Name: Serum ve plazma kopya sayı algılama gerçek zamanlı PCR kullanarak (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Keşfedin serum ve plazma DNA'sında gerçek zamanlı PCR ile kopya sayısı varyasyon analizini. Bu yöntem, kastrasyon dirençli prostat kanserinde ilaç direncini tahmin etmek için uygundur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Chiara Molinari ve Filippo Martignano veri analizi desteği için teşekkür ederim.

DNA izolasyonu kopya numara analiz için gerçek zamanlı PCR gerçekleştirmek için serum veya plazma numuneleri, protokol oluşur. DNA ekstraksiyon, DNA miktar denetimi (Spektrofotometre) ve gerçek zamanlı PCR belirli hedefleri için yapıldı. Şekil 1' de, zaman çizgisi ve yordamlar bir özetini bildirilir.
Protokol IRST insan araştırma Etik Komitesi kuralları izler.
1. serum toplama ve işleme
<ol>
	<li>Yaklaşık 5 mL tam kan serum elde etmek için antikoagülan olmadan bir serum tüp toplamak. Kan tüpleri 4 ° C'de işleme kadar korumak.</li>
	<li>Santrifüj tüpleri, 1000 x g 4 ° C'de 15 dakika</li>
	<li>Dikkatle serum 2 mL tüpler içine aktarın.</li>
	<li>Toplama tüp atmak ve hemen süpernatant-80 ° c kadar kullanmak dondurma.</li>
</ol>
2. plazma toplama ve işleme
<ol>
	<li>Yaklaşık 10 mL tam kan plazma elde etmek için EDTA ile plazma tüp içinde toplamak. Tüp tamamen doldurmak ve sonra 8 kere tersine çevirin. Kan tüpleri 4 ° C'de işleme kadar korumak.</li>
	<li>Tüp 1800 x g oda sıcaklığında 15 dakika santrifüj hiçbir fren ayarı ile santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Dikkatle plazma üst kısmındaki 2 mL tüpler içine aktarın. En az 1 mL süpernatant beyaz hücre katmanı üzerinde bırakarak transferi, tekrarlayın. Not: üst kısmındaki süpernatant aktarma hücreleri veya hücre artıkları bulaşma riskini azaltır.</li>
	<li>Toplama tüp atmak ve hemen süpernatant-80 ° c kadar kullanmak dondurma.</li>
</ol>
3. Serum veya plazma DNA izolasyonu
Not: Aşağıdaki adımlarda modifiye ticari iletişim kuralını kullanarak serum veya plazma DNA izolasyonu uygulanmalıdır.
<ol>
	<li>(0,5 2 mL içeren) bir aliquot serum veya plazma oda sıcaklığında erimek.</li>
	<li>Girdap ve örnek mix ve 0.5 mL serum veya plazma net 1.5 mL tüp içine aktarın. Geri kalan malzeme-80 ° C'de dondurmak</li>
	<li>50 µL İndinavir k (20 mg/mL) doğrudan örneğine ekleyin.</li>
	<li>0.5 mL lizis arabelleği için örnek ve de pipetting tarafından karıştırın.</li>
	<li>Tüpler kapatın ve örnekleri 56 ° c ısı blok 15 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>% 100 etanol belirtilmiş miktarı yıkama arabellek 1 ve 2, üreticinin yönergelerini tarafından belirtildiği şekilde eklenir.</li>
	<li>Örnekleri geri oda sıcaklığına getirmek ve mutlak etanol 0.5 mL ve de pipetting tarafından karıştırın.</li>
	<li>650 µL adım 3.7 ayrılık sütun ve 1 dk. için 6.000 x g, santrifüj elde karışımı ekleyin.</li>
	<li>Aracılığıyla akış içeren tüp atın ve sütun yeni bir temiz toplama tüp yerleştirin. Adım 3.8 ve 3,9 bir kez daha yineleyin.</li>
	<li>500 µL yıkama tampon 1, sütun ve 1 dk. için 6.000 x g, santrifüj kenarında ıslatmadan ekleyin.</li>
	<li>Aracılığıyla akış içeren tüp atın ve eski yerine koymak o ile yeni bir temiz toplama tüp.</li>
	<li>500 µL yıkama tampon 2, sütun ve 3 dak için tam hızda (20.000 x g) santrifüj kenarında ıslatmadan ekleyin.</li>
	<li>Aracılığıyla akış içeren tüp atın ve eski yerine koymak o ile yeni bir temiz toplama tüp.</li>
	<li>Herhangi bir kalıntı çamaşır arabellek kaldırmak için 3 dakika için tam hızda (20.000 x g) santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Sütun bir temiz 1.5 mL tüp içine yerleştirin. 150 µL elüsyon arabelleği ekleyin ve bu arabellek sütun ıslatıyor emin olmak için 7 dk. bekleyin.</li>
	<li>1 dk. için 8000 x g de santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Elute DNA'ın en büyük kurtarma sağlamak 1 dk için tekrar aynı sütun ve santrifüj tam hızda (20.000 x g) içine 3,16 adım pipette.</li>
</ol>
4. DNA miktar ve seyreltme
<ol>
	<li>Miktar DNA bir Spektrofotometre kullanarak gerçekleştirin. Örnek 2 µL tezgah üstü Spektrofotometre başına üreticinin yönergelerini kullanın. Not: Eğer DNA miktar gerçek zamanlı PCR ile devam etmek yeterli değildir (en az 120 ng), yeni bir DNA izolasyon işlemi gerçekleştirin.</li>
	<li>DNA için son hacim (yaklaşık 50 µL) tüm gerçek zamanlı PCR yeterli 2.5 ng/µL serum veya plazma sulandırmak.</li>
</ol>
5. gerçek zamanlı PCR
<ol>
	<li>Tezcan kopya numarası deneyleri, referans gen tahlil, seyreltilmiş DNA örnekleri ve buzun içinde havuzlu KALİBRATÖRLER. Oda sıcaklığında 4 ° C'de depolanan ana mix equilibrate</li>
	<li>Hedef tahlil, referans gen testin 1 µL ve ana Mix 10 µL 1 µL karışımı her örnek ve KALİBRATÖRLER havuzlu 3 çoğaltır için hazırlar. Negatif kontrol (su) ve 2 ilave örnekler de dahil olmak üzere karışımı hazırlayın.</li>
	<li>96'plaka, aliquot 12 µL her kuyuya karışımı iyi. Pipet ya da spin tüpleri var.</li>
	<li>Her DNA örneği ve her kuyuya havuzlu KALİBRATÖRLER 8 µL (2.5 ng/µL konsantrasyon) ekleyin. Pipet ya da spin tüpleri var. Her şey için belgili tanımlık uç değiştirin. Not: 96-şey plaka kullanarak gerçek zamanlı her deneme için 30 DNA örnekleri işlenebilir: 30 x 3 örnekleri + 1 x 3 KALİBRATÖRLER havuza alınan + negatif kontrol 94 =.</li>
	<li>Kısaca spin plaka 1000 x g de aşağı.</li>
	<li>Aşağıdaki iletişim kuralını kullanarak plakayı araştırmanı: 40 devredir 15 95 ° C'de 10 dakika, 95 ° C'de sahne tutun s ve 60 ° C için 1 dakika.</li>
</ol>
6. veri analizi ve yorumu
<ol>
	<li>Amplifikasyon arsa sonuçları altındaki "seçeneği" bölümünde, analiz ilk hedef gen için 0.2 Ct eşik ayarlayın. Kümedeki her hedef veya başvuru genler için yineleyin. .Txt uzantısı gerçek zamanlı PCR dosyasında dışa aktarmak için araç çubuğu'na "Dışa Aktar" tuşuna basın. Sadece "sonuçlar" Seç bayrak → verilecek veriyi uzantısı .txt → basın "start verme" → yakın dosya türü olarak verme aracını seçin.</li>
	<li>Analiz yazılımı açın ve dosyayı .txt (araç çubuğu → alma) alın.</li>
	<li>Analiz ve araç çubuğu (oyun sembol) tarafından analiz ayarı seçmek için dosya adını seçin.</li>
	<li>Kalibratör örnek ve hedef (Örneğin, 1 AR gen için kopya) kopya bilinen sayısını belirtin. Basın "uygulanır."</li>
	<li>Her örnek için farklı delta Ct (ΔCt) ile karşılaştırıldığında diğer wells ile bir şey atlayın.</li>
	<li>Deney (basın oyun sembol) yeniden çözümle.</li>
	<li>Arsa veya tablo bar kopya sayısıyla sonuçlarını değerlendirmek. Not: Güven, Z-score ve sonuçları yorumlama için yararlı olabilir analiz çoğaltır gibi çok sayıda parametre sonuçları tablo içerir.</li>
</ol>

<ol><li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+DNA+as+a+diagnostic+marker+for+cancer%3A+current+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Onco+Targets+Ther%22%5BJournal%5D)">Cell-free DNA as a diagnostic marker for cancer: current insights.</a> Onco Targets Ther. 9, 6549-6559 (2016).</li>
<li>Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+DNA+as+a+liquid+biopsy+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor DNA as a liquid biopsy for cancer.</a> Clin. Chem. 61 (1), 112-123 (2015).</li>
<li>Murtaza, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+analysis+of+acquired+resistance+to+cancer+therapy+by+sequencing+of+plasma+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencing of plasma DNA.</a> Nature. 497 (7447), 108-112 (2013).</li>
<li>Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B., Speicher, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+detection+of+genome-wide+somatic+copy+number+alterations+by+liquid+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Non-invasive detection of genome-wide somatic copy number alterations by liquid biopsies.</a> Mol. Oncol. 10 (3), 494-502 (2016).</li>
<li>Diaz, L. A. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+evolution+of+acquired+resistance+to+targeted+EGFR+blockade+in+colorectal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers.</a> Nature. 486 (7404), 537-540 (2012).</li>
<li>Dawson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+circulating+tumor+DNA+to+monitor+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer.</a> N. Engl. J. Med. 368 (13), 1199-1209 (2013).</li>
<li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+cell-free+AR+and+CYP17A1+copy+number+variations+may+associate+with+outcome+of+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer+patients+treated+with+abiraterone%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone.</a> Br. J. Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).</li>
<li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+AR+copy+number+and+outcome+to+enzalutamide+in+docetaxel-treated+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Circulating AR copy number and outcome to enzalutamide in docetaxel-treated metastatic castration-resistant prostate cancer.</a> Oncotarget. 7 (25), 37839-37845 (2016).</li>
<li>Romanel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+AR+and+abiraterone-resistant+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Plasma AR and abiraterone-resistant prostate cancer.</a> Sci. Transl. Med. 7 (312), (2015).</li>
<li>Conteduca, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androgen+receptor+gene+status+in+plasma+DNA+associates+with+worse+outcome+on+enzalutamide+or+abiraterone+for+castration-resistant+prostate+cancer%3A+a+multi-institution+correlative+biomarker+study%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Androgen receptor gene status in plasma DNA associates with worse outcome on enzalutamide or abiraterone for castration-resistant prostate cancer: a multi-institution correlative biomarker study.</a> Ann Oncol. , (2017).</li>
<li>Attard, G., Antonarakis, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostate+cancer%3A+AR+aberrations+and+resistance+to+abiraterone+or+enzalutamide%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Urol%22%5BJournal%5D)">Prostate cancer: AR aberrations and resistance to abiraterone or enzalutamide.</a> Nat. Rev. Urol. 13 (12), 697-698 (2016).</li>
<li>Lee, T. H., Montalvo, L., Chrebtow, V., Busch, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+genomic+DNA+in+plasma+and+serum+samples%3A+higher+concentrations+of+genomic+DNA+found+in+serum+than+in+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Quantitation of genomic DNA in plasma and serum samples: higher concentrations of genomic DNA found in serum than in plasma.</a> Transfusion. 41 (2), 276-282 (2001).</li>
<li>Chan, K. C., Yeung, S. W., Lui, W. B., Rainer, T. H., Lo, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+preanalytical+factors+on+the+molecular+size+of+cell-free+DNA+in+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Effects of preanalytical factors on the molecular size of cell-free DNA in blood.</a> Clin. Chem. 51 (4), 781-784 (2005).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.

AR Serum ve plazma örnek analizde CN stratifikasyon kastrasyon dayanıklı prostat kanseri (CRPC) hastaların için yeni, non-invaziv bir yaklaşım temsil eder. Son zamanlarda AR CN abiraterone ve enzalutamide, tedavi öncesi ve sonrası kemoterapi7,8,9,10CRPC hastalarda sonuçlar tahmin etmek mümkün olduğunu kanıtlanmıştır.
Bizim yaklaşım en büyük avantajı...

Hücre ücretsiz DNA (cfDNA) kan dolaşan biyolojik kanser tanısı, prognoz, izleme ve tedavi direnci1,2tahmini için en iyi bir kaynağı olmak kanıtlanmıştır. Birçok çalışma DNA değişiklikler (mutasyonlar, kopya numarası varyasyonları, dokularda epigenetik değişiklikler) ve tümör DNA (ctDNA) dolaşan olduğunu teyit karşılık gelen plazma örnekleri1' de bulunanlar arasında iyi bir uyum göstermiştir birincil ve metastatik tümör doku değişiklikleri3için bilgilendirici. CtDNA eğitim imkanı böylece genomik düzenlemeler ve kopya numarası varyasyonları (CNVs) belirli oncogenes4potansiyel metastatik klonal ve subclonal hücreleri tanımlayan, yeniden inşası için izin verir. CtDNA belirli mutasyonlar ve özel hedeflenmiş tedaviler5,-6ile ilgili CNVs, limanlar gibi özellikle kanser tedavi izlemek için klinik olarak yararlı olabilir göstermiştir. Ayrıca doku biyopsisi ihtiyacını üstesinden gelir ve non-invaziv bir şekilde belirli kanser tedavisi sırasında farklı zamanlarda elde edilecek sonuçlar sağlar.
Prostat kanseri, boş hücre androjen dolaşan arasında önemli bir bağıntı ile ilgili olarak reseptör (AR) CNVs ve tedavi yanıt-e doğru abiraterone ve enzalutamide gösterilen, gösteren AR Gen kopya numarası (CN) cfDNA-ebilmek var olmak bir umut verici biyomarker tedavi direnci7,8,9,10,11tahmin yeteneğine sahip. CNVs ctDNA belirli genlerin değerlendirilen farklı duyarlılık, maliyet ve hız ile farklı yaklaşımlar kullanarak (örn. gerçek zamanlı, dijital PCR ve sonraki nesil sıralama).
Burada serum ve plazma örnekleri7,8cfDNA AR CN değerlendirmek için gerçek zamanlı PCR teknolojisinde çift yönlü deneyleri temel basit ve hızlı bir yaklaşım açıklar. Biz iki farklı genomik Berisi Bölgeler Klasiği intron 5 AR (Xq12) ve iki diğer genler, prostat kanseri (RNaseP, normal kopya numarası durumundaki bilinen iç standart referans genler olarak tasarlanmış iki farklı PCR deneyleri kabul 14q11 üzerinde bulunan; 1'de yer alan önce1, p 34). Biz bir duyarlık ve sonuçları duyarlılığını artırmak için yerine, iki referans genler seçildi. Bir DNA miktar olan 60 ng her tahlil birleşimi (kombine tahlil ve AR-assay_2 + AGO1 AR-assay_1 + RNaseP için) için güçlendirilmiş. Sağlıklı erkek üç serum veya plazma DNA örnekleri havuza alınmış ve bir Kalibratör kullanılır. Biz cutoffs, kabul &#62; AR kazanç için 1.5 ve &#60; 0,5 silinmek. Bu yöntemin ana avantajlarından biri bu esnek ve diğer genler Ayrıca, standart iç başvuru genler, tümör tipi ve özellikleri temelinde değiştirme değerlendirilebilir olduğunu olmasıdır.

<table><tbody><tr><td>BD Vacutainer Serum Tüpleri</td><td>Becton Dickinson</td><td>367814</td><td>serum için tam kan tüpü</td></tr><tr><td>BD Vacutainer EDTA Tüpleri</td><td>Becton Dickinson</td><td>366643</td><td>plazma için tam kan tüpü</td></tr><tr><td>Etanol mutlak</td><td>VWR</td><td></td><td>kullanıcı ayrıca diğer şirketleri de kullanabilir</td></tr><tr><td>TaqMan Kopya Numarası tahlili</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4400291</td><td>FAM boyası ile önceden tasarlanmış ve doğrulanmış tahliller. Aşağıdaki testi kullandık: AR_assay1: hs04107225 ve AR_assay2: hs04511283</td></tr><tr><td>TaqMan Kopya Numarası testi (değiştirilmiş)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4467084</td><td>VIC-boya ile modifiye edilmiş önceden tasarlanmış test: AGO1: Hs02320401_cn</td></tr><tr><td>TaqMan Kopya Numarası Referans Testi, insan, RNase P</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4403326</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4326708</td><td>Gerçek Zamanlı PCR için ana karışım</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini Kiti (50)</td><td>Qiagen</td><td>51304</td><td>DNA ekstraksiyon kiti</td></tr><tr><td>MicroAmp 96 Kuyulu Plakalar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N8010560</td> süresi <td>için plakalar PCR</td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 Spektrofotometre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td> <td>-</td> kullanıcı, DNA 7500 Hızlı Gerçek Zamanlı PCR Sistemini <td>ölçmek için diğer spektrofotometrik yöntemleri de kullanabilir</td></tr><tr><td></td><td>Uygulamalı Biyosistem-kullanıcı</td><td>,</td> kopya sayısı analizi için <td>diğer gerçek zamanlı cihaz</td></tr><tr><td>CopyCaller Yazılımı</td><td>Uygulamalı Biyosistem Yazılımını</td><td></td><td></td></tr> da kullanabilir</tbody></table>

serum ve plazma kopya sayı algılama gerçek zamanlı pcr kullanarak

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Serum ve Plazma hücre ücretsiz DNA (cfDNA) biyolojik kanser tanısı, prognoz, izleme ve tedavi direnci tahmini için bir bilgilendirici, non-invaziv kaynağı olarak gösterilmiştir. Androjen reseptör (AR) Gen kopya numarası (CN) kazanç varsayımını başlayarak sık olay metastatik kastrasyon direnç prostat kanseri (mCRPC), bu durumda cfDNA bir potansiyel akıllı biyomarker olarak analiz etmek önerdiğimiz.
Biz AR CN 2 farklı gerçek zamanlı PCR deneyleri ve 2 başvuru genler (RNaseP ve önce1) kullanarak cfDNA olarak değerlendirildi. DNA bir miktar olan 60 ng her tahlil birleşim için kullanıldı. AR CN kazanç dijital PCR daha doğru bir yöntemle doğrulandı. CN varyasyon analizi zaten tedavi direnci mCRPC ortamda tahmin için bilgilendirici olmak kanıtlanmıştır, ama aynı zamanda farklı hasta ortamlarda başka amaçlar için yararlı olabilir. CfDNA CN analiz çeşitli avantajları vardır: non-invaziv, hızlı ve gerçekleştirmek kolay ve serum veya plazma malzeme küçük bir birimden başlar.

Toplam cfDNA konsantrasyonu ölçülebilir spectrophotometry için tüm örneklerini analiz, 6,12 ng/µL sayılarının gösterilen tarafından (aralığı: 2,00-23.71 ng/µL) serum örnekleri ve 3.21 ng/µL ortancası (aralığı: 2.31 8,49 ng/µL) plazma numuneleri için. Gerçek zamanlı PCR deneyler tarafından Toplam 115 örnekleri analiz ettik.
Test duyarlılık ARve DNA için yüksek veya düşük kazancı da Kalibratör örnekleri kopya numara anali...

Bu el yazması kopya numarası varyasyon analizi serum veya plazma DNA gerçek zamanlı PCR yaklaşımı kullanarak gerçekleştirilen açıklar. Bu yöntem için tahmin kastrasyon dayanıklı prostat kanseri hastalarda ilaç direnci uygundur, ama aynı zamanda diğer hastalıklar için bilgilendirici olabilir.

Serum ve plazma kopya sayı algılama gerçek zamanlı PCR kullanarak

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Bu yöntemin genel amacı, serum veya plazma örneklerinde gen kopya sayısı varyasyonunu tespit etmektir. Bu yöntem, sporların azalmasını tahmin etmek veya izlemek için yararlı belirteçlerin tespiti gibi ileri prostat kanseri alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, yapılmasının kolay ve hızlı olmasıdır. Bu tekniğin etkileri, ileri prostat kanserinin tedavisine kadar uzanır, çünkü androjen reseptörü gen kopya sayısı varyasyonu sık görülen bir olaydır. Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler, hücresiz DNA'nın konsantrasyonu ve kalitesi genellikle beklenenden daha düşük olduğu için mücadele edecektir. Serum toplanması için, dört santigrat derecede tutulan antikoagülanlar olmadan beş mililitre tam kan ve serum örneğinden çalışın.Örnekleri 1.000 g'da 15 dakika santrifüjleyerek başlayın. İki mililitrelik tüplere aktarın ve peleti atın. Serum hemen işlenmedikçe, numuneleri 80 ° C'de dondurun

serum-and-plasma-copy-number-detection-using-real-time-pcr

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Burada, T hücresi reseptör eksizyon çemberlerinin (TREC'ler) ve K-silme rekombinasyon eksizyon çemberlerinin (KREC'ler) eşzamanlı niceliklemesi için bir yöntem açıklıyoruz. TREC/KREC testi, timik ve kemik iliği çıkışının belirteci olarak kullanılabilir.

T-hücre reseptörleri Eksizyon Circles Eşzamanlı Niceleme (TREC) ve K-silme Rekombinasyon Eksizyon Circles (KRECs) Gerçek zamanlı PCR ile

Sirkülasyon mikroRNAlar son zamanlarda çeşitli kanser ve diğer hastalıklar için umut verici ve yeni biyolojik belirteçler olarak ortaya çıkmıştır. Bu makalenin amacı üç farklı prob-tabanlı gerçek zamanlı PCR platformları ve ölçmek ve microRNA dolaşan bereket belirlemek için kullanılabilir yöntemleri tartışmaktır.

Probe-tabanlı Real-time PCR microRNA Kantitatif Ölçüm Yaklaşımları

Boya bazlı bir kimya ve damlacık dijital PCR teknolojisi kullanılarak hücresiz mikroRNA'ların miktar tayini için hassas ve doğru bir yöntem açıklanmaktadır.

MicroRNA Niceleme DNA bağlayıcı Boya Kimya ve Damlacık Dijital PCR kullanarak Sirkülasyon

Bu rapor plazma miRNA, nicel gerçek zamanlı ters transkripsiyon PCR ile veya öncesi amplifikasyon olmadan kullanarak mutlak düzeylerini ölçmek için bir protokolünü açıklar. Bu iletişim kuralı plazma miRNAs miktarı daha iyi anlaşılmasını tanıyor ve nitel karşılık gelen verilerden farklı çalışmalar veya laboratuvar değerlendirmesini sağlar.

Cynomolgus maymunlar, nicel gerçek zamanlı ters transkripsiyon PCR kullanarak plazma mikroRNA düzeylerinin mutlak miktar

El yazması bir nadir CDH1 transkript değişken (CDH1a) taze donmuş normal ve mide kanseri olan hastalarda elde edilen tümör doku algılamak için bir çip tabanlı dijital PCR tahlil açıklar.

Bir CDH1 nadir transkript değişken mide kanseri taze donmuş dokularda çip tabanlı dijital PCR tarafından algılanması

Burada, doğru bir şekilde birden fazla genetik değişiklikler hedef bölge teslim ddPCR ve hidroliz probları benzersiz bir çift kullanarak tek bir tepki olarak ölçmek için bir protokol mevcut.

Tek damlacık dijital polimeraz zincir tepkimesi mutasyonlar Hotspot bölgelerde kapsamlı ve eşzamanlı algılanması için

Burada, hastanın biyolojik sıvılarında (biyoluidler) bulunan DNA 'Yı dolaşarak tümör somatik mutasyonları tespit etmek için bir protokol sunuyoruz. Damlacık dijital polimeraz zincir reaksiyonu (dPCR) tabanlı yöntem, tümör mutasyonu allelik frekansının (MAF) ölçülmesini sağlar ve tümör yanıtının tanı ve temporal izlenmesi için minimal invaziv bir tamamlayıcı kolaylaştırır.

Hasta Biofluidinde tümör Ilişkili sirkülasyon DNA 'Sı tespiti ve Izlenmesi

Burada, tek hücrelerde mutlak mitokondriyal (mt) DNA kopya sayısını ve mtDNA delesyon heteroplazmi seviyelerini ölçmek için bir protokol sunuyoruz.

Dijital Damlacık Polimeraz Zincir Reaksiyonu Kullanarak Tek Hücreli Mitokondriyal DNA Kopya Sayısını ve Heteroplazmiyi Ölçme

Bu el yazması mutasyonlar düşük frekans ctDNA, ER-Seq. algılamak için bir teknik anlatılmaktadır Bu yöntem iki yönlü hata düzeltmesi, özel arka plan filtre ve verimli moleküler acquirement eşsiz kullanımı tarafından ayrıştırılan.

Sonraki nesil sıralama kullanarak CtDNA nadir mutasyonların tespiti

Biz burada pre-harekete geçirmek CD8 sitotoksisite araştırmak için bir protokol tarif+ T hücreleri kanser hücrelerine karşı apoptotik kanser hücreleri aracılığıyla gerçek zamanlı mikroskobu tespit ederek. Bu protokol mekanizmaları myeloid hücre kaynaklı T hücre bastırma arkasında araştırmak ve T hücreleri ile abluka bağışıklık baskılayıcı myeloid hücre yenileyici amaçlı bileşikler değerlendirmek.

Gerçek zamanlı hafiye-in Vitro tümör hücre Apoptosis içinde CD8 tarafından indüklenen+ T hücreleri Myeloid hücrelerin tümör infiltre bağışıklık baskılayıcı işlevlerini çalışmaya

Keşfedin serum ve plazma DNA'sında gerçek zamanlı PCR ile kopya sayısı varyasyon analizini. Bu yöntem, kastrasyon dirençli prostat kanserinde ilaç direncini tahmin etmek için uygundur.

Serum ve plazma kopya sayı algılama gerçek zamanlı PCR kullanarak

Daha fazla video keşfet