Bir RANKL tabanlı Osteoklast kültür tahlil, fare mTORC1 Osteoklast oluşumunda rol araştırmak için ilik

Bu protokolün genel amacı, osteoklastları fare kemik iliğinden in vitro olarak izole etmek ve kültürlemek ve memeli rapatisin kompleksi birin osteoklast oluşumundaki rolünü incelemektir. Bu yöntem, mTORC1'in osteoklast farklılaşmasındaki rolü gibi osteoklast oluşumundaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, bir hafta içinde çok sayıda dev osteoklast ile sonuçlanmasıdır.

Bu tekniğin etkileri osteoporoz tedavisine kadar uzanır, çünkü osteoklastın öncüllerinden farklılaştığı mekanizmayı incelemek yararlıdır. Bu işleme başlamak için, ötenazi yapılmış bir farenin tibiasının distal ucunda dikey bir kesi yapın ve cildi arka bacaklar boyunca inceleyin. Daha sonra, kalça eklemlerinin eklem bağını makasla kesin ve arka bacakları gövdeden çıkarın.

Diz ekleminin eklem bağını kesin ve tibia ve uyluk kemiğini dikkatlice ayırın. Yumuşak dokuyu makasla nazikçe çıkarın. Bir farenin tüm kemiklerini, buz üzerinde iki mililitre alfa-MEM içeren altı oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna yerleştirin.

İzolasyon için, altı oyuklu bir plakanın bir kuyusunu% 75 etanol ve diğer beş kuyucuğu alfa-MEM ile doldurun. Bir farenin tüm kemiklerini 15 saniye boyunca etanol yıkamaya koyun ve ardından kemikleri her seferinde 10 saniye boyunca alfa-MEM ile beş kez yıkayın. Epifizleri makasla kesin ve kemik boşluğuna 0.45 milimetrelik bir şırınga iğnesi yerleştirin.

İliği alfa-MEM ile 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne boşaltın. Ardından, aynı yöntemi kullanarak kemik boşluğunu kemiğin diğer ucundan yıkayın. Kemik soluklaşana kadar kemik boşluğunu iyice yıkamak için en az iki kez tekrarlayın.

Daha sonra, beş dakika boyunca dört santigrat derecede bir hücre peleti elde etmek için kemik iliğini santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanı aspire edin. Santrifüj tüpüne üç mililitre kırmızı kan hücresi lizis tamponu ekleyin ve kemik iliğini yeniden süspanse etmek için hafifçe pipetleyin.

Ardından, kırmızı kan hücrelerini parçalamak için santrifüj tüpünü sekiz dakika boyunca buz üzerinde tutun. Sekiz dakika sonra, hücre parçalanmasını durdurmak için santrifüj tüpüne altı mililitre alfa-MEM ekleyin. 800 g ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin.

Daha sonra, üç mililitre alfa-MEM kültür ortamında yeniden süspanse edin ve hücreleri altı oyuklu bir plakaya yerleştirin. Gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Bu adımda, ertesi sabah bağlanmamış hücreleri toplamak için süpernatanı 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.

Daha sonra, beş dakika boyunca 800 g ve dört santigrat derecede santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin. Daha sonra, hücreleri dört mililitre alfa-MEM kültür ortamında yeniden süspanse edin. 20 mikrolitre hücre çözeltisi alın ve 20 mikrolitre Tripan Blue ile karıştırın.

Daha sonra, sayma odasına 10 mikrolitre karışım ekleyin ve mililitre çözelti başına hücre sayısını elde edin. Bunu takiben, mililitre başına 500.000 hücrelik bir hücre çözeltisi elde etmek için uygun hacimde alfa-MEM kültür ortamı ekleyin. Daha sonra, sırasıyla 24 oyuklu bir plaka ve 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 500 mikrolitre ve 50 mikrolitre kemik iliği makrofaj indüksiyon ortamı ekleyin.

Daha sonra, sırasıyla 24 oyuklu bir plakanın ve 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 500 mikrolitre ve 50 mikrolitre hücre çözeltisi ekleyin. Üç gün boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Kaplamadan üç gün sonra, 96 oyuklu plakanın her bir oyuğundan 50 mikrolitre ortam toplayın ve eksi 20 santigrat derecede dondurun.

Ardından, kalan ortamı aspire edin. Sırasıyla 24 oyuklu bir plakanın ve 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna bir mililitre ve 100 mikrolitre osteoklast indüksiyon ortamı ekleyin. İki gün boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

İki gün sonra, her oyuktan 50 mikrolitre ortam toplayın ve kalan ortamı aspire edin. Daha sonra, her bir oyuğa osteoklast indüksiyon ortamı ekleyin ve bir gün boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Osteoklastlar oluştuktan sonra, 96 oyuklu plakanın her bir oyuğundan 50 mikrolitre ortam toplayın.

Bu adımda, ortamı aspire edin ve numuneyi 1X PBS ile üç kez nazikçe yıkayın. Daha sonra, 96 oyuklu plakanın her bir oyuğundaki hücreleri, oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 100 mikrolitre sabitleme çözeltisi ile sabitleyin. Fiksasyondan sonra, sabitleme solüsyonunu aspire edin ve hücreleri 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtılmış deiyonize su ile üç kez nazikçe yıkayın.

Ardından, deiyonize suyu aspire edin ve 96 oyuklu plakanın her bir kuyucuğuna 100 mikrolitre TRAP boyası ekleyin. Plakayı 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin ve ışıktan koruyun. Boyamadan sonra, TRAP lekesini aspire edin ve deiyonize su ile üç kez nazikçe yıkayın.

Daha sonra, osteoklastları 40X büyütmede ters çevrilmiş bir mikroskopta görüntüleyin. Daha sonra, daha önce toplanan ortamın 30 mikrolitresini 96 oyuklu yeni bir plakaya aktarın. Daha sonra, 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 90 mikrolitre substrat karışımı ekleyin.

Plakayı bir saat boyunca 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin ve ışıktan koruyun. Bir saat sonra, 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 30 mikrolitre üç molar sodyum hidroksit ekleyerek reaksiyonu durdurun. Ardından, EnVision Çok Etiketli Plaka Okuyucu ile 405 nanometre dalga boyunda absorbansı ölçün.

İşte altıncı günde parlak alanda gözlemlenen osteoklastların temsili görünümü. Kırmızı çizgi, osteoklastların sınırını belirledi. Ve burada tipik olarak dev, çok çekirdekli, TRAP pozitif bir osteoklast gösteriliyor.

Siyah ok, çok çekirdekli osteoklastın iki çekirdeğini gösterdi. Bu şekil, altıncı günde BMM'lerin TRAP boyamasını göstermektedir. Sırasıyla vahşi tip ve Ctsk-Cre Raptor nakavt gruplarındaki karelerin yüksek büyütmeli görüntüleri gösterilir.

Bunlar, vahşi tip gruba kıyasla Ctsk-Cre Raptor nakavt BMM'lerinde oluşan daha az dev, TRAP pozitif osteoklastlardı. Bu şekil, kültürlenmiş vahşi tip ve Ctsk-Cre Raptor nakavt BMM'lerinin TRAP aktivitesini göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde uygulanırsa bir hafta içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, canlı kemik iliği makrofajlarının optimal tohumlama yoğunluğu kritik olduğundan, kemik iliği makrofajlarının canlılığını korumayı hatırlamak önemlidir. Kemiğin buz üzerinde bir saatten fazla tutulmaması ve hücrelerin nazikçe yeniden askıya alınması önerilir. Bu prosedür, osteoklastın normal ve patolojik fizyolojisini incelemek için kemik dilimleri ile osteoklast rezorpsiyon testi gibi diğer yöntemlerle birleştirilebilir.

Bu yöntemle, mTORC1'in osteoklast oluşumunda önemli bir rol oynadığını ve gelecekte osteoporoz gibi kemik metabolik bozukluklarının tedavisi için potansiyel bir farmakolojik hedef olarak hareket edebileceğini bulduk.