Name: Mitokondrial kaynaklı peptid tedavi üzerine ERK harekete geçirmek için hücre altı ayırma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Öğrenin mitokondrial kaynaklı peptidlerle hücre uyarımında ERK sinyal yolunu ve fosfo-protein lokalizasyonunu inceleme yöntemini. SH-SY5Y ve HEK293 hücreleri kullanılarak geliştirilen bu protokol, mitokondriyal biyoloji araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser bir Ellison/AFAR doktora sonrası bursu SJK için eskime araştırma programı tarafından desteklenen ve Glenn Vakfı Ödülü ve NIH verir PC için (1P01AG034906, 1R01GM 090311, 1R01ES 020812). Tüm yazarlar filmde görünür.

1. peptid tedavi hücrelere <ol><li>iki milyon SH-SY5Y plaka veya HEK293 hücrelere 10 cm (2 x 10 6) yemek ve onlar için 2 gün</li> <li>(isteğe bağlı) ertesi gün, Dulbecco serum içermeyen hücrelerle yıkama &#39; s modifiye Orta (DMEM) medya bir kez kartal ve ücretsiz DMEM gecede serum boş ortam içinde yapılması gereken tedavi ihtiyacı varsa serum ile kuluçkaya.</li>
	<li>3 günde S14G-humanin peptidler µm filtre, distile su ve 1 mM hisse senedi çözüm olarak sulandırmak 0,2 içinde erimesi. 
	Not: Peptidler peptid (örneğin, genel ücret) sıra özellikleri tarafından belirlenen ve peptidler ticari olarak kullanılabilir durumdaysa üreticisi tarafından sağlanan uygun çözücü içinde çözünmüş. Örneğin, S14G-humanin, SHLP2 ve SHLP6 ve MOTS-c suda çözülür. Aliquot peptidler döngüleri erime ve donma önlemek için bir uygun birimi (örneğin, 50 μL) içinde. Bir kez çözdürülen, bunları tekrar kullanmayın.</li>
	<li>Aliquot Önceden ısıtılmış serum içeren veya bir 50 ml konik tüp ve bir çalışma konsantrasyonu (örneğin, 1 µM, 10 µM) yapmak için oda sıcaklığında 1 mM hisse senedi çözüm eklemek serum-Ücretsiz medya.</li>
	<li>Yerine medya ile 6 mL peptid eriyik--dan adım 1.4. ve hücreleri uygun süreyi için kuluçkaya. 
	Not: kuluçka süresi ERK etkinleştiren, koşula bağlı olarak seçin.</li>
</ol> 2. Sitozol ve çekirdeği için hücre altı ayırma <ol><li>buz gibi PBS 10 mL iki kez hücrelerle yıkama, hücreleri 5 mL buz gibi PBS de plaka kapalı kazımak ve hücre süspansiyon 15 mL konik tüp içine transfer.</li>
	<li>Hücreleri, 500 x g 5 min için saat 4'te santrifüj kapasitesi ° C.</li>
	<li>PBS Aspire edin ve Pelet buz gibi ayırma arabellek 200 µL içinde yeniden askıya alma (10 mM HEPES pH 7,6, 3 mM MgCl 2, 10 mM KCl, %5 (v/v) gliserol, % 1 iyonik olmayan yüzey aktif (C 13 H 22 O (C 2 H 4 O) = n), proteaz/fosfataz inhibitörleri). 
	Not: protein fosforilasyon durumları tutmak için fosfataz inhibitörü olarak iyi proteaz inhibitörü taze eklenmelidir ve örnekleri buza hiç tutulmalıdır zaman. Donma ve erime yinelenen örnekleri döngüleri kaçınılmalıdır. Onları-80 buz gibi önce az miktarda (örneğin 50 μg) içine aliquot örnekleri ° C.</li>
	<li>15 dakika buzda yeniden askıya alınmış Pelet kuluçkaya ve 5 min için 250 x g, saat 4'te santrifüj kapasitesi ° C.</li>
	<li>Süpernatant sitoplazmik kesir olarak toplamak ve Pelet nükleer kesir için devam.</li>
	<li>Hücresel enkaz ve 18.000 x g 4 ° C'de 10 dakika için de diğer kirleri çıkarmak ve sonra süpernatant yeni bir microcentrifuge tüp içine aktarmak için süpernatant santrifüj kapasitesi. Sitozol kesir bu.</li>
	<li>Pelet 200 μL buz gibi yıkama arabellekte resuspend (10 mM HEPES pH 7,6, 1.5 mM MgCl 2, 420 mM NaCl, %25 (v/v) gliserol, 0.2 mM EDTA, proteaz/fosfataz inhibitörleri =) ve 4 ° C'de 5 min için 250 x g, santrifüj</li>
	<li>Süpernatant kaldırmak ve Pelet 100 μL buz gibi nükleer ayıklama arabellekte resuspend (20 mM HEPES pH 7,6, 1.5 mM MgCl 2, 420 mM NaCl, %25 (v/v) gliserol, 0.2 mM EDTA, proteaz/fosfataz inhibitörleri =) ve 10 kez solüsyon içeren temizleyicide (5 üzerinde 10 s s Çekil, % 30 amp.) buz üzerinde</li>
	<li>Santrifüj 18.000 x g 4 ° C'de 10 dk de</li>
	<li>Yeni bir microcentrifuge tüp süpernatant aktarın. Nükleer kesir bu.</li>
	<li>Miktarını BCA tahlil kullanarak protein miktarı</li></ol>
 3. ham mitokondrial kesir <ol><li>buz gibi PBS 10 mL ile her 10 cm çanak hücrelerde yıkama, 5 mL buz gibi PBS ekleyin ve bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri ayırmak. 
	Not: Western Blot mitokondri, iyi bir verim almak için üç 10 cm yemekleri hücre kullanın.</li>
	<li>Hücre süspansiyon 15 mL konik tüp aktarmak ve her üç 10 cm yemeklerini bir 15 ml konik tüp içine birleştirmek.</li>
	<li>Hücreleri, 10 min 600 x g 4'te santrifüj kapasitesi ° C.</li>
	<li>PBS Aspire edin ve Pelet 1 mL buz gibi mitokondri yalıtım arabellek yeniden askıya alma (10 mM Tris-BEZLERİ, 1 mM EGTA/Tris, 200 mM Sükroz, ayarlamak için pH 7.4 =).</li>
	<li>Buz üzerinde politetrafloroetilen kaplamalı havaneli ile 25 vuruş 2 mL homogenizer hücrelerle homojenize 
	Not: Bu mitokondri bütünlüğünü korumak ve mitokondrial kesir verimi en üst düzeye çıkarmak için kritik bir adımdır. Vuruş sayısı her hücre türü için optimize edilmelidir. Yordamına başlamadan önce homogenizer precool.</li>
	<li>Homogenate bir microcentrifuge tüp aktarmak ve vasıl 600 x g 4 ° C'de çekirdeği ve kesilen hücreleri kaldırmak için 10 dk santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Süpernatant toplamak, yeni bir microcentrifuge tüp aktarmak ve 7000 x g 10 min için de 4'te santrifüj kapasitesi ° C. 
	Not: Pelet gevşemiş, süpernatant özenle toplamak ve Pelet bozmamaya çalışın.</li>
	<li>Süpernatant kaldırmak, pelet 200 μL buz gibi mitokondri yalıtım arabelleği ile yeniden askıya alma ve çözüm için yeni bir microcentrifuge tüp aktarın. 7000 x g 10 dk de tüp 4'te santrifüj kapasitesi ° C.</li>
	<li>Pelet yıkamak için yineleme adım 3.8. Bu adımda yeni bir microcentrifuge tüp süpernatant aktarmak gerekli değildir.</li>
	<li>Süpernatant yıkanmış Pelet kaldır ve mitokondri ile 50 μL RIPA arabelleği içeren Pelet yeniden askıya alma.</li>
	<li>Incubate 10 dakika süreyle buzda süspansiyon</li>
	<li>Süspansiyon 16.000 x g 15dk için de 4'te santrifüj kapasitesi ° C.</li>
	<li>Yeni bir microcentrifuge tüp süpernatant aktarın. Mitokondrial kesir bu.</li>
	<li>BCA tahlil kullanarak protein miktarı ölçmek.</li>
</ol> 4. Western Blot fosfo-spesifik proteinler için <ol><li>bir SDS-polyacrylamide Jel Elektroforez (8-%16 erken jel) gerçekleştirmek ve protein bir PVDF membran 4 ' e transfer.</li>
	<li>Kuluçkaya membran TBST %5 BSA ile (% 0,1 Polysorbate 20) arka plan belirsiz bağlayıcı siteleri engellemek için oda sıcaklığında 30 dk için. 
	Not: fosforile protein tespiti için membran BSA değil süt ile engelleyin. Süt içeren kazein, yüksek nonspesifik sinyal sonuçları bir bol miktarda Fosoprotein.</li>
	<li>Membran 4 ° C'de birincil antikoru (anti-fosfo-ERK1/2) ile bir gecede kuluçkaya.</li>
	<li>Ertesi gün, membran TBST ile yıkayın (% 0,1 polysorbate 20) üç kere oda sıcaklığında 5 min için.</li>
	<li>Membran ile ikincil antikoru (Anti-tavşan HRP) oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Membran TBST ile yıkayın (% 0,1 polysorbate 20) üç kere oda sıcaklığında 5 min için.</li>
	<li>Membran ECL çözüm ile kuluçkaya ve Image analyzer membran görüntü.</li>
	<li>Şerit arabellek 15 dakika oda sıcaklığında ve yıkama membran ile TBST üç kez 5 dakika süreyle sıyırma ile membran</li>
	<li>4.2-4.7 kullanarak anti-toplam ERK1/2 antikor arasındaki adımları yineleyin.</li>
	<li>Her kesir saflığı kontrol etmek için SDS-sayfa çalıştırmalarına ve işaretleri her bölmesi (örneğin, Okan B1 çekirdeği, sitozol için GAPDH ve TOM20 mitokondri için) için tanıma antikorları kullanarak immunoblots.</li>
</ol>

<ol><li>Yen, K., Lee, C., Mehta, H., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+the+mitochondrial-derived+peptide+humanin+in+stress+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The emerging role of the mitochondrial-derived peptide humanin in stress resistance.</a> J. Mol. Endocrinol. 50 (1), 11-19 (2013).</li>
<li>Muzumdar, R. H., Huffman, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanin%3A+a+novel+central+regulator+of+peripheral+insulin+action%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Humanin: a novel central regulator of peripheral insulin action.</a> PloS one. 4 (7), 6334(2009).</li>
<li>Lee, C., Yen, K., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanin%3A+a+harbinger+of+mitochondrial-derived+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Humanin: a harbinger of mitochondrial-derived peptides.</a> Trends Endocrinol. Metab. 24 (5), 222-228 (2013).</li>
<li>Kim, S. J., Guerrero, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial-derived+peptide+humanin+activates+the+ERK1%2F2%2C+AKT%2C+and+STAT3+signaling+pathways+and+has+age-dependent+signaling+differences+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial-derived peptide humanin activates the ERK1/2, AKT, and STAT3 signaling pathways and has age-dependent signaling differences in the hippocampus.</a> Oncotarget. 7 (30), 46899-46912 (2016).</li>
<li>Ying, G., Iribarren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanin%2C+a+newly+identified+neuroprotective+factor%2C+uses+the+G+protein-coupled+formylpeptide+receptor-like-1+as+a+functional+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor.</a> J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).</li>
<li>Zhang, W., Liu, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAPK+signal+pathways+in+the+regulation+of+cell+proliferation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">MAPK signal pathways in the regulation of cell proliferation in mammalian cells.</a> Cell Res. 12 (1), 9-18 (2002).</li>
<li>Huang, C., Jacobson, K., Schaller, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAP+kinases+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">MAP kinases and cell migration.</a> J. Cell Sci. 117, Pt 20 4619-4628 (2004).</li>
<li>Cagnol, S., Chambard, J. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERK+and+cell+death%3A+mechanisms+of+ERK-induced+cell+death--apoptosis%2C+autophagy+and+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">ERK and cell death: mechanisms of ERK-induced cell death--apoptosis, autophagy and senescence.</a> FEBS J. 277 (1), 2-21 (2010).</li>
<li>Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+and+properties+of+MAPKs%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Differential regulation and properties of MAPKs.</a> Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).</li>
<li>Morrison, D. K., Davis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+MAP+kinase+signaling+modules+by+scaffold+proteins+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev%22%5BJournal%5D)">Regulation of MAP kinase signaling modules by scaffold proteins in mammals.</a> Annu. Rev. Cell Dev. 19 (1), 91-118 (2003).</li>
<li>Wainstein, E., Seger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+subcellular+localization+of+ERK%3A+mechanisms+of+translocation+and+role+in+various+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The dynamic subcellular localization of ERK: mechanisms of translocation and role in various organelles.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 39, 15-20 (2016).</li>
<li>Zehorai, E., Yao, Z., Plotnikov, A., Seger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subcellular+localization+of+MEK+and+ERK--a+novel+nuclear+translocation+signal+%28NTS%29+paves+a+way+to+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The subcellular localization of MEK and ERK--a novel nuclear translocation signal (NTS) paves a way to the nucleus.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 314 (2), 213-220 (2010).</li>
<li>Kolch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinating+ERK%2FMAPK+signalling+through+scaffolds+and+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Coordinating ERK/MAPK signalling through scaffolds and inhibitors.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (11), 827-837 (2005).</li>
<li>Horbinski, C., Chu, C. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15589366">Kinase signaling cascades in the mitochondrion: a matter of life or death.</a> Free Radic. Biol. Med. 38 (1), 2-11 (2005).</li>
<li>Aebersold, D. M., Shaul, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+signal-regulated+kinase+1c+%28ERK1c%29%2C+a+novel+42-kilodalton+ERK%2C+demonstrates+unique+modes+of+regulation%2C+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular signal-regulated kinase 1c (ERK1c), a novel 42-kilodalton ERK, demonstrates unique modes of regulation, localization.</a> Mol Cell Biol. 24 (22), 10000-10015 (2004).</li>
<li>Zhu, J. -H., Guo, F., Shelburne, J., Watkins, S., Chu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+phosphorylated+ERK%2FMAP+kinases+to+mitochondria+and+autophagosomes+in+Lewy+body+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Localization of phosphorylated ERK/MAP kinases to mitochondria and autophagosomes in Lewy body diseases.</a> Brain Pathol. 13 (4), 473-481 (2003).</li>
<li>Cobb, L. J., Lee, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+mitochondrial-derived+peptides+are+age-dependent+regulators+of+apoptosis%2C+insulin+sensitivity%2C+and+inflammatory+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring mitochondrial-derived peptides are age-dependent regulators of apoptosis, insulin sensitivity, and inflammatory markers.</a> Aging. 8 (4), 796-809 (2016).</li>
<li>Ihle, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Stat+family+in+cytokine+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The Stat family in cytokine signaling.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 13 (2), 211-217 (2001).</li>
<li>Xu, Y. S., Liang, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+Undergoes+Acetylation-dependent+Mitochondrial+Translocation+to+Regulate+Pyruvate+Metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">STAT3 Undergoes Acetylation-dependent Mitochondrial Translocation to Regulate Pyruvate Metabolism.</a> Sci. Rep. 6 (1), 39517(2016).</li>
<li>You, L., Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25951043">The role of STAT3 in autophagy.</a> Autophagy. 11 (5), 729-739 (2015).</li>
<li>Hashimoto, Y., Niikura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+characterization+of+neuroprotection+by+a+rescue+factor+humanin+against+various+Alzheimer%27s+disease-relevant+insults%5BTitle%5D)+AND+%22The+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Detailed characterization of neuroprotection by a rescue factor humanin against various Alzheimer's disease-relevant insults.</a> The J Neurosci. 21 (23), 9235-9245 (2001).</li>
<li>Ying, G., Iribarren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanin%2C+a+newly+identified+neuroprotective+factor%2C+uses+the+G+protein-coupled+formylpeptide+receptor-like-1+as+a+functional+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor.</a> J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).</li>
<li>Hashimoto, Y., Kurita, M., et al. Humanin inhibits apoptosis in pituitary tumor cells through several signaling pathways including NF-κB activation. Mol. Biol. Cell. 20 (12), 2864-2873 (2009).</li>
</ol>

Bir hissedar ve Yen CohBar, Inc. bir danışman olarak hizmet vermiştir CohBar, Inc Kelvin danışmanlığını Pinchas Cohen olduğunu

Burada, biz iki farklı hücre tiplerinde humanin peptid-aracılı ERK1/2 Etkinleştirme oluşuyor ve aktif ERK1/2 hücre altı lokalizasyonu (örneğin, peptid, zaman nokta ve hücre doz koşullara bağlı olarak farklı olabilir gösterdi yazın). O humanin göstermiştir-sinyal içinde iki hücre hatları gibi farklı dozda kullanımının humanin gereksinimini farklılıkları açıklayabilir iki farklı reseptörleri22,23, sinyalleri. Bu fizyolojik etkileri değil tam olarak incelen...

Ortaya çıkan çalışmalar mitokondrial kaynaklı peptidler (MDP'ler) cytoprotection ve metabolizma1,2,3' te önemli rol oynarlar göstermektedir. Sinyal iletim yolu MDP'ler huzurunda anlama bize hangi çeşitli işlevleri MDP'ler modüle mekanizması görmemizi sağlar. İlk tanımlanan MDP, humanin, hücre dışı sinyal düzenlenir kinaz 1/2 (ERK1/2) artırmak için gösterilmiştir fosforilasyon, reseptör4,5bağlama aracılığıyla. Ancak, ERK1/2 aktivasyon aşağı akım etkisi hala underexplored.
ERK1/2 basamaklı hücresel süreçler yayılması, hücre göç, hücresel metabolizma, hayatta kalma ve Apoptozis6,7,8de dahil olmak üzere çeşitli önemli bir aracı olarak hizmet vermektedir. Tüm alacak için ayrı bu hücresel süreçler, aktivite ve ERK1/2 hücre altı yerelleştirme sıkıca fosfatazlar ve İskele proteinler9,10tarafından düzenlenmektedir. Translasyon modifikasyon ek olarak, dinamik ERK1/2 / mekik onun sinyal işlevi, aktivite ve özgüllük11,12düzenlemektedir. ERK1/2 öncelikle sitozol13' te lokalize edilmiştir. Ankraj ve İskele proteinler bir dizi yardımcı organelleri, yüzey veya dağınık sitoplazma13' te hücre iskeleti elemanları ERK1/2 korumak. Stimülasyon, üzerine ERK1/2 fosforile ve onun ankraj proteinler ERK1/2 translocation çekirdeği, mitokondri, Golgi ve organellerin14, de dahil olmak üzere diğer hücre altı bölmeleri için sağlayan ayrışmış olur 15 , 16.
Humanin ERK1/2 yolu sinyal etkinleştirmek için bilinen rağmen ERK1/2 aktivasyonu sadece toplam hücresini lysates görülmektedir. ERK1/2 hücre altı yerelleştirme aşağı akım etkisi, hem hücre altı yerelleştirme analizi ve toplam düzeyde önemli bir rol oynar bu yana daha önce açıklandığı gibi fosforile ERK1/2 kapsamlı bir anlayış sağlamak için gerekli humanin kaynaklı ERK1/2 harekete geçirmek ve aşağı akım hedefleri aktivasyonu.
Aktif ERK1/2 hedef organelleri anlamak için hücre altı ayırma fosforile ERK1/2 için western Blot tarafından takip gerçekleştirildi. Standart laboratuar ekipmanları ve Kimyasalları kullanır gibi bu yöntem kolayca uygulanabilir. İzole hücre altı bölmeleri delikanlı yorumlanması için sonuçlar sağlayan yüksek saflık vardır. Immunostaining ERK1/2 benzer sonuçlara neden olabilir. Ancak, belirli hücre altı bölmeleri nispeten zor görselleştirmek ve özel fiksasyon ve permeabilization yöntemleri gerektirir. Hücre altı bölmeleri ERK1/2 düzeyleri farklılık ve bu değişim tüm cep telefonu lysates bakıldığında yanlış pozitif ve yanlış olumsuz sinyaller neden olabilir. Bu nedenle, bir immunoblot izole hücre altı bölmeleri kullanarak bize ERK1/2 yerelleştirme daha iyi bir anlayış verir.
Yöntem çok yönlülük değişiklikler diğer MDP'ler veya translocation ile STAT3 başka sinyal moleküllerin de dahil olmak üzere diğer uyarıcı etkilerini araştırmak için iletişim kuralı sağlar. Son zamanlarda keşfedilen küçük humanin benzeri peptidler (yelken) nerede humanin kodlanır ve onlar-si olmak benzer ancak farklı özellikleri HN17' ye göre 16S rRNA bölgesinden kodlanır. Örneğin, 5 dk. ERK1/2 İnceleme yanıt-e doğru farklı peptidler hücre altı yerelleştirme içinde ERK1/2 humanin etkinleştirir, ancak 8 h bize Bu peptidler Biyoloji daha iyi bir anlayış verir sonra SHLP2 ve SHLP3 ERK1/2 etkinleştirin. Kanıt ortaya çıkan sinyal molekülleri, hücre altı yerelleştirme aşağı akım etkileri önemli bir rol oynar gösterdi. Örneğin, STAT3 geleneksel olarak öncelikle resting hücrelerdeki sitozol yerelleştirilecek bilinmektedir ve sonra gen ekspresyonu sitokinler18yanıt olarak etkinleştirmek için çekirdek içine translocates. STAT3 Ayrıca mitokondri için translocates ve TCA döngüsü ve ATP üretimi19düzenlemektedir. Autophagy Yönetmeliği ile ilgili çeşitli yolları20autophagy STAT3 farklı hücre altı yerelleştirme modüle. Örneğin, nükleer STAT3 transcriptionally autophagy ile ilgili genleri düzenler ve bir autophagy modülatör davranır. Sitoplazmik STAT3 moleküller sinyal autophagy ile etkileşerek autophagy yapısal engeller. Mitokondrial STAT3 engeller ve oksidatif stres indüklenen autophagy baskılayarak mitophagy engeller. Bu nedenle, bu hücre altı yuvası ayırma yöntemi diğer sinyal molekülleri yanı sıra ERK1/2 rolünün anlaşılması için önemlidir.

<table><tbody><tr><td>p44/42 MAPK (ERK1/2)</td><td>Hücre sinyalizasyonu</td><td>9102</td><td>Seyreltme 1:1.000</td></tr><tr><td>fosfo-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204)</td><td>Hücre sinyalizasyonu</td><td>4370</td><td>Seyreltme 1:1.000</td></tr><tr><td>Lamin B1</td><td>Hücre sinyali</td><td>12586</td><td>Nükleer İşaretleyici, Seyreltme 1:1.000</td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>Hücre sinyali</td><td>5174</td><td>Sitoplazmik belirteç, Seyreltme 1:2.000</td></tr><tr><td>Tom20</td><td>Santa cruz</td><td>SC-17764</td><td>Mitokondri işaretleyicisi, Seyreltme 1:2.000</td></tr><tr><td>anti-Tavşan-HRP konjuge</td><td>Hücre sinyalizasyonu</td><td>7074</td><td>Seyreltme 1:30.000</td></tr><tr><td>RIPA Lizis ve Ekstraksiyon Tamponu</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>89900</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Kültür Kabı</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>12556002</td><td></td></tr><tr><td>HNG peptit</td><td>Genescript</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25mm Sylinge filtresi</td><td>ThermoFisher BİLİMSEL</td><td>09-719A</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ThermoFisher BİLİMSEL</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>3609</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Tris bazlı</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>HCL</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Sıyırıcı</td><td>FALCON</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>Durma ve ticaret; Proteaz ve Fosfataz İnhibitör Kokteyli (100X)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>78440</td><td></td></tr><tr><td>Thomas Pürüzsüz Havaneli Doku Öğütücü Tertibatları</td><td>Thomas Scientific</td><td>3432S90</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>%8-16 Mini-PROTEAN TGX Prekast Protein Jelleri</td><td>BIO RAD</td><td>4561104</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Modülü</td><td>BIO RAD</td><td>1658030</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo Transfer Sistemi</td><td>BIO RAD</td><td>1704150</td> Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kiti BIO RAD 1704272 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Blotting Yüzeyleri</td><td>BIO RAD</td><td>1705060</td><td></td></tr><tr><td>Western blot sıyırma tamponunu</td> <td>geri yükleyinThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>21059</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Eagle Ortamı</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Sonikatör, Medel: FB120</td><td>ThermoFisher BİLİMSEL</td><td>695320-07-12</td><td></td></tr></tbody></table>

mitokondrial kaynaklı peptid tedavi üzerine erk harekete geçirmek için hücre altı ayırma

Subcellular Fractionation for ERK Activation Upon Mitochondrial-derived Peptide Treatment

Mitokondrial kaynaklı peptidler (MDP'ler) küçük açık okuma çerçevesi mitokondri genom kopyası bilinen diğer genler içinde tarafından kodlanmış peptidler yeni bir sınıf vardır. MDP'ler çok çeşitli nöronların apoptosis korumak, metabolik işaretçileri artırma ve kemoterapi hücrelerin korunması gibi biyolojik etkileri var. Humanin ilk MDP keşfedilmeyi ve en çok çalışılan peptid MDP aile arasında. Membran reseptörleri ve humanin aşağı akım sinyal yollar dikkatle karakterize. MOTS-c ve SHLP1-6 gibi ek MDP'ler daha Geçenlerde bulunduktan ve sinyal mekanizmaları henüz aydınlatılmamıştır zorunda. Burada Bu peptidler işlevini belirlemek için bir hücre kültür dayalı yöntem açıklanmaktadır. Özellikle, hücre ayırma teknikleri, western Blot birlikte harekete geçirmek kantitatif tayin ve translocation önemli sinyal molekülünün için izin verir. Hücre ayırma başka yöntemler olmakla birlikte, burada açıklanan bir kolay ve basit yöntemdir. Bu yöntemler Bu peptidler ve diğer terapötik ajanlar etki mekanizması daha fazla aydınlatmak için kullanılabilir.

Burada sunulan işlemi uygulayarak, biz 1 mikron ve 100 mikron HEK293 ve SH-SY5Y hücrelerle tedavi S14G-humanin, bir güçlü humanin analog21, sırasıyla, içinde tamamlamak medya belirtilen süreler için (Resim 1A ve şekil 1 B). sonra ERK1/2 Toplam ve fosforile şeklinde Thr202/Tyr204 toplam proteini özleri itibariyle incelenmiştir. S14G-humanin tedavi ERK...

Bu iletişim kuralı, mitokondrial kaynaklı peptidler içeren hücreleri uyarmak ve sinyal cascade ve yerelleştirme fosfo-proteinlerin değerlendirmek açıklar.

Mitokondrial kaynaklı peptid tedavi üzerine ERK harekete geçirmek için hücre altı ayırma

Mitochondrial-derived peptides (MDPs) are a new class of peptides that are encoded by small open reading frames within other known genes of the ...

Bu deneyin genel amacı, mitokondriyal türevli peptitlerle uyarılan hücrelerde yer alan aşağı akış sinyal kaskadını tanımlamaktır. Bu yöntem, mitokondriyalden türetilmiş peptit alanındaki hangi sinyal yollarının dahil olduğu ve bunun nerede meydana geldiği gibi temel soruları yanıtlayabilir. Bu tekniğin temel avantajı, basit ve gerçekleştirilmesi nispeten kolay olmasıdır.Bu yöntem için ilk olarak, aşağı akış gerçekleri hakkında bize sınırlı bilgi veren insan aracılı ERK sinyalizasyonunu incelediğimizde aklımıza geldi. Subscale Kersher yöntemi bize insan aracılı sinyallemenin rolü hakkında daha iyi bir fikir verdi. Kaplama ve yıkamadan sonraki üçüncü gün, iki kez on ila altıncı, SH-SY5Y veya HEK293 hücreleri metin protokolüne göre.S14G humanin peptitlerini sıfır noktası iki mikron filtrelenmiş damıtılmış suda çözün. Ve bunları tek milimolar bir stok çözeltisi olarak yeniden oluşturun. Önceden ısıtılmış serum içeren veya serumsuz ortamı 15 mililitrelik konik bir tüpte alikotlayın ve bir çalışma konsantrasyonu oluşturmak için oda sıcaklığında humanin peptit stok çözeltisi ekleyin.Hücrelerdeki ortamı hemen altı mililitre peptit çözeltisi ile değiştirin. Ve hücreleri uygun süre boyunca inkübe edin. Hücreleri iki kez yıkamak için 10 mililitre buz gibi soğuk PBS kullanın.Daha sonra hücreleri plakadan beş mililitre buz gibi soğuk PBS'de kazıyın. Ve hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Hücreleri beş dakika boyunca 500 kez G ve dört santigrat derecede santrifüjleyin.Peletleri 200 mikrolitre buz gibi soğuk fraksiyonlama tamponunda tekrar süspanse edin ve buz üzerinde 15 dakika inkübe edin. Tüpü beş dakika boyunca 250 kez G ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Daha sonra süpernatanı sitoplazmik fraksiyon olarak toplayın ve peleti nükleer fraksiyon için saklayın.Hücresel kalıntıları ve diğer kirleticileri temizlemek için süpernatanı on dakika boyunca 18000 kez G ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Ve sonra süpernatanı yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Bu sitisol fraksiyonudur.Peleti 200 mikrolitre buz gibi soğuk yıkama tamponunda tekrar süspanse edin ve çözeltiyi beş dakika boyunca 250 kez G ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve peleti yeniden askıya almak için 100 mikrolitre buz gibi soğuk nükleer ekstraksiyon tamponu kullanın. Daha sonra numuneyi 10 kez buz üzerinde sonikasyona tabi tutun.Numuneyi tekrar santrifüjleyin. Ardından süpernatanı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Ham mitokondriyal fraksiyonu izole etmek için, her 10 santimetrelik tabaktaki hücreleri yıkamak için 10 mililitre buz gibi soğuk PBS kullanın.Sonra beş mililitre buz gibi soğuk PBS ekleyin ve hücreleri ayırmak için bir hücre kazıyıcı kullanın. Hücre süspansiyonlarını tek bir 15 mililitrelik konik tüpe aktarın. Daha sonra hücreleri 10 dakika boyunca 600 kez G ve dört santigrat derecede santrifüjleyin.PBS'yi aspire edin ve peleti yeniden askıya almak için bir mililitre buz gibi mitokondriyal izolasyon tamponu kullanın. Daha sonra buz üzerinde politetrafloretilen kaplı bir havaneli ile hücreleri 25 mililitrelik bir homojenizatör ile homojenize edin. Homojenatı bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve çekirdeği ve kırılmamış hücreleri çıkarmak için numuneyi 600 kez G ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin.Daha sonra süpernatanı toplayın, yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve çözeltiyi 10 dakika boyunca 7000 kez G ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Süpernatanı çıkardıktan sonra, peleti 200 mikrolitre buz gibi soğuk mitokondri izolasyon tamponu ile yeniden askıya alın ve çözeltiyi yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Tüpü 10 dakika boyunca 7000 kez G ve dört santigrat derecede santrifüjleyin.Yıkamayı tekrarladıktan sonra, peleti yeniden süspanse etmek için 15 mikrolitre RIPA tamponu kullanın ve süspansiyonu buz üzerinde 10 dakika inkübe edin. Daha sonra numuneyi 15 dakika boyunca 16000 kez G ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Mitokondriyal fraksiyon olan süpernatanı yeni bir tüpe aktarın.Metin protokolüne göre batı lekelemeyi ölçün ve gerçekleştirin. Bu videoda gösterilen prosedürü kullanarak, HEK293 ve SH-SY5Y hücreleri, güçlü bir humanin analoğu olan bir ve 100 mikromolar S14 G humanin ile geri çekildi. Ve toplam protein ekstraktlarından theanine 202, tirozin 204'teki ERK12'nin toplam ve fosforile formu analiz edildi.Burada görüldüğü gibi, S14G humanin tedavisi, ERK12 ve düzenleyici teanin-202, tirozin-204 bölgesinin fosforilasyonunda bir artış gösterdi. S14G insan aracılı ERK12 aktivasyonunun hedefini anlamak için, S14G insan tedavisi sonrası toplam ve fosforile ERK12'nin hücre altı lokalizasyonu analiz edildi. Bu batı lekelerinde gösterildiği gibi, HEK293 hücrelerinde, fosforile ERK hem sitoplazmada hem de çekirdekte artmıştır, ancak mitokondride artmamıştır.Bununla birlikte, SH-SY5Y hücrelerinde, sitoplazma çekirdeğinde ve mitokondride fosforile ERK azaldı. S14G insan aracılı ERK fosforilasyonunun farklı hücre tiplerinde ve farklı koşullarda farklı bir rol oynayabileceğini düşündürmektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, hücre nükleer fraksiyonasyonu bir saat içinde yapılabilir ve mitokondriyal fraksiyonlama, uygun şekilde yapılırsa bir saat 30 dakika içinde yapılabilir.Bu prosedürü denerken, tüm numuneleri buz üzerinde tutmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, sinyal moleküllerinin aşağı akış hedeflerini anlamak için ko-immün çökeltme ve kütle spektrometresi dahil olmak üzere diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.

subcellular-fractionation-for-erk-activation-upon-mitochondrial

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, insan embriyonik kök hücreleri mitokondriyal solunum zinciri kompleksleri jel faaliyet deneyleri kullanarak nasıl analiz edilebilir size gösterecektir.

İnsan Embriyonik Kök Hücreleri Mitokondrial Kompleksi Aktivite araştırmayı

Solunum ve oksidatif fosforilasyon ile ve hücre canlılığı üzerindeki ilişkili mitokondriyal fonksiyonları üzerinde, protein kinaz C (PKC), izozimlerinin aktivasyon etkisi tarif edilmektedir. Yaklaşım seçici olarak mitokondriyal işlev ve hücre enerji durumunu belirlemek için birincil hücre kültürü deneyleri ve çeşitli PKC izozimleri overexpress için adenoviral teknik uyum sağlar.

Böbrek Hücreleri aşırı eksprese eden protein kinaz C izozimlerinin Mitokondriyal Fonksiyonlar ve Hücre Canlılık Değerlendirilmesi

Bu işlem yetişkin fare beyin mitokondri ilişkili ER membranlar veya MAM ve MAM ve mitokondriyal hazırlıkları glycosphingolipid zenginleştirilmiş microdomain fraksiyonları izole etmek için nasıl göstermektedir.

Mitokondri ilişkili ER Membranlar (MAM) ve Glycosphingolipid zenginleştirilmiştir Microdomains (GEM&#39;lerle): Fare Beyin izolasyon

Örnekler arasındaki mitokondriyal membran potansiyelinin karşılaştırılması, hücresel durum hakkında değerli bilgiler verir. Mitokondriyi izole etmek ve floresan kullanarak inhibitörlere ve ayrıştırıcılara yanıtı değerlendirmek için ayrıntılı adımlar açıklanmaktadır. Bu protokolün yöntemi ve faydası, bir hücre kültürü ve hücresel stresin hayvan modeli kullanılarak gösterilmiştir.

İzolasyon ve Kültür Hücrelerinin ve Fare Doku gelen Mitokondri Fonksiyonel Analizi

Burada, bir (hücre döngüsü) kinazın mitokondriyal lokalizasyonunun nasıl çalışılacağını ve alt mitokondriyal konumunun yanı sıra potansiyel mitokondriyal substratların/hedeflerin nasıl belirleneceğini ana hatlarıyla açıklıyoruz. Proteinlerin mitokondriye zorla ekspresyonu, ilgilenilen bir proteinin mitokondriyal lokalizasyonunun fonksiyonel sonuçlarını incelemek için yararlı bir araç sağlar.

Deneysel Yaklaşımlar Mitokondriyal Yerelleşme ve Nükleer Hücre Döngüsü Kinaz, Cdk1 Fonksiyonu Eğitim için

Protein kinazlar, inter-ve intraselüler sinyal iletimi için kritik olan, oldukça gelişen sinyalleme enzimleri ve iskeletleridir. Radyoaktif işaretli adenosin trifosfatın ([γ- 32 P] ATP) kinaz aktivitesini ölçmek için bir protokol sunuyoruz, bu hücresel sinyal düzenlenmesinin aydınlatılmasına yardımcı olan güvenilir bir yöntemdir.

Protein Kinaz Aktivitesini Radyoaktif Etiketli ATP ile Tahlil

Burada, plazma zarı, sitoplazma ve yüksek hızlı Santrifüjü kullanmanıza gerek kalmadan U937 hücrelerinin mitokondri izole etmek için bir protokol mevcut. Bu tekniği yoluyla protein yerelleştirme immunoblotting sonraki incelenmesi için hücre altı fraksiyonları arındırmak için kullanılabilir.

Yüksek hızlı Santrifüjü yokluğunda U937 hücrelerinin hücre ayırma

Son gelişmelere rağmen, birçok maya mitokondriyal protein hala işlevleri tamamen bilinmemektedir. Bu protokol, moleküler işlevlerinin aydınlatılması için temel olan proteinlerin boyunkondriyal lokalizasyonunu belirlemek için basit ve güvenilir bir yöntem sağlar.

Tomurcuklanan Maya Sakkaromices cerevisiae'de Submitochondrial Protein Lokalizasyonunun Değerlendirilmesi

Mevcut protokol, nöronal K-Cl ko-transporter KCC2'nin fonksiyonlarını ve aktivitelerini incelemek için batı blotlama tekniğinin uygulanmasını vurgulamaktadır. Protokol, kinaz düzenleyici bölgeler Thr906/1007'de batı lekelenmesi yoluyla KCC2 fosforilasyonunun araştırılmasını açıklamaktadır. Ayrıca, KCC2 etkinliğini doğrulamak için ek yöntemler bu metinde kısaca vurgulanmıştır.

Western Blotting Kullanarak Nöronal K-Cl Co-Transporter KCC2'nin Fonksiyonlarının ve Aktivitelerinin İncelenmesi

RASopatiler, RAS-MAPK yolağı hiperaktivasyonunun neden olduğu multisistemik genetik sendromlardır. Doğrulanmayı bekleyen potansiyel olarak patojenik varyantlar sürekli olarak ortaya çıkarken, zayıf klinik öncesi kanıtlar tedaviyi sınırlar. Burada, genç muhabir zebra balığında canlı FRET görüntüleme ile RASopati ile ilişkili ERK aktivasyon seviyelerini ve embriyogenez sırasındaki farmakolojik modülasyonunu test etmek ve çapraz doğrulamak için in vivo protokolümüzü açıklıyoruz.

Canlı FRET mikroskobu ve immünofloresan ile erken zebra balığı Noonan sendromu modellerinde ERK aktivite modülasyonunu değerlendirmek için etkili bir protokol

Öğrenin mitokondrial kaynaklı peptidlerle hücre uyarımında ERK sinyal yolunu ve fosfo-protein lokalizasyonunu inceleme yöntemini. SH-SY5Y ve HEK293 hücreleri kullanılarak geliştirilen bu protokol, mitokondriyal biyoloji araştırmalarına katkı sağlar.

Mitokondrial kaynaklı peptid tedavi üzerine ERK harekete geçirmek için hücre altı ayırma

Daha fazla video keşfet