Name: Aşırı Ezme ve İnsanın Saflaştırılması Cis -prenıltransferaz in Escherichia coli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Keşfedin, insan cis-preniltransferazının Escherichia coli'de aşırı ekspresyonu ve saflaştırılması için basit, ekonomik ve zaman kazandıran bir yöntem. Bu teknik, izoprenoid sentezi ve retinitis pigmentosa araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Yapısal Hücre Biyolojisi (1775/12) &#39;da İsrail Bilim Vakfı Araştırma Mükemmellik Merkezi (I-CORE) ve İsrail Bilim Vakfı tarafından 1721/16 ve 2338/16 (YH) ve 825/14 (DK) hibeleri ile finanse edildi. ). Fields Estate Vakfı&#39;nın DK&#39;ya desteği çok takdir edilmektedir. Bu çalışma, Ilan Edri ve Michal Goldenberg tarafından Tel Aviv Üniversitesi Sackler Tıp Fakültesi&#39;nin MD tez şartlarının kısmen yerine getirilmesiyle gerçekleştirildi.

1. E. coli &#39;de aşırı salgılamasının için sis -PT klonlanması <ol><li> 109aa tioredoksin (TRX) proteini 17 ile kaynaştırılmış protein dizilerinin klonlanması ve yüksek seviyede ekspresyonu için tasarlanmış pET-32b ifade vektörünü ve tam boy cis -PT&#39;nin E. coli kodon-optimize edilmiş 18 kodlama dizisini elde edin. </li><li> TEV-proteaz, bir kısa esnek bir bağlayıcı ile ve ardından (tütün etch virüsü proteaz) parçalama bölgesine ( &quot;/&quot; bölünme noktasını gösterir ENLYFQ / G) 9 için özen cis akış yukarı (SGSGSG, yarılma sitesi erişilebilirlik arttırmak için) -PT dizisi (Şekil 1 A). Ayrıca, klonlama için uygun 5 &#39;ve 3&#39; kısıtlama bölgeleri ekleyin. </li><li> Standart ligasyon teknikleri kullanılarak sentezlenmiş DNA yapısını pET-32b vektörü içine kopyalayın 10 . </li></ol> 2. Overexpreİnsan DHDDS&#39;sinin E. coli&#39;de bulunması <ol><li> E. coli T7&#39;i, yetkili hücreleri, üreticinin talimatlarına göre TRX-füzyon DHDDS yapısı ile ifade edin. </li><li> Dönüştürülen hücreleri, ampisilin seçici koşullar altında (200 mg / L) LB-agar üzerindeki imalatçının talimatlarına göre plakaya yerleştirin. </li><li> Seçilen kolonileri, 100 mg / L ampisilin ile 250 ml&#39;lik şişeler başlangıç ​​kültürlerinde 100 mL&#39;lik LB ortamına aşılayın ve gece boyunca 200 rpm&#39;de sabit çalkalama ile 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Kültürün 80 mL&#39;si, her biri, 100 mg / L NaCl ile 1.5 L 2x YT ortamı (16 g / L tripton, 10 g / L maya özütü, 5 g / L NaCl) içeren iki 5 L&#39;lik şişeye (40 mL / şişe) L ampisilin. </li><li> Kültürü OD 600 nm = 0.5&#39;e ulaşana kadar 180 rpm&#39;de sabit çalkalama ile 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Sıcaklığı 16 ° C&#39;ye indirin ve hücreleri, 0.5 mM izopropil β-D-l-tiogalaktopiranozit (IPTG) ilave ederek indükleyin. aleyhteProtein dozu için 16-20 saat boyunca aynı koşullar altında inkübe edildi. </li><li> Hücreleri santrifüjle (10 dakika için 10,000 x g ) hasat edin. Not: Protokol burada duraklatılabilir; Hücreler pelet arındırılıncaya kadar -80 ° C&#39;de tutulmalıdır. </li></ol> 3. İnsan DHDDS&#39;sinin Arıtımı <ol><li> Hücreleri tampon A&#39;ya (25 mM Tris-HC1, pH 7.5, 150 mM NaCl,% 0.1 Triton X-100, 10 mM β-merkaptoetanol), 1 μg / mL DNase I ve bir proteaz inhibitörü karışımı içine tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Bir cam-Teflon homojenleştirici kullanarak hücreleri homojen hale getirin. </li><li> Hücreleri 12.000 - 15.000 psi&#39;de bir mikrofluidizer veya eşdeğeri kullanarak parçalayın 11 . </li><li> 4 dakika 40 dakika, 40,000 xg&#39;de hücre lizatı santrifüj ° C. Çözülebilir fraksiyonu içeren süpernatanı alın. </li><li> Süpernatanı, 5 - 10 mL kobalt hareketsizleştirilmiş metal afinite kromatografisine (Co2 + -IMAC) 12 sütun üzerine 10Bunu takiben, spesifik olmayan protein bağlanmayı azaltmak için tampon A ve 10 mM imidazol ile iyice yıkanır. </li><li> Aşırı preslenmiş proteinleri 250 mM imidazol ile takviye edilmiş tampon A ile elute edin. </li><li> İmidazolü, tampon A ile dengelenmiş 53 mL&#39;lik bir hazırlayıcı tuz giderme sütunu kullanarak çıkarın. </li><li> 6xHis etiketli TRX füzyon proteinini gece boyunca 4 ° C&#39;de çıkarmak için elüe edilen proteinlere 6xHis etiketli TEV proteaz (50 mg protein başına 1 mg TEV proteaz) ekleyin. </li><li> Bölünmüş 6x His-etiketli TRX füzyon protein ve TEV proteaz kaldırmak için, 5 mM imidazol ile takviye tampon A ile dengelenmiş bir Co 2 + -IMAC sütun üzerine parçalanmış protein yükleyin. </li><li> Akışı toplayın ve 30 kDa&#39;lık bir moleküler ağırlıklı kesme santrifüj filtresi kullanarak 3-4 mL&#39;ye konsantre edin. </li><li> Konsantre proteini, son saflaştırma için tampon A ile dengelenmiş bir süperdeks-200 ebat dışlama kromatografi kolonuna yükleyin. Protein, dimer (~ 76 kDa) olarak akar. </li&gt; <li> Elution profilini bir sütun kalibrasyon eğrisi ile karşılaştırarak ilgili fraksiyonları seçin. </li><li> SDS-PAGE kullanarak hazırlığın saflığını değerlendirin. </li><li> İndirgenmiş deneyler için gereken protein konsantrasyonunu belirleyin ve sıvı nitrojende saflaştırılmış, konsantre proteinlerin küçük miktarlarını dondurun ve kullanana kadar -80 ° C&#39;de saklayın. </li></ol> 4. Analitik Boyut Dışlama Kromatografisi (SEC) <ol><li> Proteinin donma-çözme döngülerine dayanma kabiliyetini sağlamak için donmuş proteinlerin bir kısmını çözdürün ve çözünmeyen agregaları çıkarmak için 10 dakika boyunca 21.000 x g&#39;de santrifüjleyin. Süpernatanı toplayın. </li><li> Proteinleri, ultra-performanslı bir sıvı kromatografi sistemi 13 kullanarak 25 mM Tris-HC1, pH 7.5, 150 mM NaCl,% 0.02 Triton X-100, 10 mM β-merkaptoetanol ile önceden dengelenmiş bir süper-dex-200 analitik kolona yükleyin , 14 . </li><li> Triptofan tohumu izleyinProteinlerin elüsyonlu elüsyon profili tespit etmek için scence (λ ex = 280 nm, λ em = 350 nm). Moleküler ağırlık değerlendirmesi için geçerli bir kalibrasyon eğrisine sahip olduğunuzdan emin olun - bu eğriler SEC sütun üreticileri aracılığıyla edinilebilir. </li></ol> 5. Enzim Kinetikleri - Zamana Bağlı Faaliyet 15 , 16 , 17 <ol><li> 30 ° C - saflaştırılmış proteinin aktivitesini sağlamak için, 22 ° C&#39;de 0.5 mM MgCl2 ile tampon A içinde reaksiyonu başlatmak için 10 uM FPP ve 50 uM 14C-IPP ile saflaştırılmış DHDDS 5 uM karıştırın. Not: Tam reaksiyon koşulları, DHDDS&#39;den farklı cis- PT&#39;lerin preparatlarına göre değişiklik gösterebilir. Üstelik DHDDS&#39;nin aktivitesi ayrıca sıcaklığa ve [Mg 2+ ] bağlıdır. Dikkat: 14 C-IPP radyoaktiftir ve yerel radyasyon güvenlik yönetmeliklerine uygun olarak kullanılmalıdır. </li&gt; <li> 15 μL tampon A ilave edilmiş 20 mM EDTA (10 mM EDTA nihai konsantrasyona) eklenmesiyle reaksiyonun derhal söndürülmesinin ardından 0, 2, 4 ve 6 saat reaksiyondan 15 μL numuneler çıkarın. </li><li> Ekle 1 ml H2 iyice reaksiyon ürünleri elde etmek için 1-butanol ve vorteks O-doymuş. Not: Protokol burada durdurulabilir ve numuneler daha sonra okunacak şekilde tutulabilir. </li><li> Numunelere sintilasyon kokteyli ilave edin ve bir sintilasyon sayacı kullanarak, toplam radyoaktiviteyi temsil eden reaksiyon karışımından 15 uL&#39;lik radyoaktivite ile birlikte 14 C&#39;yi kapsayan bütanol fazındaki reaksiyon ürünlerini nicel hale getirin. </li><li> Her zaman noktasından 0 saatlik örnekleri kullanarak ölçülen arka plan okumalarını çıkarın ve kullanılan 14 C-IPP yüzdesini hesaplayın. </li><li> Toplam 14 C-IPP katılma oranını her bir zaman noktasında hesaplayın, toplam 14 </&gt; C-IPP konsantrasyonları ve sonuçları zamanın bir fonksiyonu olarak çizin. Net 14 C-IPP katılımının zamanla artması beklenmektedir. </li></ol>

<ol><li>Grabinska, K. A., Park, E. J., Sessa, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cis-Prenyltransferase%3A+New+Insights+into+Protein+Glycosylation%2C+Rubber+Synthesis%2C+and+Human+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">cis-Prenyltransferase: New Insights into Protein Glycosylation, Rubber Synthesis, and Human Diseases.</a> J Biol Chem. 291 (35), 18582-18590 (2016).</li>
<li>Ogura, K., Koyama, T., Sagami, H. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/chapter/10.1007/978-1-4615-5901-6_3">Polyprenyl diphosphate synthases.</a> Subcell Biochem. 28, 57-87 (1997).</li>
<li>Ogura, K., Koyama, T. Enzymatic Aspects of Isoprenoid Chain Elongation. Chem Rev. 98 (4), 1263-1276 (1998).</li>
<li>Imperiali, B., O'Connor, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+N-linked+glycosylation+on+glycopeptide+and+glycoprotein+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Effect of N-linked glycosylation on glycopeptide and glycoprotein structure.</a> Curr Opin Chem Biol. 3 (6), 643-649 (1999).</li>
<li>Bukhtiyarov, Y. E., Shabalin, Y. A., Kulaev, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubilization+and+characterization+of+dehydrodolichyl+diphosphate+synthase+from+the+yeast+Saccharomyces+carlsbergensis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Solubilization and characterization of dehydrodolichyl diphosphate synthase from the yeast Saccharomyces carlsbergensis.</a> J Biochem. 113 (6), 721-728 (1993).</li>
<li>Adair, W. L., Cafmeyer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+cis-prenyltransferase+required+for+dolichyl+phosphate+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Saccharomyces cerevisiae cis-prenyltransferase required for dolichyl phosphate biosynthesis.</a> Arch Biochem Biophys. 259 (2), 589-596 (1987).</li>
<li>Zelinger, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+missense+mutation+in+DHDDS%2C+encoding+dehydrodolichyl+diphosphate+synthase%2C+is+associated+with+autosomal-recessive+retinitis+pigmentosa+in+Ashkenazi+Jews%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">A missense mutation in DHDDS, encoding dehydrodolichyl diphosphate synthase, is associated with autosomal-recessive retinitis pigmentosa in Ashkenazi Jews.</a> Am J Hum Genet. 88 (2), 207-215 (2011).</li>
<li>Zuchner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-exome+sequencing+links+a+variant+in+DHDDS+to+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Whole-exome sequencing links a variant in DHDDS to retinitis pigmentosa.</a> Am J Hum Genet. 88 (2), 201-206 (2011).</li>
<li>Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+soluble+His%286%29-tagged+TEV+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease.</a> Methods Mol Biol. 498, 297-307 (2009).</li>
<li>Crouse, G. F., Frischauf, A., Lehrach, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+and+simplified+approach+to+cloning+into+plasmids+and+single-stranded+phages%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">An integrated and simplified approach to cloning into plasmids and single-stranded phages.</a> Methods Enzymol. 101, 78-89 (1983).</li>
<li>Middelberg, A. P. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/073497509502007P">Process-scale disruption of microorganisms.</a> Biotechnol Adv. 13 (3), 491-551 (1995).</li>
<li>Block, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilized-metal+affinity+chromatography+%28IMAC%29%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review.</a> Methods Enzymol. 463, 439-473 (2009).</li>
<li>Sachyani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+a+Kv7.1+potassium+channel+gating+module%3A+studies+of+the+intracellular+c-terminal+domain+in+complex+with+calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural basis of a Kv7.1 potassium channel gating module: studies of the intracellular c-terminal domain in complex with calmodulin.</a> Structure. 22 (11), 1582-1594 (2014).</li>
<li>Shuart, N. G., Haitin, Y., Camp, S. S., Black, K. D., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+for+3%3A1+subunit+stoichiometry+of+rod+cyclic+nucleotide-gated+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism for 3:1 subunit stoichiometry of rod cyclic nucleotide-gated ion channels.</a> Nat Commun. 2, 457(2011).</li>
<li>Chang, S. Y., Tsai, P. C., Tseng, C. S., Liang, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refolding+and+characterization+of+a+yeast+dehydrodolichyl+diphosphate+synthase+overexpressed+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Refolding and characterization of a yeast dehydrodolichyl diphosphate synthase overexpressed in Escherichia coli.</a> Protein Expr Purif. 23 (3), 432-439 (2001).</li>
<li>Chang, S. Y., Ko, T. P., Liang, P. H., Wang, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytic+mechanism+revealed+by+the+crystal+structure+of+undecaprenyl+pyrophosphate+synthase+in+complex+with+sulfate%2C+magnesium%2C+and+triton%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Catalytic mechanism revealed by the crystal structure of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with sulfate, magnesium, and triton.</a> J Biol Chem. 278 (31), 29298-29307 (2003).</li>
<li>Guo, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structures+of+undecaprenyl+pyrophosphate+synthase+in+complex+with+magnesium%2C+isopentenyl+pyrophosphate%2C+and+farnesyl+thiopyrophosphate%3A+roles+of+the+metal+ion+and+conserved+residues+in+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Crystal structures of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with magnesium, isopentenyl pyrophosphate, and farnesyl thiopyrophosphate: roles of the metal ion and conserved residues in catalysis.</a> J Biol Chem. 280 (21), 20762-20774 (2005).</li>
<li>Collins, F. S., Green, E. D., Guttmacher, A. E., Guyer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vision+for+the+future+of+genomics+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A vision for the future of genomics research.</a> Nature. 422 (6934), Institute, U.S.N.H.G.R. 835-847 (2003).</li>
<li>Freeze, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+human+glycosylation+disorders%3A+biochemistry+leads+the+charge%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Understanding human glycosylation disorders: biochemistry leads the charge.</a> J Biol Chem. 288 (10), 6936-6945 (2013).</li>
<li>LaVallie, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thioredoxin+gene+fusion+expression+system+that+circumvents+inclusion+body+formation+in+the+E.+coli+cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%28N+Y%29%22%5BJournal%5D)">A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm.</a> Biotechnology (N Y). 11 (2), 187-193 (1993).</li>
<li>Elena, C., Ravasi, P., Castelli, M. E., Peiru, S., Menzella, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+codon+optimized+genes+in+microbial+systems%3A+current+industrial+applications+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Expression of codon optimized genes in microbial systems: current industrial applications and perspectives.</a> Front Microbiol. 5, 21(2014).</li>
<li>Vincentelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+protein+expression+screening+and+purification+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput protein expression screening and purification in Escherichia coli.</a> Methods. 55 (1), 65-72 (2011).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

E. coli hücrelerindeki işlevsel insan DHDDS&#39;sinin saflaştırılması için burada açıklanan protokol, basit ve etkili olup uygun bir yapı elde edildiğinde 3-4 gün içinde proteini fazla ifade ve saflaştırmaya izin verir. Protein saflaştırma için bu gibi protokoller, böylece protein seviyesinde 19 de patojenik mekanizmalar karakterize etmek için yüksek verimli yöntemlerin geliştirilmesine ihtiyaç, bir çok hastalık 18. genetik ilişkin bilgilerin bolluk mesafede genom...

Preniltransferazlar, izopentenil difosfat (IPP) kullanarak alikolit difosfatın zincir uzamasını, çoklu yoğunlaşma reaksiyonları 1 , 2 yoluyla katalize eden bir grup enzimdir. Z tipi enzimler, yoğunlaşma reaksiyonundan cis çift ​​bağlarının oluşumunu katalizlerken, E-tipi enzimler, trans çift ​​bağ oluşumunu katalize eder 3 . cis--Prenyltransferases (sis -PT, Z-tipi enzimler) klasik kısa zincirli (Cı-15), orta-zincirli (Cı-50-55) içine ürün zinciri uzunluğuna göre sınıflandırılır ve uzun zincirli (Cı-70-120 ) 4 . DHPDS (dehidrodirililik fosfat sentaz), farnesil difosfatın (FPP, bir alilikik difosfat) zincir uzamasını, izopentenil difosfat (IPP) 1 ile çoklu kondansasyonlar yoluyla katalizleyen bir ökaryotik uzun zincirli cis -PT&#39;dir, 5 , 6 . Bu, N-bağlantılı protein glikosilasyonuna 1 dahil olan glikosil taşıyıcı molekül olan dolichylpyrophosphate için bir öncül olarak görev yapan bir C 55-100 poliprenil difosfat olan dehidrodoliril difosfatın oluşumuyla sonuçlanır. Ashkenazi Yahudileri arasında, DHDDS&#39;deki bir missense muhafazakar olmayan mutasyon (K42E) otozomal resesif retinitis pigmentosa 7 , 8 ile sonuçlanır. Dolayısıyla, mevcut protokol, mekanik çalışmalar için uygun saflaştırılmış DHDDS&#39;yi elde etmek için geliştirildi. Escherichia coli , rekombinant protein ekspresyonu için en uygun ve uygun maliyetli konak olarak düşünülür ve bu nedenle de en sık kullanılan konakçıdır. Bununla birlikte, bir heterolog olarak E. coli&#39;deki proteinleri aşırı ifade etmeye çalışırsa, proteine ​​spesifik hususlar yapılmalıdır. Düzgün şekilde katlanan aktiviteyi elde etmekE. rekombinant proteinlerin E. coli&#39;den ayrılması, farklı proteinlerin farklı özelliklerinden dolayı basit bir konu değildir. Bu engellerin üstesinden gelmek için sayısız yaklaşım geliştirildi. Burada, protein füzyonunun kullanımı, optimize edilmiş kültür koşulları ve kodon optimizasyonu, E. coli&#39;de işlevsel olarak aktif insan DHDDS&#39;sinin aşırı ekspresyonunu ve saflaştırılmasını sağlamak için kullanıldı. Unutmayın, protein füzyonu olmaksızın maya cis- PT&#39;yi aşırı ifade etme girişiminde bulunmak, deterjan 12 varlığında bile tam çözünmezlik nedeniyle başarısız olmuştur. Açıklanan protokol, basit, uygun maliyetli, zaman kazandıran ve mekanik çalışmalara uygun DHDDS preparatlarını elde etmeyi sağlar. Farklı türler arasındaki cis- PT homolojisi göz önüne alındığında, bu protokolün diğer ökaryotik cis- PT için de uygulanabileceğini önermekteyiz.

<table><tbody><tr><td>pET-32b</td><td>Novagen</td><td>69016-3</td><td></td></tr><tr><td>T7 Ekspres&nbsp; lysY&nbsp; Yetkili&nbsp; E. coli&nbsp; (Yüksek Verimlilik)</td><td>NEB</td><td>C3010I</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, EDTA İçermeyen Proteaz İnhibitörü Kokteyl</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>TALON-süper akışlı reçine</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9574-99</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep 26/10 tuz giderme kolonu&nbsp;</td><td>GE Sağlık</td><td>17508701</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 16/60 superdex-200&nbsp;</td><td>GE Sağlık</td><td>28989335</td><td></td></tr><tr><td>superdex-200 artışı 5/150 GL&nbsp;</td><td>GE Sağlık</td><td>28990945</td><td></td></tr><tr><td>14C-İzopentenil pirofosfat</td><td>Perkin-Elmer</td><td>NEC773050UC&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>trans, trans-Farnezil pirofosfat</td><td>Sigma</td><td>44270-10MG</td><td></td></tr></tbody></table>

aşırı ezme ve İnsanın saflaştırılması cis -prenıltransferaz in escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Preniltransferazlar (PT), çoklu yoğunlaşma reaksiyonları yoluyla izopentenil difosfat (IPP) kullanarak allikik difosfatın zincir uzamasını katalize eden bir grup enzimdir. DHPDS (dehidrodiliden difosfat sintaz), farnesil difosfatın (FPP, bir alilikik difosfat) zincir uzamasını izopentenil difosfat (IPP) ile çoklu yoğunlaştırmalar yoluyla katalizleyen bir ökaryotik uzun zincirli cis -PT (yoğunlaşma reaksiyonundan cis çift ​​bağları oluşturur) &#39;dir. DHDDS, biyomedikal önem taşır çünkü enzimdeki muhafazakar olmayan bir mutasyon (K42E) sonuç olarak retinitis pigmentosa ile sonuçlanır ve sonuç olarak körlüğe yol açar. Dolayısıyla, mevcut protokol mekanik çalışmalar için uygun olan büyük miktarlarda saflaştırılmış DHDDS elde etmek için geliştirildi. Burada, protein füzyonu, optimize edilmiş kültür koşulları ve kodon optimizasyonu, fonksiyonel olarak aktif insan DHDDS&#39;sinin aşırı ekspresyonunu ve saflaştırılmasını sağlamak için kullanıldı. <em&gt; e. Coli. Açıklanan protokol basit, uygun maliyetli ve zaman kazandıran. Farklı türler arasındaki cis- PT&#39;nin homolojisi, bu protokolün, doğal kauçuk sentezinde yer alanlar gibi diğer ökaryotik cis- PT için de uygulanabileceğini önermektedir.

Burada kullanılan yapıya genel bir bakış ve saflaştırma süreci Şekil 1'de gösterilmektedir. Her saflaştırma adımında elde edilen numuneler Şekil 2'de gösterilmektedir. Bu SDS-PAGE analizi, DHDDS'nin kademeli olarak arıtılmasını gösterir ve sonuç olarak yüksek saflıkta bir ürün elde edilir. Şekil 3 , saflaştırılmış enzimin analitik SEC sonuçlarını göstermektedir, bu protein sadece bir homodimer olara...

Escherichia&#39;dan denatüre edici olmayan koşullar altında, kodon-optimize edilmiş insan cis- preniltransferazın aşırı ekspresyonu ve saflaştırılması için basit bir protokol Coli , bir enzimatik aktivite tahlili ile birlikte anlatılmıştır. Bu protokol, mekanik çalışmalara uygun miktarda ve kalitede diğer cis- prenyltransferase proteinlerinin üretimi için genelleştirilebilir.

Aşırı Ezme ve İnsanın Saflaştırılması Cis -prenıltransferaz in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Bu protokolün genel amacı, denatüre edici olmayan koşullar altında kodon ile optimize edilmiş insan cis-preniltransferazını aşırı eksprese etmek ve saflaştırmak ve enzimatik aktivitesini test etmektir. Prosedür, ökaryotik uzun zincirli cis-preniltransferaz dehidrodolichyl diphosphate sentaz veya DHDDS ile gösterilmiştir. Bu yöntem, izoprenoid sentez anlayışımızı ilerletebilir ve DHDDS'deki mutasyonlarla ilişkili retinitis pigmentosa'nın patofizyolojik mekanizması hakkında önemli bilgiler sağlayabilir.Bu tekniğin temel avantajları, basit, uygun maliyetli ve zaman kazandıran olmasıdır. Ayrıca, diğer cis-preniltransferaz proteinlerinin yüksek miktarda üretimi için genelleştirilebilir. Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı gibi insan DHDDS'nin bir ifadesini klonlayarak başlayın.Hücreleri tampon A, mililitre DNaz I başına bir mikrogram ve bir proteaz inhibitörü karışımı içinde yeniden süspanse edin. Ardından, yeniden süspanse edilmiş hücreleri bir cam Teflon homojenizatör kullanarak homojenize edin. Hücreleri 12.000 ila 15.000 psi'de bir Mikroakışkanlaştırıcı veya eşdeğeri ile bozun.Daha sonra, hücre lizatını dört santigrat derecede 45 dakika boyunca 40.000 kez g'de santrifüjleyin. Çözünür fraksiyonu içeren süpernatanı geri kazanın. Süpernatanı, 10 milimolar imidazol ile beş ila 10 milimetre kobalt ile hareketsizleştirilmiş bir metal afinite kromatografi kolonuna yükleyin.Hızlı bir protein sıvı kromatografi makinesine yükledikten sonra, spesifik olmayan protein bağlanmasını azaltmak için kolonu 10 milimolar imidazol içinde tampon A ile iyice yıkayın. FPLC programına başlayın. Aşırı eksprese edilen proteinleri 250 milimolar imidazol ile desteklenmiş tampon A ile elute edin.Elüsyonu takiben, tampon A ile dengelenmiş 53 mililitre hazırlayıcı bir tuzdan arındırma sütunu kullanarak imidazol'ü çıkarın.Ardından, hekzahistidin etiketli tioredoksin DHDDS füzyonlarını çıkarmak için ayrıştırılan proteinlere hekzahistidin etiketli TEV proteaz ekleyin. Karışımı gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, parçalanmış proteinleri, beş milimolar imidazol ile desteklenmiş tampon A ile dengelenmiş kobalt ile hareketsizleştirilmiş bir metal afinite kromatografi kolonuna yükleyin.Parçalanmış hekzahistidin etiketli tioredoksin ve TEV proteazı çıkarmak için akışı toplayın. 30 kilodalton moleküler ağırlıklı kesilmiş santrifüj filtre kullanarak akışı üç ila dört mililitre arasında yoğunlaştırın. Daha sonra, konsantre proteini, son saflaştırma için tampon A ile dengelenmiş bir Superdex 200 boyutlu dışlama kromatografi kolonuna yükleyin.Numuneleri bir fraksiyon toplayıcıdaki 96 oyuklu bir rafa yerleştirin. Protein bir dimer olarak ortaya çıkar. Elüsyon profilini bir kolon kalibrasyon eğrisi ile karşılaştırarak ilgili fraksiyonları seçin.Bu noktada, SDS-PAGE kullanarak preparatın saflığını değerlendirin. Son olarak, aşağı akış deneyi için gereken protein konsantrasyonunu belirleyin ve saflaştırılmış konsantre proteinlerin sıvı nitrojen içinde hızlı dondurulması. Alikotları kullanana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.Proteinin donma-çözülme döngülerine dayanabilmesini sağlamak için, donmuş proteinlerin bir kısmını çözün. Çözünmeyen agregaları çıkarmak için alikotu 21.000 kez g'de 10 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeyi takiben süpernatanı toplayın.Daha sonra, proteinleri ultra performanslı bir sıvı kromatografi sistemi kullanılarak TNXB ile önceden dengelenmiş bir Superdex 200 analitik kolonuna yükleyin. Proteinin elüsyon profilini tespit etmek için triptofan floresansını izleyin. Moleküler ağırlık değerlendirmesi için SEC sütun üreticileri aracılığıyla kullanılabilen geçerli bir kalibrasyon eğrisine sahip olduğunuzdan emin olun.Saflaştırılmış proteinin aktivitesini sağlamak için, önce beş mikromolar saflaştırılmış DHDDS'yi 10 mikromolar FPP ve 50 mikromolar C14 IPP ile karıştırın. Reaksiyonu 22 ila 30 santigrat derecede 0.5 milimolar magnezyum klorür ile tampon A'da başlatın. 20 milimolar EDTA ile desteklenmiş 15 mikrolitre tampon A ilavesiyle reaksiyonun hemen söndürülmesini takiben sıfır, iki, dört ve altı saat sonra reaksiyondan 15 mikrolitre numune çekin.Ardından, bir mililitre suya doymuş 1-butanol ekleyin ve reaksiyon ürünlerini çıkarmak için iyice girdaplayın. Protokol burada durdurulabilir ve numuneler daha sonra okunmak üzere saklanabilir. Ardından, sintilasyon kokteylini örneklere ekleyin.Bir sintilasyon sayacı kullanarak, toplam radyoaktiviteyi temsil eden 15 mikrolitre reaksiyonun radyoaktivitesi ile birlikte C14'ü kapsayan bütanol fazındaki reaksiyon ürünlerini nicelleştirin. Son olarak, toplam C14 IPP konsantrasyonlarından kullanılan yüzdeyi hesaplayarak her bir zaman noktasında net C14 IPP katılımını hesaplayın ve sonuçları zamanın bir fonksiyonu olarak çizin. Zamanla net C14 IPP katılımında bir artış bekleniyor.Her saflaştırma adımında elde edilen numuneler burada gösterilmektedir. Bu SDS-PAGE analizi, DHDDS'nin aşamalı olarak saflaştırılmasını gösterir ve bu da yüksek oranda saflaştırılmış bir ürünle sonuçlanır. Bu kromatogram, saflaştırılmış enzimin analitik boyut dışlama kromatografisinin sonuçlarını temsil eder ve proteinin yalnızca bir homodimer olarak gözlemlendiğini ortaya çıkarır.Burada ok, boşluk hacmini gösterir. Temsili bir zamana bağlı aktivite testi, C14 IPP katılımının altı saat içinde açıkça arttığını ve saflaştırılmış enzimin işlevsel olduğunu doğruladığını ortaya koymaktadır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu basit preparat iki ila üç gün içinde yapılabilir, bu da oldukça saf ve aktif bir enzim ile sonuçlanır.Bu videoyu izledikten sonra, insan cis-preniltransferazını E.coli'den nasıl aşırı eksprese edeceğinizi ve saflaştıracağınızı ve aktivitesini zamana bağlı bir şekilde nasıl ölçeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.

overexpression-purification-human-cis-prenyltransferase-escherichia

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu beş günlük protokolü bütün adımlar, ekipman, ve esaslı etkili endojen Escherichia coli sıfırdan TX-TL hücre serbest ifade sistemi oluşturmak ve çalıştırmak için gerekli ek yazılım özetliyor. Reaktif ile protokol 8 kurulumu için saat veya daha az bir tepki toplamak ve işlem verileri alır.

Bir uygulama için Protokoller Escherichia coli Tabanlı TX-TL Hücre-Özgür İfade Sistemi

Yeşil floresan proteini füzyon göre, Escherichia coli içinde rekombinant zar proteinlerinin ifadesi için tarama için bir aerodinamik bir yaklaşım sunulmuştur.

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

Protein ko-ekspresyonu, protein komplekslerinin in vitro olarak yeniden yapılandırılmasına güçlü bir alternatiftir ve in vivo biyokimyasal ve genetik testlerin gerçekleştirilmesinde yardımcı olur. Burada, protein kompleksleri elde etmek ve hücrelerin mutasyon frekansını ayarlamak için Escherichia coli'de protein ko-ekspresyonunun kullanımını rapor ediyoruz.

Protein birlikte-ifade edilme yönlü Faydalar<em&gt; Escherichia coli</em

Çinko-Parmak etki doğal olarak hücre-geçirgen ve memeli hücre türlerinin geniş bir aralığı içine protein verilmesinin aracılık edebilmektedir. Burada, hücre içi protein teslimat için çinko-parmak teknolojisi uygulanması için ayrıntılı bir adım-adım protokolü sunulmuştur.

Hücre geçirgen Cys kullanılarak memeli hücrelerinde doğrudan protein teslim<sub&gt; 2</sub&gt; His<sub&gt; 2</sub&gt; Çinko-parmak Alanlar

Bu, salgılanan, glikosile edilmiş memeli proteinlerinin üretimi ve ardından X-ışını kristalografisi ve diğer biyofiziksel çalışmalar için yeterli homojen protein verimi ile tek aşamalı saflaştırma için hızlı, uygun maliyetli bir protokoldür.

Verimli memeli hücre ekspresyon ve Kristalizasyon için hücre dışı Glikoproteinlerin Tek aşamalı saflaştırma

Ökaryotik proteinlerin uygun translasyon sonrası modifikasyonla laboratuvar ölçeğinde üretimi önemli bir engel teşkil etmektedir. İşte bir memeli ekspresyon sistemi kullanarak protein ekspresyonu için hızlı kuruluş ve geri dönüşe sahip sağlam bir protokol. Bu sistem, seçici amino asidi, proteinlerin seçici etiketlenmesini ve glikan bileşiminin küçük molekül modülatörlerini destekler.

Süspansiyon HEK293 hücrelerinin kısa süreli transfection ile Rekombinant İnsan Proteinlerinin Yüksek Verimli İfadesi

Biyokimyasal ve yapısal analizleri glikozile proteinlerin homojen örnekleri nispeten büyük miktarda gerektirir. Burada, reaktif Cys thiols hedefleyerek bakterilerden saflaştırılmış rekombinant proteinlerin siteye özgü Glikozilasyon için verimli bir kimyasal yöntem mevcut.

Sistein Thiols rekombinant proteinler Vitro siteye özgü Glikozilasyon için hedefleme

Sentetik Biyoloji Mühendisliği proteinlerin kanonik olmayan amino asitlerin co-translational ekleme kullanarak benzersiz özellikleri ile sağlar. Burada, GFP türü fluorophore "altın" floresan protein (GdFP) olarak adlandırdığı roman Floresans spektroskopik özellikleri ile hayalice kırmızı kaymıştır bir türevi E. coli seçici basınç birleşme (SPI) yolu ile nasıl üretilir sundu.

Mühendislik kanonik olmayan Amino asitler ve seçici basınç eklenmesi tarafından 'Altın' floresan ve kütle spektrometresi ve floresan göre Protein analizi

Bu iletişim kuralı tarafından cryo-elektron mikroskobu, verimli bir şekilde en az çaba ve toksisite, protein ayıklama, arıtma ile memeli hücrelerinde genlerin ifade etmek için kullanılan bir baculovirus sistemi de dahil olmak üzere iyon kanal yapılarını belirlemek için kullanılan teknikler açıklanır, ve kalite kontrol, örnek kılavuz hazırlık ve tarama, hem de veri toplama ve işleme.

İfade ve insan Lipid duyarlı ba * kanal TRPC3 arınma için tek-parçacık Cryo-elektron mikroskobu ile yapısal kararlılık

E. coli'de heterolog ekspresyon ve fransız presi kullanılarak hücrelerin lysis'inde üretilen membran vezikül preparatlarında proton-tahrikli membran taşıyıcılarının karakterizasyonu için bir yöntem tanımladık.

E. coli'de Heterolog Ekspresyon ile Membran Taşıyıcılarının Karakterizasyonu ve Membran Veziküllerinin Üretimi

Bu makale, bir C41 (DE3) ekspresyon sisteminde toksik bir nükleaz olan rekombinant Nsp15'in aşırı eksprese edilmesi için bir metodolojiyi ve ardından afinite ve boyut dışlama kromatografisi kullanılarak etiketli proteinin saflaştırılmasını açıklamaktadır. Bu protokoller diğer zorlu toksik proteinler için uyarlanabilir.

Escherichia coli'den Toksik Bir Nükleazın Aşırı İfade Edilmesi ve Saflaştırılması

Keşfedin, insan cis-preniltransferazının Escherichia coli'de aşırı ekspresyonu ve saflaştırılması için basit, ekonomik ve zaman kazandıran bir yöntem. Bu teknik, izoprenoid sentezi ve retinitis pigmentosa araştırmalarına katkı sağlar.

Aşırı Ezme ve İnsanın Saflaştırılması Cis -prenıltransferaz in Escherichia coli

Daha fazla video keşfet