Perfüze Mikro-biyoreaktörler Chip tabanlı üç boyutlu Hücre Kültürü

Merhaba, ben Eric Gottwald ve Ware Institute of Technology'nin Biyolojik Arayüzler Enstitüsü'nde araştırma bilimcisiyim. Ve bugün sizi çip tabanlı perfüze Mikro biyoaktif sistemimizle tanıştırmak istiyorum. Çipi hücre kültürü uygulamalarında kullanmadan önce, polimeri hidrolize etmemiz ve mikro yapılı alanı azaltmamız gerekiyor.

Bu, çipi farklı bir izopropanol konsantrasyonuna daldırarak elde edilir, %100 ile başlayarak çipi her konsantrasyona sadece birkaç saniye daldırıyorum ve son adım sadece sudur. Daha sonra, çip kurutulur ve son olarak çipi, hücrelerin polimere yapışmasını kolaylaştırmak için bir çözelti olan bir kollajen ile kaplamamız gerekir. Bu, mikro yapılı alanın üzerine sadece birkaç damla kollajen, bir çözelti damlatılarak yapılır ve bu durumda, çip gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edilir.

Kollajen bir çözelti ile gece boyunca inkübasyondan sonra, çözelti çıkarılır ve çip steril PBS ile yıkanır Daha sonra, ayrıca PBS çıkarılır ve çip artık hücrelerin aşılanması için hazırdır. Şimdi hücre gemisini tek hücreli bir süspansiyonla aşılayacağız ve bu, mikro yapılı alanın üzerine sadece 150 mikrolitre hücre süspansiyonu koyarak yapılır. Hücrelerin biriktirilmesinden sonra, çip bir inkübatörde 37 derecede üç saat inkübe edilir.

Üç saatlik Kuluçka süresinden sonra, çip inkübatörden çıkarılır ve artık ektora yerleştirilmeye hazırdır. Bunun için ektor steril ambalajından çıkarılır ve bu saydam folyonun gama ışınlaması ile sterilite sağlanır. Bu yüzden sadece paketi açmamız ve ector'u çıkarmamız gerekiyor.

Bundan sonra yapacağımız şey, şişenin üst kısmını bu orta rezervuara yerleştireceğiz, böylece çipin yerleştirilmesi için biyoreaktör muhafazasını sökebiliriz. Biyoreaktör muhafazasını açtıktan sonra, çipi şimdi yerleştirebiliriz, bu sadece çipi biyoreaktör muhafazasının oluğuna yerleştirerek elde edilir ve baktör artık tekrar monte edilebilir. Sonunda yapmamız gereken, orta rezervuara steril filtrelere ve bir steril numune alma portuna bağlanmamız gerektiğidir.

Kapalı sirkülasyon döngüsündeki gerçek oksijen geriliminin ölçümü için, iki oksijen sensörünü sadece bu iki konektör arasına monte ederek yerleştireceğiz. Bactor artık kültür ortamı ile doldurulmaya hazırdır. Bactor sistemi artık hücre kültürü ortamı ile doldurulmaya hazırdır ve bu, kapalı sirkülasyon döngüsünün silindir pompasına basitçe bağlanmasıyla elde edilir.

Bununla, tüm baktör dolaşımını aynı anda azaltacağız. Burada Ector penceresinde görebileceğiniz gibi, aşağıdan gelen ortamın yükselip yükseldiğini ve baktörü üstte bıraktığını görebilirsiniz. Bactor sistemini inkübatöre yerleştirmeden önce, sirkülasyon döngüsünün kabarcıksız dolumunu kontrol ediyoruz.

Artık sistem tamamen hücre kültürü ortamı ile doldurulmuştur ve biyoreaktörü inkübatöre aktarabiliriz. Şimdi bi rektörü kuluçka odasına yerleştireceğiz. Ve bunun için, ilk başta, bi rektör, kısa bir süre önce gördüğünüz gibi, silindir pompasına bağlanır ve şimdi ektor, bu ortam tarafından şişeden aktif olarak perfüze edilir.

Ve ortamdaki oksijen konsantrasyonunu korumak için orta rezervuarı gaz kaynağına bağlarız. Ve son olarak, sistemdeki oksijen gerilimini çevrimiçi olarak izlemek için dolaşıma iki oksijen sensörü bağlayacağız. Artık kurulum tamamlanmıştır ve denemeyi tasarladığınız sürece çalışabilir.

MicroCon kaplarının içindeki hücrelerin organotipik fonksiyonlarının analizi sırasındaki en güçlü araçlardan biri, burada görebileceğiniz lazer tarama mikroskobudur. Lazer tarama mikroskobu bize her bir MicroCon kabına zarar vermeden bakma fırsatı veriyor. MicroCon kapları veya çip, geleneksel immüno-boyama immünofloresan yöntemleri için kullanılabildiğinden, mikro kapların içindeki her türlü belirteç ve organotipik işlevi tespit edebiliyoruz.

Gördüğünüz gibi, bu çipin animasyonunda, alt kısım tamamen hücrelerle ve MicroCon konteyner duvarlarıyla dolu. Oldukça canlı olan çok sayıda hücremiz var ve çok, çok az ölü hücremiz var. Bir sonraki resim, MicroCon kabının içindeki her türlü organotipik fonksiyonu tespit edebileceğimizi göstermektedir.

Örneğin, hepatositler için, albümin üretimi veya E, hücrelerde bir ifade duyabilir, burada kaplamada güzel bir şekilde görebilirsiniz. Çekirdek mavi renkte boyanmıştır. Buradaki eko yeşil renkle boyanmıştır ve albümin kırmızı ile ifade edilir veya boyanır.

Ve burada güzel bir şekilde görebileceğiniz gibi, hepatositlerden beklediğiniz tüm organotipik fonksiyonlar bu tür bir 3D kültürde güzel bir şekilde ifade edilir. Ayrıca, başka bir hepatosit markörüne baktık ve bu sitokeratin 18 idi ve bu resim size Sitokeratin 18'in bu tür kültürlerde de güzel bir şekilde ifade edildiğini gösteriyor. Ve bu umarım sizi bu tür organotipik fonksiyonların diğer organotipik kültürler için de yararlı olabileceğine ikna eder.

Biore deneyinin sona ermesinden sonra, çip, örneğin toplam RNA gibi her türlü hücresel bileşenin izolasyonu için kullanılabilir. Burada görebileceğiniz gibi, burada size biyoreaktör sisteminden izole edilen toplam RNA'nın alımını gösteriyoruz. Bu toplam RNA daha sonra örneğin gerçek zamanlı PCR veya burada görebileceğiniz gibi mikrodizi analizi gibi aşağı akış uygulamaları için kullanılabilir.

Ayrıca, sağlam hücreler sistemden izole edilebilir ve bu hücreler daha sonra geleneksel akış sitometrisi analizi için kullanılabilir. Burada gördüğünüz gibi, umarım size sistemin organotipik reaksiyonların gerekli olduğu her türlü uygulama için yararlı olabileceğini gösterebiliriz ve sistemin şimdiye kadar düşünmediğimiz tüm bu tür uygulamalar için yararlı olabileceğini gösterebiliriz, örneğin kök hücre uygulamaları gibi.