Name: Bir RANKL tabanlı Osteoklast kültür tahlil, fare mTORC1 Osteoklast oluşumunda rol araştırmak için ilik (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Keşfedin fare kemik iliği osteoklast izolasyonu ve mTORC1'in osteoklast oluşumundaki rolünü inceleyen RANKL tabanlı kültür yöntemi. Bu teknik bir haftada dev osteoklast üretimi sağlar ve osteoporoz tedavisi araştırmalarına katkı sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. Minghan Tong ve S. Kato yazarlar nazikçe sağlayan reaktifler ve fareler için teşekkür ederiz. Biz yararlı tartışmalar Zou laboratuvar üyeleri teşekkür ederim. Bu eser kısmen hibe tarafından desteklenmiştir 973 Çin Bakanlığı bilim ve Teknoloji (çoğu) [2014CB964704 2015CB964503], 9 insanların Hastanesi, Shanghai Jiao Tong Üniversitesi Tıp Fakültesi klinik araştırma programı Program. Hücre biyolojisi ve çekirdek tesis Kimya Biyoloji, moleküler hücre bilim, Shanghai Enstitüsü biyokimyası ve hücre biyolojisi, Çin Bilimler Akademisi mükemmelliği CAS merkezi çekirdek tesis yardım için teşekkür ederiz.

Hayvanlarla ilgili tüm yordamlar Stanford idari Panel üzerinde laboratuvar hayvan bakım (APLAC) tarafından onaylanmış protokolüne göre gerçekleştirilen ve hayvan bakım ve kullanım Komitesi Shanghai Enstitüsü Biyokimya ve hücre tarafından kabul edildi Biyoloji.
1. hazırlık
<ol><li>Osteoklast belirli Raptor silme fareler (Raptorfl/fl; oluşturmak Ctsk-cre, ahiret CtskRap) Ctsk-cre fareler ile Raptorfl/fl fareler çiftleşme tarafından. Bu çalışmada WT denetimi olarak Raptorfl/fl fare kullanın.</li>
	<li>Bir konteyner ile izole kemik tutmak için buz var.</li>
	<li>
Kültür ortamı hazırlamak.
	<ol>
<li>α-MEM kültür orta minimum temel orta alfa (α-MEM) 1 x glutamin, penisilin-streptomisin ve % 10 fetal buzağı serum ile ilave olarak hazırlayın.</li>
		<li>α-MEM orta ve M-CSF 50 mL 20 ng/mL oluşan kemik iliği makrofaj indüksiyon orta hazırlayın.</li>
		<li>M-CSF ve RANKL 20 ng/mL sırasıyla, α-MEM orta 50 mL oluşan Osteoklast indüksiyon orta hazırlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aşağıdaki arabellekleri tuzak boyama önce hazırlayın.
	<ol>
<li>Aseton, 2.5 mL sitrat çözüm ve 0.8 mL % 37 (vol/vol) formaldehit çözeltisi mL 6.5 oluşan düzeltme çözüm hazırlamak.</li>
		<li>Çözüm boyama tuzak hazırlayın.<ol>
<li>Deiyonize su ile 37 ° c prewarm</li>
			<li>100 µL hızlı garnet GBC temel çözüm ve sodyum nitrit çözeltinin 100 µL 1.5 mL microtube ve 30 s. bırakmak için nazik INVERSION tarafından 2 min için stand karışımı karıştırın.</li>
			<li>Prewarm 9 mL deiyonize su ile 37 ° c Diazotized hızlı garnet GBC temel çözüm 200 µL adım 1.4.2.2, 100 µL naftol AS-BI fosfat çözüm, 400 µL asetat çözüm ve 200 µL tartarat çözüm ekleyin.</li>
			<li>Bir su banyosu 37 ° C'de çözümde karışım boyama tuzak tutmak</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
TUZAK etkinlik miktar kültür ortamının önce aşağıdaki arabellek hazırlayın.
	<ol>
<li>Tartarat arabellek (50 mL) hazırlamak: 0,33 M L tartarik asit, 0,33 M sodyum tartarat dibasic 48 mL 2 mL kurutmak. 4,9 pH değerine ayarlayın.</li>
		<li>4-Nitrophenyl fosfat disodyum (pNPP) arabellek (200 mL) hazırlamak: 1.502 g glisin, 41 mg MgCl2, ZnCl227.2 mg ve 180 mL deiyonize su. 10,4 ile 3 M NaOH pH değerine ve 200 mL deiyonize su ile birime ayarlayın.</li>
		<li>PNPP arabellek fosfataz substrat ile (bir 96-şey plaka) hazırlamak: 49.37 mg fosfataz substrat ve pNPP arabelleği adım 1.5.2 175 µL.</li>
		<li>Substrat arabellek (9 mL/96-iyi plaka) hazırlamak: 6,24 mL deiyonize su, asetat çözüm 360 μL ve tartarat arabellek 2.4 mL. Gönderen Vortex mix ve kullanımdan önce 37 ° C'de ısıtın.</li>
		<li>9 ml substrat karışımı ve 10 için girdap yapmak için Önceden ısıtılmış substrat buffer(1.5.4) fosfataz substrate(1.5.3) ile pNPP tamponunun 90 μL eklemek s.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. diseksiyon (gün -1)
<ol><li>3 aylık bir kadın WT ve RapCtsk fareler CO2 tarafından ayrı ayrı ötenazi. CO2 inhalasyon eğitimli personel tarafından uygun ekipman ile gerçekleştirin.</li>
	<li>Bir ölçek ile % 75 etanol (vol/vol) bakteriyel kontaminasyonu önlemek ve daha sonra sırtüstü pozisyonda bir diseksiyon tahtada yer 5 min için 100 mL 6 fare bırakın. Bir kesik dikey olarak tibia distal yapmak ve arka bacak boyunca cilt oftalmik makasla incelemek.</li>
	<li>Kalça eklemi eklem bağ makasla kesme ve hind bacaklarda bagajdan yerinden çıkar.</li>
	<li>Diz eklem eklem bağ kesilmiş ve dikkatle diz eklemi üzerinden femur ve tibia ilişkisini kaldır. Yavaşça yumuşak doku makasla çıkarın.</li>
	<li>Bütün kemikleri tek bir fare bir genotip içinde altı iyi bir tabak her şey α-MEM buz üzerinde 2 mL ile yerleştirin. Not: hücre canlılığı korumak için kemik az 1 h için bu koşullarda tutulmalıdır.</li>
</ol>3. yalıtım (gün -1)
<ol><li>Bir altı-şey plaka % 75 etanol (3 mL) ile bir kuyu ve diğer 5 kuyuları α-MEM orta (3 mL) ile doldurun.</li>
	<li>5 kere α-MEM orta 10 ile 15 s ve yıkama kemikler için etanol yıkama bir genotip tüm kemikleri koymak lar her zaman.</li>
	<li>Epifizleri makas ile kesti ve kemik boşluğu ve floş iliğini α-MEM orta içine 50 mL santrifüj tüpü ile 0,45 mm şırınga iğne yerleştirin.</li>
	<li>Kemik diğer ucundan aynı yöntemi kullanarak kemik boşluğu floş. En az iki kez kemik soluk olana kemik boşluğu iyice yıkamak için yineleyin.</li>
	<li>Bir hücre Pelet vasıl 800 x g ve 4 ° C 5 dk. aspiratı süpernatant elde etmek için kemik iliği santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Kırmızı kan hücre lizis arabellek 3 mL santrifüj tüpü ve pipet yavaşça kemik iliği resuspend ekleyin. Santrifüj tüpü için kırmızı kan hücreleri parçalayıcı için 8 dakika buzda tut.</li>
	<li>α-MEM orta 6 mL hücre lizis durdurmak için santrifüj tüpüne ekleyin. 500 x g ve 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi ve süpernatant Aspire edin.</li>
	<li>3 mL α-MEM kültür orta resuspend ve hücreleri bir altı-şey plaka (genellikle bir fare iyi başına) içine yerleştirin.</li>
	<li>%5 CO2 kuluçka 37 ° C'de gecede kuluçkaya.</li>
</ol>4. kaplama (0 gün)
<ol><li>Süpernatant ertesi sabah ekli olmayan hücreleri toplamak için 15 mL santrifüj tüpü aktarın.</li>
	<li>800 g ve 5 min için 4 ° C x santrifüj kapasitesi ve süpernatant Aspire edin.</li>
	<li>4 mL α-MEM kültür orta resuspend.</li>
	<li>Hücre çözümü 20 µL alıp Trypan mavi 20 µL ile karıştırın. Karışımı 10 µL sayım odasına ekleyin ve çözüm mL başına hücre sayısı elde edilir.</li>
	<li>Uygun bir birim olarak 500.000 hücre/mL hücre çözümü elde etmek için α-MEM kültür ortamının ekleyin.</li>
	<li>500 µL ve kemik iliği makrofaj indüksiyon orta 50 µL 24-şey plaka ve 96-şey plaka, her kuyuya sırasıyla ekleyin.</li>
	<li>500 µL ve hücre çözümü 50 µL 24-şey plaka ve 96-şey plaka, her kuyuya sırasıyla ekleyin.</li>
	<li>%5 CO2 kuluçka 37 ° C'de 3 gün kuluçkaya.</li>
</ol>5. farklılaşma (3-7 gün)
<ol><li>Üç gün sonra kaplama, 96-iyi-plaka her kuyudan 50 µL orta toplamak ve -20 ° C'de dondurmak ve kalan orta Aspire edin.</li>
	<li>1 mL ve 100 µL Osteoklast indüksiyon orta 24-şey plaka ve 96-şey plaka her kuyuya sırasıyla ekleyin.</li>
	<li>37 ° C de 2 gün kuluçkaya.</li>
	<li>Orta 50 µL her kuyudan toplamak ve kalan orta Aspire edin.</li>
	<li>Osteoklast indüksiyon orta her kuyunun içine ekleyin.</li>
	<li>37 ° C'de 1 gün için kuluçkaya. Not: Bu zaman noktada, ters bir mikroskop altında (şekil 2A) büyük, multinucleated Osteoklastlar görülmelidir.</li>
	<li>Osteoklastlar görülmez, Osteoklast indüksiyon orta değiştirmek ve Osteoklastlar görülmektedir kadar her gün gözlemlemek.</li>
	<li>Osteoklastlar oluşmuş sonra orta 50 µL 96-şey plaka her kuyudan toplamak.</li>
</ol>6. tartarat dayanıklı asit fosfataz (tuzak) Boyama
Not: Olgun Osteoklastlar vitro kültür (Adım 4) 6-7 gün sonra mevcut olabilir.
<ol><li>Orta Aspire edin ve yavaşça 3 kez 1 x PBS ile yıkayın.</li>
	<li>Hücreleri 96-şey plaka her şey 100 µL 30 için düzeltme çözümü ile fix s, oda sıcaklığında.</li>
	<li>Fiksasyon sonra düzeltme çözüm Aspire edin ve yavaşça 37 ° C'ye prewarmed deiyonize su ile 3 kez yıkamak Deiyonize su Aspire edin.</li>
	<li>TUZAK leke 96-şey plaka her kuyuya 100 µL ekleyin ve kuluçka 37 ° C'de 30 dk ve ışık kalkan plaka yer.</li>
	<li>Boyama sonra tuzak leke Aspire edin ve yavaşça 3 kez deiyonize su ile yıkayın.</li>
	<li>40 X büyütme oranında ters bir mikroskop kullanarak görüntü Osteoklastlar.</li>
</ol>7. tuzak etkinlik Quantification kültür ortamının
<ol><li>30 µL kültür süpernatant her şey 96-şey plaka adım 5.1, 5.4 ve 5,8 toplamak; Kültürlü Osteoklast indüksiyon orta 30 µL negatif kontrol kullanın. Örnekleri yeni bir 96-şey tabağına yerleştirin.</li>
	<li>Substrat mixture(1.5.5) 90 μL 96-şey plaka her kuyunun içine ekleyin.</li>
	<li>Plaka 37 ° C'de bir kuluçka 1 h ve ışık kalkan için yerleştirin.</li>
	<li>Reaksiyon 96-şey plaka her kuyuya 50 µL 3 M NaOH ekleyerek durdurmak.</li>
	<li>Ölçmek theabsorbance, dalga boyu 405 nm.</li>
</ol>8. Batı kurutma
Not: vitro kültür 24-şey plaka 6-7 gün sonra olgun Osteoklastlar görünür olmalıdır.
<ol><li>Orta Aspire edin.</li>
	<li>Yavaşça önceden soğutulmuş 1 x PBS 3 kere yıkayın.</li>
	<li>PBS Aspire edin.</li>
	<li>1 SDS lizis arabellek içeren proteaz inhibitörü kokteyl x 100 µL ekleyin.</li>
	<li>Isı lysates 105 ° c 10 dakika ve 10 dakika süreyle santrifüj 12.000 × g ve 4 ° C protein içeren supernatants toplamak.</li>
	<li>% 10 SDS-sayfa11 tarafından 30 µg protein içeren lysates ayırın ve sonra bir polivinilidin florid (PVDF) membran aktarın.</li>
	<li>%5 30 dk için yağsız süt ile membranlar engelleyin.</li>
	<li>Membranların Anti-Raptor, anti-P-S6, anti-S6, anti-β-aktin, gecede 1:1,000 seyreltme 4 ° C'de % 5 yağsız süt ile kuluçkaya.</li>
	<li>Tris tamponlu tuz ile ara-20 (TBST) ile membranlar 10 dakika oda sıcaklığında yıkayın.</li>
	<li>Adım 8,9 iki kez tekrarlayın.</li>
	<li>Membranlar horseradish peroksidaz (HRP) ile kuluçkaya-Anti-fare ya da tavşan IgG antikorlar 1:5,000 seyreltme oda sıcaklığında 1 h için %5 yağsız süt, Birleşik.</li>
	<li>Membranlar 3 kez ile TBST 10 dk için oda sıcaklığında yıkayın.</li>
	<li>Chemiluminescent algılama için Batı chemiluminescent HRP substrat membranlar ekleyin ve oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya. Fazla yüzey drenaj ve röntgen film açıkları ortaya çıkarmak.</li>
</ol>

<ol><li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+differentiation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li>
<li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+gene+expression%3A+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nature Genetics. 33, 245-254 (2003).</li>
<li>Feng, X., McDonald, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disorders+of+bone+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">Disorders of bone remodeling.</a> Annu Rev Pathol. 6, 121-145 (2011).</li>
<li>Boyce, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+osteoclast+biology+reveal+potential+new+drug+targets+and+new+roles+for+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Advances in osteoclast biology reveal potential new drug targets and new roles for osteoclasts.</a> J Bone Miner Res. 28 (4), 711-722 (2013).</li>
<li>Ibbotson, K. J., Roodman, G. D., McManus, L. M., Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+osteoclast-like+cells+and+their+progenitors+in+cultures+of+feline+marrow+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of osteoclast-like cells and their progenitors in cultures of feline marrow mononuclear cells.</a> J Cell Biol. 99 (2), 471-480 (1984).</li>
<li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoprotegerin+ligand+is+a+cytokine+that+regulates+osteoclast+differentiation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation.</a> Cell. 93 (2), 165-176 (1998).</li>
<li>Wong, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRANCE+is+a+novel+ligand+of+the+tumor+necrosis+factor+receptor+family+that+activates+c-Jun+N-terminal+kinase+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">TRANCE is a novel ligand of the tumor necrosis factor receptor family that activates c-Jun N-terminal kinase in T cells.</a> J Biol Chem. 272 (40), 25190-25194 (1997).</li>
<li>Zoncu, R., Efeyan, A., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR%3A+from+growth+signal+integration+to+cancer%2C+diabetes+and+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">mTOR: from growth signal integration to cancer, diabetes and ageing.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (1), 21-35 (2011).</li>
<li>Bhaskar, P. T., Hay, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+TORCs+and+Akt%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The two TORCs and Akt.</a> Dev Cell. 12 (4), 487-502 (2007).</li>
<li>Dai, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+Regulatory-associated+Protein+of+mTOR+%28Raptor%29%2FMammalian+Target+of+Rapamycin+Complex+1+%28mTORC1%29+Signaling+in+Osteoclasts+Increases+Bone+Mass+by+Inhibiting+Osteoclast+Differentiation+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Inactivation of Regulatory-associated Protein of mTOR (Raptor)/Mammalian Target of Rapamycin Complex 1 (mTORC1) Signaling in Osteoclasts Increases Bone Mass by Inhibiting Osteoclast Differentiation in Mice.</a> J Biol Chem. 292 (1), 196-204 (2017).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , Cold spring harbor laboratory press. (1989).</li>
<li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+Marrow-Derived+Macrophages+%28BMM%29%3A+Isolation+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li>
<li>Bradley, E. W., Oursler, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+culture+and+resorption+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Osteoclast culture and resorption assays.</a> Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).</li>
<li>Tevlin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+derivation+from+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Osteoclast derivation from mouse bone marrow.</a> J Vis Exp. (93), e52056(2014).</li>
<li>Xing, L., Boyce, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RANKL-based+osteoclastogenic+assays+from+murine+bone+marrow+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">RANKL-based osteoclastogenic assays from murine bone marrow cells.</a> Methods Mol Biol. 1130, 307-313 (2014).</li>
<li>Hsu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor+receptor+family+member+RANK+mediates+osteoclast+differentiation+and+activation+induced+by+osteoprotegerin+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor receptor family member RANK mediates osteoclast differentiation and activation induced by osteoprotegerin ligand.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (7), 3540-3545 (1999).</li>
<li>Underwood, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+where+comes+the+osteoclast%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">From where comes the osteoclast?</a> J Pathol. 144 (4), 225-226 (1984).</li>
<li>Wein, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+bone+resorption+in+mice+by+Schnurri-3%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Control of bone resorption in mice by Schnurri-3.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8173-8178 (2012).</li>
</ol>

Tüm yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları ellerinde devlet.

Osteoclastogenic tahlil yalıtmak ve Osteoklastlar vitro12,13kültür için en çok kullanılan yöntemdir. Ise birkaç RANKL tabanlı Osteoklast indüksiyon açıklanan13,14,15olabilirdi, bu da çalışmanın bir iletişim kuralı önceki yöntemleri üzerinde temel bazı değişikliklerle nitelendirdi.
Önceki çalışmada, BMMs hemen yalıtım...

Kemik değişen bir organdır ve dokusunu ve hayatı boyunca Osteoklastlar tarafından yenilenmiş. Osteoklastlar mineralize matris rezorpsiyonu için sorumlu ve dokusunu sentez ve yeni kemik matrisler1salgılar. Kemik rezorpsiyonu ve kemik oluşumu arasındaki dengeyi kemik bakım da dahil olmak üzere Kemik sağlığı için önemlidir kütle ve stimülasyon ve yaralanma yanıt. Bu denge bozulur, bir dizi metabolik kemik hastalıkları, Osteoporoz ve periodontal hastalıkları da dahil olmak üzere meydana gelebilir. Bu hastalıklar, kemik dokusunu2,3kapasite şekillendirme mediatörlerin kemik rezorpsiyonu kaynaklanan kemik kayıplarının aşıyor. Böylece, osteoporoz gibi iskelet bozuklukları tedavisinde ilaç hedefleri geliştirmek için üretimi ve Biyoloji Osteoklastlar4anlamak önemlidir.
Osteoklastlar benzersiz dev multinucleated hücreleri, veya kemik yüzeye yakın bulunan ve monosit/makrofaj aile1' e ait. Ibbotson K. J. vd. Osteoklast benzeri hücreler vitro ile 1,25-dihidroksi-vitamin D35içeren ortam oluşturmak için bir yöntem bildirdi. Makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) ve reseptör aktivatör nükleer faktör-κ B ligand (RANKL) için tanımlayıcısı Osteoklast oluşumu temel faktörler olarak osteoclastogenesis içinde vitro verimliliğini önemli ölçüde artmıştır 1 , 6 , 7. Kültür Osteoklastlar vitro yeteneği anlayışımız oluşturma ve düzenleme, Osteoklastlar geliştirdi.
Memeli/mekanik hedef iki yapısal ve işlevsel olarak ayrı kompleksleri, yani mTORC1 ve mTORC28,9' rapamycin (mTOR) fonksiyonların. İki çok protein kompleksleri onların farklı bileşenleri ve aşağı akım yüzeylerde nedeniyle birbirinden farklıdır. mTORC2 içerirken, rapamycin-duyarlı arkadaşı mTOR (Rictor)9mTORC1 mTOR (Raptor), benzersiz düzenleyici ilişkili protein içerir. mTORC1 entegre ve hücre büyümesi, yayılmasını önleme ve farklılaşma düzenleyen önemli sinyalleri iletmek. Son zamanlarda, biz bu mTORC1 mTORC1 Osteoklastlar10devre dışı bırakabilirsiniz için Raptor silinmesiyle tarafından katabolik kemik rezorpsiyonu ağ içinde önemli bir rol oynar gösterdi. Ancak, temel mekanizmaları daha fazla çalışma gerektirir. Bu da çalışmanın, Osteoklastlar kemik iliği türevi makrofajlar vahşi-tipi (WT) ve Ctsk Rap fareler (BMMs) oluşturmak ve mTORC1 inactivation Osteoklast üzerindeki etkisini incelemek için osteoclastogenic RANKL tabanlı yöntemi kullanıldı oluşumu.

<table><tbody><tr><td>Raptorfl/fl fareler</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>013188</td><td></td></tr><tr><td>Ctsk-cre fareler</td><td></td><td></td><td>S. Kato, Tokyo Üniversitesi, Tokyo, Japonya</td></tr><tr><td>&-MEM</td><td>Corning</td><td>10-022-CVR</td><td></td></tr><tr><td>Glutamin</td><td>Gibico</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin streptomisin</td><td>Gibico</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Fetal buzağı serumu</td><td>BioInd</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant fare M-CSF proteini</td><td>R& D</td><td>Q3U4F9</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant fare RANKL proteini</td><td>R & D</td><td>Q3TWY5</td><td></td></tr><tr><td>RBC lizis tamponu</td><td>Beyotime</td><td>C3702</td><td></td></tr><tr><td>Tripan mavisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>302643</td><td></td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Shanghai Chemical Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sitrat çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>915</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit çözeltisi</td><td>Shanghai Chemical Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Asit Fosfataz, Lökosit (TRAP) Kiti</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Hızlı Garnet GBC Baz çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3872</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Nitrit Çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>914</td><td></td></tr><tr><td>Naphthol AS-BI Fosfat Çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3871</td><td></td></tr><tr><td>Asetat çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3863</td><td></td></tr><tr><td>Tartarat çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3873</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu su</td><td>Corning</td><td>21-031-CVR</td><td></td></tr><tr><td>L-tartarik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251380</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum tartrat dibazik dehidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>s4797</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Shanghai Chemical Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td> <td>Şangay Kimya Ltd. Şti.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Shanghai Chemical Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Şangay Kimya Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfataz substrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4744</td><td></td></tr><tr><td>anti-Raptor</td><td>Hücre Sinyal Teknolojisi</td><td>2280</td><td></td></tr><tr><td>anti-P-ribozomal protein S6 (S235 / 236)</td> <td>Hücre Sinyal Teknolojisi</td><td>2317</td><td></td></tr><tr><td>anti-ribozomal protein S6</td><td>Hücre Sinyal Teknolojisi</td><td>2211</td><td></td></tr><tr><td>anti-&beta;-aktin</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-130300</td><td></td></tr><tr><td>%37 formaldehit</td><td>Xilong bilimsel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>poliviniliden florür (PVDF) membran</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Western Kemilüminesan HRP Yüzey (ECL)</td><td>Millipore</td><td>00000367MSDS</td><td></td></tr><tr><td>IX71</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Envision</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,45 mm Şırınga</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Makas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sivrisinek forsep</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bir rankl tabanlı osteoklast kültür tahlil, fare mtorc1 osteoklast oluşumunda rol araştırmak için ilik

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

Osteoklastlar vardır benzersiz kemik-resorbing kemik iliği monosit/makrofaj soyundan hücre. Osteoklastlar disfonksiyon kemik metabolik hastalıkları, osteoporoz da dahil olmak üzere bir dizi neden olabilir. Patolojik kemik kayıplarının önlenmesi için ilaç hedefleri geliştirmek için hangi precursors Osteoklastlar ayırt mekanizmaları anlaşılması gerekir. Yeteneği yalıtmak ve çok sayıda Osteoklastlar vitro kültür Osteoklast ayrımında belirli genlere rolünün belirlemede önemlidir. İnactivation rapamycin karmaşık 1 (TORC1) Osteoklastlar içinde memeli/mekanik hedef Osteoklast kaç azaltın ve kemik kütlesi artırmak; Ancak, temel mekanizmaları daha fazla çalışma gerektirir. Bu da çalışmanın, ayırmak ve fare kemik iliği dan Osteoklastlar kültür ve mTORC1 inactivation Osteoklast oluşumu üzerine etkisi çalışmaya RANKL tabanlı bir protokol açıklanmıştır. Bu iletişim kuralı, genellikle bir hafta içinde çok sayıda dev Osteoklastlar, başarıyla sonuçlandı. Raptor silinmesiyle Osteoklast oluşumu Engelli ve o mTORC1 Osteoklast oluşumu için kritik olduğunu belirten salgı tartarat dayanıklı asit fosfataz aktivitesini azalmıştır.

Mevcut iletişim kuralını kullanarak, çok sayıda dev Osteoklastlar gün 6 görüldü; Dev Osteoklastlar görülmez, bir gün daha Osteoklast farklılaşma olabilir (şekil 1) gerekli. Başarılı Osteoklast oluşumu (şekil 2A) Boyama tuzak tarafından doğrulandı. Osteoklastlar 3'ten fazla çekirdeği dev şarap kırmızı/mor hücrelerle vardı. 250'den fazla Osteoklastlar WT BMMs (şekil 4A) 96-şey plaka her şey elde edilmi...

Bu el yazması bir iletişim kuralına izole etmek ve kültür Osteoklastlar vitro fare kemik iliği ve rapamycin karmaşık 1 Osteoklast oluşumunda memeli/mekanik hedef rolü çalışmaya açıklar.

Bir RANKL tabanlı Osteoklast kültür tahlil, fare mTORC1 Osteoklast oluşumunda rol araştırmak için ilik

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

Bu protokolün genel amacı, osteoklastları fare kemik iliğinden in vitro olarak izole etmek ve kültürlemek ve memeli rapatisin kompleksi birin osteoklast oluşumundaki rolünü incelemektir. Bu yöntem, mTORC1'in osteoklast farklılaşmasındaki rolü gibi osteoklast oluşumundaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, bir hafta içinde çok sayıda dev osteoklast ile sonuçlanmasıdır.Bu tekniğin etkileri osteoporoz tedavisine kadar uzanır, çünkü osteoklastın öncüllerinden farklılaştığı mekanizmayı incelemek yararlıdır. Bu işleme başlamak için, ötenazi yapılmış bir farenin tibiasının distal ucunda dikey bir kesi yapın ve cildi arka bacaklar boyunca inceleyin. Daha sonra, kalça eklemlerinin eklem bağını makasla kesin ve arka bacakları gövdeden çıkarın.Diz ekleminin eklem bağını kesin ve tibia ve uyluk kemiğini dikkatlice ayırın. Yumuşak dokuyu makasla nazikçe çıkarın. Bir farenin tüm kemiklerini, buz üzerinde iki mililitre alfa-MEM içeren altı oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna yerleştirin.İzolasyon için, altı oyuklu bir plakanın bir kuyusunu% 75 etanol ve diğer beş kuyucuğu alfa-MEM ile doldurun. Bir farenin tüm kemiklerini 15 saniye boyunca etanol yıkamaya koyun ve ardından kemikleri her seferinde 10 saniye boyunca alfa-MEM ile beş kez yıkayın. Epifizleri makasla kesin ve kemik boşluğuna 0.45 milimetrelik bir şırınga iğnesi yerleştirin.İliği alfa-MEM ile 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne boşaltın. Ardından, aynı yöntemi kullanarak kemik boşluğunu kemiğin diğer ucundan yıkayın. Kemik soluklaşana kadar kemik boşluğunu iyice yıkamak için en az iki kez tekrarlayın.Daha sonra, beş dakika boyunca dört santigrat derecede bir hücre peleti elde etmek için kemik iliğini santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanı aspire edin. Santrifüj tüpüne üç mililitre kırmızı kan hücresi lizis tamponu ekleyin ve kemik iliğini yeniden süspanse etmek için hafifçe pipetleyin.Ardından, kırmızı kan hücrelerini parçalamak için santrifüj tüpünü sekiz dakika boyunca buz üzerinde tutun. Sekiz dakika sonra, hücre parçalanmasını durdurmak için santrifüj tüpüne altı mililitre alfa-MEM ekleyin. 800 g ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin.Daha sonra, üç mililitre alfa-MEM kültür ortamında yeniden süspanse edin ve hücreleri altı oyuklu bir plakaya yerleştirin. Gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Bu adımda, ertesi sabah bağlanmamış hücreleri toplamak için süpernatanı 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.Daha sonra, beş dakika boyunca 800 g ve dört santigrat derecede santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin. Daha sonra, hücreleri dört mililitre alfa-MEM kültür ortamında yeniden süspanse edin. 20 mikrolitre hücre çözeltisi alın ve 20 mikrolitre Tripan Blue ile karıştırın.Daha sonra, sayma odasına 10 mikrolitre karışım ekleyin ve mililitre çözelti başına hücre sayısını elde edin. Bunu takiben, mililitre başına 500.000 hücrelik bir hücre çözeltisi elde etmek için uygun hacimde alfa-MEM kültür ortamı ekleyin. Daha sonra, sırasıyla 24 oyuklu bir plaka ve 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 500 mikrolitre ve 50 mikrolitre kemik iliği makrofaj indüksiyon ortamı ekleyin.Daha sonra, sırasıyla 24 oyuklu bir plakanın ve 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 500 mikrolitre ve 50 mikrolitre hücre çözeltisi ekleyin. Üç gün boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Kaplamadan üç gün sonra, 96 oyuklu plakanın her bir oyuğundan 50 mikrolitre ortam toplayın ve eksi 20 santigrat derecede dondurun.Ardından, kalan ortamı aspire edin. Sırasıyla 24 oyuklu bir plakanın ve 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna bir mililitre ve 100 mikrolitre osteoklast indüksiyon ortamı ekleyin. İki gün boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.İki gün sonra, her oyuktan 50 mikrolitre ortam toplayın ve kalan ortamı aspire edin. Daha sonra, her bir oyuğa osteoklast indüksiyon ortamı ekleyin ve bir gün boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Osteoklastlar oluştuktan sonra, 96 oyuklu plakanın her bir oyuğundan 50 mikrolitre ortam toplayın.Bu adımda, ortamı aspire edin ve numuneyi 1X PBS ile üç kez nazikçe yıkayın. Daha sonra, 96 oyuklu plakanın her bir oyuğundaki hücreleri, oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 100 mikrolitre sabitleme çözeltisi ile sabitleyin. Fiksasyondan sonra, sabitleme solüsyonunu aspire edin ve hücreleri 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtılmış deiyonize su ile üç kez nazikçe yıkayın.Ardından, deiyonize suyu aspire edin ve 96 oyuklu plakanın her bir kuyucuğuna 100 mikrolitre TRAP boyası ekleyin. Plakayı 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin ve ışıktan koruyun. Boyamadan sonra, TRAP lekesini aspire edin ve deiyonize su ile üç kez nazikçe yıkayın.Daha sonra, osteoklastları 40X büyütmede ters çevrilmiş bir mikroskopta görüntüleyin. Daha sonra, daha önce toplanan ortamın 30 mikrolitresini 96 oyuklu yeni bir plakaya aktarın. Daha sonra, 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 90 mikrolitre substrat karışımı ekleyin.Plakayı bir saat boyunca 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin ve ışıktan koruyun. Bir saat sonra, 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 30 mikrolitre üç molar sodyum hidroksit ekleyerek reaksiyonu durdurun. Ardından, EnVision Çok Etiketli Plaka Okuyucu ile 405 nanometre dalga boyunda absorbansı ölçün.İşte altıncı günde parlak alanda gözlemlenen osteoklastların temsili görünümü. Kırmızı çizgi, osteoklastların sınırını belirledi. Ve burada tipik olarak dev, çok çekirdekli, TRAP pozitif bir osteoklast gösteriliyor.Siyah ok, çok çekirdekli osteoklastın iki çekirdeğini gösterdi. Bu şekil, altıncı günde BMM'lerin TRAP boyamasını göstermektedir. Sırasıyla vahşi tip ve Ctsk-Cre Raptor nakavt gruplarındaki karelerin yüksek büyütmeli görüntüleri gösterilir.Bunlar, vahşi tip gruba kıyasla Ctsk-Cre Raptor nakavt BMM'lerinde oluşan daha az dev, TRAP pozitif osteoklastlardı. Bu şekil, kültürlenmiş vahşi tip ve Ctsk-Cre Raptor nakavt BMM'lerinin TRAP aktivitesini göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde uygulanırsa bir hafta içinde yapılabilir.Bu prosedürü denerken, canlı kemik iliği makrofajlarının optimal tohumlama yoğunluğu kritik olduğundan, kemik iliği makrofajlarının canlılığını korumayı hatırlamak önemlidir. Kemiğin buz üzerinde bir saatten fazla tutulmaması ve hücrelerin nazikçe yeniden askıya alınması önerilir. Bu prosedür, osteoklastın normal ve patolojik fizyolojisini incelemek için kemik dilimleri ile osteoklast rezorpsiyon testi gibi diğer yöntemlerle birleştirilebilir.Bu yöntemle, mTORC1'in osteoklast oluşumunda önemli bir rol oynadığını ve gelecekte osteoporoz gibi kemik metabolik bozukluklarının tedavisi için potansiyel bir farmakolojik hedef olarak hareket edebileceğini bulduk.

a-rankl-based-osteoclast-culture-assay-mouse-bone-marrow-to

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Retinoik asit ile osteoblastların primer fare tedavisi kemik hücresinin morfolojik ve moleküler özellikler taşıyan dallanmış homojen bir hücreler popülasyonu üretir. Yöntem, elde edilmesi ve kültürü birincil kemik hücresinin korumanın zorluğu üstesinden gelir ve transjenik modelleri türetilen hücreler çalışma avantajlı olabilir.

İlköğretim Fare Osteoblastlar gelen osteositlere Kültürler Edinme Retinoik Asit Uygulama

Öncü hücrelerin osteoklastlara farklılaşması sitokinler ve büyüme faktörleri tarafından düzenlenir. Burada, osteoklastların in vivo olarak farklılaşması için yeni bir gen transfer tekniği ve sitokinlerin osteoklastogenez üzerindeki etkilerini incelemek için bir yöntem olarak öncü hücrelerin in vitro osteoklastlara farklılaşması için hücre kültürü protokolleri açıklanmaktadır.

Bir Roman In vivo Gen Transferi Tekniği ve In vitro Hücre Tabanlı Tahliller

Osteoklastlar vücutta ana kemik-rezorbe hücresi vardır. Çok sayıda osteoklastlar izole etmek için bir yeteneği osteoklast biyoloji anlama konusunda önemli ilerlemelere yol açmıştır. Bu protokol, yetiştirilmesi ve in vitro olarak osteoklast aktivitesi miktarının, izole edilmesi için bir yöntem açıklanmaktadır.

Fare Kemik İliği osteoklast türetilmesi

Notch sinyali, hücreler arasında doğrudan temasa dayanan bir hücresel iletişim şeklidir. Notch sinyalini in vitro olarak düzgün bir şekilde indüklemek için, Notch ligandları hücrelere hareketsiz bir durumda sunulmalıdır. Bu protokol, fare osteoklast öncülerinde Notch sinyalinin in vitro stimülasyonu için yöntemleri açıklar.

Fare Osteoklast Öncüleri Notch Sinyal uyarılması

Bu iletişim kuralı bir vitro insan preklinik modeli osteoclastogenesis kanser hücre-Osteoklast etkileşimi taklit etmek için meme kanseri hücre hatları ile kültürlü periferik kan monosit üzerinden gelişimi anlatılmaktadır. Model kemik metastaz oluşumunu anlayışımız daha fazla ve tedavi olanakları geliştirmek için kullanılabilir.

Osteoclastogenesis periferik kan monosit kültürlü meme kanseri hücre hatları ile birlikte gelen bir insan preklinik modelinin geliştirilmesi

Bu makalede, biz izole ve kemik iliği stromal hücreler ve hematopoetik kök hücre fare uzun kemiklerin ayırt etmek için yöntemler mevcut. İki farklı protokol verimli farklı hücre popülasyonlarının genişleme ve farklılaşma dokusunu, adipositler ve Osteoklastlar içine uygun sunulmaktadır.

Yalıtım, kültür ve kemik iliği Stromal hücreler ve Osteoklast ataları fareler gelen farklılaşma

Osteokuzlar, hematopoetik kök hücrelerin monosit-makrophaj soylarından elde edilen dokuya özgü makrophaj polykaryonlarındadır. Bu protokol, kemik iliği hücrelerinin nasıl yalıtılmasını açıklar, böylece geleneksel yöntemlerde bulunan kazaların riskini azaltarak büyük miktarlarda osteocsürer elde edilir.

Sıçan kemik Iliği Osteoclast precursors yalıtım, arıtma ve farklılaşma

Bu iletişim kuralı fare uzun kemik ve kemik iliği makrofajlar oluşturup Osteoklastlar makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) ve reseptör aktivatör nükleer faktör Kappa B ligand (RANKL) kullanarak üretmek için kemik iliği yalıtım, diseksiyon içerir veya tümör nekroz faktör alfa (TNF-α) ve anti-c-fms antikor, M-CSF reseptör tarafından onların tutuklama.

Osteoklast oluşumu ve hızla çoğalmak-in Vitro Osteoklast habercisi Anti-c-fms antikor etkisi

Bu protokol, in vivo osteoklast aktivitesini kontrol eden kritik genleri anlamak için kurallı bir yöntemi açıklar. Bu yöntem, iskelet fenotipini analiz etmek için transgenik bir fare modeli ve bazı kurallı teknikler kullanır.

Koşullu Stat3 Silme Fare Modelinin İskelet Fenotip Analizi

Burada, kalsiyum fosfat kaplı hücre kültürü plakaları kullanılarak rezorpsiyon çukuru testleri için basit ve etkili bir tahlil prosedürü sunuyoruz.

Osteoklastik Rezorpsiyonu In Vitro Görselleştirmek ve Ölçmek için Basit Bir Pit Tahlil Protokolü

Keşfedin fare kemik iliği osteoklast izolasyonu ve mTORC1'in osteoklast oluşumundaki rolünü inceleyen RANKL tabanlı kültür yöntemi. Bu teknik bir haftada dev osteoklast üretimi sağlar ve osteoporoz tedavisi araştırmalarına katkı sunar.

Bir RANKL tabanlı Osteoklast kültür tahlil, fare mTORC1 Osteoklast oluşumunda rol araştırmak için ilik

Daha fazla video keşfet