Temel işlemler sırasında mikrobiyal hücre büyümesini gözlemlemek için hücre Floresans mikroskobu canlı

Bu mikroskopi tabanlı yaklaşımın genel amacı, bakteri hücrelerinin büyümesi sırasında merkezi bir süreci gözlemlemektir. Bu yöntem, bakteri hücresi büyümesi ve bölünmesi sırasında temel süreçlerin nasıl koordine edildiği gibi bakteriyolojideki önemli soruları ele almamızı sağlar. Bu tekniğin temel avantajı, canlı hücrelerdeki bakteri hücre yüzeylerini ve yapılarını görselleştirmek için floresan reaktifleri kullanabilmemizdir.

Burada, Agrobacterium tumefaciens'teki temel süreçler hakkında bilgi sağlamak için bu yöntemi kullanıyoruz. Bununla birlikte, bu işlem büyümelerini incelemek için diğer bakterilere de uyarlanabilir. Başlamak için, üç mililitre ATGN Büyüme Ortamını aşılamak için steril bir tahta çubuk veya pipet ucu kullanın, vahşi tip veya mutant bir A.Tumifaciens suşunun tek bir kolonisi ile.

Kültürü gece boyunca 28 santigrat derece ve 225 RPM'de büyütün. Ertesi gün, OD600'ü ölçmek için bir spektrofotometre kullanın. Daha sonra, hücre kültürünü yaklaşık 0.2'lik bir OD600'e seyreltin ve hücreleri 0.6'lık bir OD600'e büyütmeye devam edin.

Bir mililitre üstel kültürü üç mikrofüj tüpüne dağıtın. Ve hücreleri beş dakika boyunca 7.000 x g'da bir masaüstü santrifüjde peletleyin. Her hücre peletini bir mililitre PBS içinde yeniden süspanse edin ve ardından bir mikrolitre DMSO Orange stok çözeltisi veya DAPI stok çözeltisi ekleyin.

Pipetleme ile nazikçe karıştırın ve yeniden süspanse edilmiş hücreleri karanlıkta beş dakika inkübe edin. Hücreleri beş dakika boyunca 7.000 x g'da santrifüjleme ile peletleyin ve fazla reaktifi çıkarmak için peleti bir mililitre PBS'de yeniden süspanse edin. Daha sonra, hücreleri iki kez daha yıkayın ve peleti 50 mikrolitre PBS veya ortamda tekrar süspanse edin.

Eşzamanlı hızlandırılmış görüntüleme için, her tedaviden on mikrolitre hücreyi yeni bir mikrofüj tüpünde birleştirin. Hücre görüntüleme için agaroz pedleri hazırlamak için, kılavuz olarak bir lamel kullanın ve kenarlarından bir neşter geçirerek 22 x 22 milimetre karelik bir laboratuvar filmi kesin. Laboratuvar filminin ortasından bir kare kesin ve agaroz pedi için bir conta görevi görmesi için yaklaşık iki ila beş milimetrelik bir kenarlık bırakın.

Ardından, ortadaki kesiği atın. Film contasını, amonyak ve alkolsüz bir temizleyici ile temizlenmiş bir cam slayt üzerine yerleştirin. Ve film cam üzerinde hafifçe eriyene kadar slaydı ısıtmak için 70 santigrat dereceye ayarlanmış bir ısı bloğu veya bir alev kullanın.

Daha sonra, küçük bir şişede yaklaşık 0.075 gram agaroz ve beş mililitre ortamı karıştırarak agaroz çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi, agaroz çözülene ve çözelti berraklaşana kadar karıştırmak için periyodik olarak dönen bir mikrodalgada ısıtın. Agaroz çözeltisini 55-70 santigrat derecede tutun ve 48 saat içinde birden fazla agaroz pedinin yapımında kullanın.

Sıcak agaroz ortamını contanın ortasına pipetleyin. Ardından, agarozu eşit şekilde dağıtmak için contanın üzerine bir kapak fişi yerleştirin. Slaytı yaklaşık iki dakika katılaşması için serin ve düz bir yüzeye yerleştirin.

Şimdi, kapak kızağını agaroz pedinden dikkatlice kaydırın, ardından pedin yüzeyi kuru görünene kadar agaroz pedin oda sıcaklığında bir ila iki dakika havada kurumasına izin verin. Agaroz pedinin uygun şekilde yapılandırılması, yüksek kaliteli görüntüler elde etmek için çok önemlidir. Kötü bir ped üzerinde görüntü oluşturmaya çalışmayın.

Agaroz pedi kurursa, dalgalanır veya yırtılırsa, tembel olmamak ve bunun yerine yeni bir ped yapmak en iyisidir. Daha sonra, bir neşter kullanarak, yaklaşık iki ila yedi ila on milimetrelik bir hava cebi oluşturmak için küçük bir agaroz şeridini çıkarın. A.Tumefacien hücreleri en iyi hava cebinin yakınında büyüme eğilimindedir.

Agaroz ped üzerinde 0.8 ila 1 mikrolitre hücre tespit edin. Ardından, hücreleri pedin yüzeyine dağıtmak için agaroz pedin üstüne yavaşça bir örtü fişi yerleştirin. Uzun süreli hızlandırılmış görüntüleme için, kapak kızağının kenarlarını kapatmak için erimiş Valap kullanın.

Kapak kızağının tüm kenarlarını ve köşelerini Valap ile kapattığınızdan emin olun. Bunun yapılmaması, agaroz ped hızlandırılmış görüntüleme sırasında sürüklenmeye neden olabilir. Epifloresan mikroskobu yapmak için, daldırma yağını istenen objektife yerleştirin ve ters çevrilmiş slaytı sahnedeki slayt tutucuya yerleştirin.

Hücreleri odaklamak için odaklama düğmelerini kullanın. Floresan görüntüler için istenen floresan filtresini kullanarak Faz veya DIC ve floresan görüntüler elde edin. İsteğe bağlı olarak, agaroz pedlerinin hava cebine yakın on hücre alanını rastgele seçerek birden fazla x, y pozisyonu elde edin.

İstenen zaman aralığında Faz içi veya DIC görüntü için zaman dizisi alımını ayarlayın. Burada gösterildiği gibi, hücreler santrifüjleme ile yıkandıktan sonra doğrudan kültürden görüntülendi ve hücreler yüzde 0.1 DMSO ile inkübe edildikten sonra, sonuçlar DMSO'nun tek başına hücre morfolojisini etkilemediğini gösterdi. Hem Orange hem de DAPI, canlı A.Tumefaciens hücreleri içinde DNA'yı etiketledi.

Geç bölünme öncesi hücrelerde, Turuncu boyama ile iki farklı nükleoloid gözlenirken, DNA etiketlemesi DAPI boyama ile daha yaygın görünmektedir. Eşit oranda etiketlenmemiş, DAPI etiketli ve Turuncu etiketli vahşi tip A.Tumefaciens ile yapılan bu hızlandırılmış deneyde, tüm hücreler Faz kontrast mikroskobu ile görüntülendiğinde büyüdü, bu da hiçbir lekenin hücre büyümesini bozmadığını gösterdi. Hücreler ayrıca TRITC filtresi kullanılarak epifloresan mikroskobunda Faz kontrastı altında büyüdü.

Bununla birlikte, DAPI filtresi ile görüntülendiğinde, hücreler bir saat içinde büyümeyi durdurdu. Benzer yöntemleri izleyerek, bakteri hücre duvarını veya zarlarını görselleştirmek için diğer floresan reaktifler de kullanılabilir. Ayrıca, bu floresan boyaların çoğu, bakteri hücre yüzeyinin kapsamlı bir görüntüsünü sağlamak için birleştirilebilir.

Canlı bakterilerdeki temel süreçlerin görselleştirilmesi heyecan vericidir, çünkü bu süreçleri koşullu mutantlarda veya model olmayan bakterilerde inceleme olasılığını ortaya çıkarır. Bu, çeşitli bakteri türleri üzerindeki çalışmalarımızı geliştirmemizi sağlar.