönüşüm üzerine Th-T bağlamak ve böylece gerçek zamanlı olarak Th-T (RFU) göreli Floresans birimler zaman içinde ifade Floresans ölçerek tespit edilebilir amiloid liflerinde içine büyür. Bir kez izlenen, RFU göreli tohumlama faaliyetleri ve gecikme faz gibi nicel parametreleri değerlendirmek için kullanılabilir. Gecikme faz sırasında hangi rPrP erken aşamada tepki Th-T Floresans algılama sınırın altına dönüştürmedir eşik ulaşmak için gereken süreyi (h) temsil eder. Eşlik eden yeterli amiloid çekirdeği (çekirdekleşme/uzama) oluşumuna belirgin gecikme faz sonu Th-T Floresans eşik düzeyini aşıyor ve olumlu olur oluşur. Amiloid liflerinde gerçek zamanlı ve ilk PrPSc veya aşağıdaki örnekte yer alan tohumlama aktivite tespit edilebilir büyüme daha fazla tohum üreten bölümleme tarafından güçlendirilmiş. Bu tohumlar sırayla hızlı üssel faz amiloid fiber büyüme teşvik.
Çünkü bu tahlil 1 düşük tespit edebilmektedir fg PrPSc 24yüksek hassasiyet nitelendirir ante öldükten sonra ya da non-invaziv tanı çeşitli periferik dokulara, salgılarının veya diğer PrPSc tespit ederek elde etmek için bu tekniği numune infektivite seviyesinin düşük yataklık tür. RT zlı kesinlikle avantajları diğer deneyleri tekrarlanabilirlik, pratiklik, hız (az 50 h) ve BİYOANALİZLER için karşılaştırıldığında düşük maliyetleri sağlar. O PMCA içinde kullanılan sonication gibi teknik karmaşıklığı önler; Ayrıca, hangi her şey aerosol bulaşma riskini en aza indirgemek bir bant mühürlü Mikroplaka içinde gerçekleştirilir. Çok iyi biçimi aynı deneyi 96 örnekleri çözümleme sağlar. Tekrarlayan sorunun yanlış pozitif ve rPrP vitro dönüşüm deneyleri içinde spontan dönüşüm karşı bir eşik (cut-off) RT zlı uygulanması çok yararlıdır. Nitekim, negatif kontrol (ortalama RFU negatif örnekler + 5 SD 27) sonuçlarına göre bir temel hangi-ebilmek kılınmak ayrımcılık pozitif ve negatif örnekleri arasında ayarlanır. Dört çoğaltır kullanım örnekleri için böylece çoğaltır en az % 50 olumlu bir sinyal gösterdiğinizde bir örnek pozitif tanımlamak için yardımcı olabilir, Yani çapraz kesme 28. Örneğin bir önceki çalışmada, hamster rPrP insan PrPvCJD homolog substrat kıyasla daha duyarlı bir substrat olmak tohumlari ve koyun büyük tepkiler numaralı seribaşı tespit edildi gibi homoloji arasında tohum ve substrat RT içinde zlı, gerekli değildir 29. hamster-koyun chimeric rPrP da insan varyant CJD Prionlar 30algılamak için insan rPrP daha daha iyi uygun bir substrat olmasını önerdi. Böylece, farklı türlerden rPrP yüzeylerde kullanımı bu tahlil çok yaygındır. Bu tahlil sporadik CJD 31,32,33, gen gibi birkaç prion hastalıkları için başarıyla uygulandıETIC prion hastalıkları 34, BSE 35,36,37, büyük 23,36ve CWD 38,39,40,41, 42. RT zlı içinde tohum PrPSc 38,39,40,41, tespit etmek için tüm başarılı olduğu gibi çalışmalar kullanarak beyin omurilik sıvısı, tam kan, tükürük ve idrar işlenen 42. örneklerinde inhibitörleri Amiloid Dil oluşumu içerebilir kan plazması gibi algılama yeteneği teşvik etmek için Orrú ve ark. (2011) Amiloid Dil oluşumu potansiyel inhibitörleri PrPSc immunoprecipitation (IP) adım ve RT-QuIC tarama ile kaldırmak için bir strateji geliştirdi, tahlil (eQuIC) "QuIC gelişmiş" adında. Buna ek olarak, bir yüzey yedek adım duyarlılığını artırmak için reaksiyon süresi ~ 24 h sonra istihdam edildi. Sonuçta, olarak düşük 1 ag PrPSc eQuIC 30tarafından algılanabilir.
Dışkı özleri arındırmak ve olası tahlil inhibitörleri dışkı çıkarmak için dışkı örnekleri preklinik ve klinik aşamalarında elk deneysel oral enfeksiyon üzerine toplanan deterjanlar ve proteaz inhibitörleri içeren arabellekte homojenize. Dışkı özleri daha fazla protein yağış ile sodyum phosphotungstic asit (NaPTA) yağış kullanan örnekler PrPSc konsantre için farklı yöntemler için sunuldu. Önce Safar vd tarafından açıklanan NaPTA yağış yöntemi 43, PrPSc test örneklerinde konsantre için kullanılır. NaPTA kuluçka PrPCyerine PrPSc tercihli yağış örnek sonuçlarını içeren. Ancak, moleküler mekanizma hala belli değildir. Bu adımı da içeren ve bazı durumlarda görülmektedir rPrP spontan dönüşüm önleme yardım etti. Son olarak, dışkı özleri en iyi duruma getirilmiş RT-fare rPrP (aa 23-231) bir substrat kullanarak ve yüzey yedek iletişim kuralında dahil algılama hassasiyeti artırmak için zlı tarafından test edildi.
Sonuçlar burada geliştirilmiş bu yöntem çok düşük konsantrasyonlarda CWD Prionlar algılayabilir ve algılama ve özgüllük dışkı örneklerinde NaPTA yağmur damlaları ve yüzey yedek olmadan bir iletişim kuralına göre hassasiyeti artar gösterilmektedir. Bu yöntem potansiyel olarak diğer doku ve vücut sıvıları uygulanabilir ve vahşi ve esir cervids CWD gözetimi için büyük kullanım olabilir.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Malzemeler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Acrodisc seringe filtreler</td><td>PALL</td><td>4652</td><td></td></tr><tr><td>amicon Ultra-15 Santrifüj filtre Ünitesi</td><td>Millipore</td><td>UCF901024</td><td></td></tr><tr><td>BD 10 ml seringe</td><td>VWR</td><td>CA75846-842</td><td></td></tr><tr><td>Kloramfenikol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>Corning şişe üstü vakum filtreleri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431118</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS M Tüp</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>Guanidin hidroklorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4505</td><td></td></tr><tr><td>İmidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>İzopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Kanamisin sülfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) suyu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12780029</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>N2 takviyesi (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15502048</td><td></td></tr><tr><td>N-lauroylsarcosine sodyum tuzu (sarkosil)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ML9150</td><td></td></tr><tr><td>Nanosep omega membranlı santrifüj cihazlar 100K</td><td>PALL</td><td>OD100C34</td><td></td></tr><tr><td>Nunc sızdırmazlık bantları</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>232702</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>fenilmetilsülfonil florür (PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz inhibitör tableti</td><td>Roche</td><td></td><td></td>4693159001</tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum deoksikolat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum dodesil sülfat (SDS)</td> <td>Calbiochem</td><td>7910-OP</td><td></td></tr><tr><td>sodyum fosfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342483</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat dibazik susuz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat monobazik monohidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfotungstat hidrat (NaPTA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>496626</td><td></td></tr><tr><td>Thioflavin T</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3516</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Hidroksi-Metil-Amino-Metan (Tris)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Triton-100</td><td>Calbiochem</td><td>9410-OP</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company<</td><td>strong>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Ticari tamponlar ve çözümler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BugBuster Master Mix</td><td>Nogagen</td><td>71456-4</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA süper akışlı</td><td>Qiagen</td><td>1018401</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) pH 7.4 (1X)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Damıtılmış Su</td><td>İnvitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>İsim<</td><td>strong>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Yorumlar </td></tr><tr><td>< güçlü > Standartlar ve ticari kitler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Express Otoindüksiyon Sistemi 1</td><td>Novagen</td><td>71300-4</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Test Kiti</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Adı <</td><td>strong>Company </td><td> Katalog Numarası</td><td>Yorumlar</güçlü></td></tr><tr><td>güçlü<güçlü>Ekipman kurulumu</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AKTA protein saflaştırma sistemleri FPLC</td><td>GE Sağlık Yaşam Bilimleri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman Avanti J-25 Santrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman rotor JA-25.50</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman rotor JA-10</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FLUOstar Omega mikroplaka okuyucu</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Ayrıştırıcı</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</strong</td><td>>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Sofware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MARS Veri Analizi</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism6</td><td>GraphPad yazılımı</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

gerçek zamanlı depremin dönüşüm tahlil cwd prionlar fekal madde olarak algılanması için kaynaklı

Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material

Esas numaralı seribaşı misfolding ve rekombinant prion protein (PrP) substrat prion tohum dönüştürme için bir şablon olarak kullanarak toplama göre hassas vitro boş hücre deli dana amplifikasyon tahlil RT zlı tekniğidir. RT zlı gerçek zamanlı Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) benzer bir roman yüksek üretilen iş tekniği kullanıyor. Amiloid Fibriller büyüme tespiti üzerine ᵦ sayfalık zengin proteinler ile spesifik etkileşime fluoresces Thioflavin T boya temel alır. Böylece, Amiloid Dil oluşumu gerçek zamanlı olarak tespit edilebilir. Kronik israf hastalığı (CWD) Prionlar dışkı hulâsa içinde algılamak için bir güvenilir non-invaziv tarama testi geliştirmek çalıştı. Burada, özellikle CWD dışkısı etkinliğinde tohum PrPSc cervids enfekte ortaya çıkarmak için RT zlı tekniği adapte olması. Başlangıçta, hazırladığımız dışkı özleri tohumlama etkinliği RT içinde zlı, nispeten düşük potansiyel tahlil inhibitörleri fekal malzeme nedeniyle oldu. Dışkı özleri tohumlama etkinliğini artırmak ve olası tahlil inhibitörleri kaldırmak için deterjanlar ve proteaz inhibitörleri içeren bir arabellek dışkı örneklerinde homojenize. Biz de örnekleri PrPSc sodyum phosphotungstic asit ve merkezkaç kuvveti kullanan protein yağış temelinde konsantre için farklı yöntemler için gönderilmektedir. Son olarak, dışkı özler tarafından en iyi duruma getirilmiş RT-yüzey yedek algılama hassasiyeti artırmak için iletişim kuralında dahil zlı test edildi. Böylece, bir protokol CWD deli dana önceden klinik ve klinik cervids tarafından RT-non-invaziv CWD tanı için kullanışlı bir araç olabilir zlı, dışkısı etkinliğinde tohum hassas algılanması için kurduk.

(w/v) hazırlanan CWD dışkı özleri RT zlı tepki tohum başardık, henüz algılama hassasiyeti düşük 27oldu. Dışkı homojenizasyon için belirli bir arabellek kullanarak yüksek arka plan Floresans reaksiyonlarda RT zlı eşlik eden kullanmak için fare rPrP substrat, önlemek için önemli bir adımdı yerine daha özel almak için izin geyik rPrP 27sonuç. NaPTA yağış ilavesi rPrP RT-zlı (şekil 1) içinde spontan dönüşüm amplifi...

Burada, bir basit, hızlı ve verimli prion amplifikasyon tekniği, gerçek zamanlı dönüştürme (RT zlı) gökyüzünden kaynaklı yöntemi açıklamak için bir iletişim kuralı mevcut.

Gerçek zamanlı depremin dönüşüm tahlil CWD Prionlar fekal madde olarak algılanması için kaynaklı

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant ...

Gerçek zamanlı sarsıntı kaynaklı dönüşüm testi için bu protokolün genel amacı, servid dışkı örneklerinde kronik israf hastalığı prionlarının hassas tespitine izin vermektir. Bu yöntem, dışkıda cervid CWD prionlarının ne zaman enfekte olduğu gibi CWD araştırma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, spesifik, hassas olması ve yüksek numune verimi sağlamasıdır.Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir laboratuvar teknisyeni olan Ginny Cheng olacak. Bu işleme başlamak için, 10 mililitre dışkı özü tamponu içeren bir tüpe bir gram dışkı materyali ekleyin. Proteinler için önceden ayarlanmış bir programa sahip bir ayrıştırıcı kullanarak, dışkı peletlerini oda sıcaklığında bir dakika boyunca homojenize edin.Dışkı örnekleri tamamen homojen hale gelene kadar bunu iki ila üç kez tekrarlayın. Daha sonra tüpleri kapatmak için parafilm kullanın ve oda sıcaklığında bir saatlik inkübasyon için sallanan bir platform veya döner çalkalayıcı üzerine yerleştirin. Bundan sonra, oda sıcaklığında beş dakika boyunca 18.000 g'da santrifüjleyin.Süpernatanları toplayın ve 1.5 mililitrelik tüplere ayırın. Kullanıma hazır olana kadar eksi 80 santigrat derecede sa

real-time-quaking-induced-conversion-assay-for-detection-cwd-prions

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Burada hemen arındırıcı intraperitoneal aşılama ve floresan sonra enjeksiyon yerinde alımı ve hareket izleme ve bu olaylara aracılık eden hücreler karakterize enfekte beyin malzeme toplanan prion çubuklar etiketleme prion alımı ve ticareti bağışıklık hücreleri tarafından izlenmesi için yeni bir tahlil açıklar.

İntraperitoneal Enfeksiyon sonra Bağışıklık Hücreleri Ticareti Floresan Prion Çubuklar Saat İzlenmesi

Protein misfolding siklik amplifikasyon (PMCA) Prion dönüşüm ve zorlanma ve tür engellerin çalışma için bir in vitro testtir. Aynı zamanda, bir prion saptama sistemi olarak da kullanılabilir.

Prionlar protein misfolding Döngüsel Amplifikasyon

Süpürücüleri hastalıksız bölgelere kendi dışkılarıyla bulaşıcı bulaşıcı süngerimsi ensefalopati prionları translokasyonunda potansiyele sahiptir. Biz fare adapte skrapi prıonlar Amerikan kargalar sindirim sisteminde (Corvus brachyrhynchos), ölü hayvanların ortak bir tüketici olsa geçtikten sonra bulaşıcı kalırsa belirlemek için kullanılan ayrıntı yöntemleri.

Bir Kuş Türlerinin Sindirim Sistemi geçtikten sonra Bulaşıcı prions belirlenmesi için prosedürler

Bu protokol, formalinle sabitlenmiş, parafine gömülü biyopsi dokusunda sitomegalovirüsün qPCR tespitini tanımlar, bu da hızlı, hassas, spesifik ve belirsiz hematoksilen ve eozin veya immünohistokimyasal boyama paternlerini yorumlamak için yararlıdır.

QPCR Formalinle sabit, Parafin-gömülü Biyopsi Doku sitomegaloviral DNA tespiti için bir Hassas ve Hızlı Yöntem mi

Prion hastalıklarının türler arası bulaşmasının önündeki engeli ölçmek zordur ve tipik olarak hayvan zorluklarını veya biyokimyasal analizleri içerir. Burada, tür engellerini tahmin etme yeteneğine sahip bir in vitro prion protein dönüşüm testi sunuyoruz.

Bir ile Bulaşıcı Süngerimsi Ensefalopati Türler Engelleri değerlendirilmesi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Prion Proteini Dönüştürme Deneyi

Sağlanan, bir termal döngüleyici veya bir mikroskop ve sahne ısıtıcısı kullanarak DNA örneklerinin ilk konsantrasyonunu ölçmek için gerçek zamanlı bir rekombinaz polimeraz amplifikasyon testi geliştirmek için bir protokoldür. Ayrıca bir iç pozitif kontrolün geliştirilmesi de açıklanmaktadır. Ham gerçek zamanlı floresan verilerinin işlenmesi için komut dosyaları sağlanmıştır.

İç Pozitif Kontrol ile Kantitatif Recombinase Polimeraz Amplifikasyon Testi Geliştirme

Bitki patojenleri yerinde, özellikle toprak kaynaklı patojenler, hızlı ve doğru tespiti daha fazla inoculum üretim ve alanında bitki hastalıklarının yayılması önlemek için çok önemli olduğunu. Burada bir taşınabilir gerçek zamanlı PCR algılama sistemi kullanılarak geliştirilen yöntem yerinde tanı alan koşullarında sağlar.

Toprak kaynaklı Phytopathogens bir taşınabilir gerçek zamanlı PCR sistemi kullanarak yerinde moleküler tespiti

Ters transkripsiyon (RT-qPCR) ile birlikte gerçek zamanlı nicel polimeraz zincir reaksiyonu analiz RNA virüs enfeksiyonları düzeyini ölçmek için yaygın olarak kullanılmış. Burada dang virüs dahil olmak üzere birkaç RNA virüsleri miktar için geliştirilen bir RNA arıtma adım gerekli değildir doğrudan bir RT-qPCR tahlil mevcut.

Dang virüs RNA kültür süpernatant gerçek zamanlı nicel polimeraz zincir reaksiyonu tarafından enfekte hücre içinde ölçme

Bu protokol, in vitro transkripsiyon kullanarak çeşitli sığır beyin anatomik yapıları içindeki kuduz virüsü nükleoprotein (N) gen kopya numarasını belirlemek için qRT-PCR tabanlı bir yaklaşım sunar.

Çeşitli Sığır Beyin Yapılarında Kuduz Virüsünün Nicelliği

İmmünohistokimya protokollerini kullanarak anormal prion proteininin immüno-etiketlemesi, spesifik numune ve anti-PrP antikor hazırlama metodolojileri gerektirir. Bu protokol, uygun PrP immün etiketlemesini sağlamak ve spesifik olmayan arka plan boyamasını en aza indirmek için epitop demasking işlemindeki temel adımları açıklamaktadır. Ayrıca, bu yaklaşım, prion ile enfekte olmuş dokularla immünohistokimya çalışmaları yaparken biyogüvenlik önlemlerini de göz önünde bulundurur.

İmmünohistokimya ile Anormal Prion Proteininin Saptanması

Prion kontaminasyonu ve etkili dekontaminasyon için laboratuvar ortamlarında yaygın olarak kullanılan alanları değerlendirmek için bir yöntem eksiktir. Burada açıklanan protokol, belirli laboratuvarların bireysel ihtiyaçlarını karşılamak için kolayca değiştirilebilen bir laboratuvar prion güvenlik kaydırma testinin uygulanması için temel temelleri sağlar.

Prion Güvenlik Laboratuvarı Kaydırma Testi

Öğrenin, RT-QuIC yöntemiyle geyik dışkı örneklerinde kronik israf hastalığı priyonlarını hassas şekilde nasıl tespit edeceğinizi. Bu protokol, yüksek verimli analiz ve spesifik sonuçlar sağlar.

Gerçek zamanlı depremin dönüşüm tahlil CWD Prionlar fekal madde olarak algılanması için kaynaklı

Daha fazla video keşfet