Name: Temel işlemler sırasında mikrobiyal hücre büyümesini gözlemlemek için hücre Floresans mikroskobu canlı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Öğrenin canlı hücre floresan mikroskobu ile bakteri büyümesi sırasında temel süreçleri gözlemlemeyi. Agrobacterium tumefaciens kullanarak hücre yüzeylerini ve yapıları canlı hücrelerde görselleştirin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Michael VanNieuwenhze (Indiana Üniversitesi) Resim 2 ve şekil 4kullanılan FDAAs hediye için teşekkür ediyoruz. Bu el yazması hazırlanması sırasında üye kahverengi laboratuarının geribildirim için teşekkür. A. tumefaciens hücre büyümesi ve bölünme kahverengi laboratuarında Araştırma Ulusal Bilim Vakfı (IOS1557806) tarafından desteklenmektedir.

1. A. tumefaciens suşlarının büyüme
<ol><li>
A. tumefaciens suşları kültür
	<ol>
<li>Bir koloni istediğiniz baskı ile ATGN büyüme ortamının (tarifi için malzemeler listeye bakın) 1 mL aşılamak için steril bir tahta sopa ya da damlalıklı ipucu kullanın. Not: A. tumefaciens tükenmesi suşları için ATGN 1 mM IPTG temel protein biyosentezi korumak için bir uyarıcı içermelidir.</li>
		<li>A. tumefaciens suşları gecede ATGN 225 rpm'de sallayarak ile 28 ° C'de içinde büyümek.</li>
		<li>Hücreleri 600 optik yoğunluğunu ölçmek bir Spektrofotometre kullanarak nm (OD600). Hücre kültürü bir OD600 seyreltik ~0.2 = ve OD600 kadar büyümeye devam = ~0.6 ulaşıldığında. Tükenmesi suşları için OD600 kadar uyarıcı ile büyümeye devam = ~0.6 ulaşıldığında.</li>
		<li>A. tumefaciens wildtype ve mutant suşları OD600 kullanın = ~0.6 hedef özel boyama ve/veya hızlandırılmış mikroskobu (bkz: Bölüm 2 ve 3.1). Tükenmesi suşları için uyarıcı (bakınız Bölüm 1.2.) yıkamak</li>
	</ol>
</li>
	<li>
A. tumefaciens protein tükenmesi suşları karakterizasyonu için uyarıcı kaldırılması
	<ol>
<li>Üstel kültürünün 1 mL cips (OD600 ~0.4-0.6 =) tarafından Santrifüjü 7000 x g 5 dakika içinde oda sıcaklığında masaüstü santrifüj için de.</li>
		<li>Yıkamak için süpernatant kaldırın ve uyarıcı olmadan taze medya Pelet resuspend ve hücreleri (1.2.1) açıklandığı gibi cips. Hücreleri toplam taze medya 3 kez yıkayın.</li>
		<li>Son Pelet taze medyada resuspend ve konsantre bir OD600 hücrelere hemen hedef özel boyalar (Bölüm 2 ve şekil 4B-D) veya hızlandırılmış mikroskobu (Bölüm 3.2 ve şekil 4A) ile boyama için ~0.8 = . Alternatif olarak, hücreleri istediğiniz süreyi için medya olmadan önce boyama ve hücreleri Imaging uyarıcı hücrelerde büyüyen tarafından önceden tüketmek.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. hedef özel boyama A. tumefaciens hücre
<ol><li>
Floresan d-amino asit hücre duvarı etiketleme Not: FDAAs kolayca A. tumefaciens peptidoglikan dahil edilmiştir toksik olmayan floresan d amino asitleri vardır. Bu basit etiketleme yordamı büyüme canlı hücreleri6' desenlendirme sondalar. Dört FDAAs sentezi için kullanılabilir38iletişim kurallarıdır.<ol>
<li>Üstel kültürünün 500 µL cips (OD600 ~0.4-0.6 =) tarafından Santrifüjü 7000 x g 5 dakika içinde Masaüstü santrifüj için de. Hücre Pelet taze medya 100 µL içinde resuspend.</li>
		<li>5 FDAA için yıkanmış ve hücrelerin konsantre ve karanlıkta 2 min için kuluçkaya mm 5 µL ekleyin. Not: Sınırlamak FDAA ışığa maruz kalma. Kuluçka süresi zorlanma büyüme hızının bağlı olarak değişir. Genellikle, kuluçka kez katlama zaman%65-10 olmalıdır.</li>
		<li>Hücreleri tarafından Santrifüjü cips ve hücre topakları fosfat tamponlu tuz (PBS) ile üç kez yıkayın.</li>
		<li>Pelet ~ 50 µL PBS içinde resuspend. Not: PBS resuspension için kullanılan birim Pelet boyutuna göre değişebilir.</li>
		<li>0,8-1 uygulamak µL hücre bir özel defteri ve hemen epifluorescence mikroskobu (bkz: bölümler 3.1 ve 3.2) kullanarak görüntü için.<ol>
<li>Alternatif olarak, daha fazla etiket birleşme buz gibi % 70 etanol ile hücreleri düzelterek durdurmak. Hücre Pelet 1 mL buz gibi % 70 etanol resuspend ve 15 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya.</li>
			<li>Santrifüjü tarafından hücreleri toplamak ve daha sonra görüntüleme için PBS küçük bir hacim içinde resuspend. Hücre süspansiyonlar 4 ° C ve görüntü 48 saat içinde saklayın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DNA DAPI veya turuncu leke ile boyama Not: DNA gözlemlemek için yapısı, hücre DAPI ya da portakal (ölü hücre leke) ile etiketlenir. Her ne kadar klasik bir "ölü hücre leke" açıklanan, turuncu permeant, photostable ve canlı hücre DNA10Imaging etkinleştirme bakteri hücrelerinin büyümesini etkilemez. A. tumefaciens, turuncu etiketleme işleri canlı hücreler içinde iyi ve hızlandırılmış mikroskobu (şekil 3) için uygundur. Buna ek olarak, ultraviyole (UV) ışık pozlama görüntüleme DAPI lekeli hücreler için gerekli Fototoksik (şekil 3) ve böylece DAPI boyama için anlık görüntüleme veya sabit hücreleri boyama canlı hücreleri boyama için en uygun olan.<ol>
<li>DAPI hücreleri boyama<ol>
<li>Üstel kültürünün 1 mL cips (OD600 ~0.4-0.6 =) tarafından Santrifüjü 7000 x g 5 dakika içinde Masaüstü santrifüj için de.</li>
			<li>İsteğe bağlı olarak, hücre boyama önce düzeltmek için hücre Pelet 1 mL % 70 buz gibi etanol resuspend. 10-15 dk. içinde 2.2.1.1 hücreler Santrifüjü tarafından açıklanan toplamak için buz üzerinde kuluçkaya.</li>
			<li>Hücre Pelet 1 mL 1 µL DAPI hisse senedi çözüm (1 mg/mL; bkz: Malzemeler tablo) içeren PBS resuspend. Pipetting tarafından karışımı yavaşça ve 5 dakika içinde belgili tanımlık karanlık kuluçkaya.</li>
			<li>Hücreleri tarafından Santrifüjü 7000 x g 5 min için de cips ve 1 mL aşırı DAPI kaldırmak için PBS resuspend. Hücreleri iki kez daha yıkama ve Pelet 50 µL PBS veya medya resuspend.</li>
			<li>0,8-1 uygulamak µL hücre bir özel defteri ve hemen epifluorescence mikroskobu kullanarak görüntü için. 3.1 ve 3.2 bölümlerine bakın. Not: Bu protokol kromozom dynamics (şekil 3) gözlemlemek hızlandırılmış mikroskopi için en uygun değildir. Turuncu boyama (bakınız Bölüm 2.2.2) alternatif olarak kullanmayı düşünün.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Turuncu canlı hücreleri boyama</li>
		<li>Üstel kültürünün 1 mL cips (OD600 ~0.4-0.6 =) tarafından Santrifüjü 7000 x g 5 dakika içinde Masaüstü santrifüj için de. Hücre Pelet 1 mL 1 µL turuncu hisse senedi çözüm içeren PBS resuspend (malzeme listeye bakın). Pipetting tarafından karışımı yavaşça ve karanlıkta 5 min için kuluçkaya.</li>
		<li>Hücreleri tarafından Santrifüjü cips ve 1 mL aşırı turuncu kaldırmak için PBS resuspend. Hücreleri iki kez daha yıkama ve Pelet 50 µL PBS resuspend.</li>
		<li>0,8-1 uygulamak µL hücre bir özel defteri ve hemen epifluorescence mikroskobu kullanarak görüntü için. 3.1 ve 3.2 bölümlerine bakın. Not: Bu protokol de canlı hücreleri ile çalışır ve hızlandırılmış mikroskobu kromozom dynamics (şekil 3) gözlemlemek uygundur. Hemen görüntüye uygun değilse, hücreler buz gibi % 70 etanol (bakınız Bölüm 2.2.1.2) sabit olabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Membran etiketleme Not: Lipofilik styryl floresan boya 4-64 yaygın bakteriyel hücre membran gözlemlemek için kullanılmıştır. Birçok bakteri, aksine 4-64 A. tumefaciens hücreleri etiketli düzgün etiket değil, ama oldukça sık sergi "nal" desen14,15. Dikkat çekici, büyüme Kutbu yaklaşık leke yoksun ise eski pole yoğun bir şekilde etiketlenmiştir. Böylece, 4-64 hücre büyüme desen ve A. tumefaciensmembran yapısı görselleştirme sağlar.<ol>
<li>8 µg/mL üssel faz hücre kültürü 1 ml nihai bir konsantrasyon FM 4-64 ekleyin ve 5 dakika içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
		<li>5 dakika içinde Masaüstü santrifüj için 7000 x g de Santrifüjü tarafından etiketli hücreleri cips ve hücre Pelet PBS 1 mL resuspend. Hücreleri aşırı boya kaldırmak için üç kez toplam yıkayın.</li>
		<li>PBS ve hemen görüntü için bir özel defteri yerinde küçük bir cilt hücrelerinde resuspend. (3.1 ve 3.2 bölümlerine bakın) Dikkat: Hücreleri hemen karakteristik etiketleme desen gözlemlemek için yansıması gerekir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. A. tumefaciens hücreleri görüntüleme
<ol><li>
Özel yüzey hazırlama Not: Resim 1 resim silsilesi (Masası'nda) ve şematik (Masası B) hızlandırılmış mikroskopi için hazırlanan bir tipik özel ped içerir. Özel yastıkları genellikle gerektiği gibi hazırlanır.<ol>
<li>3.1.1. bir coverslip bir 22 x 22 mm laboratuvar kare film (malzeme listesini görmek) kenarlarda neşterden çalıştırarak bir rehber ve kesim olarak kullanın.</li>
		<li>~ 2-5 bırakarak laboratuvar film Merkez dışında bir kare şeklinde bir kesik mm kenarlık için özel yastık bir conta olarak hizmet için. Merkezi kesme atmak.</li>
		<li>Bir amonyak ve alkol içermeyen temizleyici ile (bkz: malzeme listesi) temiz bir cam slayt (75 mm x 25 mm) üzerine film conta yeri ve film biraz cam ( şekil1a en iyi görüntü) üzerine erimiş kadar ısı. Laboratuvar film eritmek için 70 ° C ısı blok kümesine kenarına kullanın veya hafifçe bir ateşte eritin.</li>
		<li>Özel çözüm ~0.075 g özel karıştırarak hazırlayın (malzeme listesini görmek) küçük bir şişeye medyada 5 ml. Isı ile periyodik özel eriyene kadar karıştırın ve çözüm için dönen bir mikrodalga çözümde açıktır. Özel çözüm 55-70 ° C de tutabilir ve 48 saat içinde birden çok özel yastıkları inşaat için kullanabilirsiniz.</li>
		<li>1.2-%1.5 özel conta ortasına içeren medya pipet. Not: Medya hacmi genellikle 50-60 µL olmakla birlikte conta boyutuna göre değişir. Soğuk bir slayt için medya çok hızlı bir şekilde kuvvetlendirmek özel neden olabilir eklemek, böylece slayt sıcak bir yüzey üzerinde tutulmalıdır. Bir ısı blok kenarına ayarlayın 70 ° C çalışır iyi. Su özel veya fosfat tamponlu tuz (PBS) gibi arabelleğe alınan özel çözümler içeren özel uygulamalar sürekli hücre büyümesini gerekli değildir için medya yerine kullanılabilir. Tükenmesi suşları görüntüleme için uyarıcı olabilir sunmak da yok medyada. Uyarıcı yokluğu-ecek açığa vurmak tükenmesi fenotip ise uyarıcı varlığı bir denetim olarak kullanılabilir.</li>
		<li>Bir coverslip özel olarak dağıtabilmenizi conta yerleştirin.</li>
		<li>Slayt bu buruşuk yüzeyinde özel defteri ve yüzeye uygulanan hücre süspansiyon havuzu da yol açar gibi ~ 2 dk. kaçının özel yastık •kızılötesi için kuvvetlendirmek için serin, düz bir yüzey üzerine yerleştirin.</li>
		<li>Dikkatle coverslip özel yastık kapalı kaydırın. Dikkat: Bu adımı acele etmeyelim. Özel yastık kolayca gözyaşı ve düzensiz özel yastık görüntüleme zorlaştırabilir.</li>
		<li>Ped yüzeyi kuru görünene kadar hava için özel defteri oda sıcaklığında 1-2 min için Kuru izin. Bir neşter kullanarak, özel hava boşluğuna (orta görüntü, şekil 1A); oluşturmak için a küçük soymak kaldırmak hava boşluğu genellikle ~ 2 x 7-10 mm ve A. tumefaciens hücreleri hava boşluğu (şekil 1 c) en iyi büyümeye eğilimindedir. Not: Sabit hücre veya büyüme nerede izlenmiyor koşullar altında görüntüleme için hava boşluğuna gerekli değildir.</li>
		<li>Nokta 0,8-1 µL özel defteri ve yeni bir coverslip ile kapak sayfasında bulunan bir hücreler. Yavaşça coverslip hücreleri özel ped yüzeyi boyunca dağıtmak için özel yastık tepesinden yerleştirin.</li>
		<li>Erimiş VALAP kullanarak coverslip kenarlarını kapatın (bkz: Malzemeler tablo için tarifi; Şekil 1A, alt resim). Tüm kenarları ve köşeleri coverslip mühür hücreleri görüntüleme sırasında sürüklenen götürecek özel ped kurutma neden olabilir. Not: Mühürleme coverslip sadece uzun vadeli zaman hata görüntüleme için gereklidir.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56497/56497fig1.jpg"> Şekil 1: özel yastık hazırlık. (A)görüntü özel yastık hazırlık protokolü sırasını. Resim 1 laboratuvar film conta ile bir slayttır. Resim 2, özel defteri ve hava boşluğu görüntülenir. Son olarak, Resim 3 tam özel yastık altında bir coverglass hücreleri ile gösterir ve VALAP ile mühürlenmiş. (B) A şematik bir özel ped hızlandırılmış mikroskopi için sağlanır. Anahtar şekil-in belgili tanımlık özel yastık şematik etiketlenir. (C) hava boşluğu A. tumefaciens büyüme özel yastıkları üzerinde terfi. Görüntüleri bir özel yastık üzerinde 20 saat boyunca yetiştirilen wildtype A. tumefaciens hücre gösterilir. Görüntüleri mevzilerine hava cebinden giderek uzak alındı. Görüntünün en yakın kenara uzaklığı hava boşluğu için yukarıdaki her görüntü gösterilir. Ölçek çubuğu 10 µm. = <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56497/56497fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<ol start="2"><li>
Görüntüleme Not: Fark girişim kontrast, faz kontrast ve epifluorescence görüntüleme yapılır donanım tabanlı autofocusing, otomatik bir sahne, standart filtrelere, bir LED ışık kaynağı, 60 X yağı daldırma ile donatılmış bir ters mikroskobu ile Hedefler (1.4 NA) faz kontrast veya fark girişim kontrast (DIC) ve 1K elektron teksir makinesi şarj-birleştiğinde-cihaz (EMCCD) kamera. Mikroskop bir sıcaklık kontrollü odada yer almalıdır. Alternatif olarak, bir sahne daha sıcak veya odası tutarlı sıcaklık görüntüleme sırasında korumak için kullanılabilir.<ol>
<li>Epifluorescence mikroskobu Not: floresan görüntüleme için canlı hücre, resim satın alma sayısını sınırlamak ve pozlama süresi photobleaching ve fototoksisite en aza indirmek için en iyi duruma getirmek için gerekli. Her boya görüntüleme için bu yeterli Floresans algılama sağlar ancak photobleaching veya fototoksisite yol değil bir en uygun çekim hızı bulmak için tavsiye edilir. Şekil 2-4' te, pozlama süreleri 200 MS tüm Floresans resimler için kullanılmıştır. Şekil 3' te gösterilen hızlandırılmış dizileri için her 10 min 3 h için görüntüleri elde.<ol>
<li>Daldırma yağ istenen hedefte yerleştirin ve ters Slayt Slayt tutucusuna sahne alanı üzerine yerleştirin. Odaklama topuzlar hücreleri odak haline getirmek için kullanın.</li>
			<li>Aşama (ya da DIC) Albümdeki ve istenen floresan filtre edinme. Not: Maksimal uyarma ve emisyon dalga boylarında Şekil 2, şekil 3ve şekil 4 kullanılan lekeler için aşağıdaki gibidir: HADA (405/460), NADA (450/555), TADA (555/570), 4-64 (515/640), DAPI (360/460), Orange (547/570).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Hızlandırılmış mikroskobu Not: bilgisayar kontrollü hızlandırılmış mikroskobu sırasında aşağıdaki özellikleri şunlardır: x, y ve z konum, panjurlar ve floresan filtreler. Bir donanım tabanlı otomatik odaklama sistemi odak zaman hata görüntüleme sırasında korumak için en iyi yöntemdir. Alternatif olarak, bir yazılım tabanlı otomatik odaklama döngü kullanılabilir.<ol>
<li>Daldırma yağ istenen hedefte yerleştirin ve ters Slayt Slayt tutucusuna sahne alanı üzerine yerleştirin. Odaklama topuzlar hücreleri odak haline getirmek için kullanın.</li>
			<li>İsteğe bağlı olarak: Elde birden fazla (x, y) pozisyonlar. Rastgele 10 alan hücre yakın özel yastıkları hava boşluğu seçin.</li>
			<li>Sistem saat sıra satın görüntü için faz veya DIC istenilen zaman aralığında. Not: şekil 4' te gösterilen hızlandırılmış sırası için 30 ms maruz her 10 min 14 h ile DIC görüntüleri elde. Floresans görüntüleme sırasında hızlandırılmış mikroskobu kullanırken, photobleaching ve fototoksisite en aza indirmek için satın alma aralığı ve pozlama zamanını ayarlayın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Daniel, R. A., Errington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+morphogenesis+in+bacteria%3A+two+distinct+ways+to+make+a+rod-shaped+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of cell morphogenesis in bacteria: two distinct ways to make a rod-shaped cell.</a> Cell. 113 (6), 767-776 (2003).</li>
<li>Tiyanont, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+peptidoglycan+biosynthesis+in+Bacillus+subtilis+with+fluorescent+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Imaging peptidoglycan biosynthesis in Bacillus subtilis with fluorescent antibiotics.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (29), 11033-11038 (2006).</li>
<li>Turner, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycan+architecture+can+specify+division+planes+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycan architecture can specify division planes in Staphylococcus aureus.</a> Nat Commun. 1, 26(2010).</li>
<li>Wheeler, R., Mesnage, S., Boneca, I. G., Hobbs, J. K., Foster, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+reveals+cell+wall+dynamics+and+peptidoglycan+architecture+in+ovococcal+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy reveals cell wall dynamics and peptidoglycan architecture in ovococcal bacteria.</a> Mol Microbiol. 82 (5), 1096-1109 (2011).</li>
<li>Turner, R. D., Hurd, A. F., Cadby, A., Hobbs, J. K., Foster, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wall+elongation+mode+in+Gram-negative+bacteria+is+determined+by+peptidoglycan+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Cell wall elongation mode in Gram-negative bacteria is determined by peptidoglycan architecture.</a> Nat Commun. 4, 1496(2013).</li>
<li>Kuru, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+probing+of+newly+synthesized+peptidoglycan+in+live+bacteria+with+fluorescent+D-amino+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">In Situ probing of newly synthesized peptidoglycan in live bacteria with fluorescent D-amino acids.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 51 (50), 12519-12523 (2012).</li>
<li>Siegrist, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%28D%29-Amino+acid+chemical+reporters+reveal+peptidoglycan+dynamics+of+an+intracellular+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">(D)-Amino acid chemical reporters reveal peptidoglycan dynamics of an intracellular pathogen.</a> ACS Chem Biol. 8 (3), 500-505 (2013).</li>
<li>Kepner, R. L., Pratt, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fluorochromes+for+direct+enumeration+of+total+bacteria+in+environmental+samples%3A+past+and+present%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Use of fluorochromes for direct enumeration of total bacteria in environmental samples: past and present.</a> Microbiol Rev. 58 (4), 603-615 (1994).</li>
<li>Johnson, M. B., Criss, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy+methods+for+determining+the+viability+of+bacteria+in+association+with+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells.</a> J Vis Exp. (79), (2013).</li>
<li>Bakshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonperturbative+imaging+of+nucleoid+morphology+in+live+bacterial+cells+during+an+antimicrobial+peptide+attack%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Nonperturbative imaging of nucleoid morphology in live bacterial cells during an antimicrobial peptide attack.</a> Appl Environ Microbiol. 80 (16), 4977-4986 (2014).</li>
<li>Barak, I., Muchova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+lipid+domains+in+bacterial+cell+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">The role of lipid domains in bacterial cell processes.</a> Int J Mol Sci. 14 (2), 4050-4065 (2013).</li>
<li>Fishov, I., Woldringh, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+membrane+domains+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Visualization of membrane domains in Escherichia coli.</a> Mol Microbiol. 32 (6), 1166-1172 (1999).</li>
<li>Barak, I., Muchova, K., Wilkinson, A. J., O'Toole, P. J., Pavlendova, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+spirals+in+Bacillus+subtilis+and+their+role+in+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Lipid spirals in Bacillus subtilis and their role in cell division.</a> Mol Microbiol. 68 (5), 1315-1327 (2008).</li>
<li>Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zupan, J. R., Zik, J. J., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycan+synthesis+machinery+in+Agrobacterium+tumefaciens+during+unipolar+growth+and+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycan synthesis machinery in Agrobacterium tumefaciens during unipolar growth and cell division.</a> MBio. 5 (3), e01219(2014).</li>
<li>Zupan, J. R., Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+FtsA+and+FtsZ+localization+and+outer+membrane+alterations+during+polar+growth+and+cell+division+in+Agrobacterium+tumefaciens%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dynamic FtsA and FtsZ localization and outer membrane alterations during polar growth and cell division in Agrobacterium tumefaciens.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (22), 9060-9065 (2013).</li>
<li>Eberhardt, A., Wu, L. J., Errington, J., Vollmer, W., Veening, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+localization+of+choline-utilization+proteins+in+Streptococcus+pneumoniae+using+novel+fluorescent+reporter+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cellular localization of choline-utilization proteins in Streptococcus pneumoniae using novel fluorescent reporter systems.</a> Mol Microbiol. 74 (2), 395-408 (2009).</li>
<li>Iniesta, A. A., Garcia-Heras, F., Abellon-Ruiz, J., Gallego-Garcia, A., Elias-Arnanz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+systems+for+conditional+gene+expression+in+Myxococcus+xanthus+inducible+by+isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside+or+vanillate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Two systems for conditional gene expression in Myxococcus xanthus inducible by isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside or vanillate.</a> J Bacteriol. 194 (21), 5875-5885 (2012).</li>
<li>Figueroa-Cuilan, W., Daniel, J. J., Howell, M., Sulaiman, A., Brown, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mini-Tn7+Insertion+in+an+Artificial+attTn7+Site+Enables+Depletion+of+the+Essential+Master+Regulator+CtrA+in+the+Phytopathogen+Agrobacterium+tumefaciens%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mini-Tn7 Insertion in an Artificial attTn7 Site Enables Depletion of the Essential Master Regulator CtrA in the Phytopathogen Agrobacterium tumefaciens.</a> Appl Environ Microbiol. 82 (16), 5015-5025 (2016).</li>
<li>Jacob, F., Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulatory+mechanisms+in+the+synthesis+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins.</a> J Mol Biol. 3, 318-356 (1961).</li>
<li>Khan, S. R., Gaines, J., Roop, R. M. 2nd, Farrand, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad-host-range+expression+vectors+with+tightly+regulated+promoters+and+their+use+to+examine+the+influence+of+TraR+and+TraM+expression+on+Ti+plasmid+quorum+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Broad-host-range expression vectors with tightly regulated promoters and their use to examine the influence of TraR and TraM expression on Ti plasmid quorum sensing.</a> Appl Environ Microbiol. 74 (16), 5053-5062 (2008).</li>
<li>Yansura, D. G., Henner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+Escherichia+coli+lac+repressor+and+operator+to+control+gene+expression+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Use of the Escherichia coli lac repressor and operator to control gene expression in Bacillus subtilis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (2), 439-443 (1984).</li>
<li>Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+regulation%2C+modulation%2C+and+high-level+expression+by+vectors+containing+the+arabinose+PBAD+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter.</a> J Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).</li>
<li>Thanbichler, M., Iniesta, A. A., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+set+of+plasmids+for+vanillate-+and+xylose-inducible+gene+expression+in+Caulobacter+crescentus%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A comprehensive set of plasmids for vanillate- and xylose-inducible gene expression in Caulobacter crescentus.</a> Nucleic Acids Res. 35 (20), e137(2007).</li>
<li>Topp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+riboswitches+that+induce+gene+expression+in+diverse+bacterial+species%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Synthetic riboswitches that induce gene expression in diverse bacterial species.</a> Appl Environ Microbiol. 76 (23), 7881-7884 (2010).</li>
<li>Peters, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comprehensive%2C+CRISPR-based+Functional+Analysis+of+Essential+Genes+in+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Comprehensive, CRISPR-based Functional Analysis of Essential Genes in Bacteria.</a> Cell. 165 (6), 1493-1506 (2016).</li>
<li>Qi, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repurposing+CRISPR+as+an+RNA-guided+platform+for+sequence-specific+control+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression.</a> Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).</li>
<li>Griffith, K. L., Grossman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+protein+degradation+in+Bacillus+subtilis+using+heterologous+peptide+tags+and+adaptor+proteins+to+target+substrates+to+the+protease+ClpXP%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Inducible protein degradation in Bacillus subtilis using heterologous peptide tags and adaptor proteins to target substrates to the protease ClpXP.</a> Mol Microbiol. 70 (4), 1012-1025 (2008).</li>
<li>McGinness, K. E., Baker, T. A., Sauer, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+controllable+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Engineering controllable protein degradation.</a> Mol Cell. 22 (5), 701-707 (2006).</li>
<li>Schneider, J. P., Basler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shedding+light+on+biology+of+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Shedding light on biology of bacterial cells.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 371 (1707), (2016).</li>
<li>Escobar, M. A., Dandekar, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+tumefaciens+as+an+agent+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium tumefaciens as an agent of disease.</a> Trends Plant Sci. 8 (8), 380-386 (2003).</li>
<li>Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+plant+transformation%3A+the+biology+behind+the+%22gene-jockeying%22+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 67 (1), table of contents 16-37 (2003).</li>
<li>Nester, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium%3A+nature%27s+genetic+engineer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium: nature's genetic engineer.</a> Front Plant Sci. 5, 730(2014).</li>
<li>Imam, J., Singh, P. K., Shukla, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+Microbe+Interactions+in+Post+Genomic+Era%3A+Perspectives+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Plant Microbe Interactions in Post Genomic Era: Perspectives and Applications.</a> Front Microbiol. 7, 1488(2016).</li>
<li>Subramoni, S., Nathoo, N., Klimov, E., Yuan, Z. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+tumefaciens+responses+to+plant-derived+signaling+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium tumefaciens responses to plant-derived signaling molecules.</a> Front Plant Sci. 5, 322(2014).</li>
<li>Yuan, Z. C., Williams, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+really+useful+pathogen%2C+Agrobacterium+tumefaciens%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A really useful pathogen, Agrobacterium tumefaciens.</a> Plant Cell. 24 (10), (2012).</li>
<li>Alvarez-Martinez, C. E., Christie, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+diversity+of+prokaryotic+type+IV+secretion+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Biological diversity of prokaryotic type IV secretion systems.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 73 (4), 775-808 (2009).</li>
<li>Pitzschke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+infection+and+plant+defense-transformation+success+hangs+by+a+thread%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium infection and plant defense-transformation success hangs by a thread.</a> Front Plant Sci. 4, 519(2013).</li>
<li>Kuru, E., Tekkam, S., Hall, E., Brun, Y. V., Van Nieuwenhze, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+fluorescent+D-amino+acids+and+their+use+for+probing+peptidoglycan+synthesis+and+bacterial+growth+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Synthesis of fluorescent D-amino acids and their use for probing peptidoglycan synthesis and bacterial growth in situ.</a> Nat Protoc. 10 (1), 33-52 (2015).</li>
<li>Curtis, P. D., Brun, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+essential+alphaproteobacterial+genes+reveals+operational+variability+in+conserved+developmental+and+cell+cycle+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of essential alphaproteobacterial genes reveals operational variability in conserved developmental and cell cycle systems.</a> Mol Microbiol. 93 (4), 713-735 (2014).</li>
<li>Kim, J., Heindl, J. E., Fuqua, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+division+and+development+influences+complex+multicellular+behavior+in+Agrobacterium+tumefaciens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Coordination of division and development influences complex multicellular behavior in Agrobacterium tumefaciens.</a> PLoS One. 8 (2), e56682(2013).</li>
<li>Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Cell+Imaging+of+Bacillus+subtilis+and+Streptococcus+pneumoniae+using+Automated+Time-lapse+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy.</a> J Vis Exp. (53), (2011).</li>
<li>Turnbull, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+imaging+of+the+cytokinetic+Z+ring+in+live+bacteria+using+fast+3D-structured+illumination+microscopy+%28f3D-SIM%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Super-resolution imaging of the cytokinetic Z ring in live bacteria using fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM).</a> J Vis Exp. (91), e51469(2014).</li>
<li>Zeng, L., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Following+cell-fate+in+E.+coli+after+infection+by+phage+lambda%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Following cell-fate in E. coli after infection by phage lambda.</a> J Vis Exp. (56), e3363(2011).</li>
<li>Brown, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+growth+in+the+Alphaproteobacterial+order+Rhizobiales%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Polar growth in the Alphaproteobacterial order Rhizobiales.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (5), 1697-1701 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu protokol A. tumefaciens tükenmesi wildtype ve mutant suşları incelenmesi için işlemler bir dizi içerir. Bu protokol bölümünde listelenen tüm yordamları büyüme medya, sıcaklık ve büyüme oranları için hesabınıza ek değişiklikler ile diğer bakteri suşları için kolayca adapte edilebilir dikkati çekiyor.
Hedef özel boyalar bakteri hücreleri hücre döngüsü olayları detaylı karakterizasyonu sağlamak için değerli bir araç kullanmaktır. Burada, peptidoglikan ekleme desenleri floresan d amino...

Bakteriyel hücre döngüsü boyunca ilerleme membran ve hücre duvarı sentezi, DNA ikileşmesi ve segregasyon ve hücre bölünmesi gibi birçok işlemi koordinasyon gerektirir. Tamamen bakteriyel hücre biyolojisi karmaşıklığını anlamak için bu temel olayları incelemek gereklidir; Başlıca bileşenleri bu yollar, mutagenized zaman hücre canlılığı tehlikeye beri Ancak, bu önemsiz bir görevdir. Hedef özel boyalar ile birleştiğinde Epifluorescence mikroskopi wildtype ve mutant bakteri suşları temel bu işlemlerde soruşturma için güçlü bir yaklaşımdır.
Peptidoglikan özel boyalar floresan antibiyotik (Vankomisin-FL, bocillin-FL) ve floresan d amino asitler (örneğin, 7-Hidroksikumarin-3-karboksilik asit-3-amino-d-alanin, HADA; 4-chloro-7-nitrobenzofurazan-3-amino-d-alanin içerir , NADA; tetramethylrhodamine-3-amino-d-alanin; TADA). Gram-pozitif bakterilerde peptidoglikan biyosentezi sitelerin soruşturma için floresan antibiyotik analogları sublethal konsantrasyonları kullanımı peptidoglikan ekleme desenleri1,2ortaya çıkarmak için etkili bir strateji olmuştur, 3,4. Floresan Vankomisin etiketleme ekleme desenleri sabit Ayagin Gram-negatif bakteri5peptidoglikan anlayışlar kazanmak için kullanılmıştır, dış membran genellikle floresan kullanımını engelleyen bir geçirgenliği bariyer sağlar antibiyotik olarak bir sonda peptidoglikan canlı hücreleri içinde biyosentezi için. Buna ek olarak, floresan-d-amino asit veya biorthogonal fonksiyonel gruplar ile d-amino asitler ve kısa darbeleri kovalent bölgelerinde yaşayan bakteri hücreleri6,7geniş bir alanda son peptidoglikan ekleme etiketleyin. Sentetik d amino asitler ile gözlenen desenleri peptidoglikan ekleme punctate ve septal içerir (Escherichia coli ve Bacillus subtilis), kutup ve septal (Agrobacterium tumefaciens ve Listeria Monositogenez), septal tek (Staphylococcus aureus) ve apikal (Streptomyces venezuelae)6,7. Bu gözlemler bakteri hücre duvarı dipnotlar farklı desenler sergi ve sentetik d amino asitler olarak büyüme desenlendirme incelenmesi için sonda kullanımı birçok bakteri içinde değerli bir stratejidir gösterir.
Bakteriyel kromozomlar etiket boya dahil deoksiribonükleik asit (DNA) belirli küçük groove cilt (4,6-diamidino-2-phenylindole; DAPI) ve yüksek afinite siyanür boyalar (yeşil ve turuncu malzeme listesini görmek;). Canlı hücrelerin DAPI boyama bakteriyel canlılığı9belirtmek için kullanılır, ancak sabit hücrelerin DAPI boyama numaralandırma çevre örnekleri8, bakterilerin yardımcı olur. Buna ek olarak, Sigara-hücrelerin9numaralandırmak için membran impermeant "ölü" hücre lekeleri gibi turuncu ve yeşil sık açıklandığı gibi siyanür boyuyor. Bu reaktifler hücre büyümesi sırasında bakteriyel çevrili morfolojisi soruşturma için kullanıldığında, dikkat çekici, DAPI, turuncu ve yeşil tüm membran permeant ve canlı hücreleri10etiketleme kabil olmak gösterilmiştir. E. coli hücreleri canlı, DAPI DNA'sı boyama sitoplazma auto-floresan nedeniyle yaygın görünür ve ultraviyole (UV) ışık için hücre DAPI lekeli tekrarlanan Etkilenmeler perturbs çevrili yapısı10. Bu boya membran permeant olup uzun süreli Floresans bağlama üzerine canlı hücrelerdeki DNA hücre büyümesi, DNA ikileşmesi veya Kromozom ayrımı10 etkilemeden sağlar boyama E. coli ya da B. subtilis ile portakal ortaya çıkarır . Bu gözlemler siyanür DNA boyalar nucleoids Morfoloji çoğu bakterinin hücre büyüme sırasında izlemek için kullanılabilir öneririz.
Phospholipid-Specific stryl boya N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) fenil gibi) hexatrienyl) pyridinium dibromide (4-64; bkz: malzeme listesi) Katyonik bileşiklerdir ve tercihen olumsuz ücret ilişkilendirmek fosfolipitler gibi cardiolipin ve phosphatidylglycerol11. 4-64 farklı bakteri membran etiketlemek için kullanıldığında farklı desenler gözlenir. Escherichia coli, 4-64 yan duvar boyunca bantlarında Polonyalılar zenginleştirilmiş ve bölünme siteler geç pre-divisional12hücreleri. Bacillus subtilisiçinde 4-64 etiketleme lipid spiraller13görselleştirme sağlar. Agrobacterium tumefaciens, 4-64 dış membran etiketleri ve karakteristik "nal" desen büyüme Kutbu14,15etiketleme yoksun olduğu görülmektedir. Bu gözlemler Bu bakterilerin varlığı nedeniyle heterojen lipid dağıtımları için hücresel asimetri katkıda lipid etki alanlarının sergi gösteriyor. Diffüz etiketleme varlığını gibi 4-64 etiketleme şekillerindeki değişiklikleri, blebs veya veziküller, invaginations veya membran büzülme dağıtım veya lipidler biyosentezi etkisi mutantlar karakterize bilgilendirici olabilir.
Hücre boyama ötesinde, proteinlerin temel süreçlerine katılan işlevi belirlenmesi gereklidir. Gerekli genler silmek ve fenotipik sonuçları çalışma mümkün değildir çünkü temel proteinler karakterizasyonu teknik olarak zordur. Böylece, protein tüketen alternatif yaklaşımlar ortaya çıkmıştır. Örneğin, temel bir gen bir indüklenebilir organizatörü tercihan--dan onun yerel organizatörü kontrolü altında konabilir. İndüklenebilir rehberleri gibi küçük moleküllere duyarlı vardır; 16, izopropil β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)17,18,19,20,21, arabinoz22, vanillate17,23çinko, ve ksiloz23, böylece hedef gen transkripsiyonu sona erer ve uyarıcı kaldırıldığında faiz protein tükenmiştir. Küçük molekül RNA etkileşimleri hedef genlerin transkripsiyon CRISPR girişim25,26 engellemek için kullanılan sentetik riboswitches24 ilgi temel protein tüketen Alternatif yaklaşımları içerir hedef genlerin ve tarafından ClpXP proteaz bozulmayı peptid Etiketler hedef proteinler için kullandığı indüklenebilir protein yıkımı27,28 blok transkripsiyon için. Hücrelerin canlılık kaybetmeden tükenmesi suşları karakterizasyonu için sadece kısa bir süre sağlarsanız, bu nedenle, hücrelerin mikroskobik görüntüleme protein tüketimi sırasında zamanla karakterizasyonu için güçlü bir yaklaşım. Nitekim, mikroskobu canlı bakteri hücre hücre şekil bakım, salgı ve Bölünebilme29mekanizmaları da dahil olmak üzere temel biyolojik süreçlerin anlayışlar kazanmak araştırmacılar sağladı.
A. tumefaciens bir bakteriyel bitki patojeni30 ve doğal genetik mühendisi31,32olduğunu. Böylece, mekanizmalar patojen için ilgili ana bilgisayar-patojen etkileşimleri33,34,35, salgı36ve ana bilgisayar dönüşüm30,31, gibi 37 kapsamlı bir şekilde araştırıldı. A. tumefaciens aracılı hastalığı önlemek ya da bitki dönüşüm geliştirmek stratejiler tasarlamak için A. tumefaciens hayatta kalmak için gerekli işlemleri daha iyi anlaşılması gerekir. Hedef özel boya kullanımı ve son gelişmeler A. tumefaciens18 için bir protein tükenmesi stratejinin temel süreçleri araştırmak için bir yol sağlar.
Burada, A. tumefaciens wildtype, mutant ve protein tükenmesi suşları mikroskobik analizi için detaylı protokoller sağlanır. İlk iki protokol, hücreleri hazırlamak ve onları hedef özel boyalar ile etiket açıklanmıştır. Üçüncü protokol için özel yastıkları (şekil 1) hazırlama ve bakteri hücreleri (Şekil 2, şekil 3, şekil 4) görüntüleme hakkında adım adım yönergeler sağlar. Bu protokoller de farklı ortam koşulları, büyüme oranları, oksijen gereksinimleri ve hücre yapıları için hesabınıza ek uyarlamalar ile diğer bakteriler için uygun olabilir.

<table><tbody><tr><td><güçlü>Bakteriyel Suşlar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agrobacterium tumefaciens C58</td><td>ATCC</td><td>33970</td><td>Watson B, Currier TC, Gordon MP, Chilton MD, Nester EW. 1975. Agrobacterium tumefaciens'in virülansı için gerekli plazmid. J Bakteriyol 123:255-264.</td></tr><tr><td>Agrobacterium tumefaciens C58 ve Delta; tetRA::mini-TN7T-GM-PTAC-ctrA &Delta; ctrA</td><td></td><td></td><td>Figueroa-Cuilan W, Daniel JJ, Howell M, Süleyman A, Kahverengi PJB. 2016. Yapay bir attTn7 bölgesine Mini-Tn7 yerleştirilmesi, fitopatojen Agrobacterium tumefaciens'deki orijinal ana regülatör CtrA'nın itilmesini sağlar. Uygulama Çevresi Mikrobiyol. 82:5015-5025.</td></tr><tr><td><>Ad<</td><td>strong>Company</td><td>Katalog Numarası</td>strong<td>><Comments</td></tr><tr><td>Media Components</strong</td>><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATGN Minimal Orta</td><td></td><td></td><td>1 L sterilize suya 50 ml 20X Tampon, 50 ml 20X Tuz, 12.5 ml %40 glikoz ekleyin. Plakalar için 1 L suya 15 g Bacto Agar ekleyin ve otoklavlayın. 55 ° C'ye kadar serin; C ve 50 ml 20X Tampon, 50 ml 20X Tuz, 12.5 ml %40 glikoz ekleyin.</td></tr><tr><td>20X AT Tamponu</td><td></td><td></td><td>Suya 214 g/L KH2PO4 ekleyin ve sodyum hidroksit ile pH'ı 7.0'a ayarlayın. Otoklav.</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP359</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Chemical</td><td>P288</td><td></td></tr><tr><td>20X AT Tuzları</td><td></td><td></td><td>40 g/L (NH4)2SO4, 3.2 g/L MgSO4&boğa; 7H<alt>2</alt>O, 0.2 g/L CaCl<alt>2</alt>&boğa; 2H<alt>2</alt>O ve 0,024 g/L MnSO<alt>4</alt>&boğa; H2O suya. Otoklav.</td></tr><tr><td>(NH<alt>4</alt>)<alt>2</alt>SO<alt>4</alt></td><td>Fisher Kimyasal</td><td>A701</td><td></td></tr><tr><td>MgSO<alt>4</alt>&boğa; 7H2O</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP213</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&bull; 2H2O</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP510</td><td></td></tr><tr><td>MnSO4&bull; H2O</td><td>Fisher Chemical</td><td>M114</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16</td><td>%40 su stoğu hazırlayın. Filtre sterilize eder.</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1423</td><td>Tabakları hazırlarken 1 L suya 15 g ekleyin.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td> İsteğe Bağlı Medya Katkı Maddeleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kanamisin</td><td>GoldBio</td><td>K-120</td><td>Suda 100 mg / ml stok çözeltisi olarak hazırlayın ve süzgeçte sterilize edin. 200 & mikro nihai konsantrasyonda kullanın; g/ml'dir.</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>GoldBio</td><td>I2481C5</td><td>Suda 1 M stok solüsyonu olarak hazırlayın ve filtreyi sterilize edin. İndüksiyon için gerektiği gibi 1 mM'lik son konsantrasyonda kullanın.</td></tr><tr><td><güçlü > Adı</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td> Mikroskopi Malzemeleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Slaytları</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550D</td><td>25 X 75 X 1.0 mm. Sparkle cam temizleyici ile temizleyin.</td></tr><tr><td>Mikroskop Kapağı</td><td>Camı Fisherbrand</td><td>12-541-B</td><td>22 X 22 mm. No. 1.5. Sparkle cam temizleyici ile temizleyin.</td></tr><tr><td>Sparkle Cam</td><td>Temizleyici Ev Deposu</td><td>203261385</td><td>Amonyak ve alkol içermez.</td></tr><tr><td>Ultra Saf Agaroz</td><td>Invitrogen</td><td>16500-100</td><td>Suya, PBS'ye veya ortama %1 - 1,5'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin. Mikrodalgada eritin ve steril</td></tr> su <tr>ile 1X'e seyreltilecek 70 C<td>PBS</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP399500</td><td>10X çözeltisine yerleştirin.</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-999</td><td>Agaroz ped hazırlamada conta olarak kullanılan laboratuvar filmi.</td></tr><tr><td>VALAP</td><td></td><td></td><td>Konik bir tüpe eşit ağırlıkta lanolin, parafin mumu ve vazelin ekleyin. 70 & derece ısı borusu; C kuru, boncuk veya su banyosu eritmek ve karıştırmak için. VALAP'ı hala erimiş halde uygulayın.</td></tr><tr><td>Lanolin Yağı</td><td>SAAQIN</td><td>SQ-LAB-R1</td><td></td></tr><tr><td>Petrol Jeli</td><td>Hedef A.Ş.</td><td>06-17644</td><td></td></tr><tr><td>Parafin Balmumu</td><td>Kurnaz Mumlar</td><td>263012</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>İsim</güçlü</td><td>><güçlü>Şirket<>güçlü</td><td><güçlü>Katalog Numarası</td><td>Yorumlar</strong</td></tr><tr><td>>Hedefe özel boyalar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP231-1</td><td>Boya stok çözeltilerini gerektiği gibi seyreltmek için kullanın.</td></tr><tr><td>FDAA'lar (NADA, HADA, TADA)FDAA'lar,</td> Mike VanNieuwenhze (Indiana Üniversitesi) <td></td><td></td><td>ile anlaşma yoluyla sentezlenebilir veya edinilebilir. DMSO'da 100 mM stok çözeltisi hazırlayın. 5 mM'lik bir son konsantrasyonda kullanın.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62247</td><td>DMSO'da 1 mg / ml stok çözeltisi hazırlayın. 1 & mikro nihai konsantrasyonda kullanın; g/ml'dir.</td></tr><tr><td>SYTOX Turuncu Nükleik Asit Lekesi</td><td>Invitrogen</td><td>S11368</td><td>DMSO'da stok konsantrasyonu 5 mM'dir. 5 >M'lik son konsantrasyonda kullanın.</td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>Invitrogen</td><td>T3166</td><td>DMSO'da 8 mg / ml stok çözeltisi hazırlayın. 8 & mikro nihai konsantrasyonda kullanın; g/ml'dir.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kuru banyo</td><td>Sheldon İmalat, Inc.</td><td>52120-200</td><td></td></tr><tr><td>Metalik termal boncuklar</td><td>Lab Armor</td><td>42370-002</td><td></td></tr><tr><td>Bu çalışmada EMCDD kamera</td><td></td><td></td> ile donatılmış epifloresan mikroskobu <td>QImaging Rolera em-c2 1K elektron çarpım şarj bağlantılı cihaz (EMCCD) kamera ile donatılmış Nikon Eclipse TiE kullanılmıştır.</td></tr></tbody></table>

temel işlemler sırasında mikrobiyal hücre büyümesini gözlemlemek için hücre floresans mikroskobu canlı

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

Temel hücresel süreçleri DNA ikileşmesi ve segregasyon, protein sentezi, hücre duvarı sentezi ve hücre bölünmesi gibi bakteriyel hayatta kalmak için gerekli proteinlerin işlevi güveniyor. Bu işlemler probları daha iyi anlamak gibi bir dizi hedef özel boyalar kullanılabilir. Lipofilik boyalar ile boyama membran yapısı gözlenmesi, lipid microdomains görselleştirme ve membran blebs olarak algılanmasını sağlar. Floresan-d-amino asitler (FDAAs) peptidoglikan biyosentezi sitelerin soruşturma için kullanımı hücre duvarı Dipnotlar veya hücre büyüme desenlendirme potansiyel kusurları işaret ediyor olabilir. Son olarak, nükleik asit lekeleri DNA çoğaltma veya Kromozom segregasyon olası hataları işaret ediyor olabilir. Siyanür DNA hücre yaşayan etiket lekeleri ve hızlandırılmış mikroskobu çevrili Morfoloji gerçek zamanlı gözlemleri sırasında hücre büyümesini etkinleştirme için uygundur. Hücre etiketleme için protokol protein tükenmesi mutantlar membran yapısı, hücre duvarı Biyogenez ya da kromozom segregasyon tanımlamak için uygulanabilir. Ayrıca, hızlandırılmış mikroskobu gibi gerekli bir protein kaldırılır ve ek protein işlevi kazandırabileceğini morfolojik değişiklikleri izlemek için kullanılabilir. Örneğin, hücre büyüme proteinler tükenmesi hücre daha kısa veya yuvarlak haline neden olabilir, ancak temel hücre bölünmesi proteinler tükenmesi filamentation veya dallanma, sonuçları. Burada, hücre büyümesi, hedef özel etiketleme ve hızlandırılmış mikroskobu protokollerde bakteriyel bitki patojeni Agrobacterium tumefacienssağlanır. Birlikte, hedef özel boyalar ve hızlandırılmış mikroskobu temel süreçleri karakterizasyonu etkinleştirmek A. tumefaciens. Son olarak, sağlanan iletişim kuralları diğer bakterilerde temel işlemleri soruşturma için kolayca değiştirilebilir.

Hedef özgü wildtype etiketleme A. tumefaciens hücreleri Bu hücre morfolojisi göstermek için yıkama adımları veya (hangi floresan boyalar sulandırmak için kullanılır) % 1 DMSO ile tedavi etkilenmez, hücreleri doğrudan kültür (şekil 2A, sol paneli), hücreler tarafından yıkadıktan sonra yansıma 1.2 (şekil 2A, sol panelde) veya % 1 DMSO 10 min için hücrelerle kuluçka ve ...

Bakterilerde temel süreçleri işlevini anlamak zordur. Floresans mikroskobu hedef özel boyalar ile mikrobiyal hücre büyüme ve hücre döngüsü ilerleme içine anahtar anlayışlar sağlayabilir. Burada, Agrobacterium tumefaciens yöntemleri canlı hücre görüntüleme için gerekli işlemleri karakterizasyonu için vurgulamak için bir model bakteri kullanılmaktadır.

Temel işlemler sırasında mikrobiyal hücre büyümesini gözlemlemek için hücre Floresans mikroskobu canlı

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...

Bu mikroskopi tabanlı yaklaşımın genel amacı, bakteri hücrelerinin büyümesi sırasında merkezi bir süreci gözlemlemektir. Bu yöntem, bakteri hücresi büyümesi ve bölünmesi sırasında temel süreçlerin nasıl koordine edildiği gibi bakteriyolojideki önemli soruları ele almamızı sağlar. Bu tekniğin temel avantajı, canlı hücrelerdeki bakteri hücre yüzeylerini ve yapılarını görselleştirmek için floresan reaktifleri kullanabilmemizdir.Burada, Agrobacterium tumefaciens'teki temel süreçler hakkında bilgi sağlamak için bu yöntemi kullanıyoruz. Bununla birlikte, bu işlem büyümelerini incelemek için diğer bakterilere de uyarlanabilir. Başlamak için, üç mililitre ATGN Büyüme Ortamını aşılamak için steril bir tahta çubuk veya pipet ucu kullanın, vahşi tip veya mutant bir A.Tumifaciens suşunun tek bir kolonisi ile.Kültürü gece boyunca 28 santigrat derece ve 225 RPM'de büyütün. Ertesi gün, OD600'ü ölçmek için bir spektrofotometre kullanın. Daha sonra, hücre kültürünü yaklaşık 0.2'lik bir OD600'e seyreltin ve hücreleri 0.6'lık bir OD600'e büyütmeye devam edin.Bir mililitre üstel kültürü üç mikrofüj tüpüne dağıtın. Ve hücreleri beş dakika boyunca 7.000 x g'da bir masaüstü santrifüjde peletleyin. Her hü

live-cell-fluorescence-microscopy-to-observe-essential-processes

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada izlenir ve sayısal, fonksiyonel moleküler kompleksler tespit sağlamak için canlı bakteri hücreleri tek-molekül floresan mikroskopi gerçekleştirmek için protokolleri göstermektedir.

Tek Moleküler Kompleksleri görselleştirme In Vivo Gelişmiş Floresan Mikroskopi

Bu protokol, otomatik floresan zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak zaman farklı bakteriler tek hücre davranışlarını izlemek için bir adım-adım yordam sağlar. Ayrıca, biz nasıl mikroskobu görüntüleri analiz etmek için yönergeler sağlar.

Canlı Hücre Görüntüleme Bacillus subtilis Ve Streptococcus pneumoniae Otomatik Zaman atlamalı Mikroskopi

Fisyon Maya Kantitatif Canlı Hücre Floresan mikroskopi Analizi

Kaynak: Brzozowski, R. S. ve diğerleri. Bakterilerde subhücre protein lokalizasyonunu ve hücre morfolojisindeki değişiklikleri araştırmak için canlı hücre floresan mikroskobi. J. Vis. Exp. (2019)Bu video, bakterilerde gerçek zamanlı morfolojik değişiklikleri görselleştirmek için canlı hücre floresans mikroskopisini göstermektedir. Yüksek çözünürlüklü görüntüleri gerçek zamanlı elde etmek için görüntüleme, zaman geçişi ve dekonvolüsyonda kullanılan adımları özetler.

Bakterilerde Morfolojik Değişikliklerin Canlı Hücre Floresan Mikroskopisi Kullanılarak Görüntülenmesi

Biyomoleküllerin in vivo çalışmaları, biyolojik bağlamda moleküler işlevi anlamak için çok önemlidir. Burada, DNA veya proteinler gibi floresan biyomoleküllerin canlı mikroorganizmalara içselleştirilmesine izin veren yeni bir yöntemi açıklıyoruz. Floresan mikroskobu ile kaydedilen in vivo verilerin analizi de sunulmakta ve tartışılmaktadır.

Elektroporasyon yoluyla Yaşam Mikroorganizmalar içinde içselleştirilmesi ve Floresan biyomoleküllerin Gözlem

Bu makalede, mikro akışkan cips üretim ve kullanım ömrü ve tek bir maya hücrelerinin hücresel fenotipleri ölçmek için mikro-akışkan deney kurulumu için optimize edilmiş bir protokol sunulur.

Mikroakışkan Aygıtlar Kullanma Tek Budding Maya Hücreleri ömrü ve Hücresel fenotipleri Ölçmek için

Bakteri hücreleri son derece dağınık şekilde düzenlenir. Yavaş büyüyen Myxococcus xanthus hücreler zamanla bu organizasyonda takip etmek için bir tuzak birçok nesiller boyunca yüksek kronolojik zamanmekansal çözünürlük ile floresan canlı hücre görüntüleme için geliştirilmiştir. Bu yöntemi kullanarak, kromozom segregasyon ve hücre bölünmesi için önemli proteinlerin kronolojik zamanmekansal dynamics tespit edilemedi.

Floresans Live-hücre görüntüleme, tam bitkisel hücre döngüsü yavaş büyüyen sosyal bakteri Myxococcus xanthus

Burada, araştırmacıların mitoz ve Meiosis sırasında yaşayan fisyon Maya hücrelerinde protein davranışları ve nükleer dinamikleri incelemesini sağlayan toksik olmayan bir mikroskopi yöntemi olan canlı hücreli görüntüleme sunuyoruz.

Floresans canlı hücre mikroskobu ile mitotik ve meiotic Fission Maya nükleer dinamiklerinin incelenmesi

Bu makalede, protein subselliyerizasyon dinamiklerini araştırmak ve Bacillus subtilis ve Staphylococcus aureus'ta yüksek çözünürlüklü floresan mikroskobu kullanarak morfolojik değişiklikleri izlemek için adım adım kılavuz verilmektedir.

Bakterilerde Hücre Altı Protein Lokalizasyonu ve Hücre Morfolojisi Değişikliklerini Araştırmak Için Canlı Hücre Floresan Mikroskobu

Bu canlı-bakteriyel hücre görüntüleme protokolü zaman içinde tek hücre düzeyinde birden fazla bakteri türü arasındaki etkileşimlerin görselleştirilmesiiçin izin verir. Hızlandırılmış görüntüleme, tek tek kültür veya ortak kültürdeki her bakteri türünün gözlemlenmesine olanak sağlar ve bireysel hücre hareketliliği ve canlılığı da dahil olmak üzere çok türler arası bakteri topluluklarındaki türler arası etkileşimleri sorgular.

Tek Hücreli Türler Arası Bakteri Etkileşimlerinin Kinetik Görselleştirilmesi

Öğrenin canlı hücre floresan mikroskobu ile bakteri büyümesi sırasında temel süreçleri gözlemlemeyi. Agrobacterium tumefaciens kullanarak hücre yüzeylerini ve yapıları canlı hücrelerde görselleştirin.

Temel işlemler sırasında mikrobiyal hücre büyümesini gözlemlemek için hücre Floresans mikroskobu canlı

Daha fazla video keşfet