Hedef hücre ön zenginleştirme ve tüm genom amplifikasyon tek hücre aşağı akım karakterizasyonu için

Yeniden elde etmek ve moleküler genetik karakterizasyon tek hücre düzeyinde bir karışımı nadir Hedef hücrelerden olmayan hedef arka plan hücrelerle hazırlamak protokolüdür. DNA kalitesi olmayan tedavi tek hücrelere eşittir ve (her iki tarama tabanlı ve analiz hedefli) tek hücreli uygulama için sağlar.

Bu prosedürün genel amacı, hücreleri tek hücre aşağı akış analizi için kullanılabilir hale getirmek için hücre süspansiyonundan izole etmektir. Bu yöntem, sıvı biyopsiler ve hücresel heterojenlik bağlamında temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tek hücrelerin antikor bazlı izolasyonuna ve tek hücre düzeyinde daha sonraki moleküler genetik analiz için geri kazanımlarına izin vermesidir.

Hastalarda kullanımı için onaylandıktan sonra, bu teknik kanser hastalarından dolaşımdaki tümör hücrelerinin karakterizasyonunu sağlayacaktır. Bu yöntem, tek hücreler arasındaki heterojenlik hakkında fikir verebildiğinden, kan örnekleri, hücre kültürlerinden alınan örnekler veya ilişkisiz doku ve organlar gibi alt popülasyonları içeren her türlü hücre süspansiyonuna uygulanabilir. Bu yöntem için ilk olarak, aşağı akış analizi amacıyla hücreleri serbest bırakma yeteneğine sahip olmayan bir in vivo zenginleştirme cihazı kullandığımızda aklımıza geldi.

Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü lazer mikrodiseksiyon veya mikromanipülasyon kullanılarak tek hücrelerin toplanması adımlarının başarılı bir şekilde gerçekleştirilmesi zordur, çünkü tek hücrelerin hasat edilmesi işlemi hücre kaybına eğilimlidir ve yüksek düzeyde uzmanlık gerektirir. Bir mililitre önceden ısıtılmış hücre kültürü ortamında, HT-29 CFSE etiketli hücreleri yeniden süspanse edin ve 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede yenilenmelerine izin verin. Hücreleri hasat etmek için 300 g'da üç dakika santrifüjleyin.

Daha sonra, hücre peletini bir mililitre kullanıma hazır Hoechst 33342 DNA boyama solüsyonunda 37 santigrat derecede 10 dakika boyunca yeniden süspanse edin. Daha sonra, hücre süspansiyonunu üç dakika boyunca 300 g'da santrifüjleyin. Ardından, süpernatanı atın ve hücre peletini dört mililitre 1X fosfat tamponlu salin içinde yeniden süspanse edin.

Ardından, bir hemositometre kullanarak hücre sayısını sayın ve floresan mikroskobu ile floresan etiketlemesini kontrol edin. Daha sonra, hücreleri üç dakika boyunca 300 g'da santrifüjleyin, süpernatanı atın ve peleti mililitre başına yaklaşık 500.000 hücrede yeniden süspanse edin ve hücreleri buzun üzerine yerleştirin. Beş mililitre periferik kanda, yaklaşık 500 ila 500.000 hücre ekleyin ve ardından tüpü ters çevirerek karıştırın.

Teli saklama bölmesinden çıkardıktan sonra, teli tutan lastik kapağı çıkarın ve teli 1X fosfat tamponlu tuzlu suda yıkayın ve tüpün kapağına monte edin. Daha sonra, tüpü oda sıcaklığında 30 dakika boyunca dakikada beş dönüşte eğimli bir silindirli karıştırıcı üzerinde inkübe edin. İnkübasyondan sonra, teli 1X fosfat tamponlu tuzlu suda üç kez durulayın.

Ardından, teli karanlıkta 1X fosfat tamponlu salin içeren 15 mililitrelik bir tüpte saklayın. Bir gres kalemi kullanarak bir cam slayt üzerine dikdörtgen bir alan çizin, ardından üzerine 500 mikrolitre 1X fosfat tamponlu tuzlu su ekleyin. Telin işlevsel kısmını 1X fosfat tamponlu tuzlu suya batırmak için, telin işlevsel olmayan kısmını bükün ve cam kızağın üzerine yerleştirin.

Yakalanan hücrelerin sayısını saymak için, telin her iki tarafını da görsel olarak inceleyin. İnceledikten sonra, teli 1X fosfat tamponlu tuzlu su ile 15 mililitrelik tüpe geri aktarın ve karanlıkta tutun. Bir mililitre 1X fosfat tamponlu tuzlu su içinde, dört miligram serbest bırakma tamponu bileşenini çözün, ardından kullanıma hazır tamponu elde etmek için çözeltiyi 0.2 mikrometre steril filtreden süzün.

Ardından, serbest bırakma tamponunu beş dakika boyunca 37 santigrat derecede ısıtın. Isıtıldıktan sonra, 1,5 mililitrelik bir reaksiyon tüpünü tamamen doldurmak için 1,6 mililitre serbest bırakma tamponu aktarın. Daha sonra, telin işlevsel kısmını serbest bırakma tamponunda 37 santigrat derecede bir su banyosunda 20 dakika inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, teli 15 dakika boyunca dakikada 500 dönüşte bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin. Daha sonra teli 300 g'da 10 dakika santrifüjleyin. Santrifüjleme bittiğinde, teli tüpten çıkarın, kapağı kapatın ve tüpü 10 dakika boyunca 300 g'da tekrar santrifüjleyin.

Hücre süspansiyonunun hacmini azaltmak için, mikromanipülasyon için 100 mikrolitre süpernatan veya sonraki sitosantrifüjleme ve lazer mikrodiseksiyon için 300 mikrolitre hariç hepsini atın. Ardından, hızlı bir şekilde tek hücreli örneklemeye geçin. Mikromanipülasyon için, 100 mikrolitre hücre süspansiyonunun tamamını bir cam slayt üzerine aktarın.

Ardından, cam slaytı bir mikromanipülatör ile donatılmış bir mikroskoba yerleştirin ve hücrelerin beş dakika boyunca oturmasına izin verin. Daha sonra, 0.2 mililitrelik PCR tüplerinde, iki mikrolitre hücre lizis ana karışımını pipetleyin ve buz üzerine aktarın. Bir mikrolitre 1X fosfat tamponlu salinde tek bir hücreyi toplamak için mikromanipülatörü kullanın.

Daha sonra, hücreyi doğrudan iki mikrolitre hücre lizis ana karışımına aktarın. Tüpün dibindeki sıvıyı toplamak için numuneleri üç saniye boyunca 2.000 g'da hızlı bir şekilde döndürmek için bir masaüstü mikrofüj kullanın. Ardından, numuneyi buz üzerine aktarın ve adaptör-bağlayıcı tabanlı tüm genom amplifikasyonuna geçin.

En fazla bir mikrolitre tampon kullanarak sadece bir hücreyi aspire edin. Hücreyi lizis çözeltisine aktarırken, çözeltiden çıkan kabarcıkları gördüğünüzden emin olun, bu da aspire edilen tüm hacmin aktarıldığını gösterir. Lazer mikrodiseksiyon için, 300 mikrolitre hücre süspansiyonunun tamamını beş dakika boyunca 300 g'da zar kaplı bir slayt üzerine sitosantrifüj edin.

Ardından, membran kaplı slaytı lazer mikrodiseksiyon yapabilen bir mikroskop üzerine yerleştirin. Daha sonra, 4.5 mikrolitre hücre lizis ana karışımını 0.2 mililitrelik PCR tüpünün kapağına pipetleyin. Kapağı numunenin üzerine yerleştirin ve lazer mikrodiseksiyon ile tek bir hücreyi hasat edin.

Hemen ardından, PCR kapağında izole edilmiş hücreleri kontrol edin, PCR tüpünü lazer mikrodiseksiyon mikroskobundan çıkarın ve tüpü kapatın. Kısa bir sıkma ile tüpün altındaki tüm sıvıyı toplayın. Numuneyi buz üzerine aktarın ve adaptör-bağlayıcı tabanlı tüm genom amplifikasyonuna geçin.

Lazer mikrodiseke hücreyi kurtardığınızdan emin olun. Bu nedenle, tüm tüp kapağının lizis çözeltisi ile kaplanması önemlidir. Mikrodiseksiyondan sonra, hücrenin varlığı için tüp kapağını kontrol edin.

CFSE ve Hoechst 33342 ile boyanan hücreleri göstermek için, tel şarj edilmeden önce, hücreler tele bağlanırken, daha sonra telden ayrılırken ve son olarak slayt üzerinde immünofloresan görüntüleme yapıldı. Hücrelerin şarjdan önceki immünofloresan görüntüleri mavi renkte parlak nükleik leke gösterirken, hücrelerin sitoplazması heterojen hücreler arası yoğunlukta yeşil CFSE boyası gösterir. Benzer boyama paterni, tele bağlı ve daha sonra ayrılan hücreler için de gözlenir.

Tüm genom amplifikasyon ürünlerinin kalitesini kontrol etmek için% 1'lik bir agaroz jeli çalıştırıldı. Agaroz jeli, tüm genom amplifikasyonunun PCR ürünleri için 0.2 ila 1 kilobazdan daha büyük bir DNA yayması gösterir. Tek hücreden elde edilen 4plex kalite kontrol PCR ürünleri 100, 200, 300 ve 400 baz çiftinden oluşan ürünler verir.

Üçten az bant gösteren ürünler daha fazla analizin dışında tutulur. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde gerçekleştirilirse, tek hücrelerin hücre süspansiyonlarından dört saat içinde izole edilmesine izin verir. Bu prosedürü denerken, özellikle hücrelere zarar vermemek için hücrelerin tele bağlı olduğu süre boyunca, hücreleri tampon içinde tutmayı unutmamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, kopya sayısı varyasyonlarına ve mutasyonlara dayalı olarak tek hücreleri karakterize etmek için alan karşılaştırmalı genomik hibridizasyon, yeni nesil dizileme ve hedefe özgü PCR gibi analiz yöntemleri gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, işlevselleştirilmiş bir tel kullanarak hücre süspansiyonlarından hücrelerin nasıl izole edileceğini ve kurtarılacağını ve çoklu aşağı akış moleküler genetik analizi için tek hücrelerin nasıl örnekleneceğini iyi anlamış olmalısınız. İnsan kanı ile çalışmanın enfeksiyon olasılığı oluşturduğunu unutmayın, bu nedenle bu işlemi gerçekleştirirken eldiven ve laboratuvar önlüğü giymek zorunludur.