İç içe geçmiş PCR kullanarak keneler Lyme hastalığı Sfilis, Borrelia Burgdorferi, algılama

Lyme hastalığı, spiroketal patojen Borrelia burgdorferi sensu lato'nun neden olduğu zayıflatıcı bir hastalıktır. Bakteri, enfekte bir kene ısırması yoluyla insanlara bulaşır ve cildi, eklemleri, kalbi ve sinir sistemini etkileyebilen çok sistemli semptomlara neden olur. Köpek gezdirme ve yürüyüş gibi günlük aktiviteler, insanları Lyme hastalığına yakalanma riskinin artmasına neden olabilir.

Bu nedenle, bu büyüyen tehditle mücadele stratejileri, kenelerde patojen prevalansını gösterebilen ve ilgili coğrafi bölgeleri belirleyebilen sağlam sürveyans önlemlerini içerir. Bu video, Borrelia için moleküler bir tarama aracı olarak iç içe polimeröz zincir reaksiyonunun faydasını göstermektedir. Spesifik olarak artırmak için, hem dış yüzey proteini A hem de flagellin B genleri amplifikasyon için hedeftir.

İş akışı, kene toplama, DNA ekstraksiyonu ve ardından Borrelia'ya özgü lokusları tespit etmek için ilk PCR turu ile başlar. İkinci tur PCR, daha küçük dahili amplifikasyon fragmanları oluşturmak için ilk reaksiyonun ürününü yeni bir şablon olarak kullanır. Her iki Borrelia geninden iç amplikonlar agaroz jel elektroforezi ile tespit edilebildiğinde, patojen için bir kene pozitif olarak kabul edilir.

Pasif sürveyans, test için keneleri toplamak ve göndermek için vatandaşların ve veterinerlerin yardımını alır. Bu sürecin bir parçası olarak, kene ana bilgisayarı, karşılaşmanın tarihi ve konumu gibi bilgileri yakalamak önemlidir. Laboratuvarda, keneler önce fotoğraflanmalı ve standart anahtarlarla morfolojik karşılaştırmaya dayalı olarak tanımlanmalıdır.

İç içe PCR'nin hassasiyeti, bu tekniği kontaminasyona karşı savunmasız hale getirir, bu nedenle numune işlemenin her aşaması ayrı, temiz bir yerde gerçekleşmeli ve reaktiflerin ve ortamın kirletici maddelerden arınmış olduğundan emin olmak için birden fazla kontrol dahil edilmelidir. Çalışma alanı uygun şekilde hazırlandıktan sonra, keneyi sterilize edilmiş bir biyolojik güvenlik kabininde ikiye bölün ve yarısını bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. PCR uyumlu şablon veren herhangi bir DNA izolasyon prosedürü kullanılabilir.

Bu video, basit bir şelasyon bazlı DNA ekstraksiyonunu göstermektedir. Başlamak için, kene parçasının boyutuna bağlı olarak uygun bir hacimde litik şelasyon tamponu ekleyin ve bir mikrotüp havaneli kullanarak homojenize edin. Numuneleri 60 santigrat derecede bir su banyosunda 45 dakika inkübe edin, girdap yapın ve ardından içeriği santrifüjleyin.

Beklerken, 50 mikrometre izopropanol alikode ederek her numune için yeni mikrosantrifüj tüpleri hazırlayın. Süpernatanı yeni mikrosantrifüj tüpüne aktarın, ters çevirerek karıştırın ve daha önce olduğu gibi yeniden santrifüjleyin. Bu sefer, süpernatanı atın ve DNA peletini %70 etanol ile durulayın.

Kalan sıvıyı bir pipet kullanarak çıkarın ve peleti oda sıcaklığında 15 dakika havayla kurutun. Son olarak, her bir pelete 50 mikrometre 1 milimolar Tris ekleyin ve DNA'yı yeniden süspanse etmek için 60 derecelik bir su banyosunda bir saat inkübe edin. Numuneler artık gelecekteki moleküler analizler için eksi 20 santigrat derecede saklanabilir.

UV ışığı ve %70 etanol kullanarak bir PCR kabinini sterilize ederek başlayın. Reaksiyon kokteyli, polimeraz, su, ileri ve geri dış primerleri ve önceki prosedürde ekstrakte edilen DNA'yı içeren ana karışımdan oluşur. Her kene örneğinde OspA ve FlaB'yi bağımsız olarak tespit etmek için ayrı reaksiyonlar kurulur.

Numuneleri nabız santrifüjleyin, bir termal döngüleyiciye yerleştirin ve makineyi programlayın. İlk PCR deneyi, uzun amplikonlar üreten gene özgü dış primerler kullanır. İlk reaksiyondan PCR ürünleri daha sonra sonraki amplifikasyon için şablon haline gelir.

Bu iç içe geçmiş PCR, yeni, daha kısa DNA parçaları üretmek için ilk amplikon içinde tavlanan gene özgü primerler kullanır. İkinci reaksiyondan elde edilen ürün artık bir moleküler kütle referans merdiveninin yanına %1.2'lik bir agaroz jel üzerine yüklenebilir ve bir saat boyunca elektroforez edilebilir. Son olarak, bir transilluminatör kullanarak jeli görüntüleyin.

Bu örnekte, her şerit hem OspA hem de FlaB için analiz edilen farklı bir kene örneğini temsil eder. Amplikonlar sadece bazı şeritlerde mevcuttur. Bu iki örneğin her ikisi de OspA için PCR ürünleri üretse de, bunlardan sadece biri FlaB'yi yakaladı.

Bir numunenin her iki genin de pozitif olarak kabul edilmesi için bantlar üretmesi gerekir. PCR ürünlerinin görsel olarak incelenmesi, böylece her bir kenenin Borrelia durumunun belirlenmesine olanak tanır. Genel olarak, iç içe PCR, Borrelia sürveyansına uygulanabilecek hassas, spesifik ve nispeten basit bir tekniktir.

Bu tür girişimlerden elde edilen veriler, Lyme hastalığı için coğrafi endişe bölgelerinin belirlenmesine ve bu patojenin doğadaki prevalansının tahmin edilmesine yardımcı olabilir.