Mitokondrial kaynaklı peptid tedavi üzerine ERK harekete geçirmek için hücre altı ayırma

Bu deneyin genel amacı, mitokondriyal türevli peptitlerle uyarılan hücrelerde yer alan aşağı akış sinyal kaskadını tanımlamaktır. Bu yöntem, mitokondriyalden türetilmiş peptit alanındaki hangi sinyal yollarının dahil olduğu ve bunun nerede meydana geldiği gibi temel soruları yanıtlayabilir. Bu tekniğin temel avantajı, basit ve gerçekleştirilmesi nispeten kolay olmasıdır.

Bu yöntem için ilk olarak, aşağı akış gerçekleri hakkında bize sınırlı bilgi veren insan aracılı ERK sinyalizasyonunu incelediğimizde aklımıza geldi. Subscale Kersher yöntemi bize insan aracılı sinyallemenin rolü hakkında daha iyi bir fikir verdi. Kaplama ve yıkamadan sonraki üçüncü gün, iki kez on ila altıncı, SH-SY5Y veya HEK293 hücreleri metin protokolüne göre.

S14G humanin peptitlerini sıfır noktası iki mikron filtrelenmiş damıtılmış suda çözün. Ve bunları tek milimolar bir stok çözeltisi olarak yeniden oluşturun. Önceden ısıtılmış serum içeren veya serumsuz ortamı 15 mililitrelik konik bir tüpte alikotlayın ve bir çalışma konsantrasyonu oluşturmak için oda sıcaklığında humanin peptit stok çözeltisi ekleyin.

Hücrelerdeki ortamı hemen altı mililitre peptit çözeltisi ile değiştirin. Ve hücreleri uygun süre boyunca inkübe edin. Hücreleri iki kez yıkamak için 10 mililitre buz gibi soğuk PBS kullanın.

Daha sonra hücreleri plakadan beş mililitre buz gibi soğuk PBS'de kazıyın. Ve hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Hücreleri beş dakika boyunca 500 kez G ve dört santigrat derecede santrifüjleyin.

Peletleri 200 mikrolitre buz gibi soğuk fraksiyonlama tamponunda tekrar süspanse edin ve buz üzerinde 15 dakika inkübe edin. Tüpü beş dakika boyunca 250 kez G ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Daha sonra süpernatanı sitoplazmik fraksiyon olarak toplayın ve peleti nükleer fraksiyon için saklayın.

Hücresel kalıntıları ve diğer kirleticileri temizlemek için süpernatanı on dakika boyunca 18000 kez G ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Ve sonra süpernatanı yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Bu sitisol fraksiyonudur.

Peleti 200 mikrolitre buz gibi soğuk yıkama tamponunda tekrar süspanse edin ve çözeltiyi beş dakika boyunca 250 kez G ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve peleti yeniden askıya almak için 100 mikrolitre buz gibi soğuk nükleer ekstraksiyon tamponu kullanın. Daha sonra numuneyi 10 kez buz üzerinde sonikasyona tabi tutun.

Numuneyi tekrar santrifüjleyin. Ardından süpernatanı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Ham mitokondriyal fraksiyonu izole etmek için, her 10 santimetrelik tabaktaki hücreleri yıkamak için 10 mililitre buz gibi soğuk PBS kullanın.

Sonra beş mililitre buz gibi soğuk PBS ekleyin ve hücreleri ayırmak için bir hücre kazıyıcı kullanın. Hücre süspansiyonlarını tek bir 15 mililitrelik konik tüpe aktarın. Daha sonra hücreleri 10 dakika boyunca 600 kez G ve dört santigrat derecede santrifüjleyin.

PBS'yi aspire edin ve peleti yeniden askıya almak için bir mililitre buz gibi mitokondriyal izolasyon tamponu kullanın. Daha sonra buz üzerinde politetrafloretilen kaplı bir havaneli ile hücreleri 25 mililitrelik bir homojenizatör ile homojenize edin. Homojenatı bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve çekirdeği ve kırılmamış hücreleri çıkarmak için numuneyi 600 kez G ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin.

Daha sonra süpernatanı toplayın, yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve çözeltiyi 10 dakika boyunca 7000 kez G ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Süpernatanı çıkardıktan sonra, peleti 200 mikrolitre buz gibi soğuk mitokondri izolasyon tamponu ile yeniden askıya alın ve çözeltiyi yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Tüpü 10 dakika boyunca 7000 kez G ve dört santigrat derecede santrifüjleyin.

Yıkamayı tekrarladıktan sonra, peleti yeniden süspanse etmek için 15 mikrolitre RIPA tamponu kullanın ve süspansiyonu buz üzerinde 10 dakika inkübe edin. Daha sonra numuneyi 15 dakika boyunca 16000 kez G ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Mitokondriyal fraksiyon olan süpernatanı yeni bir tüpe aktarın.

Metin protokolüne göre batı lekelemeyi ölçün ve gerçekleştirin. Bu videoda gösterilen prosedürü kullanarak, HEK293 ve SH-SY5Y hücreleri, güçlü bir humanin analoğu olan bir ve 100 mikromolar S14 G humanin ile geri çekildi. Ve toplam protein ekstraktlarından theanine 202, tirozin 204'teki ERK12'nin toplam ve fosforile formu analiz edildi.

Burada görüldüğü gibi, S14G humanin tedavisi, ERK12 ve düzenleyici teanin-202, tirozin-204 bölgesinin fosforilasyonunda bir artış gösterdi. S14G insan aracılı ERK12 aktivasyonunun hedefini anlamak için, S14G insan tedavisi sonrası toplam ve fosforile ERK12'nin hücre altı lokalizasyonu analiz edildi. Bu batı lekelerinde gösterildiği gibi, HEK293 hücrelerinde, fosforile ERK hem sitoplazmada hem de çekirdekte artmıştır, ancak mitokondride artmamıştır.

Bununla birlikte, SH-SY5Y hücrelerinde, sitoplazma çekirdeğinde ve mitokondride fosforile ERK azaldı. S14G insan aracılı ERK fosforilasyonunun farklı hücre tiplerinde ve farklı koşullarda farklı bir rol oynayabileceğini düşündürmektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, hücre nükleer fraksiyonasyonu bir saat içinde yapılabilir ve mitokondriyal fraksiyonlama, uygun şekilde yapılırsa bir saat 30 dakika içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, tüm numuneleri buz üzerinde tutmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, sinyal moleküllerinin aşağı akış hedeflerini anlamak için ko-immün çökeltme ve kütle spektrometresi dahil olmak üzere diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.