Name: Hedef hücre ön zenginleştirme ve tüm genom amplifikasyon tek hücre aşağı akım karakterizasyonu için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Öğrenin, nadir hedef hücreleri izole etmek ve tek hücre düzeyinde moleküler genetik analiz için hazırlamak üzere antikor temelli izolasyon ve tüm genom amplifikasyon yöntemlerini. Bu teknik, dolaşımdaki tümör hücrelerinin karakterizasyonunda kanser araştırmaları için kritik öneme sahiptir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışmada Avusturyalı Bilim Fonu (FWF tarafından), proje no finanse edildi. Ben 1220-B19 içinde translasyonel kanser araştırma (TRANSCAN) "Circulating tümör hücreleri biyomarker prostat kanseri (CTC-tarama) Minimal rezidüel hastalığı olarak" ERANET projenin parçası olarak (PS için). Doktora adayı S.C. doktora programı moleküler tıp tıbbi Graz Üniversitesi çerçevesinde eğitim gördü. Yazarlar uzman teknik yardım minnetle Nina Schlögl, Daniel Kummer, Gabi Wendt, Claudia Chudak, Julia Schulz ve Johanna Schiller kabul edersiniz. Yazarlar Georg Peinhaupt grafik tasarım destek için teşekkür ederiz.

<ol><li>Saucedo-Zeni, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+in+vivo+isolation+of+circulating+tumor+cells+from+peripheral+blood+of+cancer+patients+using+a+functionalized+and+structured+medical+wire%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Oncol%22%5BJournal%5D)">A novel method for the in vivo isolation of circulating tumor cells from peripheral blood of cancer patients using a functionalized and structured medical wire.</a> Int J Oncol. 41 (4), 1241-1250 (2012).</li>
<li>Gorges, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+and+Molecular+Characterization+of+Tumor+Cells+in+Lung+Cancer+Patients+Using+a+Novel+In+Vivo+Device+for+Capturing+Circulating+Tumor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Enumeration and Molecular Characterization of Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Novel In Vivo Device for Capturing Circulating Tumor Cells.</a> Clin Cancer Res. 22 (9), 2197-2206 (2016).</li>
<li>Kuske, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+detection+of+circulating+tumor+cells+in+non-metastatic+high-risk+prostate+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep-UK%22%5BJournal%5D)">Improved detection of circulating tumor cells in non-metastatic high-risk prostate cancer patients.</a> Sci Rep-UK. 6 (1), (2016).</li>
<li>van Beers, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplex+PCR+predictor+for+aCGH+success+of+FFPE+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Brit+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">A multiplex PCR predictor for aCGH success of FFPE samples.</a> Brit J Cancer. 94 (2), 333-337 (2006).</li>
<li>El-Heliebi, A., Chen, S., Kroneis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Multiplex+PCR+for+Assessing+the+Quality+of+Whole+Genome+Amplified+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Using Multiplex PCR for Assessing the Quality of Whole Genome Amplified DNA.</a> Methods Mol Biol. 1347, 119-128 (2015).</li>
<li>Möhlendick, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Robust+Method+to+Analyze+Copy+Number+Alterations+of+Less+than+100+kb+in+Single+Cells+Using+Oligonucleotide+Array+CGH%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Robust Method to Analyze Copy Number Alterations of Less than 100 kb in Single Cells Using Oligonucleotide Array CGH.</a> PLoS ONE. 8 (6), e67031(2013).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catch+and+Release%3A+rare+cell+analysis+from+a+functionalised+medical+wire%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep-UK%22%5BJournal%5D)">Catch and Release: rare cell analysis from a functionalised medical wire.</a> Sci Rep-UK. 7, 43424(2017).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+and+molecular+characterization+of+circulating+tumor+cell+using+an+in+vivo+capture+system+in+squamous+cell+carcinoma+of+head+and+neck%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+J+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Enumeration and molecular characterization of circulating tumor cell using an in vivo capture system in squamous cell carcinoma of head and neck.</a> Chin J Cancer Res. 29 (3), 196-203 (2017).</li>
<li>Carter, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+circulating+tumor+cells+identifies+distinct+copy-number+profiles+in+patients+with+chemosensitive+and+chemorefractory+small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of circulating tumor cells identifies distinct copy-number profiles in patients with chemosensitive and chemorefractory small-cell lung cancer.</a> Nat Med. 23 (1), 114-119 (2017).</li>
<li>Luca, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+analysis+of+single+circulating+tumor+cells+by+next+generation+sequencing+in+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Mutational analysis of single circulating tumor cells by next generation sequencing in metastatic breast cancer.</a> Oncotarget. , (2016).</li>
<li>Aravanis, A. M., Lee, M., Klausner, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-Generation+Sequencing+of+Circulating+Tumor+DNA+for+Early+Cancer+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Next-Generation Sequencing of Circulating Tumor DNA for Early Cancer Detection.</a> Cell. 168 (4), 571-574 (2017).</li>
<li>Page, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+Generation+Sequencing+of+Circulating+Cell-Free+DNA+for+Evaluating+Mutations+and+Gene+Amplification+in+Metastatic+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Next Generation Sequencing of Circulating Cell-Free DNA for Evaluating Mutations and Gene Amplification in Metastatic Breast Cancer.</a> Clin Chem. 63 (2), 532-541 (2017).</li>
<li>Kalinich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA-based+signature+enables+high+specificity+detection+of+circulating+tumor+cells+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">An RNA-based signature enables high specificity detection of circulating tumor cells in hepatocellular carcinoma.</a> P Natl Acad Sci USA. 114 (5), 1123-1128 (2017).</li>
<li>Gorges, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accession+of+Tumor+Heterogeneity+by+Multiplex+Transcriptome+Profiling+of+Single+Circulating+Tumor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Accession of Tumor Heterogeneity by Multiplex Transcriptome Profiling of Single Circulating Tumor Cells.</a> Clin Chem. 62 (11), 1504-1515 (2016).</li>
<li>Sinkala, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+protein+expression+in+circulating+tumour+cells+using+microfluidic+western+blotting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Profiling protein expression in circulating tumour cells using microfluidic western blotting.</a> Nat Commun. 8, 14622(2017).</li>
<li>Morrow, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumourigenic+non-small-cell+lung+cancer+mesenchymal+circulating+tumour+cells%3A+a+clinical+case+study%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Tumourigenic non-small-cell lung cancer mesenchymal circulating tumour cells: a clinical case study.</a> Ann Oncol. 27 (6), 1155-1160 (2016).</li>
<li>Williamson, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasculogenic+mimicry+in+small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Vasculogenic mimicry in small cell lung cancer.</a> Nat Commun. 7, 13322(2016).</li>
<li>Czyż, Z. T., Stoecklein, N. H., Polzer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Microdissection+of+FFPE+Tissue+Areas+and+Subsequent+Whole+Genome+Amplification+by+Ampli1TM%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Laser Microdissection of FFPE Tissue Areas and Subsequent Whole Genome Amplification by Ampli1TM.</a> Methods Mol Biol. 1347, 141-162 (2015).</li>
<li>Czyż, Z. T., Klein, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deterministic+Whole-Genome+Amplification+of+Single+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Deterministic Whole-Genome Amplification of Single Cells.</a> Methods Mol Biol. 1347, 69-86 (2015).</li>
<li>Kroneis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+retrieval+of+single+microchimeric+cells+and+verification+of+identity+by+on-chip+multiplex+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Automatic retrieval of single microchimeric cells and verification of identity by on-chip multiplex PCR.</a> J Cell Mol Med. 14 (4), 954-969 (2010).</li>
<li>Kroneis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+Molecular+Genetic+and+Cytogenetic+Analysis+from+Single+Cells+after+Isothermal+Whole-Genome+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Combined Molecular Genetic and Cytogenetic Analysis from Single Cells after Isothermal Whole-Genome Amplification.</a> Clin Chem. 57 (7), 1032-1041 (2011).</li>
<li>Kroneis, T., Jonasson, E., Andersson, D., Dolatabadi, S., Ståhlberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+preamplification+simplifies+targeted+mRNA+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep-UK%22%5BJournal%5D)">Global preamplification simplifies targeted mRNA quantification.</a> Sci Rep-UK. 7, 45219(2017).</li>
<li>Picelli, S., Faridani, O. R., Bjorklund, A. K., Winberg, G., Sagasser, S., Sandberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nat Protoc. 9 (1), 171-181 (2014).</li>
<li>El-Heliebi, A., Heitzer, E., Kroneis, T., Chen, S., Haudum, C., Fuchs, J. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-319-53661-3_12">Potential and Challenges of Liquid Biopsies.</a> Mechanisms of Molecular Carcinogenesis. 2, 233-261 (2017).</li>
<li>Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24556840">Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (3), 178-196 (2014).</li>
<li>Ferreira, M. M., Ramani, V. C., Jeffrey, S. S. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S157478911600017X">Circulating tumor cell technologies.</a> Mol Oncol. 10 (3), 374-394 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Açıklanan Protokolü (aygıtı olarak adlandırılır) bir functionalized tel ex vivo tek hücreli genom analizi için hücreleri almak amaçlamaktadır. Biz üç EpCAM pozitif hücre hatları (HT-29, LNCaP ve VCaP) test, ama prensip olarak, bu yöntem EpCAM ifade herhangi bir hücre kültürünü uygulanabilir. EpCAM pozitif hedef hücreler için aygıtı saf hücre süspansiyon olarak sunulan (2.1 bkz.) veya karma bir fazlalık arka plan hücre içine (e.g. periferik kan, 2.2 bkz.). Özellikle ikinci yalıtım kapasiteleri nadir hücre koşullar altında test etmek için kullanılabilir, ancak, kabloya bağlı hücre sayısı ince ayar yapılabilir açıklanan düşük hacimli kullanarak yaklaşım (2.3 bkz.). Hücre hatları arasındaki farklar beklenen gibi Tel, rotasyon şarj etmek için uygun hücre yoğunluğu kuluçka süresi bir ayirt mikroskop kullanarak bağlı hücre sayısı değerlendirerek ampirik olarak test edilmesi gerektiği de hız.
Tek hücre düzeyinde WGA genomik aşağı akım uygulamaları için gereklidir. WGA yönteminin seçimi labs arasında farklı olabilir ve prensip olarak, bizim yöntem Embriyolardan veya lazer mikrodiseksiyon elde edilen örnekler işleyebileceğinden daha bütün yöntemler açıktır. Bu protokol için bir ısı-parçalanma temel WGA7kıyasla daha iyi bir performans nedeniyle enzimatik parçalanmış DNA esas alarak bir yöntemini kullanın. İsteğe bağlı, tek hücre izotermal WGA için sonraki DNA20,21profil oluşturma izin iletilebilir.
Açıklanan protokol functionalized teller yeni nesil genomik tek hücre analizi için bağlı sonra sağlam hücreleri kurtarma amaçlamaktadır. Aynı zamanda yalnızca CE onaylı vivo içinde zenginleştirme cihazlar piyasada defa temsil, functionalized teller ilk nesil metastas kanserli hastalarda CTCs numaralandırmak için kullanılmıştır. Önceki yayın ve kendi veri geçerli altın standart teknoloji2ile karşılaştırıldığında daha duyarlı olması için in vivo yalıtım tekniği öneririz. Böylece, belgili tanımlık aygıt içinde fark gibi bu vivo içinde yalıtım teknik bir kurtarma özelliği ile donatılması karakterizasyonu tek hücre düzeyinde yüksek CTC kurtarma birleştirme sağlar.
Ancak, aygıt hastalarda kullanım için temizlenmez, böylece, klinik veri mevcut değildir. Ex vivo uygulamalar (Yani CTCs periferik kan örnekleme sonra izole) teknoloji boşuna (olasılığını artırma ile kübital boşuna, örneğin düşük çap mevcut ayarları adapte olduğu gibi tavsiye edilmez CTCs ve alıcı antikor arasındaki temas doğrudan) ve uzun tutma zamanı (30 dk, kan için 2-3 tel geçmek L izin). Ancak, Seviyelendirilmiş içinde bölüm olarak 2.2. hedef hücreleri de karma örnekleri7' den ayrılmış olabilir.
Bir geçerli yöntem sabitlenmemiş hücrelerin verimsiz kurtarma dekolmanı teller üzerinden sonra kısıtlamasıdır. Bu, ancak, dekolmanı tedavi öncesinde bir hücre fiksasyon adım tarafından geliştirilmiş.
Özet olarak, bu iletişim kuralı genetik olarak karakterize tek hücre için hücre kurtarma bir vivo içinde yalıtım tekniği kombine kullanımı ilk adımdır. Daha fazla çaba hücre kurtarma ve izin kendi uygulamasında hasta1,2için en iyi duruma getirme adresi gerekir. Ancak, tedavi izleme ve tedavi kararları için kişiselleştirilmiş tıp CTCs numaralandırma olduğunu. Böylece, bu yöntem genomik CTC karakterizasyonu tek hücre düzeyinde doğru bir ilk adımdır.
Sağlam hücre hasat gibi tek hücreli transcriptome analiz doğru uygulamalar mümkün gibi görünüyor. Ancak, bu kurtarma yordamı RNA bütünlüğü (doğrudan lizis RT-qPCR22tarafından takip kurtarılan tek hücrelere iletmeörneğin ) etkiler olup olmadığını tespit edilebilir kalır. Eğer başarılı olursa, tek hücreleri (örneğin CTCs) karakterizasyonu daha detaylı analizler izin transcriptome seviyeye kaymıştır. Bu konuda, RNA-seq akıllı-seq2 kullanarak değerli bir araç (RNA-seq Kütüphane hazırlık sırasında elde edilen) preamplified cDNA kantitatif PCR için tabi olarak kadar RNA tek hücreleri aşağı akım analizi için sağlar. Bu bir kombine hedef ve tarama tabanlı analiz tek kurtarılan hücreleri22,23sağlayacaktır.
Geçerli functionalized teller CTCs24pozitif seçim için yaygın olarak kullanılan bir epitel belirtecidir anti-EpCAM antikorlar temel alır. Birkaç CTCs cytokeratins veya EpCAM25gibi tümleyici epitel işaretleri kadar antikor gibi HER2/yeni ekleme CTC yalıtım şansını artırmak. Birkaç antikor stratejiler geliştirdi ve Ferreira ve arktarafından gözden zenginleştirme dayalı. 2016 yılında26. Bir tel üzerinde immobilize antikorlar karışımı daha yüksek bir sayı yalıtım ve ek alt türlerinden CTCs önde gelen teknoloji gelecekte bir gelişme olabilir.
Bu çözümde işlevselliğini korumak için su altında tel fonksiyonel tutmam için işleme tel içeren tüm adımları için zorunludur. Tel 1 x PBS değerlendirme sırasında (mikroskop; yerleştirmek için tavsiye e.g. 3.1 adımlar. -3.3.) ve depolama. Uygunsuz boyama önlemek için taze kullanılarak hazırlanan boyama çözüm adımları 1.2.1 öneririz. ve 1.2.2. Zayıf lekeli hücreleri cep tel üzerinde sayma engel ve ekli hücreleri küçümseme için yol açabilir.
Pasteur pipet kauçuk kapaklı tel Pasteur pipet sonraki yükleme hücre süspansiyon (Adım 2.3.4.) eklerken takmayı önlemek gereklidir. Kauçuk kapak böylece fonksiyonel bölümü Pasteur pipet ucu içinde yer alan Tel tutmak için kullanılır. Kap için Pasteur pipet arka çok sıkıca bağlıysa, hücre süspansiyon yüklenmesini mümkün değildir. Bu durumda, öyle ki dolu hücre süspansiyon tarafından zorla göç ettirilmiş havada pipet bırakabilirsiniz kap kolaylaştırmak.
Tel bükme yönünü sırasında adımları 3.2 sayma hücre için çok önemlidir. ve 3,3. Öyle ki bir yana yatmak tel işlevsel olmayan sonu geliyor yapışkan bant kullanarak Tel bağlayın. Fonksiyonel Bölümü'nün tüm uzunluğu taramadan sonra diğer yarısı fonksiyonel tel taranabilir böylece tel 180 ° döndürülür. Bu adım hücreleri tel üzerinde değerlendirmek İlk deneyler için önemlidir. Hücreleri belirli bir hücre kültürünü ve yordam için değerlendirilir sonra yordamı Hücre sayımı olmadan tekrar edilebilir (örn. sadece hücrelerin varlığı için kontrol veya bu adım atlama). Dikkatli pipetting süpernatant adım 4,8 hacmi azaltarak hücre kaybı önlemek çok önemlidir. Sorunsuz turbulences Pelet için neden olmadan yapılır pipetting emin olun.

Son zamanlarda, CellCollector DC01, kanser hastaları, periferik kandan CTCs izole için anti-EpCAM antikorlar ile functionalized bir tıbbi tel CTC numaralandırma1,2,3 metodik spektrum eklendi . Sigara metastatik prostat kanseri şu anda devam eden bir çalışmada, bu functionalized Tel neredeyse iki katı kadar hastalar CTC-pozitif raporları ve CTC-pozitif hastaların CellSearch, CTC numaralandırma3 altın standart kıyasla daha yüksek CTC sayar . Bu cesaret verici performans nedeniyle yalıtım functionalized tıbbi dinleme cihazı tek hücre analizi için hücre arzu olurdu ama ne hücre dekolmanı Çözümleri (örneğin tripsin) ile enzimatik tedavi ne lazer mikrodiseksiyon sağlar sağlam hücreleri (veri gösterilmez) kurtarma.
Yakalanan hücre dekolmanı izin vermek için yeni nesil functionalized teller belirli bir polimer ile donatılmıştı. Tel yakalama antikorları bağlayan bu polimer, duyarlı bir yayın arabellek tedavi dekolmanı sağlam hücre (CellCollector DC03 için aygıtı olarak da adlandırılır) izin olduğunu. Yeni functionalized aygıt, hedef hücre kanser hücre satır hücrelerini sığır serum albumin (BSA) çivili çeşitli konsantrasyonları yalıtım sağlar / fosfat tamponlu tuz (PBS) ve periferik kan, anılan sıraya göre.
Üstünde belgili tanımlık aygıt ve kurtarma sonra hücre görsel algılama kolaylaştırmak için hedef kanser hücrelerinin carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) ve kurtarma tedavi öncesi bir DNA leke etiketli (i.e. şarj ve ayırma). Tek hücre DNA kalitesi üzerinde tedavi etkileri sonra WGA bir kalite kontrol PCR4,5aracılığıyla, dizi-CGH6,7 daha önce değerlendirildi ve sıralama7 fark gösterilen hedef tedavi olmayan hücreleri micromanipulated için hücre süspansiyonlar7karşılaştırıldığında. Bu yöntemin avantajı hücreleri tek hücre aşağı akım analizi (şekil 1) için kurtarma ve nadir hedef hücre ön zenginleştirme kombinasyonu yatıyor. Geçerli CE etiketli vivo koleksiyonu aygıtı genellikle CTCs numaralandırılmasına için değil tek hücreli moleküler karakterizasyonu2,8için kullanılır. Ancak, CTCs arasında heterojenite araştırmak için daha kapsamlı bir analiz analizi tek hücre düzeyinde (hedefYani sıralama tek hücre düzeyinde) için uzun. Diğer hücre tabanlı yöntemleri immunomagnetic yalıtım EpCAM pozitif CTCs ve daha sonraki moleküler genetik analiz9,10dielectrophoresis göre tek hücreli işleme, temel alır. CTCs moleküler karakterizasyonu bir klinik ortamda yararlı uygulamaları için önemli bir gereksinimdir ve metastatik cascade temel araştırmada aynı derecede önemlidir. DNA analizi ile en az teknik yalıtım yordamlar11,12tümör yükünün izin verdiği için CTCs paralel olarak büyük önem dolaşımdaki tümör DNA (ctDNA) haline gelmiştir. Hücre tabanlı yaklaşımlar tamamlayıcı bir katkı olarak hizmet verebilir, RNA13,14 ve protein15 ifade analizi için izin verdiği ve CTC için hücre kültürleri veya xenografts16, da elde 17. her ne kadar düşük hücre kurtarma ve hastalarda kullanım için izin gibi engeller hala aşılması gereken, yakalamak ve yöntem serbest nadir hedef hücrelerin karakterizasyonu doğru önemli bir sonraki adım alır.

<table><tbody><tr><td>Gilupi Serbest Bırakma Tamponu</td><td>Gilupi</td><td>GIL083</td><td>Telden hücreleri ayırmak için kullanılır</td></tr><tr><td>McCoy's 5A Medium (1x) suppl. L-Glutamin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16600-082</td> ile <td>HT-29 hücreleri için kullanılan kültür ortamı, kültür ortamını deneyler için kullanılan hücre hattına uyarlayın</td></tr><tr><td>HEPES Tampon Çözeltisi (1 M)</td><td>PAA</td><td>S11-001</td><td>McCoy's 5A Ortamı</td></tr> <tr><td>için EkFetal Sığır Serumu Altın</td><td>PAA</td><td>A15-151</td><td>McCoy's 5a Modifiye Orta</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (100x)</td> için Takviye <td>Biowest</td><td>L0018-100</td><td>McCoy's 5a Modifiye</td></tr> Orta <tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (1x PBS)</td> için <td>Takviye Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-015</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Biowest</td><td>L0950-100</td><td>Hücre ayrılma çözeltisi (hücre kültürü)</td></tr><tr><td>Su banyosu</td><td>GFL</td><td>Tip 1003</td><td>Ön ısıtma çözeltileri için kullanılır</td></tr><tr><td>İnkübatör</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Hücreleri inkübe etmek için kullanılır (hücre kültürü)</td></tr><tr><td>50 mL reaksiyon tüpleri</td><td>VWR</td><td>525-0403</td><td></td></tr><tr><td>Silindir karıştırıcı</td><td>Stuart Scientific</td><td>SRT6D</td><td>Hücrelerin çökelmesini önlerken hücreleri tele bağlamak için kullanılır</td></tr><tr><td>CellTrace CFSE Hücre Proliferasyonu Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C34554</td><td>Canlı hücreleri etiketlemek için kullanılır (sitoplazmik etiket)</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>H3570</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>DNA'yı boyamak için kullanılır (nükleik karşı boyama)</td></tr><tr><td>Santrifüj (15 mL ve 50 mL reaksiyon tüplerini tutmak için donatılmıştır)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Heraeus Megafuge 40R</td><td>Hücreleri peletlemek için kullanılır</td></tr><tr><td>Observer Z1 (Floresan/lazer mikrodiseksiyon mikroskobu)</td> Lazer mikrodiseksiyon yapabilen <td>Carl Zeiss Mikrogörüntüleme</td><td></td><td>İnverted (immünofloresan) mikroskobu; Floresan mikroskopları Hoechst 33342 (DAPI filtresi) ve CFSE (FITC filtresi) algılayabilmelidir</td></tr> <tr><td>Sığır Serum Albümini (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-50G</td><td>Cam / plastik yüzeyleri kaplamak için kullanılır</td></tr><tr><td>MS1 Minishaker</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z404039</td> Vacutainer EDTA (veya Na-heparin) tüplerini <td>girdaplamak için kullanılır</td></tr><tr><td></td><td>BD</td><td>366450 (veya 366480)</td> Hedef <td>hücrelerin ex vivo yakalanması için reaksiyon tüpü olarak kullanılır</td></tr><tr><td>Detektor CANCER03 DC03</td><td>Gilupi</td><td>GIL003</td><td>EpCAM pozitif hücreleri izole edebilen ve ayırabilen işlevselleştirilmiş tel (aynı zamanda catch & sürüm, C& R)</td></tr> <tr><td>Şırınga iğneleri (G20)</td> <td>VWR</td><td>613-0554</td><td>C& İçinden geçmek için R</td></tr><tr><td>Neubauer odası</td><td>Roth</td><td>T729.1</td><td>Hücreleri saymak için kullanılır</td></tr><tr><td>Pasteur pipetleri 150 mm</td><td>Volac</td><td>D810</td><td>Hücrelerin C& R</td></tr><tr><td>Gres kalemi</td><td>Dako</td><td>S2002</td><td>Hücre süspansiyonunu yerinde tutmak için cam kızaklarda kullanılır</td></tr><tr><td>Steril şırınga filtresi (0.2 ve mikro; m)</td> <td>Corning</td><td>431219</td><td>Taze hazırlanmış Gilupi Serbest Bırakma Tamponu</td></tr><tr><td>Delfia PlateShaker</td><td>Perkin Elmer</td><td>1296-003</td><td>Hücre ayrılması sırasında çalkalama için kullanılır</td></tr><tr><td>1.5 mL tüpler</td><td>Eppendorf</td><td>30,125,150</td><td></td></tr><tr><td>Ampli1 WGA Kiti</td><td>Silikon Biyosistemler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipülatör MMJ ile donatılmış Silicon Biosystems Axiovert M200 üzerinden sipariş edilecek ve CellTram vario</td><td>Zeiss/Eppendorf</td><td></td><td>Eldeki mikromanipülasyonu kullanın</td></tr><tr><td>Mikrokılcal damarlar (25 & mikro; m çapında), CustomTip I</td><td>Eppendorf</td><td>930001201</td><td>Hücreleri mikromanipüle etmek için kullanılır</td></tr><tr><td>0.2 mL PCR tüpleri</td><td>Biozym</td><td>710920</td><td></td></tr><tr><td>Sitosantrifüj ve ekipmanları</td><td>Hettich</td><td>Universal 32</td><td>Elinizin altında sitosantrifüj kullanın</td></tr><tr><td>Termo döngüleyici</td><td>Bio-Rad</td><td>DNA Engine Dyad</td><td>Isıtmalı kapaklı her termo döngüleyici kullanılabilir</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj</td><td>Roth</td><td>CX73.1</td><td>Elinizin altında masa üstü santrifüj kullanın</td></tr><tr><td>MembraneSlide 1.0 PET</td><td>Zeiss</td><td>415101-4401-050</td><td>Lazer mikrodiseksiyon için kullanılan membran kaplı cam slaytlar</td></tr><tr><td>UV Stratalinker 1800</td><td>Stratagene</td><td>400072</td><td>Eldeki DNA çapraz bağlayıcıyı kullanın</td></tr><tr><td>Standart PCR reaktifleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6x DNA Yükleme</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0611</td><td>Jel kullanın Elde boya yükleniyor</td></tr><tr><td>DNA merdiveni</td><td>BioLabs</td><td>N0551G</td><td>Elinizde 100 bp merdiven kullanın</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biozym</td><td>840004</td><td></td></tr><tr><td>Jel elektorforez istasyonu</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Elinizin altında elektroforez sistemi</td></tr><tr><td>kullanın Jel Kırmızı Nükleik Asit Lekesi</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>Agaroz jellerde DNA görselleştirme için interkalasyon boyası</td></tr></tbody></table>

hedef hücre ön zenginleştirme ve tüm genom amplifikasyon tek hücre aşağı akım karakterizasyonu için

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Nadir hedef hücreleri hedef hücre yüzey proteinleri ilişkin antikorlar özel kullanarak hedef olmayan hücre yüksek bir arka plan ayrılmış olabilir. Son zamanlarda gelişmiş bir yöntem tıbbi bir tel ile Anti-epitel hücre adezyon molekülü (EpCAM) antikorları tümör hücreleri (CTCs)1dolaşan vivo içinde yalıtım için functionalized kullanır. Hasta eşlemeli bir kohort sigara metastatik prostat Kanserinde vivo içinde yalıtım teknik CTCs yanı sıra geçerli altın standart CTC numaralandırma kıyasla daha yüksek CTC sayıları için pozitif hastalar daha yüksek bir yüzdesi sonuçlandı gösterdi. (Aygıtı olarak adlandırılır) yeni functionalized dinleme cihazı gibi hücreleri geçerli tıbbi cihazlardan kurtarılamaz, enzimatik tedavi ile yakalama ve hücre sonraki dekolmanı izin üretildi. Hücreleri mikroskop üzerinde görüntülenir ve enzimatik tedavi kullanarak müstakil aygıt eklemek için izin verilir. Kurtarılan hücre membran kaplı slaytlar üzerine cytocentrifuged vardır ve tek tek lazer mikrodiseksiyon veya Embriyolardan yoluyla hasat. Tek hücre örnekleri sonra eleme ve hedef özgü yaklaşımlar da dahil olmak üzere birden çok akış aşağı analiz izin tek hücreli tüm genom amplifikasyon tabi tutulmaktadır. İzolasyon ve kurtarma yordamı yüksek kalitede DNA tek hücreden verimleri ve sonraki tüm genom amplifikasyon (WGA) zarar değil. Tek bir hücrenin güçlendirilmiş DNA tarama için iletilebilir ve/veya analiz dizi karşılaştırmalı genom hibridizasyon (dizi-CGH) veya sıralama gibi hedef. Cihazın yapay nadir hücre örnekleri (5 mL periferik kan çiviliYani 500 hedef hücreleri) ex vivo izolasyon sağlar. Dekolmanı oranları hücre kabul edilebilir (50-%90) ise, geniş bir cep telefonda kullanılan bağımlı slayta müstakil hücreleri iyileşme oranı yayılan (< 10 - > % 50) ve biraz daha fazla dikkat gerekir. Bu aygıt hastalarda kullanım için temizlenmez.

Hücreleri CFSE ve nükleik boyama sonra DAPI ve FITC için filtre ile donatılmış bir ayirt mikroskop kullanarak değerlendirilebilir. Hücrelerin sitoplazma göstermek ise tek tip CFSE ile heterojen arası hücre yoğunluğu (şekil 2A ve 2E) ile etiketleme DAPI kanaldaki parlak bir counterstain ile çekirdekleri mevcut. Benzer şekil ve yoğunluklarda boyama tel (şekil 2B ve 2F) bağlı hücreler beklenen yanı sıra tel müstakil ve bir slayt (şekil 2B ve 2 H) kurtarıldı.
Yüksek hücre yoğunluğu (örneğin &gt; 1 000 000 hücre/mL) Tel hücreleri ile toplam kapsama teller şarj ederken neden olabilir. Ancak, hücre yoğunluğu düşük, dönme hızı kuluçka sırasında değişiklikler ve farklı hücre hatları kullanımı yalıtım verimliliği etkileyen ve ayrı olarak test edilmesi gerekir. Ne zaman teller inkübe ile 5 mL 100 000, HT-29 hücrelerinin hücre / mL olarak açıklanan bölüm 2.1., 254 ± 103 hücrelerin ortalaması (n = 5) kabloları ele geçirildi. İle aynı deneme LNCaP hücreleri, 440 ± 319 hücrelerin ortalaması kullanarak (n = 5) Tel elde edildi.
5 mL periferik kan teller (göre Protokolü Bölüm 2.2.) için de bir arka plan 500, 5 000 ve 50 000 HT-29 hücrelerinde sunma sonuçlandı 75 ± 18 hücreleri, 25 ± 9 hücreleri ve 47 ± 57 hücre yakalama (n = 3, her), anılan sıraya göre. Tel ile hücre süspansiyon (1 000 000 hücre/mL) bölümünde 2.3 protokolüne göre 15 µL suçlanıyor., en fazla 1.000 kişi (HT-29) bir tel hücreleri ekleyebilirsiniz.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig1.jpg"> <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig1large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig2.jpg"> <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig2large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig3.jpg"> <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig3large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig4.jpg"> <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig4large.jpg" target="_blank"></a><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Yeniden elde etmek ve moleküler genetik karakterizasyon tek hücre düzeyinde bir karışımı nadir Hedef hücrelerden olmayan hedef arka plan hücrelerle hazırlamak protokolüdür. DNA kalitesi olmayan tedavi tek hücrelere eşittir ve (her iki tarama tabanlı ve analiz hedefli) tek hücreli uygulama için sağlar.

Hedef hücre ön zenginleştirme ve tüm genom amplifikasyon tek hücre aşağı akım karakterizasyonu için

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Bu prosedürün genel amacı, hücreleri tek hücre aşağı akış analizi için kullanılabilir hale getirmek için hücre süspansiyonundan izole etmektir. Bu yöntem, sıvı biyopsiler ve hücresel heterojenlik bağlamında temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tek hücrelerin antikor bazlı izolasyonuna ve tek hücre düzeyinde daha sonraki moleküler genetik analiz için geri kazanımlarına izin vermesidir.Hastalarda kullanımı için onaylandıktan sonra, bu teknik kanser hastalarından dolaşımdaki tümör hücrelerinin karakterizasyonunu sağlayacaktır. Bu yöntem, tek hücreler arasındaki heterojenlik hakkında fikir verebildiğinden, kan örnekleri, hücre kültürlerinden alınan örnekler veya ilişkisiz doku ve organlar gibi alt popülasyonları içeren her türlü hücre süspansiyonuna uygulanabilir. Bu yöntem için ilk olarak, aşağı akış analizi amacıyla hücreleri serbest bırakma yeteneğine sahip olmayan bir in vivo zenginleştirme cihazı kullandığımızda aklımıza geldi.Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü lazer mikrodiseksiyon veya mikromanipülasyon kullanılarak tek hücrelerin toplanması adımlarının başarılı bir şekilde gerçekleştirilmesi zordur, çünkü tek hücrelerin hasat edilmesi işlemi hücre kaybına eğilimlidir ve yüksek düzeyde uzmanlık gerektirir. Bir mililitre önceden ısıtılmış hücre kültürü ortamında, HT-29 CFSE etiketli hücreleri yeniden süspanse edin ve 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede yenilenmelerine izin verin. Hücreleri hasat etmek için 300 g'da üç dakika santrifüjleyin.Daha sonra, hücre peletini bir mililitre kullanıma hazır Hoechst 33342 DNA boyama solüsyonunda 37 santigrat derecede 10 dakika boyunca yeniden süspanse edin. Daha sonra, hücre süspansiyonunu üç dakika boyunca 300 g'da santrifüjleyin. Ardından, süpernatanı atın ve hücre peletini dört mililitre 1X fosfat tamponlu salin içinde yeniden süspanse edin.Ardından, bir hemositometre kullanarak hücre sayısını sayın ve floresan mikroskobu ile floresan etiketlemesini kontrol edin. Daha sonra, hücreleri üç dakika boyunca 300 g'da santrifüjleyin, süpernatanı atın ve peleti mililitre başına yaklaşık 500.000 hücrede yeniden süspanse edin ve hücreleri buzun üzerine yerleştirin. Beş mililitre periferik kanda, yaklaşık 500 ila 500.000 hücre ekleyin ve ardından tüpü ters çevirerek karıştırın.Teli saklama bölmesinden çıkardıktan sonra, teli tutan lastik kapağı çıkarın ve teli 1X fosfat tamponlu tuzlu suda yıkayın ve tüpün kapağına monte edin. Daha sonra, tüpü oda sıcaklığında 30 dakika boyunca dakikada beş dönüşte eğimli bir silindirli karıştırıcı üzerinde inkübe edin. İnkübasyondan sonra, teli 1X fosfat tamponlu tuzlu suda üç kez durulayın.Ardından, teli karanlıkta 1X fosfat tamponlu salin içeren 15 mililitrelik bir tüpte saklayın. Bir gres kalemi kullanarak bir cam slayt üzerine dikdörtgen bir alan çizin, ardından üzerine 500 mikrolitre 1X fosfat tamponlu tuzlu su ekleyin. Telin işlevsel kısmını 1X fosfat tamponlu tuzlu suya batırmak için, telin işlevsel olmayan kısmını bükün ve cam kızağın üzerine yerleştirin.Yakalanan hücrelerin sayısını saymak için, telin her iki tarafını da görsel olarak inceleyin. İnceledikten sonra, teli 1X fosfat tamponlu tuzlu su ile 15 mililitrelik tüpe geri aktarın ve karanlıkta tutun. Bir mililitre 1X fosfat tamponlu tuzlu su içinde, dört miligram serbest bırakma tamponu bileşenini çözün, ardından kullanıma hazır tamponu elde etmek için çözeltiyi 0.2 mikrometre steril filtreden süzün.Ardından, serbest bırakma tamponunu beş dakika boyunca 37 santigrat derecede ısıtın. Isıtıldıktan sonra, 1,5 mililitrelik bir reaksiyon tüpünü tamamen doldurmak için 1,6 mililitre serbest bırakma tamponu aktarın. Daha sonra, telin işlevsel kısmını serbest bırakma tamponunda 37 santigrat derecede bir su banyosunda 20 dakika inkübe edin.İnkübasyondan sonra, teli 15 dakika boyunca dakikada 500 dönüşte bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin. Daha sonra teli 300 g'da 10 dakika santrifüjleyin. Santrifüjleme bittiğinde, teli tüpten çıkarın, kapağı kapatın ve tüpü 10 dakika boyunca 300 g'da tekrar santrifüjleyin.Hücre süspansiyonunun hacmini azaltmak için, mikromanipülasyon için 100 mikrolitre süpernatan veya sonraki sitosantrifüjleme ve lazer mikrodiseksiyon için 300 mikrolitre hariç hepsini atın. Ardından, hızlı bir şekilde tek hücreli örneklemeye geçin. Mikromanipülasyon için, 100 mikrolitre hücre süspansiyonunun tamamını bir cam slayt üzerine aktarın.Ardından, cam slaytı bir mikromanipülatör ile donatılmış bir mikroskoba yerleştirin ve hücrelerin beş dakika boyunca oturmasına izin verin. Daha sonra, 0.2 mililitrelik PCR tüplerinde, iki mikrolitre hücre lizis ana karışımını pipetleyin ve buz üzerine aktarın. Bir mikrolitre 1X fosfat tamponlu salinde tek bir hücreyi toplamak için mikromanipülatörü kullanın.Daha sonra, hücreyi doğrudan iki mikrolitre hücre lizis ana karışımına aktarın. Tüpün dibindeki sıvıyı toplamak için numuneleri üç saniye boyunca 2.000 g'da hızlı bir şekilde döndürmek için bir masaüstü mikrofüj kullanın. Ardından, numuneyi buz üzerine aktarın ve adaptör-bağlayıcı tabanlı tüm genom amplifikasyonuna geçin.En fazla bir mikrolitre tampon kullanarak sadece bir hücreyi aspire edin. Hücreyi lizis çözeltisine aktarırken, çözeltiden çıkan kabarcıkları gördüğünüzden emin olun, bu da aspire edilen tüm hacmin aktarıldığını gösterir. Lazer mikrodiseksiyon için, 300 mikrolitre hücre süspansiyonunun tamamını beş dakika boyunca 300 g'da zar kaplı bir slayt üzerine sitosantrifüj edin.Ardından, membran kaplı slaytı lazer mikrodiseksiyon yapabilen bir mikroskop üzerine yerleştirin. Daha sonra, 4.5 mikrolitre hücre lizis ana karışımını 0.2 mililitrelik PCR tüpünün kapağına pipetleyin. Kapağı numunenin üzerine yerleştirin ve lazer mikrodiseksiyon ile tek bir hücreyi hasat edin.Hemen ardından, PCR kapağında izole edilmiş hücreleri kontrol edin, PCR tüpünü lazer mikrodiseksiyon mikroskobundan çıkarın ve tüpü kapatın. Kısa bir sıkma ile tüpün altındaki tüm sıvıyı toplayın. Numuneyi buz üzerine aktarın ve adaptör-bağlayıcı tabanlı tüm genom amplifikasyonuna geçin.Lazer mikrodiseke hücreyi kurtardığınızdan emin olun. Bu nedenle, tüm tüp kapağının lizis çözeltisi ile kaplanması önemlidir. Mikrodiseksiyondan sonra, hücrenin varlığı için tüp kapağını kontrol edin.CFSE ve Hoechst 33342 ile boyanan hücreleri göstermek için, tel şarj edilmeden önce, hücreler tele bağlanırken, daha sonra telden ayrılırken ve son olarak slayt üzerinde immünofloresan görüntüleme yapıldı. Hücrelerin şarjdan önceki immünofloresan görüntüleri mavi renkte parlak nükleik leke gösterirken, hücrelerin sitoplazması heterojen hücreler arası yoğunlukta yeşil CFSE boyası gösterir. Benzer boyama paterni, tele bağlı ve daha sonra ayrılan hücreler için de gözlenir.Tüm genom amplifikasyon ürünlerinin kalitesini kontrol etmek için% 1'lik bir agaroz jeli çalıştırıldı. Agaroz jeli, tüm genom amplifikasyonunun PCR ürünleri için 0.2 ila 1 kilobazdan daha büyük bir DNA yayması gösterir. Tek hücreden elde edilen 4plex kalite kontrol PCR ürünleri 100, 200, 300 ve 400 baz çiftinden oluşan ürünler verir.Üçten az bant gösteren ürünler daha fazla analizin dışında tutulur. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde gerçekleştirilirse, tek hücrelerin hücre süspansiyonlarından dört saat içinde izole edilmesine izin verir. Bu prosedürü denerken, özellikle hücrelere zarar vermemek için hücrelerin tele bağlı olduğu süre boyunca, hücreleri tampon içinde tutmayı unutmamak önemlidir.Bu prosedürü takiben, kopya sayısı varyasyonlarına ve mutasyonlara dayalı olarak tek hücreleri karakterize etmek için alan karşılaştırmalı genomik hibridizasyon, yeni nesil dizileme ve hedefe özgü PCR gibi analiz yöntemleri gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, işlevselleştirilmiş bir tel kullanarak hücre süspansiyonlarından hücrelerin nasıl izole edileceğini ve kurtarılacağını ve çoklu aşağı akış moleküler genetik analizi için tek hücrelerin nasıl örnekleneceğini iyi anlamış olmalısınız. İnsan kanı ile çalışmanın enfeksiyon olasılığı oluşturduğunu unutmayın, bu nedenle bu işlemi gerçekleştirirken eldiven ve laboratuvar önlüğü giymek zorunludur.

target-cell-pre-enrichment-whole-genome-amplification-for-single-cell

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu yazıda, sıçan primer nöronal kültürlerin ve sonraki transcriptome analizi Arna amplifikasyon kullanarak tek hücre hasat için basit bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, herhangi bir hücre tipi için genellenememektedir.

Tek Hücre Transcriptome Analizi

Bu videoda, aşağı akış analizi yapmak için hedef hücrelerden oluşan bir havuzdan tek hücreleri izole etme tekniği açıklanmaktadır. Bu yöntemde, tek bir hedef hücrenin yüksek hassasiyetli izolasyonu için mikroskoba takılan bir mikromanipülatör kullanılır.

Mikromanipülasyon Kullanarak Tek Hücre Örneklemesi: Tek Hücreleri Kanser Hücresi Süspansiyonundan İzole Etme Tekniği

Bu videoda, lazer yakalama mikrodiseksiyonu kullanılarak heterojen bir hücre popülasyonundan tek bir hücre elde etme tekniği açıklanmaktadır. İzole edilen tek hücre, daha ileri genomik çalışmalar veya kanser araştırmaları için kullanılabilir.

Lazer Yakalama Mikrodiseksiyonu Kullanılarak Tek Hücre Örneklemesi: Heterojen Bir Hücre Popülasyonundan Hedef Hücreleri Hasat Etme Tekniği

Bu protokol klonal düzeyde genlerin büyük bir dizi ifadesini değerlendirmek açıklamaktadır. Tek hücreli RT-qPCR örnekleri ve yüzlerce genin için güçlü bir hassasiyetle oldukça güvenilir sonuçlar verir.

Multiplex RT-qPCR kullanarak tek hücreli Gen İfadesi Nadir Lenfoid Populasyonlarının Farklılıkları karakterize etmek

Tek hücre sıralama yüksek çözünürlükte genomik değişikliklerin ele almak için giderek daha popüler ve erişilebilir bir araçtır. Biz tek hücrelerde kopya sayısı değişiklikleri tanımlamak için tek bir hücre sıralama kullanan bir protokol sağlar.

Tek Hücre sıralama kullanarak Kopya sayısı Değişmeler Algılama

Fonksiyonel ve fenotipik analizi için antijene reaktif B hücreleri tespit etmek ve ettirecek bir manyetik nano-tanecikleri kullanır basit ama etkili bir yöntem tarif edilmiştir.

Fenotip ve Fonksiyon Analizi için algılama ve Nadir zenginleştirilmesi antijene özgü B hücreleri

Toplu gen ifade ölçümleri bulut tek hücre farkları türdeş olmayan hücre popülasyonlarının. Burada, bir protokol açıklamak nasıl tek hücreli gen ifade analizi ve dizin için Variety aktif hücre sıralama (FACS tarafından) sıralama heterojenite betimlemek için birleştirilebilir ve immunophenotypically karakterize tatlı ayrı hücre popülasyonlarının.

Bir moleküler karakterize etmek için Kombinatorik tek hücreli yaklaşım ve insan kök ve yaratıcı nüfus Immunophenotypic heterojen

Burada, verimli bir şekilde hücreleri mevcut Drosophila görsel sistemi aktif floresans hücreye (FACS) sıralama içinde düşük bereket, izole bir hücre ayrılma protokol mevcut.

Drosophila görsel sistem düşük bol hücrelerinin arıtma

Burada, sirkülasyon tümör hücrelerini (CTCs) karakterize eden fenotifik ve moleküler özellikleri tanımlamak için entegre bir iş akışı sunuyoruz. Tek ve kümelenmiş CTCs 'lerin canlı immünostasyon ve robotik mikromanipülasyonunu, alt analiz ve metasrin-tohumlama yeteneğinin değerlendirilmesi için tek hücre bazlı tekniklerle birleştiriyoruz.

Akım moleküler Analizi ve metastatik potansiyel değerlendirme için sirkülasyon tümör hücrelerinin mikromanipülasyon

Mevcut protokol, yeniden kullanılabilir tek bir hücre kullanarak yinelemeli epigenomik analizler için tek hücreli bir yöntemi açıklamaktadır. Yeniden kullanılabilir tek hücre, aynı tek hücrede birden fazla epigenetik işaretin analizine ve sonuçların istatistiksel olarak doğrulanmasına izin verir.

Yinelemeli epigenomik analizler için yeniden kullanılabilir tek hücre

Dolaşımdaki tümör hücreleri (CTC'ler), kanserin ilerlemesi ve metastazının incelenmesi için kritik öneme sahiptir. Bu makale, CTC zenginleştirme ve tek CTC dizilimi için yüksek verimli, entegre bir protokol sunmakta, kontaminasyon ve dizileme maliyetlerini azaltırken yakalama verimliliğini ve CTC saflığını artırmakta, böylece hassas onkoloji araştırmalarını ve klinik uygulamaları ilerletmektedir.

Mikroakışkan Tabanlı Yüksek Verimli Dolaşımdaki Tümör Hücresi Sıralama ve Tek Hücre Dizileme Teknolojisi

Öğrenin, nadir hedef hücreleri izole etmek ve tek hücre düzeyinde moleküler genetik analiz için hazırlamak üzere antikor temelli izolasyon ve tüm genom amplifikasyon yöntemlerini. Bu teknik, dolaşımdaki tümör hücrelerinin karakterizasyonunda kanser araştırmaları için kritik öneme sahiptir.

Hedef hücre ön zenginleştirme ve tüm genom amplifikasyon tek hücre aşağı akım karakterizasyonu için

Daha fazla video keşfet