Teşhis edilmesi için kullanılan ilişkili Viral ve hücresel proteinler Viral DNA'ın arıtma

Bu yöntemin genel amacı, viral genom ile ilişkili proteinlerin proteomik analizi için enfekte olmuş hücrelerden Herpes Simpleks virüsü tip bir DNA'yı saflaştırmaktır. Bu yöntem, hücresel faktörlerin ve Herpes virüsü enfeksiyonunun katılımı hakkında önemli bilgiler sağlar. Bu tekniğin temel avantajı, enfekte olmuş hücrelerden farklı viral DNA popülasyonlarını doğrudan saflaştırmak için uyarlanabilmesi ve enfeksiyonun birçok yönünün analizine izin vermesidir.

Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı gibi MRC beş hücresinin kültürlenmesiyle başlayın. Ardından, HSV-1'i soğuk tris tamponlu salin veya TBS ile seyreltin. Aşağıdaki adımlar için, hücrelerin kurumasını önlemek için üfleyiciyi ve doku kültürü başlığını kapatmak önemlidir.

Enfeksiyondan sonra hücrelere geri eklemek üzere büyüme ortamını MRC 5 hücrelerinden steril bir şişeye aktarmak için bir pipet kullanın. Hücrelere yedi mililitre seyreltilmiş virüs ekleyerek hücreleri enfekte edin. Hücreleri oda sıcaklığında bir saat boyunca her 10 dakikada bir sallayın.

Emilimi takiben, innokulumu aspire edin, hücreleri 50 mililitre oda sıcaklığında TBS ile durulayın ve orijinal büyüme ortamını değiştirin. Daha sonra, hücreleri% 5 karbondioksit varlığında 37 santigrat derecede inkübe edin. Viral DNA replikasyonunun başlamasından sonra, enfeksiyondan yaklaşık dört saat sonra, replikasyon yapan viral DNA'yı etiketleyin.

Bunu yapmak için, EdC'yi bir mililitre büyüme ortamında seyreltin ve iki ila dört saat boyunca enfekte olmuş hücrelerin hücre kültürü ortamına ekleyin. Çekirdekleri hasat etmek için, büyüme ortamını 20 mililitre çekirdek ekstraksiyon tamponu ile değiştirin ve ara sıra sallanarak dört santigrat derecede 20 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, bir hücre kazıyıcı kullanarak çekirdekleri plakadan kazıyın ve bunları buz üzerinde 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.

Çekirdeği peletlemek için 2.500 x g ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeyi takiben, süpernatanı atın. Nükleer peleti 10 mililitre fosfat tampon salin veya PBS içinde yavaşça çıkarın ve 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.

Ardından, numuneyi daha önce olduğu gibi santrifüjleyin. PBS'yi tamamen çıkardıktan sonra, 10 mililitrelik bir pipetle beş kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek nükleer peleti 10 mililitre tıklama reaksiyonu karışımında yeniden askıya alın. Çekirdeği daha önce olduğu gibi peletlemeden önce numuneyi dört santigrat derecede bir saat döndürün.

Hızlı reaksiyon karışımını tamamen çıkarın, ardından peleti 10 mililitre PBS'de nazikçe yeniden süspanse ederek ve tekrar santrifüjleyerek yıkayın. Şimdi, nükleer peleti bir mililitre PBS'de dikkatlice yeniden askıya alın ve çözeltiyi 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Santrifüjlemenin ardından, PBS'yi tamamen çıkarın ve peleti sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun.

Bu noktada pelet 80 santigrat derecede saklanabilir veya işleme devam edilebilir. Çekirdekleri parçalamak ve DNA'yı parçalamak için, çözülmüş çekirdekleri 500 mikrolitre Tampon B1'de yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin. Süspansiyonu 45 dakika buz üzerinde inkübe edin.

Ardından, üç milimetrelik bir mikro uçlu prob kullanarak, numuneleri her biri% 40 genlikte 30 saniye boyunca altı kez sonikleştirin. Numuneleri darbeler arasında en az 30 saniye boyunca buzun üzerine yerleştirin. Sonikasyondan sonra, örnekler bulanık değil, net görünmelidir.

Dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 14.000 x G'de santrifüjleyerek hücre kalıntılarını peletleyin. Pelet boyutu önemli ölçüde azalmalı, süpernatanı 100 mikronluk bir hücre süzgecinden filtrelemeli ve akışı korumalıdır. Ardından, filtrelenmiş süpernatanıma 500 mikrolitre Tampon B2 ekleyin.

Biyotinile edilmiş DNA'yı streptavidin kaplı boncuklara bağlamak için, 300 mikrolitre boncuk bulamacını 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktararak streptavidin manyetik boncuklarını hazırlayın. Numune başına bir tüp boncuk hazırlayın. Boncukları mililitre Tampon B2 ile üç kez yıkayın, yeniden süspanse etmek için girdap yaparak, boncukları ayırmak için bir mıknatısa uygulayın ve yıkama tamponunu aspire edin.

Ardından, yıkanmış boncuklara 900 mikrolitre numune ekleyin. Numunenin geri kalanı, giriş DNA'sı ve protein izolasyonu için kullanılacaktır. Süspansiyonu gece boyunca dört santigrat derecede döndürün.

Ertesi gün, numuneleri manyetik bir mikrofüj tüp rafına yerleştirin ve süpernatanı çıkarın. Beş dakika boyunca dört santigrat derecede döndürmeden önce boncukları bir mililitre Tampon B2'de yavaşça yeniden askıya alın. Manyetik mikrofüj tüp rafını kullanarak süpernatanı tekrar çıkarın.

Bu sefer, boncukları bir mililitrelik Tampon B3'te yavaşça yeniden askıya alın ve beş dakika boyunca dört santigrat derecede döndürün. Mıknatısı kullanarak süpernatanı boncuk karışımından çıkardıktan sonra, DNA protein komplekslerini ima etmek için boncukları 50 mikrolitre 2x Laemmli numune tamponunda yeniden süspanse edin. Daha sonra, numuneleri 95 santigrat derecede 15 dakika kaynatın.

Numuneleri bir mikrofugede hızlı bir şekilde döndürmeden önce bir karışımı girdaplayın. Numuneleri mıknatısa uygulayın ve tahsisatı yeni bir tüpe aktarın. Son olarak, numuneleri hızlı dondurun ve 80 santigrat derecede saklayın.

Metin protokolünde açıklandığı gibi protein analizi yapın. EdC etiketlemesi sıfır, 20, 40 veya 60 dakika boyunca gerçekleştirildi ve ardından viral DNA ve ilgili proteinlerin saflaştırılması izledi. Ayrıştırılan proteinler, viral DNA bağlayıcı proteinler, ICP4 ve UL42 için spesifik antikor ile coomassie mavisi boyamaya ve western blotlamaya tabi tutuldu.

Ok, her koşulda mevcut olan elüsyon sırasında boncuklardan sıyrılan streptavidini gösterir. Bu yöntemle izole edilen proteinler daha sonra kütle spektrometresine tabi tutulur. Pasta grafiği, enfeksiyondan altı saat sonra genomlarda Herpes Simplex virüs tipi ile ilişkili olduğu tespit edilen her fonksiyonel kategorideki proteinlerin sayısını göstermektedir.

Tanımlanan proteinler arasındaki protein-protein etkileşimlerine daha yakından bir bakış, dize fonksiyonel protein ilişkilendirme ağı veritabanı kullanılarak gerçekleştirildi. Sonuçlar, aynı biyolojik süreçte birlikte işlev gören proteinlerin alt komplekslerini ortaya koymaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, viral genomla ilişkili proteinlerin proteomik araştırması için viral DNA'nın enfekte olmuş hücrelerden nasıl saflaştırılacağını iyi anlamış olmalısınız.

Bu teknik üç ila dört gün içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, numunelerin DNAse veya proteaz kontaminasyonunu önlemek için önlem almayı unutmamak önemlidir. Bu prosedüre ek olarak, EdC etiketli viral DNA'nın doğasını doğrulamak için immünofloresan gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.

Bu teknik, Herpes virolojisi alanındaki araştırmacıların, konakçı proteinlerin ve viral enfeksiyonun işlevlerini keşfetmelerinin yolunu açmıştır.