Name: Teşhis edilmesi için kullanılan ilişkili Viral ve hücresel proteinler Viral DNAın arıtma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Öğrenin HSV-1 DNA'sını enfekte hücrelerden arıtma yöntemini ve viral genomla ilişkili proteinlerin proteomik analizini. Bu teknik, hücresel faktörlerin Herpes virüs enfeksiyonundaki rolüne dair önemli bilgiler sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu yazının hazırlanmasında yardım için Hannah Fox anıyoruz. Bu eser NIH tarafından desteklenen R01AI030612 verin.

1. hücre kültürü, Viral enfeksiyon ve EdC etiketleme ( şekil 1) Aşağıdaki protokol virüsler ile çalışma gerektirir. Kurumunuzun için bakınız &#39; s biyo-güvenlik protokollerini virüsler ve diğer biyolojik ajanlar güvenli taşıma ile ilgili. Bu protokolün Pittsburgh Üniversitesi Kurumsal inceleme Kurulu tarafından kabul edildi.
<ol><li>Bir Konfluent 150 cm 2 doku kültürü şişesi MRC-5 hücre trypsinize ve hücreleri 100 mL DMEM artı % 10 içeren 600 cm 2 doku kültürü plakasına transfer FBS. Varlığında % 5 CO 2 3-4 gün confluency ve sabit faz ulaşmak için için 37 ° C'de kuluçkaya. Konfluent 600 cm 2 çanak ~ 7 x 10 7 hücreler içerir. Her koşul için 1 plaka ve her karşılık gelen negatif kontrol için 1 plaka hazırlayın. 
	Not: Bu sadece vDNA etiketli ve sonraki adımlar saf emin olmak için hücresel DNA ikileşmesi etkisizleştirmek için durağan faz hücre ulaşmalıdır. 
	Not: Her örnek ücretsiz bir negatif kontrol süresi noktası EdC ek olmadan ve aynı enfeksiyon koşulları kullanılarak hazırlanan etiketsiz gerektirir. 
	Not: Bu deneme sürümü ölçekli A tandem hücresel DNA'sı karşılaştırılabilir hücre büyüme, enfeksiyon, koşullar, etiketleme EdC kullanarak görüntüleme tarafından etiketleme için test etmek ve Puan zaman yapılmalıdır (see Adım 2).</li>
	<li>7 x 10 8 PFU HSV-1 7 ml seyreltik soğuk Tris-Buffered serum fizyolojik (TBS). Büyüme orta çıkarın ve 37 ° C'de saklayın Bulaştırmak için 7-mL sulandırılmış virüs MRC-5 hücreleri ve kaya oda sıcaklığında 1 h için ekleyin. Aşağıdaki adsorpsiyon, inoculum kaldırmak, 50 mL oda sıcaklığında TBS ile durulayın ve özgün büyüme orta yerine. Varlığında % 5 CO 2 37 ° C'de kuluçkaya. Bu adımı her deneysel durumu ve negatif kontrol yapılmalıdır. 
	Not: Artan EdC etiketleme HSV-1 mutantlar arızalı için viral dUTPase (UL50 gen) ve/veya urasil glycosylase (UL2 gen) ifade kullanılarak elde edilebilir. HSV-1 dUTPase düşük substrat özgüllüğü vardır ve birkaç nükleozit analogları 25 , 27 aktivasyonu düşürebilir.</li>
	<li>Etiketi viral genom EdC ile. Gelen genleri (1.3.1.), genleri (1.3.2.) veya viral çoğaltma çatal (1.3.3.) çoğaltma etiketlemek için yönergeleri izleyin. 
	Not: Tek adım 1.3.1, 1.3.2 veya 1.3.3 gelen genleri, çoğaltılmış genleri veya çoğaltma çatal sonraki adımlar sırasıyla analiz edilecek olup bağlı olarak yapılmalıdır. 
	Not: EdU veya f-ara EdU EdC için yedek olabilir. Nükleozit analogları toksisite izlenmeli ve en aza indirgemek.
	<ol><li>Kullanım prelabeled adım 1.2 enfeksiyonunda yürütmek ve adım 2'ye devam etmek için hisse senetleri veya 3 4 h içinde yazı çoğaltılmamış vDNA ( şekil 1A) araştırmak için enfeksiyon (HPI). 
		Not: yukarıda açıklanan protokol 25 kullanarak hisse senetleri prelabeled virüs hazırlayın. Virüs stokları herhangi bir kalıntı EdC kaldırmak için G-25 sütununu tarayarak geçti.</li>
		<li>Etiket kopyalayan vDNA 5-25 µM ekleyerek EdC için 2-4 h ( şekil 1B) enfekte hücreleri hücre kültür orta için. Eklemeden önce EdC seyreltik büyüme orta 1 mL.</li>
		Viral çoğaltma çatal, vDNA çoğaltma başlangıcından sonra etiketlemek için <li>(&#8805; 4 HPI), vDNA 5-25 µM ile çoğaltma darbe etiket EdC 5-20 dk için. Kovalamak için 3 x 25-100 µM 2´deoxycytidine içeren chase orta ile yıkayın (deoxyC) ve sonra chase orta bir ek 20-40 dakika ( şekil 1 c) huzurunda kuluçkaya. 
		Not: Kullanmadan önce 37 ° C ve % 5 CO 2 darbe ve chase orta equilibrated. 
		Not: darbe chase deneyler için bu hücreyi girmek ve onlar DNA çoğaltılıyor içine dahil edilebilir önce fosforile nükleozitler geçen süreyi dikkate almak önemlidir. Bu ampirik olarak belirlenmelidir. 
		Not: darbe chase deneyler çözünürlüğünü belirlemek için kullanılan deneysel koşullar altında viral çoğaltma oranını hesaplamak. Bu bir tek adım büyüme saat ders 26 sırasında viral genom kantitatif PCR tarafından belirlenebilir. 
		Not: Viral genom görüntüleme için adım 2'ye geçin ve viral genom arıtma için adım 3'e devam.</li>
	</ol></li></ol> 2. EdC görüntüleme etiketli DNA ( şekil 2A) Not: hücresel DNA deneyleri etiketli değildir doğrulamak için viral genom arıtma yöntemi ile tandem görüntüleme gerçekleştirmek yararlıdır. Görüntüleme etiketli vDNA doğası görselleştirmek için ve proteomik verileri doğrulamak için de kullanılabilir. Hücresel ve viral DNA desenleri boyama örnekleri şekil 3 ' te gösterilen.
<ol><li>Enfeksiyonlar taşımak ve EdC adım 1 kullanarak dışında gösterildiği gibi etiketleme coverslips büyüme orta 1 mL içeren bir 12-iyi doku kültürü tabak koşullara küçülttüm.</li>
	<li>1 mL % 3.7 hücrelerle düzeltme paraformaldehyde 1 x PBS RT., 15 dakika içinde Fiksasyon sonra durulama 2 x 1 mL % 3 BSA PBS ile hücreleri. 
	Dikkat: Paraformaldehyde kalıcı ya da ciddi yaralanmalara neden olabilir. Güvenlik önlemleri izleyin. 
	Not: Protokol burada durdu ve coverslips ikinci yıkamaya 4 ° c ilâ 3 gün saklanabilir için.</li>
	<li>Permeabilize 1 mL permeabilization arabellek içeren hücreleri [Tablo malzemeleri görmek] sallanan süre oda sıcaklığında 20 dk için.</li>
	<li>Durulama 1 mL % 3 BSA ve sonra oda sıcaklığında 30 dakika ile 1 mL % 3 BSA PBS içinde blok ile sallanan süre.</li>
	<li>Eklemek tıklayın tepki kokteyl 1 mL [Tablo malzemeleri görmek] kovalent Alexa Fluor 488 çekimlerine coverslips azid EdC için DNA etiketli. 30 dk için oda sıcaklığında sallanan süre kuluçkaya. Aspire edin ve durulama PBS ile iki kez 1 mL.</li>
	<li>Leke hücresel DNA ile sallanan süre bir 1:2,000 seyreltme Höchst içinde PBS, oda sıcaklığında 30 dk için 1 mL. Aspire edin ve durulama PBS ile iki kez 1 mL.</li>
	<li>Leke standartlarına göre birincil ve ikincil antikorlar ile dolaylı ayirt protokolleri 25. 
	Not: Etiketli vDNA ICP8, ICP4 veya UL42 ile colocalizes ve hücresel etiketli DNA ile Höchst leke colocalizes.</li>
	<li>Dağ coverslips slayta ve görüntü bir floresan mikroskop kullanarak hücreleri. 
	Not: Birkaç hafta için 4 ° C'de slaytlar depolanabilir.</li>
</ol> 3. VDNA ve ilişkili proteinler arıtma Not: Bu protokol çeşitli yönleri Leung ve ark. uyarlanmıştır 22 Not: tüm arabellekleri ve Kimyasalları kullanmadan önce buzda soğutulmuş ve tüm adımları buza aksi belirtilmedikçe yapılmalıdır.
<ol><li>Hasat çekirdeği. 
	Not: çekirdeklerin izolasyon önce formaldehit crosslink proteinler DNA için kullanılabilir. Daha sıkı yıkama koşulları daha sonra boncuk streptavidin kaplı üzerinde DNA arıtma sırasında kullanılabilir. CR içinSirbu vd. osslinking ve yıkama koşullara bakınız 21. <ol><li>20 mL çekirdek ayıklama arabellek (NF'leri) ile büyüme orta eski yerine koymak ve 4 ° C'de ara sıra sallanan ile 20 dk için kuluçkaya. Hücre çekirdeği içinde mikroskop görünür olacak.</li>
		<li>Çekirdeği kullanarak bir hücre sıyırıcı plaka scrape ve 50 mL konik tüp aktarmak. 2500 x g çekirdekleri cips, süpernatant atın için 4 ° c de 10 dakika santrifüj. 
		Not: mavi boyama çekirdeği hücrelerden yalıtım doğrulamak için kullanılabilir Trypan.</li>
		<li>Yavaşça 10 ml PBS, 15 mL konik tüp transferi nükleer Pelet çıkarmak ve cips 4 ° C. tamamen Kaldır PBS de 2500 x g, 10 dk centrifuging. 
		Not: Çekirdeklerin donmuş olabilir ve protokol bu noktada duraklatıldı. Bunu yapmak için yavaşça nükleer Pelet 500 resuspend buz gibi µL tampon ve bir etanol/kuru buz banyosu tüpte kuluçkaya. Çekirdeği-80 ° C'de dondurulmuş mağaza Kullanmadan, çekirdek, oda sıcaklığında erimek, hızlı bir şekilde aktarmak buz, 10 mL PBS, yavaşça karıştırın, 2500 x g 4 ° C'de 10 dakika aralıklarla tarafından cips için rock eklemek için ve tamamen PBS kaldırmak. Çekirdeği dondurma düşük verim neden olabilir.</li>
	</ol></li> <li>Kovalent eşlenik biotin azid EdC için etiketli vDNA.
	<ol><li>10 mL tıklayın tepki nükleer Pelet mix [Tablo malzemeleri görmek] yavaşça yukarı ve aşağı pipetting 5 kere ile 10 mL damlalıklı resuspend. 
		Not: Bu tıklayın tepki karışımda bulunan reaktifler belirtilen sıraya göre eklenir önemlidir.</li>
		<li>4 ° C'de 1 h için döndürme Döndürme sırasında hazırlamak ve arabellekleri B1, B2 ve B3 [bkz: Malzemeler tablo] chill.</li>
		<li>4 ° C. tamamen Kaldır'de 2500 x g, 10 dk centrifuging tarafından Pelet çekirdeği tepki karıştır'ı tıklatın ve yavaşça 10 mL PBS resuspending ve 4 de 2500 x g, 10 dk centrifuging Pelet yıkama ° C.</li>
		<li>Yavaşça 1 ml PBS nükleer Pelet ve transfer büyük pipet ucu kullanarak 1.5 mL microfuge Tube resuspend. Cips çekirdekler için 2.500 x 4 ° C. tamamen Kaldır PBS de g ve sıvı azot flaş donma, 10 dk centrifuging. 
		Not: Bu noktada protokol duraklatılmış ve donmuş çekirdeği saklanabilir sonraki lizis-80 ° C. donma çözülme yardımcı olur, dolayısıyla çekirdeklerin ne zaman adım 3.3 için aynı gün bile geçmeden dondurulmuş flaş önerilir.</li>
	</ol></li> <li>Çekirdeği lyse ve DNA parçası.
	<ol><li>Buz çekirdeği çözülme ve 500 µL arabellek B1 yukarı ve aşağı pipetting tarafından resuspend. 45 dakika süreyle buz üzerinde kuluçkaya</li>
		<li>Sonicate örnekleri 6 kere için 30 s her % 40 genlik 3 mm microtip sonda kullanarak. Buz 30 örnekleri yer s bakliyat arasında. Sonication sonra örnekleri görünmesi gereken açık, değil bulutlu. 
		Not: Sonication koşulları tek tek sonicators için optimize edilmelidir. Sonication koşulları optimize etmek ayrıntılı yönergeler için Leung ve ark. için başvurun 22.</li> <li>cips hücre artıkları 14.000 x g 4 ° C'de 10 dakika için de centrifuging tarafından Pelet boyutunu önemli ölçüde azaltmak gerekir. Süpernatant 100 µM hücre süzgeç aracılığıyla filtre ve aracılığıyla akış korumak.</li>
		<li>Ekle 500 µL arabellek B2 süzülmüş süpernatant. 900 µL Bu örnek için 3.4.2. adımda kullanılan.</li>
		<li>Bir aliquot DNA izolasyonu (50 µL veya 1/20 birim) için her durumun alıp 50 µL 2 x SDS-bikarbonat çözüm ekleyin [Tablo malzemeleri görmek]. DNA izolasyon Protokolü (Adım 3.6) devam.</li>
		<li>Her koşul giriş protein (50 µL veya 1/20 birim) için bir aliquot almak ve 50 µL 2 x Laemmli örnek arabellek eklemek, sıvı nitrojen içinde dondurmak ve depolamak-80 ° C. kullanımda adım 3.5.6.</li>
	</ol></li> <li>Bağlama biotinylated DNA streptavidin kaplı boncuklar.
	<ol><li>1.5 mL microfuge tüp boncuk Bulamaç 300 µL aktarma tarafından hazırlamak Streptavidin T1 manyetik boncuklar. Boncuk örnek başına bir tüp hazırlayın. Yıkama boncuk 3 x ile 1 mL arabellek B2 yanında vortexing resuspend, boncuk ayırmak için bir mıknatıs uygulamak ve yıkama arabellek aspirating. 
		Not: en yüksek düzeyde verim ve minimal arka plan bağlayıcı koşulları sonuç bağlama en iyi duruma getirilmiş. Deneysel Streptavidin T1 manyetik boncuklar özel boncuk yanı sıra diğer Streptavidin boncuk ve daha az arka plan bağlayıcı Streptavidin C1 boncuk daha önemli ölçüde daha fazla bir bağlama kapasitesine sahip olduğu belirlenmiştir ( şekil 4A ).</li>
		<li>Ekleyin 900 µL örnek adım 3.3.4. yıkanmış boncuk ve Döndür'ün gece saat 4'te ° C. 
		Not: örnek onlara eklendikten sonra girdap boncuk etmeyin. 
		Not: önemli miktarda DNA veya protein etiketlenmemiş negatif kontrol izole Eğer bu adım bir gecede 4 h için arka plan bağlayıcı azaltmak için azaltılabilir.</li>
	</ol></li> <li>Yıkama boncuk ve vDNA ve ilişkili proteinler elute. 
	Not: Bu filtre ipuçları için kalan adımları kullanmak için tavsiye edilir.
	<ol><li>Yer örnekleri süpernatant Kaldır, manyetik microfuge tüp raf içine yavaşça 1 ml arabellek B2, döndürme 4 ° C'de 5 dakika süreyle resuspend.</li>
		<li>Tekrarlama adım 3.5.1 üç kez.</li>
		<li>Örnekleri bir manyetik microfuge tüp raf içine yerleştirin, süpernatant kaldırmak, yavaşça 1 mL arabellek B3, resuspend ve 5 dakika süreyle 4 ° C'de döndürmek</li>
		<li>İlişkili DNA izolasyonu için yeni bir tüp transfer 100 µL boncuk karışıma (1/10 inci cilt). Bu tüp mıknatıs için geçerlidir, süpernatant kaldırmak, SDS-bikarbonat çözüm x 100 µL 1 boncuk resuspend ve DNA izolasyon Protokolü (Adım 3.6) devam.</li>
		<li>Kalan 900 µL boncuk karışımı adım 3.5.3 içeren tüp geçerlidir. mıknatıs için süpernatant kaldırmak ve protein ve DNA-protein kompleksleri elute için Laemmli örnek arabellek x 50 µL 2 boncuk resuspend.</li>
		<li>Kaynatın örnekleri 15 95 ° c min, girdap, hızlı spin microfuge ve mıknatıs uygulanır. Yeni tüp, flaş donma ve-80 mağazasında eluate transfer ° C. 
		Not: kullanım kap kilitleri tüpler pop sağlamak için süre kaynatma açın. 
		Not: Protokol bu noktada durdu ve örnekleri için birkaç hafta-80 ° C'de saklanabilir.</li>
		<li>Analiz protein örnekleri Coomassie mavi boyama, western Blot ya da Standart prosedürler 25 tarafından kütle spektrometresi. Temsilcisi-den sonuçlanmak göstermek şekil 4 ve şekil 5. 
		Not: protein verim için kütle spektrometresi yeterli olup olmadığını belirlemek için her örneğinin 7.5 µL analiz için Coomassie boyama mavi tarafından kullanılır ve Batı temsilcisi viral genom kurutma için 7,5 µL protein (ICP4, ICP8 veya UL42) ilişkili. Lysates adım 3.3.6 aynı hacmi. yanında giriş protein düzeyleri için denetime çalıştırılır. Kalan örnek (35 µL) sonra kitle tarafından analiz 25 daha önce açıklandığı gibi spektrometresi.</li>
	</ol></li> <li>DNA izolasyon <ol><li>adımları 3.3.5 örneklerinden kuluçkaya. ve 3.5.4. 65 ° c 4-16 h. çıkarmak için manyetik boncuklar, gerekirse örnek.</li>
		<li>Ayıklamak örnekleri ile 150 µL fenol: kloroform: izoamil alkol (PCI) ve sulu faz için yeni bir tüp transfer.</li>
		<li>100 µL ile kalan PCI ayıklamak Tris-EDTA (TE) ve sulu faz için yeni bir tüp ekleyin.</li>
		<li>Ayıklamak örnekleri ile 200 µL kloroform: izoamil alkol (24:1).</li>
		<li>Arındırmak PCR arıtma Kit üreticiye göre kullanarak sulu faz &#39; s protokolü. 
		Not: pH göstergesi arabellek PB ile örnek için eklendiğinde mor dönecek. 10 ve # eklemek181; L 3M NaOAc pH 5,0 örnek pH düşmesine.</li>
		<li>Bir yer kullanarak belirlemek DNA toplama. 
		Not: Bu protokol genellikle 100-400 ng boncuk bağlı DNA verir. Hiçbir DNA negatif kontrol içinde EdC değil eklendi adım 1. 3'eluate tespit edilmelidir.</li>
		<li>DNA'sı düşük bir DNA bağlamasında depolanan tüp 4 veya - 20 ° C ve gerçek zamanlı PCR veya yüksek işlem hacmi sıralama analizi için kullanılabilir.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKnipe%2C+DM+%22Fields+virology%22">Fields virology</a>. , 6th, Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins Health. (2013).</li>
<li>Engel, E. A., Song, R., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+biology+of+alpha+herpesviruses+with+MS-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Investigating the biology of alpha herpesviruses with MS-based proteomics.</a> Proteomics. 15, 1943-1956 (2015).</li>
<li>Wagner, L. M., DeLuca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+association+of+herpes+simplex+virus+ICP4+with+cellular+complexes+functioning+at+multiple+steps+in+PolII+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Temporal association of herpes simplex virus ICP4 with cellular complexes functioning at multiple steps in PolII transcription.</a> PloS One. 8, e78242(2013).</li>
<li>Taylor, T. J., Knipe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+of+herpes+simplex+virus+replication+compartments%3A+association+of+cellular+DNA+replication%2C+repair%2C+recombination%2C+and+chromatin+remodeling+proteins+with+ICP8%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Proteomics of herpes simplex virus replication compartments: association of cellular DNA replication, repair, recombination, and chromatin remodeling proteins with ICP8.</a> J Virol. 78, 5856-5866 (2004).</li>
<li>Fontaine-Rodriguez, E. C., Taylor, T. J., Olesky, M., Knipe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+of+herpes+simplex+virus+infected+cell+protein+27%3A+association+with+translation+initiation+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Proteomics of herpes simplex virus infected cell protein 27: association with translation initiation factors.</a> Virology. 330, 487-492 (2004).</li>
<li>Greco, T. M., Diner, B. A., Cristea, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Impact+of+Mass+Spectrometry-Based+Proteomics+on+Fundamental+Discoveries+in+Virology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Virol%22%5BJournal%5D)">The Impact of Mass Spectrometry-Based Proteomics on Fundamental Discoveries in Virology.</a> Annu Rev Virol. 1, 581-604 (2014).</li>
<li>Conwell, S. E., White, A. E., Harper, J. W., Knipe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+TRIM27+as+a+novel+degradation+target+of+herpes+simplex+virus+1+ICP0%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of TRIM27 as a novel degradation target of herpes simplex virus 1 ICP0.</a> J Virol. 89, 220-229 (2015).</li>
<li>Suk, H., Knipe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+the+herpes+simplex+virus+1+virion+protein+16+transactivator+protein+in+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of the herpes simplex virus 1 virion protein 16 transactivator protein in infected cells.</a> Proteomics. 15, 1957-1967 (2015).</li>
<li>Balasubramanian, N., Bai, P., Buchek, G., Korza, G., Weller, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+interaction+between+the+herpes+simplex+virus+type+1+exonuclease%2C+UL12%2C+and+the+DNA+double-strand+break-sensing+MRN+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Physical interaction between the herpes simplex virus type 1 exonuclease, UL12, and the DNA double-strand break-sensing MRN complex.</a> J Virol. 84, 12504-12514 (2010).</li>
<li>Sampath, P., Deluca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+ICP4%2C+TATA-binding+protein%2C+and+RNA+polymerase+II+to+herpes+simplex+virus+type+1+immediate-early%2C+early%2C+and+late+promoters+in+virus-infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Binding of ICP4, TATA-binding protein, and RNA polymerase II to herpes simplex virus type 1 immediate-early, early, and late promoters in virus-infected cells.</a> J Virol. 82, 2339-2349 (2008).</li>
<li>Amelio, A. L., McAnany, P. K., Bloom, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chromatin+insulator-like+element+in+the+herpes+simplex+virus+type+1+latency-associated+transcript+region+binds+CCCTC-binding+factor+and+displays+enhancer-blocking+and+silencing+activities%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A chromatin insulator-like element in the herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript region binds CCCTC-binding factor and displays enhancer-blocking and silencing activities.</a> J Virol. 80, 2358-2368 (2006).</li>
<li>Cliffe, A. R., Knipe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+ICP0+promotes+both+histone+removal+and+acetylation+on+viral+DNA+during+lytic+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus ICP0 promotes both histone removal and acetylation on viral DNA during lytic infection.</a> J Virol. 82, 12030-12038 (2008).</li>
<li>Herrera, F. J., Triezenberg, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VP16-dependent+association+of+chromatin-modifying+coactivators+and+underrepresentation+of+histones+at+immediate-early+gene+promoters+during+herpes+simplex+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">VP16-dependent association of chromatin-modifying coactivators and underrepresentation of histones at immediate-early gene promoters during herpes simplex virus infection.</a> J Virol. 78, 9689-9696 (2004).</li>
<li>Kent, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((During+lytic+infection+herpes+simplex+virus+type+1+is+associated+with+histones+bearing+modifications+that+correlate+with+active+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">During lytic infection herpes simplex virus type 1 is associated with histones bearing modifications that correlate with active transcription.</a> J Virol. 78, 10178-10186 (2004).</li>
<li>Oh, J., Fraser, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+association+of+the+herpes+simplex+virus+genome+with+histone+proteins+during+a+lytic+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Temporal association of the herpes simplex virus genome with histone proteins during a lytic infection.</a> J Virol. 82, 3530-3537 (2008).</li>
<li>Catez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSV-1+genome+subnuclear+positioning+and+associations+with+host-cell+PML-NBs+and+centromeres+regulate+LAT+locus+transcription+during+latency+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">HSV-1 genome subnuclear positioning and associations with host-cell PML-NBs and centromeres regulate LAT locus transcription during latency in neurons.</a> PLoS Pathog. 8, e1002852(2012).</li>
<li>Everett, R. D., Murray, J., Orr, A., Preston, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+type+1+genomes+are+associated+with+ND10+nuclear+substructures+in+quiescently+infected+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus type 1 genomes are associated with ND10 nuclear substructures in quiescently infected human fibroblasts.</a> J Virol. 81, 10991-11004 (2007).</li>
<li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+minimum+herpes+simplex+virus+type+1+components+necessary+to+localize+transcriptionally+active+DNA+to+ND10%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Determination of minimum herpes simplex virus type 1 components necessary to localize transcriptionally active DNA to ND10.</a> J Virol. 77, 5821-5828 (2003).</li>
<li>Ishov, A. M., Maul, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+periphery+of+nuclear+domain+10+%28ND10%29+as+site+of+DNA+virus+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The periphery of nuclear domain 10 (ND10) as site of DNA virus deposition.</a> J Cell Biol. 134, 815-826 (1996).</li>
<li>Maroui, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Latency+Entry+of+Herpes+Simplex+Virus+1+Is+Determined+by+the+Interaction+of+Its+Genome+with+the+Nuclear+Environment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Latency Entry of Herpes Simplex Virus 1 Is Determined by the Interaction of Its Genome with the Nuclear Environment.</a> PLoS Pathog. 12, e1005834(2016).</li>
<li>Sirbu, B. M., Couch, F. B., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+spatiotemporal+dynamics+of+proteins+at+replication+forks+and+in+assembled+chromatin+using+isolation+of+proteins+on+nascent+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Monitoring the spatiotemporal dynamics of proteins at replication forks and in assembled chromatin using isolation of proteins on nascent DNA.</a> Nat Protoc. 7, 594-605 (2012).</li>
<li>Leung, K. H., Abou El Hassan, M., Bremner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+efficient+method+to+purify+proteins+at+replication+forks+under+native+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">A rapid and efficient method to purify proteins at replication forks under native conditions.</a> BioTechniques. 55, 204-206 (2013).</li>
<li>Hobbs, W. E. 2nd, DeLuca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perturbation+of+cell+cycle+progression+and+cellular+gene+expression+as+a+function+of+herpes+simplex+virus+ICP0%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Perturbation of cell cycle progression and cellular gene expression as a function of herpes simplex virus ICP0.</a> J Virol. 73, 8245-8255 (1999).</li>
<li>Lomonte, P., Everett, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+type+1+immediate-early+protein+Vmw110+inhibits+progression+of+cells+through+mitosis+and+from+G%281%29+into+S+phase+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus type 1 immediate-early protein Vmw110 inhibits progression of cells through mitosis and from G(1) into S phase of the cell cycle.</a> J Virol. 73, 9456-9467 (1999).</li>
<li>Dembowski, J. A., DeLuca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+recruitment+of+nuclear+factors+to+productively+replicating+herpes+simplex+virus+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Selective recruitment of nuclear factors to productively replicating herpes simplex virus genomes.</a> PLoS Pathog. 11, e1004939(2015).</li>
<li>Dembowski, J. A., Dremel, S. E., DeLuca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-Coupled+Recruitment+of+Viral+and+Cellular+Factors+to+Herpes+Simplex+Virus+Type+1+Replication+Forks+for+the+Maintenance+and+Expression+of+Viral+Genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Replication-Coupled Recruitment of Viral and Cellular Factors to Herpes Simplex Virus Type 1 Replication Forks for the Maintenance and Expression of Viral Genomes.</a> PLoS Pathog. 13, e1006166(2017).</li>
<li>Bjornberg, O., Nyman, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dUTPases+from+herpes+simplex+virus+type+1+and+mouse+mammary+tumour+virus+are+less+specific+than+the+Escherichia+coli+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">The dUTPases from herpes simplex virus type 1 and mouse mammary tumour virus are less specific than the Escherichia coli enzyme.</a> J Gen Virol. 77 (Pt 12), 3107-3111 (1996).</li>
<li>Chiou, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-+and+protein-scission+activities+of+ascorbate+in+the+presence+of+copper+ion+and+a+copper-peptide+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">DNA- and protein-scission activities of ascorbate in the presence of copper ion and a copper-peptide complex.</a> J Biochem. 94, 1259-1267 (1983).</li>
<li>Kennedy, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+consequences+of+copper+complexes+used+to+catalyze+bioorthogonal+click+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Cellular consequences of copper complexes used to catalyze bioorthogonal click reactions.</a> J Am Chem Soc. 133, 17993-18001 (2011).</li>
<li>Snel, B., Lehmann, G., Bork, P., Huynen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STRING%3A+a+web-server+to+retrieve+and+display+the+repeatedly+occurring+neighbourhood+of+a+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">STRING: a web-server to retrieve and display the repeatedly occurring neighbourhood of a gene.</a> Nucleic Acids Res. 28, 3442-3444 (2000).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu iletişim kuralı, değilse dikkatle takip önemli ölçüde azaltılmış protein verim veya kirlenme hücresel DNA ile sonuçlanabilir birden çok adım içerir. Bu sabit hücre hücresel DNA etiketli saf ve değil emin olmak için tüm deneyler için kullanılır önemlidir. HSV-1 genomu sentez için hücresel DNA polimeraz kullanmaz çünkü bu hücresel DNA polimerazlar protein örnek yokluğunda tarafından onaylanabilir. EdC etiketleme ve çekirdekleri adımları hasat sırasında örnekleri her eşit işlenir emin olmak için sendeleyerek. Arıtma adım...

Virüs temel işlevlerini gerçekleştirecek ve bu nedenle enfeksiyon viral gen ekspresyonu, çoğaltma, tamir, Rekombinasyon ve ulaşım dahil olmak üzere önemli yönlerini kolaylaştırmak için ana bilgisayar etkenlere bağlı için sınırlı bir kapasiteye sahip. Bu ana faktörler faaliyetleri genellikle virally kodlanmış proteinler tarafından artar. Ayrıca, virüs algılama ve girişim tarafından hücresel yanıt için viral enfeksiyon kaçınmak gerekir. Bu nedenle, virüs ana etkileşimler enfeksiyon sonucu dikte. Büyük önem nasıl virüs viral işlemleri kolaylaştırmak için hücresel makine adapte hücresel ortamı alter anlaşılmasıdır. Özel ilgi hangi faktörler ve süreçleri viral genom bulaşıcı döngüsü boyunca hareket tespitidir.
Herpes simplex virüsü tip 1 (HSV-1) bir çift DNA virüs bulaşan insan nüfusunun önemli bir kısmı mahsur olduğunu. Enfeksiyonun ilk bir saat içinde nerede viral DNA (vDNA) çoğaltma1ile koordineli olarak viral gen ekspresyonu sıralı bir çağlayan ensues çekirdeği, viral genom girer. Çekirdek, genleri tabi epigenetik düzenleme, onarım ve rekombinasyon geçmesi ve öyle ki ilk döl virions 6 saat içinde üretilen capsids paketlenir. Viral genom ilişkili proteinler enfeksiyon seyri boyunca kapsamlı değerlendirme viral genom hareket ve hangi viral ve hücresel faktörler görmemizi sağlayacak süreçleri moleküler ayrıntılarını araştırmak için zemin enfeksiyon çeşitli aşamalarında yer alırlar.
Benzeşme arıtma ilişkili hücresel proteinler2,3,4,5 analizi için viral proteinlerin ana faktörler viral enfeksiyon katılan incelenmesi için önceki yöntemleri içerir , 6 , 7 , 8 , 9. bu deneyleri ana bilgisayar antiviral yanıt yanı sıra viral Kromatin değişiklik, gen ekspresyonu, enstrümantal hücresel faktörler katılan tanımlanması için edilmiş ve DNA tamir. Ancak, vDNA ilişkilendirmesiyle etkileşimleri bağlıdır ve proteomik yalnızca belirli bir viral faktör bir fonksiyonu olarak oluşan etkileşimleri içgörü sağlamak olup olmadığını tespit etmek zordur. Kromatin immunoprecipitation (ChIP) nerede belirli viral ve hücresel proteinler viral genom10,11,12,13,14 ' e bağlamak tanımlamak için kullanılan , 15 ve immunocytochemistry ile kombine floresan In situ hibridizasyon (balık) vDNA16,17,18ile, colocalize hücresel faktörler görselleştirme sağladı 19 , 20. bu deneyleri kayma ve temporal analiz için izin. Ancak, çok özel antikorlar, sınırlı hassasiyet ve virüs ana bilgisayar etkileşimleri önceki fikir ihtiyacını ihtiyacını sınırlamaları içerir. Bu nedenle bir yöntemi iPOND (yalıtım doğmakta olan DNA üzerinde proteinlerin)21 tarihinde göre geliştirilen ve seçmeli olarak etiket ve vDNA üzerinden arındırmak için aniPOND (hızlandırılmış yerli iPOND)22 viral genom tarafsız tanımlanması için hücreleri enfekte Kütle spektrometresi ile ilişkili proteinler. iPOND hücresel çoğaltma çatal dynamics soruşturma için vesile olmuştur.
Enfekte hücreleri üzerinden viral genom seçici arıtma için vDNA çoğaltılıyor modifiye ethynyl nükleozitler, 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (EdU) veya 5-ethynyl-2´-kovalent tarafından takip deoxycytidine (EdC) (Resim 1), taşır konjugasyon için biotin azid viral genom ve ilişkili proteinler streptavidin kaplı boncuk (şekil 2B) üzerinde tek adım arıtma kolaylaştırmak için kimya'ı tıklatın. Önemlisi, enfeksiyonlar hücresel DNA ikileşmesi belirli vDNA etiketleme etkinleştirmek için nişanlı değil sabit hücrelerde, devam etmektedir. Ayrıca, HSV-1 enfeksiyonu hücre döngüsü tutuklama nedenleri ve hücresel DNA çoğaltma23,24engeller. Virüs önce gelen viral genom (şekil 1A) ile ilişkili protein analizi için enfeksiyon prelabeled ya da yeni sentezlenmiş vDNA (şekil 1B) ile ilişkili protein analizi için DNA ikileşmesi sırasında etiketli 25. Ayrıca, nabız chase analiz doğa viral çoğaltma çatal (şekil 1 c)26ile ilişkili proteinlerin araştırmak için kullanılabilir. Buna ek olarak, vDNA ethynyl-modified kovalent protein dinamiği (şekil 2A ve şekil 3) kayma soruşturma için bir fluorophore için Birleşik. Görüntüleme vDNA doğrudan görselleştirme için sağlar ve vDNA-protein etkileşimleri doğrulama için ücretsiz bir yaklaşımdır ve viral genom enfeksiyon boyunca izlemek için adapte edilebilir. Biz bu yaklaşımlar daha da herpesviral enfeksiyon, gecikme süresi ve yeniden etkinleştirme, dahil olmak üzere herhangi bir yönünü çalışmaya ve diğer DNA virüsleri çalışmaya değiştirilebiliyordu tahmin. Ayrıca, 5-ethynyl üridin ile etiketleme (AB) RNA viral genom analizi için izin verebilir.

<table><tbody><tr><td>MRC-5 hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td> <td>Gibco</td><td>26140-179</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)</td> <td>Gibco</td><td>12800-082</td>% <td>10 FBS, 2 mM L-glutamin, 12 mM ile ikame edilmiş; (şişelerde büyüme için) veya 30 mM (bulaşıklarda büyüme için) sodyum-bikarbina</td></tr><tr><td>600 cm2 doku kültürü kabı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>166508</td><td></td></tr><tr><td>Tris Tamponlu Salin (TBS), pH 7.4</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Trisin</td></tr><tr><td>HSV-1 stoğu</td><td></td><td></td><td>1x109 PFU/mL'den büyük titrelere sahip stoklar en iyi</td></tr> <tr><td>sonucu verirSephadex G-25&nbsp; sütun (PD-10 Tuzdan Arındırma Sütunu)</td> <td>GE Healthcare</td><td>17085101</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>D128-1</td><td></td></tr><tr><td>5&akut;-Etinil-2&akut;-deoksisitidin (EdC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T511307</td><td>40 mM stok, alikot hazırlamak ve -20 °C'de saklamak için DMSO'da çözün; C&nbsp;</td></tr><tr><td>2 akut; - deoksisitidin (deoksiC)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D3897</td><td>40 mM stok hazırlamak için suda çözün, alikot yapın ve -20 ° C'de saklayın; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Nükleer Ekstraksiyon Tamponu (NEB)</td><td></td><td></td><td>Taze hazırlayın (20 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM Sükroz, %0.5 Igepal)</td></tr><tr><td>Hücre sıyırıcı</td><td>Bellco cam</td><td>7731-22000</td><td>Kullanmadan önce otoklav</td></tr><tr><td>Tripan mavisi çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.2 (10x)</td><td></td><td></td><td>1,37 mM NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na<alt>2</alt>HPO<alt>4</alt>, 18 mM KH<alt>2</alt>PO<alt>4</alt> (kullanmadan önce steril suda 1x'e seyreltin)</td></tr><tr><td>Bakır (II) sülfat pentahidrat (CuSO4-5H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C489</td><td>100 mM stok hazırlayın ve 4 °C'de saklayın; 1 aya kadar</td></tr> <tr><td>C (+) Sodyum L-askorbat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4034</td><td>Taze olarak 100 mM stok hazırlayın ve kullanana kadar buz üzerinde saklayın</td></tr><tr><td>Biotin azide</td><td>Invitrogen</td><td>B10184</td><td>DMSO, aliquot'ta 10 mM stok hazırlayın ve -20 °C'de saklayın; 1 yıla kadar C&nbsp;</td></tr><tr><td>Reaksiyon Karışımı'na</td><td></td><td></td> tıklayın <td>Belirtilen sırayla reaktifler ekleyerek kullanmadan hemen önce hazırlayın (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO<alt>4</alt>, 25 mL 10 mM Biotin Azide, 1 mL 100 mM sodyum askorbat)&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Komple Proteaz İnhibitörü Kokteyli</td><td>Roche</td><td>11697498001</td><td>50x stok hazırlamak için 1 mL suda çözün, 4 ° C'de saklayabilirsiniz; 1 haftaya kadar C veya doğrudan 50 mL tampona 1 hap ekleyin</td></tr><tr><td>Donma tamponu</td><td></td><td></td><td>Taze hazırlayın (7 mL %100 gliserol, 3 mL NEB, 200 & mu; L 50x proteaz inhibitörü)</td></tr><tr><td>Tampon B1</td><td></td><td></td><td>Taze hazırlayın (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, %1 Igepal, 1x proteaz inhibitörü)</td></tr><tr><td>Tampon B2</td><td></td><td></td><td>Taze hazırlayın (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, %0,5 Igepal, 1x proteaz inhibitörü)</td></tr><tr><td>Tampon B3</td><td></td><td></td><td>Taze hazırlayın (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x proteaz inhibitörü)</td></tr><tr><td>3 mm mikro uçlu prob ile donatılmış Vibra Cell Ultra Sonic Processer</td><td>Sonics</td><td>VCX 130</td><td></td></tr><tr><td>Hücre süzgeci</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>65601</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Mıknatıslı</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Mini Tüp Döndürücü</td><td>Fisher Scientific</td><td>260750F</td><td></td></tr><tr><td>2x Laemmli numune tamponu</td><td></td><td></td><td>400 mg SDS, 2 mL %100 gliserol, 1.25 mL 1 M Tris (pH 6.8) ve 10 mg bromofenol mavisini 8 mL suda karıştırın. 4&nbsp'de saklayın; &deg; 6 aya kadar C. Kullanmadan önce, 200 mM'lik bir son konsantrasyona 1 M DTT ekleyin.</td></tr><tr><td>1,5 mL tüp için kapak kilitleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9679153</td><td></td></tr><tr><td>Standart batı lekeleme reaktifleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NOVEX Kolloidal Mavi Boyama Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>LC6025</td><td></td></tr><tr><td>12 oyuklu doku kültürü kabı</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>Lameller</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-100</td><td>Kullanmadan</td></tr> <tr><td>önce otoklavMikroskop slaytları</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-552-5</td><td></td></tr><tr><td>%16 paraformaldehit</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>15710</td><td>Kullanmadan önce 1x PBS'de %3,7'ye seyreltin</td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1605</td><td>1x PBS'de %3 hazırlayın</td></tr><tr><td>Geçirgenlik tamponu (%0,5 Triton-X 100)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>1x PBS'de</td></tr> <tr><td>%0,5 Triton-X 100 hazırlayınClick reaksiyon kokteyli - Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Görüntüleme Kiti</td><td>Moleküler Problar</td><td>C10337</td><td>Üreticinin protokolüne göre hazırlayın</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td>Suda 10 mg / mL hazırlayın, 4 ° C'de saklanabilir; 1 yıla kadar C</td></tr><tr><td>Fare anti-ICP8 birincil antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab20194</td><td>1x PBS'de 1:200 seyreltme kullanın</td></tr><tr><td>Fare anti-UL42 birincil antikoru (2H4)</td><td>Abcam</td><td>ab19311</td> 1x PBS Keçi anti-fare 594 konjuge ikincil <td>antikorda 1:200 seyreltme kullanın</td></tr><tr><td></td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>a11005</td><td>1x PBS Bağışıklık montajlı Thermo Fisher Scientific 9990402'de 1:500 seyreltme kullanın</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x SDS-bikarbonat çözeltisi</td><td></td><td></td><td>%2 SDS, 200 mM NaHCO3</td></tr><tr><td>Fenol: kloroform: izoamil alkol</td><td></td><td></td><td>Kullanmadan en az 1 gün önce 25:24:1 karıştırın, 4 ° C'de saklayın; Karanlıkta C</td></tr><tr><td>kloroform: izoamil alkol</td><td></td><td></td><td>Kullanmadan en az 1 gün önce 24: 1 karıştırın, karanlıkta oda sıcaklığında</td></tr><tr><td>saklayın 10x Tris EDTA (TE), pH 8.0</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris, 10 mM EDTA (kullanmadan önce 1x'e seyreltin)</td></tr><tr><td>Qiaquick PCR saflaştırma kiti</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>3 M sodyum asetat pH 5.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kübit 2.0 Florometre</td><td>İnvitrojen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Test Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Qubit tahlil tüpleri</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Görüntüleme yazılımı</td><td></td><td></td><td></td>ile donatılmış floresan mikroskobu</tr><tr><td>1.5 mL tüpler</td><td></td><td></td><td></td>için mikrosantrifüj</tr><tr><td>15 ve 50 mL tüpler</td><td></td><td></td><td></td>için masa üstü santrifüj</tr><tr><td>Hücre kültür inkübatörü</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biyogüvenlik kabini</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isı blokları</td><td></td><td></td><td>65 ° C; C ve 95 & derece; Ç</td></tr></tbody></table>

teşhis edilmesi için kullanılan ilişkili viral ve hücresel proteinler viral dna'ın arıtma

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

Bu iletişim kuralı kimliği için enfekte hücreleri DNA'dan (HSV-1) ilişkili herpes simplex virüsü tip 1 yalıtmak için viral ve hücresel proteinler tarafından kütle spektrometresi hedefidir. Her ne kadar viral genom ile etkileşim proteinler enfeksiyon sonucu belirlemede önemli rol oynarlar, viral genom ilişkili proteinler kapsamlı bir analiz daha önce mümkün değildi. Burada biz HSV-1 genleri enfekte hücreleri doğrudan arıtma sağlayan bir yöntem göstermek. Viral DNA çoğaltılıyor seçerek bir ALKİN fonksiyonel grup içeren değiştirilmiş nükleotit ile etiketlenir. Etiketli DNA sonra özellikle ve geri dönüşümsüz tagged biotin azid bir bakır (I) ile kovalent eki ile-katalize azid ALKİN reaksiyon cycloaddition ya da tıklayın. Biotin öğesini DNA streptavidin kaplı boncuk saflaştırılmış ve ilişkili protein eluted ve kütle spektrometresi tarafından tanımlanan. Bu yöntem seçici hedefleme ve yalıtım HSV-1 çoğaltma çatal veya karmaşık biyolojik ortamlardan bütün genleri etkinleştirir. Ayrıca, bu yaklaşım adaptasyon herpesviral enfeksiyon, çeşitli yönlerinin yanı sıra diğer DNA virüsleri genleri incelenmesi incelenmesi için izin verir.

Tıklayın kimya kullanım hücrelerden DNA arıtma için iPOND yöntemi21tarafından ilk başarılı oldu. İPOND hücresel çoğaltma çatal ilişkili proteinlerin tanımlanması için arındırmak için amaçtır. Bu teknik özellikle enfeksiyon sırasında vDNA protein etkileşimleri çalışmaya adapte olması. EdC (şekil 1), ile viral genom eşitlenmiş enfeksiyonlar ile kombine etiketlemek için yaklaşım manipülasyon seçici yalıtım ve vDNA ayrı nüfus incelenmesi i...

Bu iletişim kuralı, özellikle etiket ve seçmeli olarak viral genom ilişkili proteinler karakterizasyonu için virüslü hücrelerinden viral DNA izole etmek için hedeftir.

Teşhis edilmesi için kullanılan ilişkili Viral ve hücresel proteinler Viral DNA'ın arıtma

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

Bu yöntemin genel amacı, viral genom ile ilişkili proteinlerin proteomik analizi için enfekte olmuş hücrelerden Herpes Simpleks virüsü tip bir DNA'yı saflaştırmaktır. Bu yöntem, hücresel faktörlerin ve Herpes virüsü enfeksiyonunun katılımı hakkında önemli bilgiler sağlar. Bu tekniğin temel avantajı, enfekte olmuş hücrelerden farklı viral DNA popülasyonlarını doğrudan saflaştırmak için uyarlanabilmesi ve enfeksiyonun birçok yönünün analizine izin vermesidir.Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı gibi MRC beş hücresinin kültürlenmesiyle başlayın. Ardından, HSV-1'i soğuk tris tamponlu salin veya TBS ile seyreltin. Aşağıdaki adımlar için, hücrelerin kurumasını önlemek için üfleyiciyi ve doku kültürü başlığını kapatmak önemlidir.Enfeksiyondan sonra hücrelere geri eklemek üzere büyüme ortamını MRC 5 hücrelerinden steril bir şişeye aktarmak için bir pipet kullanın. Hücrelere yedi mililitre seyreltilmiş virüs ekleyerek hücreleri enfekte edin. Hücreleri oda sıcaklığında bir saat boyunca her 10 dakikada bir sallayın.Emilimi takiben, innokulumu aspire edin, hücreleri 50 mililitre oda sıcaklığında TBS ile durulayın ve orijinal büyüme ortamını değiştirin. Daha sonra, hücreleri% 5 karbondioksit varlığında 37 santigrat derecede inkübe edin. Viral DNA replikasyonunun başlamasından sonra, enfeksiyondan yaklaşık dört saat sonra, replikasyon yapan viral DNA'yı etiketleyin.Bunu yapmak için, EdC'yi bir mililitre büyüme ortamında seyreltin ve iki ila dört saat boyunca enfekte olmuş hücrelerin hücre kültürü ortamına ekleyin. Çekirdekleri hasat etmek için, büyüme ortamını 20 mililitre çekirdek ekstraksiyon tamponu ile değiştirin ve ara sıra sallanarak dört santigrat derecede 20 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, bir hücre kazıyıcı kullanarak çekirdekleri plakadan kazıyın ve bunları buz üzerinde 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.Çekirdeği peletlemek için 2.500 x g ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeyi takiben, süpernatanı atın. Nükleer peleti 10 mililitre fosfat tampon salin veya PBS içinde yavaşça çıkarın ve 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.Ardından, numuneyi daha önce olduğu gibi santrifüjleyin. PBS'yi tamamen çıkardıktan sonra, 10 mililitrelik bir pipetle beş kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek nükleer peleti 10 mililitre tıklama reaksiyonu karışımında yeniden askıya alın. Çekirdeği daha önce olduğu gibi peletlemeden önce numuneyi dört santigrat derecede bir saat döndürün.Hızlı reaksiyon karışımını tamamen çıkarın, ardından peleti 10 mililitre PBS'de nazikçe yeniden süspanse ederek ve tekrar santrifüjleyerek yıkayın. Şimdi, nükleer peleti bir mililitre PBS'de dikkatlice yeniden askıya alın ve çözeltiyi 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Santrifüjlemenin ardından, PBS'yi tamamen çıkarın ve peleti sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun.Bu noktada pelet 80 santigrat derecede saklanabilir veya işleme devam edilebilir. Çekirdekleri parçalamak ve DNA'yı parçalamak için, çözülmüş çekirdekleri 500 mikrolitre Tampon B1'de yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin. Süspansiyonu 45 dakika buz üzerinde inkübe edin.Ardından, üç milimetrelik bir mikro uçlu prob kullanarak, numuneleri her biri% 40 genlikte 30 saniye boyunca altı kez sonikleştirin. Numuneleri darbeler arasında en az 30 saniye boyunca buzun üzerine yerleştirin. Sonikasyondan sonra, örnekler bulanık değil, net görünmelidir.Dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 14.000 x G'de santrifüjleyerek hücre kalıntılarını peletleyin. Pelet boyutu önemli ölçüde azalmalı, süpernatanı 100 mikronluk bir hücre süzgecinden filtrelemeli ve akışı korumalıdır. Ardından, filtrelenmiş süpernatanıma 500 mikrolitre Tampon B2 ekleyin.Biyotinile edilmiş DNA'yı streptavidin kaplı boncuklara bağlamak için, 300 mikrolitre boncuk bulamacını 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktararak streptavidin manyetik boncuklarını hazırlayın. Numune başına bir tüp boncuk hazırlayın. Boncukları mililitre Tampon B2 ile üç kez yıkayın, yeniden süspanse etmek için girdap yaparak, boncukları ayırmak için bir mıknatısa uygulayın ve yıkama tamponunu aspire edin.Ardından, yıkanmış boncuklara 900 mikrolitre numune ekleyin. Numunenin geri kalanı, giriş DNA'sı ve protein izolasyonu için kullanılacaktır. Süspansiyonu gece boyunca dört santigrat derecede döndürün.Ertesi gün, numuneleri manyetik bir mikrofüj tüp rafına yerleştirin ve süpernatanı çıkarın. Beş dakika boyunca dört santigrat derecede döndürmeden önce boncukları bir mililitre Tampon B2'de yavaşça yeniden askıya alın. Manyetik mikrofüj tüp rafını kullanarak süpernatanı tekrar çıkarın.Bu sefer, boncukları bir mililitrelik Tampon B3'te yavaşça yeniden askıya alın ve beş dakika boyunca dört santigrat derecede döndürün. Mıknatısı kullanarak süpernatanı boncuk karışımından çıkardıktan sonra, DNA protein komplekslerini ima etmek için boncukları 50 mikrolitre 2x Laemmli numune tamponunda yeniden süspanse edin. Daha sonra, numuneleri 95 santigrat derecede 15 dakika kaynatın.Numuneleri bir mikrofugede hızlı bir şekilde döndürmeden önce bir karışımı girdaplayın. Numuneleri mıknatısa uygulayın ve tahsisatı yeni bir tüpe aktarın. Son olarak, numuneleri hızlı dondurun ve 80 santigrat derecede saklayın.Metin protokolünde açıklandığı gibi protein analizi yapın. EdC etiketlemesi sıfır, 20, 40 veya 60 dakika boyunca gerçekleştirildi ve ardından viral DNA ve ilgili proteinlerin saflaştırılması izledi. Ayrıştırılan proteinler, viral DNA bağlayıcı proteinler, ICP4 ve UL42 için spesifik antikor ile coomassie mavisi boyamaya ve western blotlamaya tabi tutuldu.Ok, her koşulda mevcut olan elüsyon sırasında boncuklardan sıyrılan streptavidini gösterir. Bu yöntemle izole edilen proteinler daha sonra kütle spektrometresine tabi tutulur. Pasta grafiği, enfeksiyondan altı saat sonra genomlarda Herpes Simplex virüs tipi ile ilişkili olduğu tespit edilen her fonksiyonel kategorideki proteinlerin sayısını göstermektedir.Tanımlanan proteinler arasındaki protein-protein etkileşimlerine daha yakından bir bakış, dize fonksiyonel protein ilişkilendirme ağı veritabanı kullanılarak gerçekleştirildi. Sonuçlar, aynı biyolojik süreçte birlikte işlev gören proteinlerin alt komplekslerini ortaya koymaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, viral genomla ilişkili proteinlerin proteomik araştırması için viral DNA'nın enfekte olmuş hücrelerden nasıl saflaştırılacağını iyi anlamış olmalısınız.Bu teknik üç ila dört gün içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, numunelerin DNAse veya proteaz kontaminasyonunu önlemek için önlem almayı unutmamak önemlidir. Bu prosedüre ek olarak, EdC etiketli viral DNA'nın doğasını doğrulamak için immünofloresan gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.Bu teknik, Herpes virolojisi alanındaki araştırmacıların, konakçı proteinlerin ve viral enfeksiyonun işlevlerini keşfetmelerinin yolunu açmıştır.

purification-viral-dna-for-identification-associated-viral-cellular

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Influenza A virüsünün genomu sekiz ayrı kompleksleri, RNA ve protein olarak adlandırılan viral ribonükleoprotein kompleksleri (vRNPs) oluşur. Bu yazıda, gliserol degrade arıtma ve influenza A vRNPs transmisyon elektron mikroskobu görselleştirme açıklamaktadır.

İnfluenza A Viral ribonükleoprotein Kompleksleri saflaştırılması ve Görselleştirme

Biz enfekte hücrelerden yüksek saflıkta herpesvirus nucleocapsid DNA izole süreci tanımlamak. Çözüm yakalanan son DNA ideal, yüksek verimlilik sıralama, yüksek sadakat PCR reaksiyonlar, ve yeni virüs rekombinantlar üretmek için transfections için uygun, yüksek konsantrasyon ve saflık.

Nucleocapsids gelen Viral DNA hazırlanması

Tandem afinite saflaştırma proteinlerine bağlanma ortaklarının belirlenmesi için sağlam bir yaklaşımdır. Kavramı kanıtı olarak, bu metodoloji konak hücre faktörü için inisiyasyon dahil eş-tortu ile iyi karakterize çevirisi başlatma faktörü eIF4E uygulanmıştır. Bu yöntem, kolaylıkla bir hücre ya da viral proteini için uyarlanmıştır.

Tandem Affinity Arıtma kullanarak Protein etkileşim Ortaklar belirlenmesi

Tek Virüs Genomik (SVG) tek Virons en genom izole etmek ve yükseltmek için bir yöntemdir. Karışık malzeme grubuyla viral süspansiyonları böylece virion yakalama ve alt işleme sırasında genom kesme azaltarak, agaroz içeren ayrık kuyu ile bir mikroskop lamı üzerine akım sitometri kullanılarak sıralanır. Tüm genom amplifikasyonu sekanslama için uygun olan genomik malzeme ile sonuçlanan birden fazla yer değiştirme amplifikasyonu (MDA) kullanılarak elde edilir.

&#39;Tek Virüs Genomik&#39; kullanarak Tek viryonlar İzolasyonu ve Genom Analizi

Grip virüsleri konak hücre kromatin ile birlikte kendi RNA genomu çoğaltmak. Burada, enfekte olmuş hücrelerin kromatin gelen sağlam virüs ribonükleoprotein kompleksleri arındırmak için bir yöntem sunulmaktadır. Viral kompleksleri Arıtılmış sırasıyla, Western blot ve protein ve RNA içerikleri astar uzantısı hem de analiz edilebilir.

Enfekte Hücre Kromatin gelen Gribi ribonükleoprotein Komplekslerinin Affinity Arıtma

Örneğin, kistik fibroz hava yolunu kullanarak, el yazması bir hayvan ile ilişkili örneklerde mikrobik ve virüs toplulukları karakterize metagenomic ve metatranscriptomic yaklaşımların bir kombinasyonu içeren kapsamlı bir akışını göstermektedir.

Saf olmayan Arındırıcı: Sıralama Metagenomes ve Metatranscriptomes Kompleksi Hayvan ilişkili Örneklerinden

Adenovirüs (Ad) ile enfekte olmuş insan hücrelerinden viral replikasyon kompartmanlarını (RC) izole etmek için yeni bir strateji sunuyoruz. Bu yaklaşım, viral genom replikasyonunu ve ekspresyonunu düzenleyen moleküler mekanizmaların yanı sıra RC'de kurulan viral-konak etkileşimlerinin düzenlenmesine yardımcı olabilecek hücresiz bir sistemi temsil eder.

Adenovirüs ile enfekte Normal İnsan Hücreleri Viral Çoğaltma Bölme zenginleştirilmiş Alt nükleer Kesirler izolasyonu

Burada iki iplikçikli DNA genleri ile bitki virüsleri tanımlamak için yeni bir yaklaşım mevcut. DNA ve RNA virüslü yaprakları ayıklamak ve yeni nesil sıralama dışarı taşımak için standart yöntemleri kullanın. Bioinformatic araçları dizileri contigs monte, virüs genleri temsil eden contigs tanımlamak ve genleri taksonomik gruplara atamak.

Ham Virion ayıklama DNA analizi yeni virüs genleri keşfetmek için virüslü yaprakları gelen RNA analizi ile birleştirerek

Burada floresan görüntüleme yaklaşımı için bir protokol, D NA, RNA ve protein'in (MICDDRP) multiplex immunofloresan cell bazlı detectionu, viral protein ve farklı tip ve karaya oturmuş nükleik asitlerin eşzamanlı floresan tek hücreli görselleştirmesini yapabilen bir yöntemdir. Bu yaklaşım çok çeşitli sistemlere uygulanabilir.

Viral Nükleik Asitleri ve Proteinleri Görselleştirmek ve HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virüsü ve İnfluenza Enfeksiyonunu İzlemek için Tek Hücreli Çoklanmış Floresan Görüntüleme

Burada, antijen gösteren virüs benzeri parçacıklar (VLP'ler) üzerindeki nötralizasyon epitoplarını tespit etmek için bir protokol sunuyoruz. İnsan immün yetmezlik virüsünün (HIV) türevli VLP'lerin immün özürlülüğü, protein G-konjuge manyetik boncuklarla birleştirilmiş zarf glikoproteinlere özgü monoklonal antikorlar kullanılarak gerçekleştirilir. Yakalanan VLP'ler daha sonra viral çekirdek protein Gag spesifik antikorlar kullanan SDS-PAGE ve Batı blot analizine tabi tutulur.

Virüs Benzeri Parçacık (VLP) Tabanlı Aşılarda Bir Yakalama Tahlili Kullanılarak Görüntülenen Antijenlerde Nötralizasyona Duyarlı Epitopların Tespiti

Burada, anjiyotensin dönüştürücü enzim-2'ye bağlı manyetik mikroküreler tarafından yakalanan sağlam şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2 (SARS-CoV-2) viral partikülleri üzerinde iki benzersiz spike protein epitopunu aynı anda tespit etmek için çift raportörlü bir akış sitometrik sistemi kullanan yeni geliştirilmiş bir multipleks floresan immünolojik testi açıklıyoruz.

Viral Partiküller Üzerindeki Yüzey Protein Epitoplarının Multipleks Çift Raportör Stratejisi ile Profillenmesi

Öğrenin HSV-1 DNA'sını enfekte hücrelerden arıtma yöntemini ve viral genomla ilişkili proteinlerin proteomik analizini. Bu teknik, hücresel faktörlerin Herpes virüs enfeksiyonundaki rolüne dair önemli bilgiler sağlar.

Teşhis edilmesi için kullanılan ilişkili Viral ve hücresel proteinler Viral DNA'ın arıtma

Daha fazla video keşfet