Perfüze Mikro-biyoreaktörler Chip tabanlı üç boyutlu Hücre Kültürü

Merhaba, ben Eric Gottwald ve Ware Teknoloji Enstitüsü Biyolojik Arayüzler Enstitüsü'nde araştırma bilimcisiyim. Bugün sizlere çip tabanlı perfüze mikro biyokaktif sistemimizi tanıtmak istiyorum. Çipi hücre kültürü uygulamalarında kullanabilmemiz için önce polimeri hidrolize etmemiz ve mikro yapılandırılmış alanı havalandırmamız gerekir.

Bu işlem, çipin %100'den başlayarak farklı konsantrasyonlardaki izopropanol çözeltilerine daldırılmasıyla gerçekleştirilir. Çip, her konsantrasyona sadece birkaç saniye daldırılır ve son adım sadece sudur. Ardından çip kurutulur ve son olarak, hücrelerin polimere yapışmasını kolaylaştırmak için çip bir kolajen 1 solüsyonu ile kaplanmalıdır. Bu işlem, mikro yapılandırılmış alanın üzerine sadece birkaç damla kolajen 1 solüsyonu damlatılarak yapılır ve bu şekilde çip, 4 °C'de gece boyunca inkübe edilir.

Kollajen bir çözeltisi ile gece boyunca inkübasyondan sonra, çözelti uzaklaştırılır ve çip steril PBS ile yıkanır. Ardından, PBS de uzaklaştırılır ve çip artık hücre ekimi için hazır hale gelir. Şimdi hücre çipini tek hücre süspansiyonu ile ekimleyeceğiz; bu işlem, mikro yapılandırılmış alanın üzerine 150 µL hücre süspansiyonu koyularak gerçekleştirilir. Hücrelerin yerleştirilmesinin ardından, çip bir inkübatörde 37 °C'de üç saat boyunca inkübe edilir.

Üç saatlik inkübasyon süresinin ardından, çip inkübatörden çıkarılır ve ektöre yerleştirilmeye hazır hale gelir. Bunun için ektör, steril ambalajından çıkarılır; bu şeffaf folyonun steriliteyi gamma ışınlamasıyla sağlanmıştır. Bu nedenle sadece paketi açıp ektörü çıkarmamız yeterlidir.

Sıradaki adımda, çipin yerleştirilebilmesi için biyoreaktör gövdesini sökebilmek amacıyla şişenin üst kısmını bu ortam rezervuarına yerleştireceğiz. Biyoreaktör gövdesini açtıktan sonra, çipi gövdedeki yuvasına yerleştirerek çip yerleştirme işlemini gerçekleştirebiliriz ve ardından biyoreaktör tekrar monte edilebilir. Son olarak, ortam rezervuarına iki adet steril filtre ve bir adet steril örnekleme portu bağlamamız gerekmektedir.

Kapalı dolaşım döngüsündeki gerçek oksijen tansiyonunun ölçümü için, iki oksijen sensörünü bu iki konnektör arasına monte ederek yerleştireceğiz. Baktör artık kültür ortamı ile doldurulmaya hazırdır. Baktör sistemi şu an hücre kültür ortamıyla doldurulmaya hazırdır ve bu işlem, kapalı dolaşım döngüsü basitçe roller pompaya bağlanarak gerçekleştirilir.

Böylelikle, tüm biyoreaktör sirkülasyonunu eş zamanlı olarak boşaltacağız. Buradaki Ector penceresinde görebileceğiniz üzere, besiyerinin aşağıdan yükseldiğini ve biyoreaktörden üst kısımdan ayrıldığını görebilirsiniz. Biyoreaktör sistemini inkübatöre yerleştirmeden önce, sirkülasyon döngüsünün hava kabarcığı kalmadan doldurulduğunu kontrol ederiz.

Şu an sistem tamamen hücre kültürü ortamı ile doldurulmuş durumda ve biyoreaktörü inkübatöre aktarabiliriz. Şimdi biyoreaktörü inkübasyon odasına yerleştireceğiz. Bunun için, öncelikle, kısa bir süre önce gördüğünüz üzere, biyoreaktör roller pompaya bağlandı ve şu an biyoreaktör şişedeki bu ortam tarafından aktif olarak perfüze ediliyor.

Ortamdaki oksijen konsantrasyonunu korumak için besiyeri rezervuarını gaz kaynağına bağlarız. Son olarak, sistemdeki oksijen tansiyonunu çevrimiçi olarak izlemek amacıyla sirkülasyona iki oksijen sensörü bağlayacağız. Artık kurulum tamamlanmıştır ve deneyi tasarladığınız süre boyunca çalıştırılabilir.

MicroCon kaplarının içindeki hücrelerin organotipik fonksiyonlarının analizi sırasında kullanılan en güçlü araçlardan biri, burada gördüğünüz lazer taramalı mikroskoptur. Lazer taramalı mikroskop, bize her bir MicroCon kabını tahrip etmeden inceleme imkanı sunar. MicroCon kapları veya çip, geleneksel immün boyama ve immünofloresans yöntemleri için kullanılabildiğinden, mikro kapların içindeki her türlü markörü ve organotipik fonksiyonu tespit edebilmekteyiz.

Burada, bu çipin animasyonunda görebileceğiniz üzere, alt kısım ve MicroCon konteyner duvarları tamamen hücrelerle doludur. Oldukça canlı durumda çok sayıda hücremiz var ve çok az sayıda ölü hücre mevcut. Bir sonraki resim, MicroCon konteynerı içerisinde her türlü organotipik fonksiyonu tespit edebildiğimizi göstermektedir.

Örneğin hepatositler için, hücrelerdeki albümin üretimi veya E-cadherin ekspresyonu, buradaki üst üste bindirme görüntüsünde net bir şekilde görülebilmektedir. Çekirdek maviye boyanmıştır. E-cadherin yeşil ile boyanmış ve albümin kırmızı ile eksprese edilmiş veya boyanmıştır.

Ve burada güzelce görebileceğiniz üzere, hepatositlerden beklediğiniz tüm organotipik fonksiyonlar bu tür bir 3D kültürde başarıyla ifade edilmektedir. Ayrıca, başka bir hepatosit markeri olan sitokeratin 18'e baktık ve bu resim, Sitokeratin 18'in de bu tür kültürlerde başarıyla ifade edildiğini göstermektedir. Bu durumun, bu tür organotipik fonksiyonların diğer organotipik kültürler için de faydalı olabileceği konusunda sizi ikna ettiğini umuyorum.

Biore deneyi sona erdikten sonra, çip, örneğin total RNA gibi her türlü hücresel bileşenin izolasyonu için kullanılabilir. Burada gördüğünüz üzere, biyoreaktör sisteminden izole edilen total RNA'yı gösteriyoruz. Bu total RNA daha sonra gerçek zamanlı PCR veya burada gördüğünüz gibi mikroarray analizi gibi ileri uygulamalarda kullanılabilir.

Ayrıca, sistemden bütün hücreler izole edilebilir ve bu hücreler daha sonra konvansiyonel akış sitometrisi analizi için kullanılabilir. Burada görebileceğiniz üzere, sistemin organotipik reaksiyonların gerekli olduğu her türlü uygulama için yararlı olabileceğini ve kök hücre uygulamaları gibi henüz değerlendirmediğimiz tüm bu tür uygulamalar için faydalı olabileceğini göstermiş olduğumuzu umuyorum.