Name: Yüksek içerik miktar Sod1 canlı hücreler Mutant Protein toplama oluşumu için tahlil geliştirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-04T12:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Keşfedin, SOD1 mutant protein toplanmasını HEK-293 hücrelerinde yüksek içerikli tarama için nicelendiren yeni bir analiz yöntemi. Bu teknik, ALS gibi nörodejeneratif hastalıklarda küçük moleküllerin etkisini değerlendirmeye olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Kore hükümeti (MSIP) (NMK-2014K1A4A7A01074642) ve Ulusal Araştırma Vakfı, Kore (NMG) bireysel bilim adamı destek programı (NMK-2013M3A9B5076486/NMG-2015R1D1A1A09057239) tarafından finanse edilen bir hibe tarafından desteklenmiştir.

1. lentivirus üretim Not: üretim ve işleme lentiviral vektörlerin gerçekleştirildiği rekombinant içeren araştırma için Ulusal Enstitüsü Sağlık (NIH) esaslarına göre DNA'SI. Gelişmiş YFP (SOD1WT-YFP ve SOD1A4V-YFP) ile A4V mutant SOD1 ve vahşi-türü öğesini plazmid kodlama Kim ark içinde açıklanmıştır. 11 PCR astar çifti 5 kullanarak her iki gen füzyon ürün güçlendirilmiş &#8242; - ATCGTCTAGACACCATGGCGACGAAGGTCGTGTGC - 3 &#8242; ve 5 &#8242;-TAGCGG CCGCTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3 &#8242; ve pTRIP-delta U3 CMV eklenmiş Plazmid 19 XhoI ve BsrGI kısıtlama siteleri kullanarak. Önceki deneyler, iki günde 1:4 1:6 oranında HEK-293T hücreleri ayrılmış. 20'den fazla geçit ve bakım hücre iyi transfection verimliliği sağlamak için daha az % 60 confluency yardımcı olur, kaçınma.
<ol><li>Gün hücre kültür orta (%10 FBS ve 4 mM L-glutamin ile yüksek glikoz DMEM) virüs üretim için 10 ml % 30-40 izdiham bir 10 cm çapında doku kültürü plaka (3 x 10 6 hücreler/çanak), HEK-293T hücreleri bölme 1 tarihinde,.</li>
	<li>10 cm çapında doku kültürü plaka (37 ° C, % 5 CO 2) bir CO 2 kuluçka makinesine gecede devam.</li>
	<li>On gün 2, 10 µg lentiviral vektörlerin içeren bir DNA transfection çözüm hazırlamak (pTRIP-delta U3 CMV - SOD1WT-YFP ya da - SOD1A4V-YFP) lentiviral ile birlikte ambalaj plazmid (5 µg pVSVg; pCMV-dR8.71 10 µg) () şekil 2A) 20. 1 M CaCl 2 125 µL ekleyebilir ve 500 µL distile su kullanarak birime ayarlayabilirsiniz. Yavaşça 0,05 M HEPES 500 µL karışımı ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya.</li>
	<li>Değiştir HEK-293T 1 mL DNA transfection solüsyon ile karışık orta 10 mL Önceden ısıtılmış taze kültür orta ile antibiyotik içermeyen hücreleri ve gecede 37 ° C, % 5 CO 2 kuluçkaya.</li>
	<li>3 günde, hücrenin süpernatant ile taze kültür orta yerine.</li>
	<li>Gün 4, üzerinde 15 mL tüp ve ölü hücreleri ve enkaz kaldırmak için 500 x g de 5 dk santrifüj süpernatant hasat. Daha fazla süpernatant büyük 60 mL şırınga kullanarak 0,45 µm filtreden geçirerek arındırmak. Hemen tek kullanımlık aliquots (300 µL) dağıtmak ve-80 ° C'de depolayın En fazla ürün etkinliğini korumak için donma-çözülme döngüsü önlemek.</li>
</ol> 2. Lentiviral iletim <ol><li>bölünmüş % 60 izdiham bulaşması için hücre kültürünü (HEK-293 hücreleri ve SH-SY5Y; de başına 5 x 10 5 hücre ve U2OS; iyi başına 1 x 10 5 hücre) 6-iyi doku kültürü plaka DMEM medya ile takıma 2 ml % 10 FBS.</li>
	<li>6-iyi doku kültürü plaka 37 ° C kuluçka makinesine %5 CO 2 adlı gecede devam.</li>
	<li>Donmuş lentivirus-80 ° C dondurucudan kaldır ve bir aliquot her kullanımdan önce buz çözme; değil refreeze.</li>
	Virüs çözdürme iken, <li>sıcak ilgi hücre satırı ile uyumlu serum içeren hücre kültür orta. Bir kez virüs tamamen çözdürülen, dilutions bir dizi hazırlamak (1:3, 1:10, 1:30 ve 1: 100) içinde bir taze 1.5 mL microfuge tüp DMEM.</li>
	<li>Düşük serum medya ile 1 ml tüpler hacmindeki getirmek.</li>
	<li>Polybrene (adlı bir hazır 4 µg/µL) eklemek 2 µL virüs/medya 1 ml. De pipetting tarafından mix ve hücrelere 1 mL karışımı ekleyin. Virüs 24 h için hücrelerle kuluçkaya</li>
	<li>Virüs medyayı çıkarın ve normal DMEM medya % 10 ile desteklenmiş yerine FBS. 37 ° c, % 5 CO 2 hücreleri korumak.</li>
	<li>Hücrelerinin büyümesini izlemek ve her iki günde kültür ortamı değiştirin. İzdiham 6-iyi çanak 10 cm çapında doku kültürü plaka genişletin.</li>
	Hücreleri yeterince genişletilmiş oldu bir kez <li>, 50 µL DMEM medya 384-iyi tahlil plakaları YFP ifade düzeyini denetlemek için bir kuyu başına tohum 1.5 x 10 4 hücre protein mikroskobu ile etiketledi. YFP etiketli protein hücre ifade bir sinyal-gürültü oranı gösterir &#8805; 3, hücre hisse senedi karşılık gelen hücre satırı için hazır olun.</li>
</ol> 3. Zaman bağımlı proteasome önleyici etkisi protein toplama Not: otomatik bir mikroskop kullanarak resim alma gerçekleştirmek (malzemeleri görmek).
<ol><li>% 100 DMSO (ALLN, 2 mM) 384-şey düz dipli Tabaklarda çözünmüş DMSO veya proteasome inhibitörü 0,25 µL dağıtmak.</li>
	<li>El ile DMEM 50 µL kuyuda başına tohum 1.5 x 10 4 hücre medya aynı plaka tahlil. Proteasome inhibitörü (ALLN) son konsantrasyonu 10 µM olmalıdır.</li>
	<li>37 ° C ve % 5 CO 2 mikroskop sistem çevre kontrol birimine ayarlayın. Deneysel kurulumunun bir ekran görüntüsü şekil 3 ' te gösterilen.</li>
	<li>Mikroskop yazılımı aşağıdaki ayarlarla kullanarak geniş alan Floresans modunda çalışır: LWD 20 X amaç, confocal modu, 4 alanları/iyi, bir saat yakalama aralığı ile. Her çalışma sonunda, çektiğiniz resimleri otomatik olarak sunucuya karşıya.</li>
</ol> 4. Canlı hücreler YFP ifade için atlamalı görüntüleme süresi ve görüntü analizi (tek kanal) Not: Aşağıdaki adımlarda, belgili tanımlık bilgisayar yazılımı (örneğin, Columbus) uygulanması açıklanmaktadır.
<ol><li>Seçin uygun algoritması (sitozol ve toplamları) birincil nesneleri segmentlere ayırmak için. Gerekirse, arka plan eşik ve kontrast parametreleri ( şekil 4) ayarlamak.</li>
	<li>Hücreleri hesaplama kullanarak &#39; hücreleri bulma &#39; 0.1 YFP yoğunluk kanal için bireysel bir eşik değeri ile. Kullanarak toplamları belirlemek bir &#39; noktalar bulmak &#39; algoritması bir göreli YFP nokta yoğunluğu ile &#62; 0.2 ve 1.0 yarma katsayısı.</li>
</ol> 5. Doz yanıt etkisi proteasome inhibitörleri protein toplama onların çekirdek (iki kanal) lekeli canlı hücreler üzerinde Not: otomatik bir mikroskop kullanarak resim alma gerçekleştirmek. Proteasome inhibitörleri (ALLN, Epoxomicin ve MG132) bir optimum eğri uyum sağlamak için beklenen ŞA 50 değeri üzerinde dayalı konsantrasyon aralığı belirlemek.
<ol><li>Hazırla seri dilutions 384-iyi depolama polipropilen bileşikler standart tarafından 1:3 seyreltme serisi plaka. Bileşik dilutions mix emin olun de bileşik konsantrasyonları doğru olduğundan emin olmak için.</li>
	<li>Proteasome inhibitörleri boş düz-alt siyah 384-iyi tahlil plakalar üzerinde 0,25 µL dağıtmak. Biz bir 384-kılcal kafa birimleri aktarma yeteneğine sahip ile donatılmış bir sıvı işleyicisi kullanmak.</li>
	<li>Tohum 1.5 x 50 bir kuyu başına 10 4 hücre µL tahlil plakaları DMEM medya. 37 ° C ve % 5 CO 2 24 h için tahlil plakaları kuluçkaya</li>
	<li>DMEM (37 ° C'de önceden ısındı) medya çözüm (Höchst 33342 adlı bir hisse senedi olarak 10 mg/mL) boyama ile 10 µL ekleyin ve 10 dakika süreyle oda sıcaklığında kuluçkaya</li>
	Mikro <li>başlatmakyazılımı çalışan baş. Deneysel kurulumunun bir ekran görüntüsü şekil 6 ' da gösterilmiştir. Seçin &#34; yapılandırma &#34; tab ve 20 X amaç ve doğru plaka türü seçin. Emin olmak &#34; yaka &#34; uygun odak farklı plaka türleriyle izin amaç üzerinde doğru değere ayarlanır.</li>
	<li>Select &#34; mikroskop &#34; sekmesini tanımla pozlama 1 olarak YFP (488 lazer) ve pozlama 2 Höchst olarak (405 laser). Her iki pozlama üzerinde filtre etkinleştirin ve pozlama 1 kamera 1 ve kamera 2 2 maruz atayabilirsiniz. ~ 800 ms pozlama 1 için pozlama süreleri ayarlıysa ve ~ 40 ms maruz kalma 2.</li>
	<li>Select pozlama 1. Ayarlayın odak yüksekliği 0 µm. için Select &#34; odak &#34;. Bir kez odaklı, kamera 1 ortaya çıkarmak. Pozlama uçak optimize etmek ve tıkırtı üstünde odak yüksekliğini ayarla &#34; almak yükseklik &#34;. ~ 3.000 en büyük piksel yoğunluğu vermek güç lazer ve pozlama zaman değişiyor. Pozlama parametreleri kaydedin. Tekrar maruz kalma 2.</li>
	<li>Select &#34; deney tanımı &#34; sekmesini oluşturmak bir düzen ve sublayout. Sürükle ve bırak ilgili düzen, pozlama, başvuru yansıması, skewcrop dosya ve sublayout. Deneme kaydedin.</li>
	<li>Select &#34; otomatik deney &#34; tab ve görüntüleri. Her çalışma sonunda, çektiğiniz resimleri otomatik olarak sunucuya karşıya.</li>
</ol> 6. Görüntü iki kanal görüntü analizi <ol><li>(nükleuslar, sitozol ve toplamları) birincil nesneleri segmentlere ayırmak için bilgisayar yazılımı algoritma seçin ( Şekil 7).</li>
	<li>Çekirdeği doğru bir şekilde bölümlenmiş nesneleri görsel denetim tarafından kesim yöntemi seçin. Höchst lekeli nesneleri Kanal 1 (Ch1) hücreleri belirlemek için kullanılır. YFP SOD1-A4V Kanal 2 (Ch2) toplam miktarını belirlemek için kullanılan mutant boyama.</li>
	<li>Kullanarak hücreleri hesaplama &#39; çekirdeği bulmak &#39; algoritması bölgeleri Höchst boyama olarak &#62; 20 µm 2, 7.0, bireysel bir eşik değeri 0.40 ve bir kontrast split faktörle &#62; 0.10.</li>
	<li>Veri tablosu oluşturma ve EC 50 her kullanarak bileşikler için belirlemek &#39; Non-linear regresyon &#39; grafik yazılım denklemde.</li>
</ol>

<ol><li>Schulte, J., Sepp, K. J., Wu, C., Hong, P., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+chemical+and+rnai+screens+for+suppressors+of+neurotoxicity+in+a+huntington%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">High-content chemical and rnai screens for suppressors of neurotoxicity in a huntington's disease model.</a> PLoS ONE. 6 (8), e23841(2011).</li>
<li>Honarnejad, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+implementation+of+a+high-throughput+compound+screening+assay+for+targeting+disrupted+ER+calcium+homeostasis+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Development and implementation of a high-throughput compound screening assay for targeting disrupted ER calcium homeostasis in Alzheimer's disease.</a> PLoS ONE. 8 (11), 1-12 (2013).</li>
<li>Burkhardt, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cellular+model+for+sporadic+ALS+using+patient-derived+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A cellular model for sporadic ALS using patient-derived induced pluripotent stem cells.</a> Mol Cell Neurosci. 56, 355-364 (2013).</li>
<li>Mattiazzi, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Content+Screening+for+Quantitative+Cell+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">High-Content Screening for Quantitative Cell Biology.</a> Trends Cell Biol. 26 (8), 598-611 (2016).</li>
<li>Kato, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyotrophic+lateral+sclerosis+models+and+human+neuropathology%3A+Similarities+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Amyotrophic lateral sclerosis models and human neuropathology: Similarities and differences.</a> Acta Neuropathologica. 115 (1), 97-114 (2008).</li>
<li>Strong, M. J., Kesavapany, S., Pant, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathobiology+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%3A+a+proteinopathy%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+neuropathol+exp+neurol%22%5BJournal%5D)">The pathobiology of amyotrophic lateral sclerosis: a proteinopathy?</a> J neuropathol exp neurol. 64 (8), 649-664 (2005).</li>
<li>Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Charcot+to+Lou+Gehrig%3A+deciphering+selective+motor+neuron+death+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS.</a> Nat rev Neurosci. 2 (11), 806-819 (2001).</li>
<li>Bruijn, L. I., Miller, T. M., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+Mechanisms+Involved+in+Motor+Neuron+Degeneration+in+Als%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Unraveling the Mechanisms Involved in Motor Neuron Degeneration in Als.</a> Annu Rev Neurosci. 27 (1), 723-749 (2004).</li>
<li>Vassall, K. a, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+stability+and+increased+formation+of+soluble+aggregates+by+immature+superoxide+dismutase+do+not+account+for+disease+severity+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Decreased stability and increased formation of soluble aggregates by immature superoxide dismutase do not account for disease severity in ALS.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (6), 2210-2215 (2011).</li>
<li>Hwang, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonamyloid+aggregates+arising+from+mature+copper%2Fzinc+superoxide+dismutases+resemble+those+observed+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonamyloid aggregates arising from mature copper/zinc superoxide dismutases resemble those observed in amyotrophic lateral sclerosis.</a> J Biol Chem. 285 (53), 41701-41711 (2010).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimerization%2C+Oligomerization%2C+and+Aggregation+of+Human+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis+Copper%2FZinc+Superoxide+Dismutase+1+Protein+Mutant+Forms+in+Live+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Dimerization, Oligomerization, and Aggregation of Human Amyotrophic Lateral Sclerosis Copper/Zinc Superoxide Dismutase 1 Protein Mutant Forms in Live Cells.</a> J Biol Chem. 289 (21), 15094-15103 (2014).</li>
<li>Shaw, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergent-insoluble+aggregates+associated+with+amyotrophic+lateral+sclerosis+in+transgenic+mice+contain+primarily+full-length%2C+unmodified+superoxide+dismutase-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Detergent-insoluble aggregates associated with amyotrophic lateral sclerosis in transgenic mice contain primarily full-length, unmodified superoxide dismutase-1.</a> J Biol Chem. 283 (13), 8340-8350 (2008).</li>
<li>Banci, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOD1+and+amyotrophic+lateral+sclerosis%3A+Mutations+and+oligomerization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">SOD1 and amyotrophic lateral sclerosis: Mutations and oligomerization.</a> PLoS ONE. 3 (2), 1-8 (2008).</li>
<li>Johnston, J. a, Dalton, M. J., Gurney, M. E., Kopito, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+high+molecular+weight+complexes+of+mutant+Cu%2C+Zn-superoxide+dismutase+in+a+mouse+model+for+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Formation of high molecular weight complexes of mutant Cu, Zn-superoxide dismutase in a mouse model for familial amyotrophic lateral sclerosis.</a> Proc Natl Acad Sci. 97 (23), 12571-12576 (2000).</li>
<li>Niwa, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disulfide+bond+mediates+aggregation%2C+toxicity%2C+and+ubiquitylation+of+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis-linked+mutant+SOD1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Disulfide bond mediates aggregation, toxicity, and ubiquitylation of familial amyotrophic lateral sclerosis-linked mutant SOD1.</a> J Biol Chem. 282 (38), 28087-28095 (2007).</li>
<li>Juneja, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognosis+in+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis%3A+progression+and+survival+in+patients+with+glu100gly+and+ala4val+mutations+in+Cu%2CZn+superoxide+dismutase%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Prognosis in familial amyotrophic lateral sclerosis: progression and survival in patients with glu100gly and ala4val mutations in Cu,Zn superoxide dismutase.</a> Neurology. 48 (1), 55-57 (1997).</li>
<li>Kaur, S. J., McKeown, S. R., Rashid, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+SOD1+mediated+pathogenesis+of+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Mutant SOD1 mediated pathogenesis of Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> Gene. 577 (2), 109-118 (2016).</li>
<li>de Bruyns, A., Geiling, B., Dankort, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Modular+Lentiviral+Vectors+for+Effective+Gene+Expression+and+Knockdown%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Construction of Modular Lentiviral Vectors for Effective Gene Expression and Knockdown.</a> Methods Mol Biol. 1448, 3-21 (2016).</li>
<li>Sirven, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Transgene+Expression+in+Cord+Blood+CD34%2B-Derived+Hematopoietic+Cells%2C+Including+Developing+T+Cells+and+NOD%2FSCID+Mouse+Repopulating+Cells%2C+Following+Transduction+with+Modified+TRIP+Lentiviral+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Enhanced Transgene Expression in Cord Blood CD34+-Derived Hematopoietic Cells, Including Developing T Cells and NOD/SCID Mouse Repopulating Cells, Following Transduction with Modified TRIP Lentiviral Vectors.</a> Mol Ther. 3 (4), 438-448 (2001).</li>
<li>Wu, C., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-titre+retroviral+vector+system+for+efficient+gene+delivery+into+human+and+mouse+cells+of+haematopoietic+and+lymphocytic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22J+gen+virol%22%5BJournal%5D)">High-titre retroviral vector system for efficient gene delivery into human and mouse cells of haematopoietic and lymphocytic lineages.</a> J gen virol. 91 (Pt 8), 1909-1918 (2010).</li>
<li>Irshad, H., Veillard, A., Roux, L., Racoceanu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+nuclei+detection%2C+segmentation%2C+and+classification+in+digital+histopathology%3A+A+review-current+status+and+future+potential%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Methods for nuclei detection, segmentation, and classification in digital histopathology: A review-current status and future potential.</a> IEEE Rev Biomed Eng. 7, 97-114 (2014).</li>
<li>Purschke, M., Rubio, N., Held, K. D., Redmond, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototoxicity+of+Hoechst+33342+in+time-lapse+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol+Sci%22%5BJournal%5D)">Phototoxicity of Hoechst 33342 in time-lapse fluorescence microscopy.</a> Photochem Photobiol Sci. 9 (12), 1634-1639 (2010).</li>
<li>Jaskova, K., Pavlovicova, M., Jurkovicova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+transporters+and+their+role+in+the+development+of+neuronal+disease+and+neuronal+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+physiol+biophys%22%5BJournal%5D)">Calcium transporters and their role in the development of neuronal disease and neuronal damage.</a> Gen physiol biophys. 31 (4), 375-382 (2012).</li>
<li>Kieran, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+with+arimoclomol%2C+a+coinducer+of+heat+shock+proteins%2C+delays+disease+progression+in+ALS+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Treatment with arimoclomol, a coinducer of heat shock proteins, delays disease progression in ALS mice.</a> Nat Med. 10 (4), 402-405 (2004).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

İstikrarlı hücre hatları oluşturmak için iki temel yaklaşım vardır. İlk birkaç hafta sürer ve genomik entegre plazmid DNA vektörel çizimler geçici transfection ve direnç işaretlenmesini gerektirir. İkinci birkaç saat kullanımı ile lentivirus, sınırlı bir çaba ile birden çok hücre hatlarında bu protokolü mükellef etkili ifade hedef protein yapma alır. GEZİ-CMV vektör19 , korunmuş iletim verimliliği ve istikrarlı transgene ifade ile kullanmak için sürekli bir vektör yapıldı. Bizim için sürpriz, oluş...

Protein toplama biyolojik bir işlem tarafından hangi kadar proteinler grup misfolded ve nörodejeneratif hastalıklarda (Amiloidoz) etken ajanı olarak hareket edebilir olur. Protein toplama karakterize patoloji başlangıcı etkileyen yeni faktörler keşfi kolaylaştırılması olduğu gibi hücresel disfonksiyon de toplamları rolünün anlaşılması önemlidir. Floresans öğesini proteinler canlı hücreler arasında görselleştirme deneyleri (HCS)1,2,3,4eleme yüksek içeriğe uygun geliştirilmesine yardımcı olabilir güçlü bir yöntemdir.
Amyotrofik lateral skleroz (ALS) toplamak ve ailesel ALS (fALS) ve sporadik ALS (sALS)5,6 motor nöronlarda birikir eğilimi ile misfolded proteinlerin kaynaklanan bir proteopathic hastalık olarak kabul edilir . Bir alt fALS olguların % 20 ~ ilişkili baskın mutasyonlar gen sitozolik antioksidan enzim kodlama ile bakır-çinko süperoksit dismutaz yazın 1 (SOD1)7,8. Bu genetik olarak türetilmiş disfonksiyon için birkaç olası nedeni, yapısı ve SOD1 türevleri, anormal istikrar, artmış unfolding hızı ve toplam9eğilimi gibi fonksiyon değişiklikleri de dahil olmak üzere önerilmiştir, 10. Özellikle tek doğrulanmış ve potansiyel olarak toksik özelliği her iki SOD1 ALS bağlantılı türevleri tarafından paylaşılan ve vahşi-tipi (WT) SOD1 bölümlere protein toplamları veya proteinaceous kapanımlar11,12 oluşturmak için artan bir eğilimi olduğunu . Misfolded mutant SOD1, ısrarla polyubiquitinated olduğunu ve ubiquitin-proteasome sistemi tarafından bozulmuş. Proteasome aktivitesinin inhibisyonu düşük düzeyde SOD113,14hangi formu amorf çözünür mutant SOD1 ile alışverişi yapabilirsiniz çözünür bileşenler yapılarından, agrega mutant birikimi sonucu olarak, yol açar sitozol15' te. Özellikle, SOD1 mutant A4V içinde (alanin kodon 4, Valin için değişti) en yaygın ALS neden mutasyon ve hızlı ateş hastalığı başlangıcı16sonra daha az 2 yıllık bir ortalama yaşam süresi ile yol açar. Biyokimyasal olarak, SOD1 A4V monomerize, toplamak ve amiloid gözenekleri oluşturmak için artan bir eğilim vardır; onun gözenek benzeri toplamları diğer hastalık bağlı mutant gibi form α-synuclein ve β-amiloid protein17amiloid gözeneklerin benzer. SOD1-agrega birikim dinamiklerini incelemek için geliştirilecek çözünür ve çözünmez SOD1 toplama formları izlemek için yöntem kalır.
Biz daha önce canlı hücre Imaging'i kullanma göstermiştir ve HEK-293 hücreleri geçici ALS ilişkili mutasyonlar SOD1 dimerization ve toplama11zarar floresan protein etiketli SOD1 ile transfected. Her ne kadar geçici ifade sistemleri kısa vadeli gen overexpression biyolojik sonucu hakkında yararlı bilgiler sağlayabilir, istenen genlerin istikrarlı entegrasyon sağlayan yöntemleri tahlil geliştirme için tercih edilebilir. Bu nedenle, lentiviral vektörler uzun vadeli ve düzenlenmiş gen ekspresyonu memeli hücreleri 18tarihinde bir görüşme olanağı sunuyoruz. Bu çalışmada rekombinant lentivirus WT taşıyan transduced istikrarlı hücre hatları nesil üzerinde duruldu ve mutant SOD1 sarı floresan protein (YFP) ile Etiketlenmiş. Canlı hücre görüntüleme mikroskobu ve SOD1 toplama otomatik miktar kullanarak, biz tetiklenir ve SOD1 toplama olayları üzerine proteasome inhibisyonu sayılabilir.

<table><tbody><tr><td>ALLN (C20H37N3O4)</td> <td>Millipore</td><td>208719</td><td></td></tr><tr><td>MG132 (C26H41N3O5)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>C2211</td><td></td></tr><tr><td>Epoksomisin (C 28H50N4O7)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3652</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H-3570</td><td></td></tr><tr><td>Opera</td><td>Perkin Elmer</td><td>OP-QEHS-01</td><td></td></tr><tr><td>Opera EvoShell yazılımı</td><td>Perkin Elmer</td><td>Ver 1.8.1</td><td></td></tr><tr><td>Operet</td><td>Perkin Elmer</td><td>OPRT1288</td><td></td></tr><tr><td>Harmony Görüntüleme yazılımı</td><td>Perkin Elmer</td><td>Ver 3.0.0</td><td></td></tr><tr><td>Columbus Görüntü analiz yazılımı</td><td>Perkin Elmer</td><td>Ver 2.3.2</td><td></td></tr><tr><td>CyBi Hummingwell sıvı işleme</td><td>CyBio AG</td><td>OL 3387 3 0110</td><td></td></tr></tbody></table>

yüksek içerik miktar sod1 canlı hücreler mutant protein toplama oluşumu için tahlil geliştirme

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Amyotrofik lateral skleroz (ALS) gen kodlama bakır-çinko süperoksit dismutaz 1 (SOD1) devralınan mutasyonlar neden ölümcül nörodejeneratif bir hastalıktır. SOD1 yapısal istikrarsızlık ve ailesel ALS hastalarında SOD1 pozitif kapanımlar tespiti ALS patoloji misfolded ve/veya toplanan SOD1 için potansiyel bir nedensel rolü destekler. Bu çalışmada, canlı hücreler toplamada SOD1 dinamikleri ölçmek için yaklaşımlar eleme yüksek içerik tarafından tasarlanmış bir hücre tabanlı tahlil gelişimini açıklar. Lentiviral vektörler kullanarak, biz vahşi tipi ve mutant A4V sarı floresan protein ile öğesini ve her iki proteinler sitozol toplama belirtisi olmadan ifade edildi bulundu SOD1 ifade istikrarlı hücre satırları oluşturulur. İlginçtir, sadece SOD1 A4V stabil HEK-293 ile ifade ancak U2OS veya SH-SY5Y hücre hatlarında proteasome inhibitörü tedavisi üzerine toplamları biçimi değil. Çeşitli proteasome inhibitörleri doz-yanıt analize göre toplama ölçmek ve toplama-oluşumu Kinetik tarafından hızlandırılmış mikroskobu izlemek mümkün olduğunu göstereceğiz. Yaklaşımımız ALS mutasyonlar rolünü SOD1 toplama oluşumunda etkisi miktarının yanı sıra SOD1 A4V toplama önlemek küçük moleküller için tarama olanağı sunar.

Lentivirus kullanarak oluşturma kararlı hücre kültürünü: SOD1 protein toplamları izleme için genel strateji şekil 1' de gösterilmiştir. Bir ilk adım olarak, biz bir lentiviral ifade vektör SOD1 istikrarlı gen teslim içine hücre hatları (Adım 1) için oluşturulan. İki lentiviral vektörler kodlama YFP öğesini SOD1 WT ve SOD1 A4V (SOD1WT-YFP ve SOD1A4V-YFP, sırasıyla) ambalaj ve zarf ile plazmid (şekil 2A) hazırlanmı...

Biz toplama misfolded proteinlerin ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bizim protocol detayları lentiviral istikrarlı hücre satırı üretimi, otomatik confocal görüntüleme ve görüntü analizi protein toplamları indüklenen. Açıklayıcı bir uygulama olarak SOD1 toplama bir saat ve doz bağımlı şekilde teşvik küçük moleküller etkisini okudu.

Yüksek içerik miktar Sod1 canlı hücreler Mutant Protein toplama oluşumu için tahlil geliştirme

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Bu deneyin genel amacı, küçük moleküllerin yanlış katlanmış proteinlerin agregasyonunu zamana ve doza bağlı bir şekilde modüle etmedeki etkisini incelemek için bir test geliştirmektir. Bu yöntem, hücresel tahlilin geliştirilmesi için temel soruların cevaplanmasına yardımcı olabilir ve kullanımı yüksek içerikli tarama teknikleri içindir. Bu tekniğin ana avantajı, çeşitli nörodejeneratif bozukluklarda meydana gelen protein agregasyonunu tespit etmek ve ölçmek için basit bir yöntem sağlamaktır.Bu tekniğin anlamı, ALS gibi nörodejeneratif hastalıkların potansiyel tedavisine doğru uzanır, çünkü hücresel tahlil geliştirmeye ve küçük molekül moderatörleri için tarama yapmaya izin veren basit bir yöntem önermektedir. Virüs üretimine başlamak için, plazmit transfeksiyonundan önce HEK-293 T hücrelerini 10 santimetrelik bir doku kültürü kabında ve 10 mililitre hücre kültürü ortamında% 30 ila 40 oranında bölün. Kültür plakasını gece boyunca 37 santigrat derecede %5'lik bir karbondioksit inkübatörde inkübe edin.Ertesi gün, ambalaj plazmitleri lentiviral vektörü, 125 mikrolitre bir molar kalsiyum klorür ile DNA transfeksiyon solüsyonu hazırlayın ve hacmi 500 mikrolitreye ayarlamak için damıtılmı

assay-development-for-high-content-quantification-sod1-mutant-protein

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu videoda, proteazom aktivitesini bloke eden, yanlış katlanmış, mutant proteinlerin, bir floresan etikete kaynaşmış, ubikitine bağımlı proteazomal bozunmaya uğramasını önleyen proteazom inhibitörleri kullanılarak hücre bazlı bir protein agregasyon testini gösteriyoruz, bu da hücre sitoplazması içinde birikmelerine yol açar. Protein agregatları daha sonra floresan mikroskobu ile görselleştirilir ve ölçülür.

Protein Agregat Oluşum Deneyi: Proteazom İnhibitörü ile İndüksiyon Üzerine Kültürlenmiş Hücrelerde Protein Agregasyonunu Tespit Etmek ve Ölçmek İçin Bir Yöntem

Bu videoda, deterjan fraksiyonlaması ile birlikte sikloheksimid muamelesi kullanılarak yanlış katlanmış proteinler için bir bozunma testi açıklanmaktadır. Bu yöntem, yanlış katlanmış proteinlerin dinamiklerini incelemeye ve protein döngüsünün derinlemesine mekanizmalarını ortaya çıkarmaya yardımcı olur.

Yanlış Katlanmaya Eğilimli Protein Bozunma Deneyi: Sikloheksimid Tedavisi ve Deterjan Fraksiyonlaması Kullanılarak Yanlış Katlanmış Protein Bozunmasını İzlemek İçin Bir Teknik

Bu video, genetiği değiştirilmiş Drosophila beyinlerindeki protein agregatlarının görüntülenmesini ve miktarının belirlenmesini göstermektedir. Beyinler sabitlenir, yıkanır ve montajdan önce solma önleyici bir madde ile muamele edilir. Görüntüler konfokal bir mikroskop kullanılarak yakalanır ve mutant protein agregatlarının iletimini gözlemlemek için nicelleştirilir.

Genetiği Değiştirilmiş Drosophila Beyinlerinde Protein Agregatlarının Görüntülenmesi ve Miktarının Belirlenmesi

Bu rapor, western blot veya floresan bazlı tahlillerle yanlış katlanmış proteinlerin bozunma oranlarını ölçmek için protokolleri açıklar. Yöntemler, diğer yanlış katlanmış proteinlerin analizine ve yüksek verimli taramaya uygulanabilir.

Hücreler yanlış katlanmış proteinlerle degradasyonundan Tahliller

Protein toplama ve merkezi sinir sistemi Drosophila modellerinin autophagic akı floresan-görüntüleme tabanlı cep biyolojik çalışmalar nicel veri ayıklamak için bir basit ve uyarlanabilir iş akışı geliştirdiğimiz ateş.

Ateş Drosophila ImageJ kullanarak Fluorescently Tagged proteinlerin tarafsız analizi ile yılında niceliksel hücre biyolojisi

Hücresel senesans, Yaş ile ilgili kronik patolojilerin gelişiminde önemli bir faktördür. Parlak hücreleri hedefleyen terapinin tanımlanması, sağlıklı yaşlanmanın uzatılması için söz veriyor. Burada, tek hücrelerde senesans ilişkili β-galaktosidaz aktivitesinin ölçümüne dayalı senoterapötik teşhis için ekrana bir roman tahlil sunuyoruz.

Senoterapötik Ilaçların tanımlanması için SA-β-Galactosidaz tabanlı tarama tahlili

Uyuşturucu hedef nişan ölçümleri etkili ilaç geliştirme ve kimyasal sonda doğrulama için merkezi. Burada, uyuşturucu-hedef nişan yüksek içerik görüntüleme hücresel termal kayması tahlil (CETSA) bir Mikroplaka uyumlu uyum içinde kullanarak ölçmek için bir protokol ayrıntılı.

Yüksek içeriği hedef nişan yapisan hücrelerdeki ölçmek için Imaging kullanarak

Buraya, taşıma retinitis pigmentosa ile ilişkili rhodopsin mutantların ölçmek için bir yüksek-içerik görüntüleme yöntemi nitelendirdi. Bir çoklu dalga boyu Puanlama analiz rhodopsin protein hücre yüzeyine veya tüm cep telefonu ölçmek için kullanıldı.

Rhodopsin taşıma tahlil yüksek içerik görüntüleme analizi tarafından

Burada floresan korelasyon spektroskopisi kullanarak hücre lisat ve canlı hücrelerde protein oligomerlerini ve toplamayı ölçmek için bir prosedür sunuyoruz.

Floresan Korelasyon Spektroskopisi Kullanılarak Protein Toplamanın Tespiti

Burada, nematod Caenorhabditis elegans'ta protein agregasyon kinetiğinin analizi için bir yöntem sunulmuştur. Yaş senkronize edilmiş bir popülasyondan gelen hayvanlar farklı zaman noktalarında görüntülenir, ardından CellProfiler'da yarı otomatik dahil etme sayımı ve AmyloFit'teki matematiksel bir modele uyar.

Caenorhabditis elegans'ta Otomatik Inklüzyon Sayımı Kullanarak Protein Agregasyon Kinetiğinin In Vivo'da İzlenmesi

Parkinson hastalığının patogenezini incelemek ve anlamak için α-sinükleinin in vivo fizyolojik modeli gereklidir. İnsanlaştırılmış bir maya modeli kullanarak α-sinükleinin sitotoksisitesini ve agrega oluşumunu izlemek için bir yöntem tanımladık.

İnsanlaştırılmış Bir Maya Modeli Kullanarak α-Sinüklein Toksisitesini ve Agregasyonunu İncelemek İçin Bir Yöntem

Keşfedin, SOD1 mutant protein toplanmasını HEK-293 hücrelerinde yüksek içerikli tarama için nicelendiren yeni bir analiz yöntemi. Bu teknik, ALS gibi nörodejeneratif hastalıklarda küçük moleküllerin etkisini değerlendirmeye olanak tanır.

Yüksek içerik miktar Sod1 canlı hücreler Mutant Protein toplama oluşumu için tahlil geliştirme

Daha fazla video keşfet