Geçiş hücre yaprak analiz etmek için nokta tahlil kullanarak

Nokta tahlilinin genel amacı, mikroçevresel ipuçlarına yanıt olarak bağlı yapışkan hücre tabakalarının göç fenotipini değerlendirmektir. Bu yöntem, sitokinlerin veya büyüme faktörlerinin tümör hücresi motilitesini nasıl değiştirdiği gibi kanser alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Nokta testinin temel avantajı, tekrarlanabilir sonuçlar için kolayca gerçekleştirilmesi ve kullanılmasıdır.

Bu yöntem hücre hareketliliği hakkında bilgi sağlayabilse de, büyüme kolonisi morfolojisini ve hücre saçılımını değerlendirmek için hücrelerin boyanması, immün boyama, protein ve DNA veya RNA analizi veya hücrelerin hayvanlara enjeksiyonu gibi bir dizi müteakip tahlillere de uygundur. Başlamak için, fare kollajen dördünü buz üzerinde çözün ve mililitre kollajen dört çözeltisi başına 10 mikrogramlık üç mililitre hazırlamak için 50 mikromolar HCL ile seyreltin. 12 oyuklu cam tabanlı plakaların kuyucuklarına 250 mikrolitre kollajen dört çözelti ekleyin ve bunları uygun boyutta, sıkıca kapanan bir plastik kutuya yerleştirin.

Nemli bir oda oluşturmak için plakaların üzerine ve etrafına ıslak kağıt havlu yerleştirin ve kutuyu kapatın. Ardından, plakaları gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Ertesi sabah, emilmeyen kollajeni ve tamponu hareket ettirmek için, plakaları iki kez durulamak için deiyonize su kullanın, suyu kenar tabanı ve kapak kayması tarafından oluşturulan kenar yerine plakanın kenarına yönlendirin.

Plakaları laminer bir akış başlığında havayla kurutun ve hemen kullanın veya beş güne kadar dört santigrat derecede saklayın. Hücre süspansiyonunu hazırlamak için, DMEMF12 ortamda 60 milimetrelik bir doku kültürü kabında büyütülmüş, %80 birleşmeye kadar %5 at serumu ile desteklenmiş hücreleri kullanın. Hücreleri bir kez durulamak için kalsiyum ve magnezyum içermeyen DPBS kullanın, ardından 500 mikrolitre oda sıcaklığında tripsin EDTA ekleyin ve hücreleri nemlendirilmiş bir atmosferde %5 CO2 içinde 37 santigrat derecede üç ila beş dakika inkübe edin.

Tripsin aktivitesini durdurmak için ayrılan hücreleri 4.5 mililitre kültür ortamında askıya alın ve hücre süspansiyonunun 20 mikrolitrelik bir alikotunu saymak için bir hemositometre kullanın. Kalan hücreleri 50 mililitrelik konik bir tüpte üç dakika boyunca yerçekiminin 200 katı santrifüjleme ile dışarı çekin. Daha sonra, süpernatanı aspire edin ve hücreleri kültür ortamında mililitre başına 10 ila altı hücreye üç kez yeniden süspanse edin.

Kollajen dört kaplamalı 12 oyuklu cam tabanlı plakanın her bir lamel ortasındaki hücreleri kaplamak için, kaplamaya dokunmamaya veya çizmemeye dikkat ederek 10 mikrolitrelik bir hücre süspansiyonu damlası yerleştirin. Dairesel olmayan bir damlanın kaplanması, dairesel bir hücre tabakası vermez ve kaplamaya dokunulur veya çizilirse, hücrelerin iyi yapışmasını engeller. Hücrelerin yapışmasına izin vermek için plakayı 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir atmosferde 30 dakika inkübe edin.

Ardından, ters çevrilmiş bir mikroskop altında ek olup olmadığını kontrol edin. Bir mililitre kültür ortamı ile, bağlı olmayan hücreleri çıkarmak için kuyucukları iki kez nazikçe yıkayın, ardından her oyuğa bir mililitre kültür ortamı ekleyin. Ters çevrilmiş bir mikroskop altında yüzen hücre kalmadığını kontrol edin, aksi takdirde kuyuları tekrar yıkayın.

İyi tanımlanmış hücre tabakaları elde etmek için hücreleri gece boyunca 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir atmosferde %5 CO2'de inkübe edin. Ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak, hücre kolonilerinin düzgün bir şekilde büyüdüğünden emin olmak için tüm kuyucukları kontrol edin. Gerekirse, uygun olmayan kuyuları işaretleyin ve kullanmayın.

Plakanın her bir kuyusunu, araştırılan her koşul için uygun şekilde etiketleyin. Her koşulu iki veya üç kopya halinde çalıştırın. Hücreler uyarılmadan üç saat önce% 0.1 at serumu içeren DMEMF12 hücreleri aç bırakmak için ortamı değiştirin.

Ardından, EGF veya istenen diğer aracıları ekleyerek hücreleri uyarın. Ortamı karıştırmak için bir mikrolitrelik pipetleyici kullanın veya plakayı hafifçe döndürün. Kenar yer değiştirmesini ve kenar konturunu gözlemlemek için plakayı bir ila dört gün inkübe edin.

H ve E boyamayı gerçekleştirmek için, hücreleri PBS ile iki kez yıkayın ve yaklaşık iki dakika sabitleyin. Çekirdeği boyamak için yaklaşık iki dakika hematoksilen ekleyin. Hücreleri, çekirdekler mavi olana kadar beş ila 10 dakika musluk suyuyla yıkayın.

Ardından, hücreleri deiyonize su ile durulamadan önce sitoplazmayı iki dakika boyunca eozin ile boyayın. Plakayı havayla kurutun, ardından ters çevirin ve nokta çapını ölçmek için bir cetvel kullanın. Alternatif olarak, bir kamera ile plakanın fotoğraflarını çekin ve nokta çapını analiz etmek için ImageJ'yi kullanın.

Hızlandırılmış mikroskopi yapmak için inkübatör mikroskobunu açın ve sıcaklığı 37 santigrat dereceye ayarlayın. Nemlendiriciyi DH2O ile doldurun, ardından CO2'yi %5'e ayarlayın İnkübatör odasının nemlendirildiğinden ve motorlu aşamanın serbestçe hareket edebildiğinden emin olun. Ardından, inkübatör odasını kapatın ve mikroskobun 37 santigrat dereceye ayarlanmasına izin verin.

Plakayı inkübatör mikroskobunun sahnesine yerleştirin ve sahne listesini ayarlayın, ardından iki karşıt kenarı ve her hücre noktasının merkezini görüntüleyin. 10X objektif kullanarak 15 ila 24 saat boyunca her üç dakikada bir fotoğraf çekin. Verileri indirin ve Matlab gibi tercih edilen bir programda görüntü analizine devam edin.

Başlangıçta, hücre noktalarının faz kontrast görüntülemesi, invaziv, akciğer kolonisi oluşturan meme kanseri hücrelerinin EGF ile stimülasyondan sonra mezenkimal bir fenotipi koruduğunu ortaya koydu. Bununla birlikte, tabakayı terk eden tek hücreler, EGF ile uyarılan hücre noktalarında daha sık gözlenir. Akciğer kolonisi oluşturan meme kanseri hücrelerinin EGF'ye tepkisi, dört gün boyunca EGF ile uyarılan kültürlerin H ve E boyaması ile daha fazla değerlendirildi.

Gerçekten de, EGF stimülasyonu, EGF ile uyarılan hücrelerin göçünün değişebileceğini gösteren bir koloni çapının artmasına neden oldu. Bu nokta testinde, tabaka kenarlarındaki hücreler, koloni oluşturan meme kanseri hücrelerinin EGF ile uyarılmasını takiben dokuz saat boyunca görüntülendi. PIV, EGF'nin kontrol hücrelerinde hücre hızını dakikada 0.45 mikrometreden dakikada 0.63 mikrometreye çıkardığını ortaya koydu.

Ek olarak, EGF, hücre yönlülüğünün veya açısal yayılmanın değişkenliğini kontrol kültürlerinde 0.95'ten EGF ile uyarılan kültürlerde 0.79'a düşürdü. Ek olarak, dört gün sonra H ve E boyaması ile gözlemlendiği gibi, EGF, epitel kenarının radyal yer değiştirmesini dokuz saat boyunca 257 mikrometreden 356 mikrometreye çıkardı. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik için uygulamalı süre birkaç saattir.

Bu prosedürü takiben, ek soruları yanıtlamak için hızlandırılmış görüntüleme, immün boyama ve DNA ve RNA analizi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Örneğin, proteinlerin hızlı veya yavaş göç eden hücrelerde farklı şekilde ifade edilip edilmediğini veya hücrelerin çevreye ne zaman göç ettiğini analiz etmek için kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, nokta tahlilinin nasıl kurulacağını iyi anlamalı ve bunu, mikroenvironemntal ipuçlarına yanıt olarak bağlı yapışkan hücre tabakalarının göç fenotipini değerlendirmek için kullanmalısınız.