Qa-1 epitopları bir protein eşlemek için çakışan Peptide Kütüphane

Bu prosedürün genel amacı, proteinlerdeki Qa-1 epitoplarını tanımlamaktır. Bu yöntem, bağışıklık düzenlemesi ve immünoterapi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajları, eşlenmiş peptitlerin Qa-1 kısıtlı CD8 T hücrelerini uyardığının bilinmesi ve prosedürün gerçekleştirilmesinin kolay olmasıdır.

Bu tekniğin etkileri, multipl skleroz gibi bağışıklık aracılı hastalıklar için terapötik tasarımlara kadar uzanır. Bu yöntem hayvanlarda Qa-1 aracılı bağışıklık regülasyonu hakkında bilgi sağlayabilse de, insanlarda HLA-E aracılı bağışıklık regülasyonuna da uygulanabilir. Prosedüre başlamak için, bitişik peptitlerin 11 amino asitte örtüştüğü 15-mer peptitlerden oluşan bir kütüphane tasarlayın.

Peptitleri steril koşullar altında elde edin ve sulandırın. Her peptit için, peptitin beş miligramını 100 mikrolitre dimetil sülfoksit ile birleştirin. OLP havuz stoğunu hazırlamak için her bir peptit stoğunun 10 mikrolitresini temiz bir 1 mililitrelik kriyo tüpünde birleştirin.

Daha sonra, her bir peptit stoğundan 20 mikrolitre V tabanlı 96 oyuklu bir plakaya yükleyin ve her stoğu 80 mikrolitre steril su ile seyreltin. Hem mililitre peptit stokları başına kalan 50 miligramı hem de mililitre peptit stokları başına 10 miligram plakayı 20 santigrat derecede saklayın. Daha sonra, serum içermeyen ortamda iki mililitre ışınlanmış dendritik hücre içeren 15 mililitrelik bir tüpe 10 mikrolitre OLP havuz stoğu çözeltisi ekleyin, böylece DMSO'yu iki yüz kat seyreltin.

Kalan OLP havuz stoğunu 20 santigrat derecede saklayın. DC'leri OLP havuzuyla oda sıcaklığında üç saat inkübe edin. Hücreleri her 15 dakikada bir elle hafifçe sallayın.

Kuluçka sırasında, CD8 + T hücrelerini hasat edilmiş bir fare dalağından veya lenf düğümlerinden saflaştırmak için bir kit kullanın. Serum içermeyen ortamın mililitresi başına 10 milyon T hücresi ile beş mililitre interlökin 2 ve mililitre interlökin 7 başına 100 birim ile beş mililitre çözelti hazırlayın. Saflaştırılmış CD8 T hücreleri boncuksuz veya el değmemiş olmalıdır.

48 oyuklu bir plakanın 10 oyuğunun her birine 0,5 mililitre T hücresi çözeltisi yerleştirin. OLP havuz darbeli DC çözeltisinin inkübasyonu tamamlandıktan sonra, DC'lere 10 mililitre serumsuz ortam ekleyin. Hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 kez G'de santrifüjleyin.

Daha sonra, hücreleri beş mililitre serum içermeyen ortamda yeniden oluşturun. 10 kuyucuğun her birine 0,5 mililitre hücre süspansiyonu ekleyin. Hücreleri dört gün boyunca% 5 karbondioksit atmosferinde 37 santigrat derecede inkübe edin.

Daha sonra, her bir oyuktan 400 mikrolitre kültür ortamını çıkarın. Her bir oyuğa mililitre başına 100 birim IL-2 ve IL-7 içeren 500 mikrolitre taze serumsuz ortam ekleyin. OLP havuzla hazırlanmış hücreleri yeniden uyarmadan önce hücreleri iki ila üç gün daha inkübe edin.

Yeniden stimülasyondan önce, fare peritoneal makrofajlarını elde edin ve ışınlayın. Makrofaj konsantrasyonunu, serumsuz ortamın mililitresi başına beş milyon hücreye ayarlayın. Hacimce% 0.5'lik bir nihai DMSO konsantrasyonu için 10 mikrolitre OLP havuz stoğunu iki mililitre ışınlanmış peritoneal makrofaj ile birleştirin.

Bu çözeltiyi mililitre başına 100 birim murin makrofaj koloni uyarıcı faktör ile destekleyin. 48 oyuklu bir plakayı, her oyukta 200 mikrolitre OLP-havuz makrofaj çözeltisi ile doldurun. Plakayı dört saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Ardından, her bir kuyuyu 200 mikrolitre önceden ısıtılmış RPMI-0 ortamıyla nazikçe yıkayın. Makrofaj çözeltisi çok sayıda boncuk içerecektir. OLP havuz astarlı CD8 T hücreleri eklenmeden önce, tüm kuyucukların boncuk içermediğinden emin olmak için plaka mikroskop altında kontrol edilmelidir.

Daha sonra, yeniden stimülasyon için hazır olan OLP havuzlu CD8 + T hücrelerini toplayın ve bir araya getirin. T hücresi konsantrasyonunu, mililitre başına 25 birim IL-2 ve mililitre başına 50 birim IL-7 içeren serum içermeyen ortamda mililitre başına bir milyon hücreye ayarlayın. OLP havuz darbeli makrofajlar içeren her bir oyuğa havuzlanmış T hücresi çözeltisinden bir mililitre ekleyin.

Hücreleri dört gün boyunca% 5 karbondioksit atmosferinde 37 santigrat derecede kültürleyin. Ardından, her bir oyuktan yaklaşık 400 mikrolitre ortam çıkarın. Her bir oyuğa, her biri mililitre başına 100 birim IL-2 ve IL-7 içeren 500 mikrolitre taze serumsuz ortam ekleyin.

Aynı koşullar altında inkübasyona devam edin. Üç ila dört gün sonra, interferon-gama enzimine bağlı immünospot testi ile OLP havuzuna özgü bir Qa-1 kısıtlı yanıtı için yeniden uyarılmış hücreleri inceleyin. Sonuçları beklerken CD8 + T hücresi ortamını her üç ila dört günde bir yenileyin.

Hangi peptitlerin OLP havuzuna özgü Qa-1 kısıtlı interferon-gama sekresyonunu ürettiğini belirlemek için seyreltik peptit stoklarıyla bir ELISPOT testi gerçekleştirin. Son olarak, optimal Qa-1 epitopunu belirlemek için kesilmiş bir peptit serisini ELISPOT ile değerlendirin. Bir interferon-gama ELISPOT testi, havuzlanmış MOG örtüşen peptit kütüphanesi tarafından uyarılan CD8 + T hücreleri C1R ile birleştirildiğinde nokta oluşturan hücrelerde önemli bir artış gösterdi.

Qa-1b hücreleri. Bu, T hücrelerinin Qa-1 bağlayıcı peptitlere yanıt verdiğini ve MOG_pool bir veya daha fazla Qa-1 bağlayıcı epitop içerdiğini düşündürdü. Havuzdaki tek tek peptitleri taramak için başka bir test yapıldı.

Üç peptit, C1R varlığında yanıttan en az üç kat daha büyük yanıtlar gösterdi. Peptitsiz Qa-1b hücreleri. Bunlardan, daha fazla değerlendirme için en büyük yanıta sahip peptit seçildi.

Optimal Qa-1 epitopunu tanımlamak için ilgilenilen 15-mer peptidine dayanan bir kesilmiş peptit kütüphanesi değerlendirildi. Epitop ideal olarak sekiz ila 10 mer olacaktır ve dokuz mer tercih edilir. Ayrıca, optimal epitop, 15-mer peptidinden benzer veya daha güçlü bir interferon-gama tepkisi gösterecektir.

Dokuz mer N-terminal olarak kesilmiş peptit, bu kriterlere en iyi şekilde uyar ve bu da onu optimal Qa-1 epitopu yapar. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, bağışıklık düzenlemesi alanındaki araştırmacıların, pankreas gibi diğer dokularda bağışıklık düzenlemesinin incelenmesi için yeni Qa-1 epitoplarını keşfetmelerinin yolunu açtı. Unutmayın, radyasyonla çalışmak son derece tehlikeli olabilir.

Araştırmacılar kurum politikasına sıkı sıkıya bağlı kalmalı ve uygun şekilde eğitilmelidir.