Aşırı Ezme ve İnsanın Saflaştırılması Cis -prenıltransferaz in Escherichia coli

Bu protokolün genel amacı, denatüre edici olmayan koşullar altında kodon ile optimize edilmiş insan cis-preniltransferazını aşırı eksprese etmek ve saflaştırmak ve enzimatik aktivitesini test etmektir. Prosedür, ökaryotik uzun zincirli cis-preniltransferaz dehidrodolichyl diphosphate sentaz veya DHDDS ile gösterilmiştir. Bu yöntem, izoprenoid sentez anlayışımızı ilerletebilir ve DHDDS'deki mutasyonlarla ilişkili retinitis pigmentosa'nın patofizyolojik mekanizması hakkında önemli bilgiler sağlayabilir.

Bu tekniğin temel avantajları, basit, uygun maliyetli ve zaman kazandıran olmasıdır. Ayrıca, diğer cis-preniltransferaz proteinlerinin yüksek miktarda üretimi için genelleştirilebilir. Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı gibi insan DHDDS'nin bir ifadesini klonlayarak başlayın.

Hücreleri tampon A, mililitre DNaz I başına bir mikrogram ve bir proteaz inhibitörü karışımı içinde yeniden süspanse edin. Ardından, yeniden süspanse edilmiş hücreleri bir cam Teflon homojenizatör kullanarak homojenize edin. Hücreleri 12.000 ila 15.000 psi'de bir Mikroakışkanlaştırıcı veya eşdeğeri ile bozun.

Daha sonra, hücre lizatını dört santigrat derecede 45 dakika boyunca 40.000 kez g'de santrifüjleyin. Çözünür fraksiyonu içeren süpernatanı geri kazanın. Süpernatanı, 10 milimolar imidazol ile beş ila 10 milimetre kobalt ile hareketsizleştirilmiş bir metal afinite kromatografi kolonuna yükleyin.

Hızlı bir protein sıvı kromatografi makinesine yükledikten sonra, spesifik olmayan protein bağlanmasını azaltmak için kolonu 10 milimolar imidazol içinde tampon A ile iyice yıkayın. FPLC programına başlayın. Aşırı eksprese edilen proteinleri 250 milimolar imidazol ile desteklenmiş tampon A ile elute edin.

Elüsyonu takiben, tampon A ile dengelenmiş 53 mililitre hazırlayıcı bir tuzdan arındırma sütunu kullanarak imidazol'ü çıkarın.Ardından, hekzahistidin etiketli tioredoksin DHDDS füzyonlarını çıkarmak için ayrıştırılan proteinlere hekzahistidin etiketli TEV proteaz ekleyin. Karışımı gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, parçalanmış proteinleri, beş milimolar imidazol ile desteklenmiş tampon A ile dengelenmiş kobalt ile hareketsizleştirilmiş bir metal afinite kromatografi kolonuna yükleyin.

Parçalanmış hekzahistidin etiketli tioredoksin ve TEV proteazı çıkarmak için akışı toplayın. 30 kilodalton moleküler ağırlıklı kesilmiş santrifüj filtre kullanarak akışı üç ila dört mililitre arasında yoğunlaştırın. Daha sonra, konsantre proteini, son saflaştırma için tampon A ile dengelenmiş bir Superdex 200 boyutlu dışlama kromatografi kolonuna yükleyin.

Numuneleri bir fraksiyon toplayıcıdaki 96 oyuklu bir rafa yerleştirin. Protein bir dimer olarak ortaya çıkar. Elüsyon profilini bir kolon kalibrasyon eğrisi ile karşılaştırarak ilgili fraksiyonları seçin.

Bu noktada, SDS-PAGE kullanarak preparatın saflığını değerlendirin. Son olarak, aşağı akış deneyi için gereken protein konsantrasyonunu belirleyin ve saflaştırılmış konsantre proteinlerin sıvı nitrojen içinde hızlı dondurulması. Alikotları kullanana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Proteinin donma-çözülme döngülerine dayanabilmesini sağlamak için, donmuş proteinlerin bir kısmını çözün. Çözünmeyen agregaları çıkarmak için alikotu 21.000 kez g'de 10 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeyi takiben süpernatanı toplayın.

Daha sonra, proteinleri ultra performanslı bir sıvı kromatografi sistemi kullanılarak TNXB ile önceden dengelenmiş bir Superdex 200 analitik kolonuna yükleyin. Proteinin elüsyon profilini tespit etmek için triptofan floresansını izleyin. Moleküler ağırlık değerlendirmesi için SEC sütun üreticileri aracılığıyla kullanılabilen geçerli bir kalibrasyon eğrisine sahip olduğunuzdan emin olun.

Saflaştırılmış proteinin aktivitesini sağlamak için, önce beş mikromolar saflaştırılmış DHDDS'yi 10 mikromolar FPP ve 50 mikromolar C14 IPP ile karıştırın. Reaksiyonu 22 ila 30 santigrat derecede 0.5 milimolar magnezyum klorür ile tampon A'da başlatın. 20 milimolar EDTA ile desteklenmiş 15 mikrolitre tampon A ilavesiyle reaksiyonun hemen söndürülmesini takiben sıfır, iki, dört ve altı saat sonra reaksiyondan 15 mikrolitre numune çekin.

Ardından, bir mililitre suya doymuş 1-butanol ekleyin ve reaksiyon ürünlerini çıkarmak için iyice girdaplayın. Protokol burada durdurulabilir ve numuneler daha sonra okunmak üzere saklanabilir. Ardından, sintilasyon kokteylini örneklere ekleyin.

Bir sintilasyon sayacı kullanarak, toplam radyoaktiviteyi temsil eden 15 mikrolitre reaksiyonun radyoaktivitesi ile birlikte C14'ü kapsayan bütanol fazındaki reaksiyon ürünlerini nicelleştirin. Son olarak, toplam C14 IPP konsantrasyonlarından kullanılan yüzdeyi hesaplayarak her bir zaman noktasında net C14 IPP katılımını hesaplayın ve sonuçları zamanın bir fonksiyonu olarak çizin. Zamanla net C14 IPP katılımında bir artış bekleniyor.

Her saflaştırma adımında elde edilen numuneler burada gösterilmektedir. Bu SDS-PAGE analizi, DHDDS'nin aşamalı olarak saflaştırılmasını gösterir ve bu da yüksek oranda saflaştırılmış bir ürünle sonuçlanır. Bu kromatogram, saflaştırılmış enzimin analitik boyut dışlama kromatografisinin sonuçlarını temsil eder ve proteinin yalnızca bir homodimer olarak gözlemlendiğini ortaya çıkarır.

Burada ok, boşluk hacmini gösterir. Temsili bir zamana bağlı aktivite testi, C14 IPP katılımının altı saat içinde açıkça arttığını ve saflaştırılmış enzimin işlevsel olduğunu doğruladığını ortaya koymaktadır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu basit preparat iki ila üç gün içinde yapılabilir, bu da oldukça saf ve aktif bir enzim ile sonuçlanır.

Bu videoyu izledikten sonra, insan cis-preniltransferazını E.coli'den nasıl aşırı eksprese edeceğinizi ve saflaştıracağınızı ve aktivitesini zamana bağlı bir şekilde nasıl ölçeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.