Yüksek içerik miktar Sod1 canlı hücreler Mutant Protein toplama oluşumu için tahlil geliştirme

Bu deneyin genel amacı, küçük moleküllerin yanlış katlanmış proteinlerin agregasyonunu zamana ve doza bağlı bir şekilde modüle etmedeki etkisini incelemek için bir test geliştirmektir. Bu yöntem, hücresel tahlilin geliştirilmesi için temel soruların cevaplanmasına yardımcı olabilir ve kullanımı yüksek içerikli tarama teknikleri içindir. Bu tekniğin ana avantajı, çeşitli nörodejeneratif bozukluklarda meydana gelen protein agregasyonunu tespit etmek ve ölçmek için basit bir yöntem sağlamaktır.

Bu tekniğin anlamı, ALS gibi nörodejeneratif hastalıkların potansiyel tedavisine doğru uzanır, çünkü hücresel tahlil geliştirmeye ve küçük molekül moderatörleri için tarama yapmaya izin veren basit bir yöntem önermektedir. Virüs üretimine başlamak için, plazmit transfeksiyonundan önce HEK-293 T hücrelerini 10 santimetrelik bir doku kültürü kabında ve 10 mililitre hücre kültürü ortamında% 30 ila 40 oranında bölün. Kültür plakasını gece boyunca 37 santigrat derecede %5'lik bir karbondioksit inkübatörde inkübe edin.

Ertesi gün, ambalaj plazmitleri lentiviral vektörü, 125 mikrolitre bir molar kalsiyum klorür ile DNA transfeksiyon solüsyonu hazırlayın ve hacmi 500 mikrolitreye ayarlamak için damıtılmış su ekleyin. Yavaşça 500 mikrolitre 0.05 molar HEPS tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Bundan sonra, HEK-293 T hücresi ortamını, bir mililitre DNA transfeksiyon çözeltisi ile karıştırılmış 10 mililitre önceden ısıtılmış antibiyotik içermeyen taze kültür ortamı ile değiştirin.

Gece boyunca 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksit inkübatörde inkübe edin. Hücre süpernatantını ertesi gün taze kültür ortamı ile değiştirin ve gece boyunca tekrar inkübe edin. Son olarak, ertesi gün süpernatanı hasat edin ve 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Ölü hücreleri ve kalıntıları çıkarmak için, tüpü beş dakika boyunca 500 kez g'de santrifüjleyin. Supernatent'i daha da saflaştırmak için, 60 mililitrelik bir şırınga kullanarak 0.45 mikrometrelik bir filtreden geçirin. Ardından, filtrelenmiş süpernatanı hemen 300 mikrolitrelik tek kullanımlık alikotlara dağıtın.

Hücreleri transdüksiyona hazırlamak için,% 10 FBS ile desteklenmiş iki mililitre DMAM içinde altı oyuklu bir doku kültürü plakasında% 60 birleşmede enfekte olacak şekilde bölün. Hücreleri gece boyunca %5 karbondioksitte 37 derecelik bir inkübatörde inkübe edin. Ertesi gün, her kullanım için donmuş lentivirüsün bir alikotunu buz üzerinde çözün.

Bu arada, ilgilenilen hücre hattı ile uyumlu serumu içeren hücre kültürü ortamını ısıtın. Virüs tamamen çözüldükten sonra, yeni 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerinde DMEM'de seyreltin. Ardından, azaltılmış serum ortamı ile hacmi bir mililitreye ayarlayın.

Daha sonra, ortam başına bir mililitre virüse iki mikrolitre polibren ekleyin ve pipetleyerek iyice karıştırın. Bu karışımdan bir mililitre hücrelere ekleyin ve 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyondan sonra, virüs içeren ortamı çıkarın ve% 10 FBS ile desteklenmiş normal DMEM ile değiştirin ve hücreleri inkübatöre geri koyun.

Hücre büyümesini izleyin ve ortamı iki günde bir değiştirin Hücreler birleştiğinde, altı oyuklu çanağın her bir kuyusunu 10 santimetrelik bir doku kültürü plakasına genişletin. Plakaları inkübatöre taşıyın. Son olarak, kuyucuk başına 1,5 kez 10 ila 4. hücreler ve 384 kuyu tahlil plakasında 50 mikrolitre DMEM kaydedin.

Daha sonra mikroskop altında YFP etiketli proteinin ekspresyon seviyesini kontrol edin. İfade üçe eşit veya üçten büyük sinyal-gürültü oranı gösteriyorsa, karşılık gelen hücre hattı için hücre stoğunu hazırlayın. Bileşik transferi için, 384 oyuklu bir depolama polipropilen plakası üzerinde, standart bir ila üç seyreltme serisi ile bileşiklerin seri seyreltmelerini ekleyin.

Daha sonra, 384 kılcal kafa ile donatılmış bir sıvı işleyici kullanarak, boş, düz tabanlı siyah 384 kuyulu tahlil plakalarına 0.25 mikrolitre proteazom inhibitörü dağıtın. Daha sonra bu plakalardaki 1,5 çarpı 10 ila 4. hücrelere tohumlayın. 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 24 saat inkübe edin.

Proteazom inhibitörleri ile muamele edilen hücre hattını görüntülemeden önce, boyama solüsyonu ile 10 mikrolitre önceden ısıtılmış DMEM ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Boyamadan sonra, mikroskop sekmesini seçerek otomatik mikroskop çalıştırma yazılımını başlatın. Önce konfigürasyon sekmesini seçin ve ardından doğru plaka tipinde 20 kez objektifi seçin.

Farklı plaka türleriyle doğru odaklamaya izin vermek için, arayanın hedef üzerinde doğru değere ayarlandığından emin olun. Ardından, birinci pozlamayı seçin. Odak yüksekliğini sıfır mikrometre olarak ayarlayın, ardından odağı seçin.

Odaklandıktan sonra, birinci kamerayı ortaya çıkarın. Pozlama düzlemini optimize etmek için odak yüksekliğini ayarlayın ve yüksekliği al seçeneğine tıklayın. Yaklaşık 3000 maksimum piksel yoğunluğu için pozlama sürelerini ve lazer gücünü değiştirin ve pozlama parametrelerini kaydedin.

Deney tanımı sekmesini seçin, bir düzen ve alt düzen oluşturun. Ardından, ilgili mizanpaj pozlamasını, referans görüntüsünü, eğriltme kırpma dosyasını ve alt mizanpajı sürükleyip bırakın. Ardından, denemeyi kaydedin.

Son olarak, otomatik deney sekmesini seçin ve görüntüleri alın. İki kanallı görüntüler için önce çekirdekler, sitozol ve agregalar gibi birincil nesneleri segmentlere ayırmak için yazılım algoritmasını seçin. İlk olarak, %100 DMSO veya DMSO'da çözünmüş 0.25 mikrolitre proteazom inhibitörünü 384 oyuklu düz tabanlı plakalara dağıtın.

Aynı plakada, 50 mikrolitre DMEM'de oyuk başına 1,5 kez 10 ila 4. hücreleri manuel olarak tohumlayın. Ardından mikroskop sistemi çevre kontrol ünitesini 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksite ayarlayın. Mikroskobu geniş alanlı floresan modunda çalıştırın ve yazılım ayarları olarak, LWD'yi 20 kez objektif konfokal olmayan mod, kuyu başına dört alan ve bir saatlik yakalama aralığını seçin.

Ardından, sitozol ve agregalar gibi birincil nesneyi segmentlere ayırmak için uygun algoritmayı seçin. Gerekirse arka plan eşiğini ve kontrast parametrelerini ayarlayın. SOD-1 vahşi tip ve SOD-1 A4V mutantı ile dönüştürülen test edilen hücre hatları sağlıklı kaldı, yüksek ekspresyon seviyeleri gösterdi ve SOD formundan bağımsız olarak uzun süreli geniş phi etiketlemesi gösterdi.

Proteazom inhibitörü ALLN ile 24 saat boyunca tedavi, HEK-293 hücrelerinde SOD-1 A4V YFP agregatlarının birikimini teşvik etti, ancak SOD-1 Yabani Tip YFP transdüksiyonlu hücrelerde değil. Ayrıca, U2 OS ve SH-SY5Y hücre hatları SOD-1 A4V YFP'de aynı vektörlerle transdüksiyon çok düşük agregasyon seviyeleri vardı. Hücreler ALLN varlığında veya yokluğunda tohumlandıktan sonra, 50 saatlik bir süre boyunca agrega oluşumu açısından izlendi.

ALLN agrega oluşumu 24 saatte bir platoya ulaştı ve sonraki 12 saat boyunca sabit kaldı. Ayrıca, ALLN'nin sitotoksik etkisinin bir sonucu olarak hücre yoğunluğu 28 saat sonra önemli ölçüde azalırken, DMSO ile tedavi edilen negatif kontrolde hücre sayısı artmıştır. 24 saat boyunca proteazom inhibitörleri varlığında kültürlenen SOD-1 A4V YFP hücreleri Hoechst solüsyonu ile boyandı.

Üç farklı proteazom inhibitörü için nispi toksisite, Hoechst boyası ile etiketlenmiş kuyuda kalan yapışkan hücre dizilerinin sayısı ölçülerek eşitlendi. Artan proteaz inhibitör dozuna yanıt olarak toplam hücre sayısı azaldı. Tersine, SOD-1 A4V agregatlarını eksprese eden hücrelerin yüzdesi, proteaz inhibitörünün konsantrasyonu ile artmıştır.

Bu işlemi yaparken, hücre kalitesinin sonucunuzu büyük ölçüde etkileyeceğini hatırlamak önemlidir. Bu nedenle, hücrelerin mikroplazma içermediğini ve tüm adımlar boyunca sağlıklı olduğunu belirlemek önemlidir. Bu işlemi takiben, rezonans enerji transferi kullanılarak proteinin bozunması veya proteinin diğerleriyle etkileşimi ile ilgili ek soruları yanıtlamak için başka bir görüntüleme yöntemi kullanılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, yüksek içerikli görüntü analizi kullanarak birden fazla canlı hücrede proteinin kaderini test etmek için araçların nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız. Dolayısıyla bu yöntem, basit hücresel modellerde meydana geldiği gibi protein agregasyonu hakkında bilgi sağlayabilir. Hastaya özgü indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden farklılaşmış nöron gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.