Name: Kromatin Immunoprecipitation üzerinden fare kas iskelet için geliştirilmiş iletişim kuralı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-06T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Öğrenin, fare iskelet kasından ChIP-grade kromatin hazırlama yöntemini. Bu protokol, kas liflerinde gen regülasyonunu ve kas atrofisi mekanizmalarını araştırmak için güvenilir bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

IGBMC yüksek işlem hacmi sıralama tesis, "Fransa Génomique" Konsorsiyumu (ANR10-INBS-09-08) bir üyesi ve tüm IGBMC genel Hizmetleri tüm personel özellikle IGBMC hayvan tesis personel teşekkür ediyoruz. Bu eser CNRS, INSERM, AFM, Ligue Nationale contre le kanser gelen hibe tarafından desteklenen, Fransız Fonu aracılığıyla ANR programı ANR-10-IDEX-0002-02, Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 etiketli Investissements d'Avenir altında devlet ve ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. Fon çalışma tasarım, veri toplama ve analizi, yayımlamaya karar veya el yazması hazırlanması herhangi bir rolü yoktu. S.J Ministère de l'Enseignement tarafından desteklenen Ligue Nationale contre le kanser ve ANR-AR2GR-16-CE11-009-01 ve V.U tarafından et de la Recherche. Ligue Nationale contre le kanser bir 'équipe labellisée' kimliğidir.

fareler sürekli bakım ve laboratuvar hayvanlarının kullanımı ile ilgili Kurumsal yönergelere uygun olarak ve uygun olarak ulusal hayvan bakım kuralları (Avrupa Komisyonu yönergesi 86/609/CEE; Fransızca kararname no.87-848). Tüm yordamları Fransız Ulusal Etik Komitesi tarafından kabul edildi.
 1. yalıtım kas dokusu <ol><li>kurban bir yetişkin 6 8 haftalık için fare ile servikal çıkığı. Sterlise % 70 etanol ile durulama tarafından bacak ve para cezası nokta makas ve forseps kullanarak arka bacak kasları (gastroknemius, Tibialis önünde, Quadriceps) teşrih. 
	Not: Bir fare yaklaşık 500 mg doku verim.</li>
	<li>2 mL içeren homojen bir hazırlık küçük buz gibi Hipotonik arabelleğe 1 mL tüp bebek kaslarında kıyma (&#60; 2-3 mm 3) kullanarak adet ince makas ve tezgah üst karıştırıcı 5-10 dakika süreyle 4 ° C'de sallayarak tüp terk</li>
</ol> 2. Doku lizis Not: tüm besteleri arabellek için Tablo 1 ' e bakınız.
<ol><li>Homogenate 14 mL yuvarlak alt tüp aktarmak ve 5 mL soğuk Hipotonik arabellekte (EDTA ücretsiz proteaz inhibitörü kokteyl ve PMSF) resuspend.
	<ol><li>Homogenise 15-30 s yuvarlak alt 14 mL tüpler için gevşek dounce (3 dakika içinde 20-30 vuruş) veya mekanik doku homogenizer kullanarak kıyılmış kas dokusu. 
		Not: Lizis verimliliğini tarafından ışık mikroskobu bu aşamada tespit edilebilir ve gerekirse, ek kesinti yapılabilir.</li>
	</ol></li> <li>Homogenate 15 mL tüpler için transfer ve 10 mL soğuk Hipotonik arabellek kullanarak birime doldurun. Sonraki fare ile devam etmeden önce aşağıda açıklandığı gibi homogenate saptamak.</li>
</ol> 3. Fiksasyon <ol><li>formaldehit % 1 son toplama eklemek ve oda sıcaklığında 10 dakika çalkalanır.</li>
	<li>Glisin 0,125 M son bir konsantrasyon fiksasyon ve sallamak için oda sıcaklığında 5-10 dk durdurmak için her tüpün ekleyin.</li>
</ol> 4. Çekirdeklerin hazırlık Not: tüm besteleri arabellek için Tablo 1 ' e bakınız.
<ol><li>Sabit lysate gevşek dounce (5-10 vuruş) kullanarak Homogenise.
	<ol><li>15 mL tüp ve 1000 x g, santrifüj 4 ° C'de 5 min için çekirdek ve hücresel enkaz elde etmek için transfer.</li>
	</ol></li> <li>Süpernatant kaldırmak ve Pelet taze 5 mL Hipotonik arabellekte resuspend. Lysate 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla 50 mL tüp içine filtre. Filtrate 40 µm hücre süzgeç aracılığıyla yeniden filtre.</li>
	<li>Transfer filtrate 15 mL tüp ve santrifüj 1000 x g de 4 ° C'de nükleer Pelet elde etmek için 5 dakika. 
	Not: Bu aşamada çekirdeklerin hemen sonicated veya sıvı azot kuru bir Pelet donmuş ve-80 depolanan yaslama ° C.</li>
</ol> 5. Sonication <ol><li>nükleer Pelet (makine ve dounce homojenizasyon için yaklaşık 50 µL) hacmi değerlendirmek ve sonication tampon 3-4 kez Paketli nükleer birimin kadar resuspend ve bir sonicator kullanarak 4 ° C'de 10-15 dk için solüsyon içeren temizleyicide . 
	Not: Kromatin olabilir (6) aşağıda açıklandığı gibi hemen analiz veya dondurulmuş ve-80 depolanan ° C.</li>
</ol> 6. Kromatin parça boyutu Sonication takip değerlendirirken Not: tüm besteleri arabellek için Tablo 1 ' e bakınız.
<ol><li>İçin de-crosslink, Kromatin 30 µL 1,5 mL tüp içinde alıp 20 µL 5 M NaCl. 500 µL birime tamamlamak ve 65 ° C'de gecede kuluçkaya.
	<ol><li>Ertesi gün, bir tedavi (20 mg/mL stok), 10 µL 2 M Tris pH 6.8 ve 10 µL 0,5 M EDTA 42 ° C. gerçekleştir fenol-kloroform/kloroform ayıklama, 1 h, 1 µL İndinavir K ile gerçekleştirmek ve sodyum acetat 1 hacmi ile DNA çökelti e (3 M) ve 2 cilt % 100 etanol için bir h-80 ° C'de veya gecede -20 ° c</li>
	</ol></li> <li>DNA tarafından Santrifüjü 13.500 x g 15 dk. Decant süpernatant de cips ve Pelet soğuk % 70 etanol ve 5 dk. Decant süpernatant için tekrar santrifüj ile iyice yıkayın ve Pelet kuruması.</li>
	<li>Pelet TE arabellek özgün birimi (30 µL) içinde resuspend. 260 nm/280 nm Absorbans tarafından bir Spektrofotometre DNA konsantrasyon ölçmek. 500-1000 ng DNA ile birlikte ayrı bir % 1.5 özel jel hatlarının bir DNA boyutu merdiven pipette ve Elektroforez Kromatin parçası boyutunu değerlendirmek için gerçekleştirin. 
	Not: Parça boyutu 200-500 baz çifti arasında olmalıdır ve sigara - ya da kötü-parçalanmış için DNA karşılık gelen parçaları yok algılanabilir yüksek molekül ağırlıklı olmalıdır. Gerekirse, Kromatin çözüm (5. adım) daha uzun bir süre için yeniden sonicated olabilir ve en uygun boyutu elde edilir kadar yukarıda açıklandığı gibi yeniden analiz.</li>
</ol> 7. Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) Not: tüm besteleri arabellek için Tablo 1 ' e bakınız.
<ol><li>Blok Protein G sepharose boncuk aliquoting 1 mL etanol içinde % 50 Bulamaç tarafından. Santrifüjü 400 x g 1 min bir benchtop için de tarafından boncuk santrifüj kapasitesi ve TE arabellek santrifüj 400 x g, 1 mL ile yıkayın ve yıkama tekrar Pelet
	<ol>Sonra ikinci Santrifüjü, yeniden askıya alma 1 ml çip seyreltme arabelleği 25 µL BSA (hisse senedi 20 mg/mL) ile ve 20 µL tRNA (hisse senedi 10 mg/mL) Maya <li>. Döndürme (40-60 rpm) 4 tarafından en az 2 kullanılmadan önce s boncuk engellemek ° C.</li>
		<li>Seyreltik 50 µg Kromatin (5. adım), 8-10 kez çip seyreltme tampon kullanarak. Engellenen boncuk Bulamaç 50 µL ekleyin ve 4'te (40-60 rpm) dönen 2s için kuluçkaya ° C. santrifüj 400 x g 4 ° C'de önceden temizlenmiş Kromatin elde edilir ve taze bir tüp transferi de.</li>
	</ol></li> <li>İmmunoprecipitation için birincil antikor (örneğin, 1-2 µg Kromatin 10 µg başına) uygun miktarda ekleyin ve gecede 4 döndürme kuluçkaya ° C. 
	Not: Antikor en uygun miktarda tedarikçi tarafından tavsiye edilebilir veya ampirik olarak optimum zenginleştirme görülmektedir kadar ChIP-qPCR antikor farklı miktarlarda ile gerçekleştirerek belirlenebilir. Ayrıca Protein G sepharose Protein A sepharose alt türü kullanılan antikor bağlı olarak değiştirilebilir.</li>
	<li>Engellenen boncuk ertesi gün eklemek ve döndürme (40-60 rpm) 4 1 h için kuluçkaya ° C. santrifüj 400 x g 20-30 s boncuk cips, süpernatant kaldırmak ve çip başlamak için de yıkar.</li>
	<li>ChIP yıkama: arabellekleri ile aşağıdaki yıkar gerçekleştirmek: bir kez düşük Salt arabellek ile ve sonra iki kez LiCl arabelleği, ile iki kez yüksek Salt arabellek ile ve son olarak iki kez TE arabelleği ile.
	<ol><li>Döndürme (40-60 rpm) 4 ° C'de 10 dakika her yıkama gerçekleştirmek ve boncuk Santrifüjü 400 x g 20-30 s bir tezgah üstü santrifüj içinde de tarafından her yıkama arasında cips.</li>
	</ol></li> <li>Elüsyon için son yıkama kaldırmak ve sallayarak süre 15 dakika oda sıcaklığında (taze hazırlanmış) 250 µL elüsyon arabelleği boncuk resuspend.</li>
	<li>Santrifüj 400 x g ve toplamak yeni bir tüp eluate. Bu adım iki kez ve daha sonra de-crosslink eluate gecede 20 µL NaCl 5 M ve 1 µL RNase A ile gerçekleştirmek (10 mg/mL), İndinavir K ve fenol-kloroform/kloroform NG ile tedavihareket olduğu gibi adım 6.</li>
	<li>TE arabellek 50 µL içinde resuspend ve aliquots ChIP-qPCR için standart protokolleri 15 göre çip kalitesini kontrol etmek için kullanın.</li>
</ol>

<ol><li>Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).</li>
<li>Furey, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+and+beyond%3A+new+and+improved+methodologies+to+detect+and+characterize+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions.</a> Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).</li>
<li>Wade, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+Transcription+Regulatory+Networks+with+ChIP-seq+and+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Mapping Transcription Regulatory Networks with ChIP-seq and RNA-seq.</a> Adv Exp Med Biol. 883, 119-134 (2015).</li>
<li>Alpern, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAF4%2C+a+subunit+of+transcription+factor+II+D%2C+directs+promoter+occupancy+of+nuclear+receptor+HNF4A+during+post-natal+hepatocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">TAF4, a subunit of transcription factor II D, directs promoter occupancy of nuclear receptor HNF4A during post-natal hepatocyte differentiation.</a> Elife. 3, e03613(2014).</li>
<li>Martianov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+occupancy+of+an+extended+repertoire+of+CREM+and+CREB+binding+loci+in+male+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Cell-specific occupancy of an extended repertoire of CREM and CREB binding loci in male germ cells.</a> BMC Genomics. 11, 530(2010).</li>
<li>Achour, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+identity+genes+regulated+by+super-enhancers+are+preferentially+down-regulated+in+the+striatum+of+Huntington%27s+disease+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Neuronal identity genes regulated by super-enhancers are preferentially down-regulated in the striatum of Huntington's disease mice.</a> Hum Mol Genet. 24 (12), 3481-3496 (2015).</li>
<li>Joshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TEAD+transcription+factors+are+required+for+normal+primary+myoblast+differentiation+in+vitro+and+muscle+regeneration+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">TEAD transcription factors are required for normal primary myoblast differentiation in vitro and muscle regeneration in vivo.</a> PLoS Genet. 13 (2), e1006600(2017).</li>
<li>Ohkawa, Y., Mallappa, C., Dacwag-Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOhkawa%2C+Y+%22Myogenesis%3A+Methods+and+protocols%22">Myogenesis: Methods and protocols</a>. DiMario, J. 798, Springer Science+Business Media LLC. 517-531 (2012).</li>
<li>Dimauro, I., Pearson, T., Caporossi, D., Jackson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+protocol+for+the+subcellular+fractionation+of+skeletal+muscle+cells+and+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">A simple protocol for the subcellular fractionation of skeletal muscle cells and tissue.</a> BMC Res Notes. 5, 513(2012).</li>
<li>Thomas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAK1+and+CtBP1+Regulate+the+Coupling+of+Neuronal+Activity+to+Muscle+Chromatin+and+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">PAK1 and CtBP1 Regulate the Coupling of Neuronal Activity to Muscle Chromatin and Gene Expression.</a> Mol Cell Biol. 35 (24), 4110-4120 (2015).</li>
<li>Kuo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+glucocorticoid+receptor-binding+sites+in+myotubes+identifies+gene+networks+modulating+insulin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of glucocorticoid receptor-binding sites in myotubes identifies gene networks modulating insulin signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (28), 11160-11165 (2012).</li>
<li>Whyte, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Master+transcription+factors+and+mediator+establish+super-enhancers+at+key+cell+identity+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes.</a> Cell. 153 (2), 307-319 (2013).</li>
<li>Benhaddou, A., Keime, C., Ye, T., Morlon, A., Michel, I., Jost, B., Mengus, G., Davidson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+TEAD4+regulates+expression+of+myogenin+and+the+unfolded+protein+response+genes+during+C2C12+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Transcription factor TEAD4 regulates expression of myogenin and the unfolded protein response genes during C2C12 cell differentiation.</a> Cell Death and Differentiation. 19 (2), 220-231 (2011).</li>
<li>Cowling, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+dynamin+2+expression+rescues+X-linked+centronuclear+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Reducing dynamin 2 expression rescues X-linked centronuclear myopathy.</a> J Clin Invest. 124 (3), 1350-1363 (2014).</li>
<li>Thermo Fisher Scientific. ChIP Analysis. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html">https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html</a> (2017).</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Burada Kromatin yetişkin fare iskelet kasları ve gösteri bu Kromatin transkripsiyon faktörü bağlama ve kovalent Histon değişiklikler kas lif çekirdeği tespit çip deneyleri için uygun hazırlanması için yeni bir protokol açıklayın. Bu iletişim kuralı birkaç kritik adımları içerir. İlk dounce veya mekanik kesme tarafından gerçekleştirilen doku bozulma 's. Mekanik Kesme daha hızlı ve daha tekrarlanabilir ve bu nedenle yönteminin seçimi. Hiçbir uygun cihazı varsa, yine de, bozulma da douncing, nereye mikroskop altında lizis e...

Kromatin immunoprecipitation (ChIP) kantitatif Polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) birleştiğinde ve yüksek işlem hacmi sıralama (ChIP-seq) transkripsiyon çalışmaya seçim yöntemleri ve epigenetik gen ekspresyonu çeşitli dokularda düzenlenmesi olmuştur ve hücre-tip1. Bu teknik genom çapında kovalent Kromatin değişiklikler, Histon varyant doluluk ve transkripsiyon faktörü bağlama2,3profil oluşturma sağlar.
ChIP kültürlü hücrelerden performans iyi kurulmuş olmakla birlikte, küçük parça--dan memeli dokulara daha zor kalır. Kromatin küçük parça için hazırlanıyor her doku ve hücre türü için optimize edilmiş olması gereken birkaç kritik adımları içerir. Kromatin kültürlü hücre hücresel lysates veya kendi çekirdek aşağıdaki arıtma hazırlanabilir. Memeli dokular söz konusu olduğunda, verimli lizis, formaldehit fiksasyon ve çekirdekleri arıtma Kromatin en iyi kurtarma sağlamak için önemlidir. Ayrıca, deneysel olarak belirlenecek önce veya sonra kendi arıtma çekirdeklerin düzeltmek seçeneği vardır. Bu engellerin rağmen çip başarıyla karaciğer, testis veya beyin4,5,6gibi dokularda üzerinden yapıldı. İskelet kası durumunda bozulma dokusunun yapısal proteinlerin yüksek bir içerik ve izolasyon-in onun çekirdeği sergileyen böyle bir fiziksel olarak dayanıklı, özellikle zorlu 's. Bu özgüllüğü göz önüne alındığında, diğer dokular için en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralları tatmin edici sonuçlar iskelet kasları için vermeyin.
Burada ChIP-grade Kromatin fiziksel olarak doku, formaldehit fiksasyon ve çekirdekleri ve sonication yalıtım engellemeden içerir fare iskelet kas dokusundan izole etmek için bir protokol açıklayın. Kromatin bu dokudan küçük parça için uygun hazırlamak için bu yöntem verimliliğini çeşitli transkripsiyon faktörleri, RNA polimeraz II ve kovalent Histon değişiklikler7için ChIP-qPCR ve ChIP-seq gerçekleştirerek gösterilmiştir.
Bu yeni teknik uzun collagenase sindirim adımları hangi zaman, genomik transkripsiyon faktörleri lokalizasyonu değişimler sırasında oluşan bir daha önce raporlanmış protokolü8 ' den çok daha hızlı ve değişiklikler gen ifadesinin içinde yer alabilir. Hangi ile çekirdekleri izole ve sabit hız burada açıklanan yöntemi daha sadakatle yerli genomik doluluk durumu yakalar Kromatin hazırlamak özellikle cazip kılıyor. Ayrıca, Kromatin yalıtım veya protein kas dokusunun çıkarılması için diğer yöntemleri olmasına rağmen açıklanan8,9,10 edilmiş ve seçili genler, hiçbir çip seq üzerinde ChIP-qPCR deneyler için kullanılan veri bunları kullanarak rapor edildi. Rapor burada yöntem transkripsiyon faktörü ve Histon değişikliği için ChIP-seq uygundur ve bu nedenle de 3/4 C veya hıc Kromatin conformation yakalama uygulamaları için uygun olmalıdır.

<table><tbody><tr><td>T 25 dijital ULTRA-TURRAX</td><td>T 18 ULTRA-TURRAX</td><td>0009022800</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE SARL</td><td>P7626-25G</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz İnhibitörü Kokteyl-EDTA İçermeyen</td><td>Roche Teşhis</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Protein G Sefaroz boncuk</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>P-3296</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>P-2308</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Süzgeçleri 70um</td><td>Corning BV</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Süzgeçleri 40um</td><td>Corning BV</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit EM sınıfı</td><td>Euromedex</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Fischer Bilimsel</td><td>12091039</td><td></td></tr><tr><td>Fenol: Kloroform: İzoamil Alkol 25: 24: 1</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>P3803</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>B4287-25G</td><td></td></tr><tr><td>maya tRNA</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>R5636</td><td></td></tr><tr><td>Glikojen Mavi</td><td>AMIBION</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Pol II ChIP Antikoru</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9001</td><td></td></tr><tr><td>H3K27ac ChIP Antikoru</td><td>Aktif Motif</td><td>39133</td><td></td></tr><tr><td>Tead4 ChIP Antikoru</td><td>Aviva Sistemleri Biyoloji</td><td>(ARP38276_P050)</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>I-3021</td><td></td></tr><tr><td>E220 Odaklanmış Ultrasonikatör</td><td>Covaris E220</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Ek öğeler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Makas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gevşek Dounce</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml ve 50 ml şahin tüpleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>14 ml yuvarlak tabanlı tüpler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml ve 2 ml Eppendorf tüpleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m ve 40 &mu; m hücreli süzgeçler (Corning)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kromatin immunoprecipitation üzerinden fare kas iskelet için geliştirilmiş iletişim kuralı

Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

Biz Kromatin yetişkin fare iskelet kası, yapısal proteinler yüksek bir içerik ile fiziksel olarak dayanıklı bir doku üzerinden hazırlanması için verimli ve tekrarlanabilir bir protokol tanımlamak. Disseke bacak kasları yetişkin fareler üzerinden fiziksel olarak mekanik homojenizasyon veya kıyma ve douncing, önce formaldehit fiksasyon lysate hücrenin Hipotonik arabellekte bir arada tarafından bozulur. Sabit çekirdek mekanik homojenizasyon veya douncing ve hücre artıkları kaldırmak için sıralı filtrations daha fazla döngüleri tarafından saf. Arıtılmış çekirdeklerin hemen veya daha sonraki bir aşamada donma sonra sonicated. Kromatin verimli bir şekilde sonicated ve transkripsiyon faktörleri, RNA polimeraz II ve kovalent Histon değişiklikler için uygun Kromatin immunoprecipitation deneyleri için profilleri tarafından gösterildiği gibi elde edilir. Bu iletişim kuralı tarafından hazırlanan Kromatin kullanarak tespit bağlama olayları ağırlıklı olarak kas lif çekirdeği Kromatin fiber ilişkili diğer uydu ve endotel hücreleri varlığı rağmen meydana bunlar. Bu iletişim kuralı bu nedenle yetişkin fare iskelet kas gen düzenlemesi çalışmaya adapte.

Çekirdeklerin izole etmek için biz disseke ve kıyılmış kas dokusunun mekanik homojenizasyon 18.000 ve 22.000 RPM ( Tablo malzemelerigörmek) 15 veya 45 s için gerçekleştirilen. Her koşulda, çekirdeği doku enkazı ayrılmış ama verimi düşük hız (şekil 1A-B) kullanarak en uygun olan. Çekirdek de hazırlıklı douncing tarafından 3-5 dk (şekil 1Ave veri gösterilmez) ama mekanik homojenizasyon olduğunu yön...

Kromatin yetişkin fare iskelet kas kas lifleri gen düzenlemesi çalışmanın Kromatin immunoprecipitation tarafından uyarlanmış üzerinden hazırlanması için yeni bir protokol sunulmuştur.

Kromatin Immunoprecipitation üzerinden fare kas iskelet için geliştirilmiş iletişim kuralı

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

Bu prosedürün genel amacı, yetişkin fare iskelet kasından kromatin hazırlamaktır. Bu yöntem, gen regülasyonu ve iskelet kası lifleri ile ilgili temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, fare iskelet kasından ChIP dereceli kromatinin hazırlanmasına izin vermesidir.Yüksek miktarda yapısal protein içeren fiziksel olarak dirençli bir doku. Bu yöntem fikrine ilk olarak, fare iskelet kası liflerindeki gluko-eklemli reseptör, DNA bağlanma bölgelerinin tanımlanmasını gerektiren gluko-eklemli kullanım kas atrofisinin altında yatan moleküler mekanizmaları karakterize etmeye çalışırken sahip olduk. Prosedürü gösteren, laboratuvarımızdan bir doktora sonrası olan Shilpy Joshi olacak.Bu işleme başlamak için donmuş veya yeni kesilmiş arka bacak kaslarını kurtarın. Daha sonra, ince makas kullanarak küçük parçaların homojen bir şekilde hazırlanmasına kadar bir mililitre buz gibi soğuk hipotonik tampon içeren iki mililitrelik bir test tüpünde kasları kıyın. Daha sonra, tüpü beş ila 10 dakika boyunca dört santigrat derecede bir tezgah üstü karıştırıcı üzerinde sallayarak bırakın.Daha sonra, diseke edilen dokuyu dört mililitre soğuk hipotonik tampon içeren 14 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın. Kıyılmış dokuyu 15 ila 30 saniye boyunca mekanik bir doku homojenizatörü kullanarak homojenize edin. Daha sonra homojenatı 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.10 mililitre numune elde etmek için soğuk hipotonik tampon ekleyin ve bir sonraki fareye devam etmeden önce homojenatı sabitleyin. Bu prosedürde, %1 nihai konsantrasyon elde etmek için numuneye formaldehit ekleyin. Ve sonra oda sıcaklığında 10 dakika çalkalayın.Daha sonra, fiksasyonu durdurmak için her tüpte 0.125 molar'lık bir nihai konsantrasyonla sonuçlanacak şekilde glisin ekleyin. Ve oda sıcaklığında beş ila 10 dakika çalkalayın. Bundan sonra, gevşek bir dounce kullanarak sabit lizatı homojenize edin.Daha sonra, 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve çekirdek ve hücresel kalıntılar elde etmek için dört santigrat derecede beş dakika boyunca 1000 g'da santrifüjleyin. Beş dakika sonra, süpernatanı çıkarın ve peleti beş mililitre taze hipotonik tampon içinde yeniden süspanse edin. Lizatı 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik bir tüpe süzün.Bir pipet ucu kullanarak, filtreyi bir mililitre soğuk hipotonik tamponla yıkayın. Bunu takiben, süzüntüyü 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirin. Daha sonra, süzüntüyü 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.Ve nükleer peleti elde etmek için dört santigrat derecede beş dakika boyunca 1000 g'da santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra, üç peleti bir araya getirmek için bir mililitre hipotonik tampon kullanın ve 1.5 ila iki mililitrelik bir tüpe aktarın. Beş dakika boyunca 1000 g'da santrifüjleyin.Daha sonra, bilinen bir hacimde sıvı içeren tüplerle karşılaştırıldığında nükleer peletin hacmini değerlendirin ve paketlenmiş nükleer hacmin üç ila dört katına kadar sonikasyon tamponunda yeniden askıya alın. Daha sonra, bir sonikatör kullanarak süspansiyonu dört santigrat derecede 10 ila 15 dakika boyunca sonikleştirin. Sonikasyonlu numuneyi santrifüjleyin ve kromatin süpernatantını 1.5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın.Çapraz bağlamayı çözmek için, 1,5 mililitrelik bir test tüpüne 30 mikrolitre kromatin alın ve 20 mikrolitre beş molar sodyum klorür ve 450 mikrolitre su ekleyin. Hacmi 500 mikrolitreye tamamlayın ve gece boyunca 65 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, bir mikrolitre Proteinaz K, pH 6.8'de 10 mikrolitre iki molar tris ve 42 santigrat derecede bir saat boyunca 10 mikrolitre 0.5 molar EDTA ile bir tedavi uygulayın.Ardından, düzenli bir fenol-kloroform kloroform ekstraksiyonu gerçekleştirin ve DNA'yı bir hacim sodyum asetat ve iki hacim %100 etanol ile eksi 80 santigrat derecede bir saat veya gece boyunca eksi 20 santigrat derecede çökeltin. Daha sonra, DNA'yı 15 dakika boyunca 13.500 g'da santrifüjleme ile peletleyin. Süpernatanı boşaltın ve peleti soğuk %70 etanol ile iyice yıkayın ve tekrar beş dakika santrifüjleyin.Ardından süpernatanı boşaltın ve peleti havayla kurutun. Bundan sonra, peleti orijinal tris HCl EDTA tamponu hacminde yeniden askıya alın. Bir spektrofotometredeki DNA konsantrasyonunu 260 nanometre, 280 nanometredeki emicilerle ölçün.Daha sonra, 500 ila 1000 nanogram DNA'yı,% 1.5'lik bir agaroz jelin ayrı şeritlerinde DNA büyüklüğünde bir merdivenle birlikte pipetleyin. Ve kromatinin parça boyutunu değerlendirmek için elektroforez yapın. Optimize etmek için homojenizasyon, 18.000 ve 22.000 RPM olmak üzere iki hızda 15 saniye veya 45 saniye boyunca gerçekleştirildi.Her koşulda, çekirdekler doku kalıntılarından ayrılabilirdi, ancak verim daha düşük hız kullanılarak optimaldi. Çekirdekler ayrıca üç ila beş dakika boyunca sıçrayarak da hazırlanabilir. Ancak mekanik homojenizasyon, optimum çekirdek veriminin 15 saniye gibi kısa bir sürede elde edilebilmesi ve özellikle birden fazla numunenin işlenmesi gerektiğinde önemli bir zaman kazancı sağlaması nedeniyle tercih edilen yöntemdir.Bu protokolü kullanarak, 100 mikrogram kromatin üretmek için 500 miligram dokudan 10 ila yedi çekirdek 2.7 kata kadar izole edilebilir. Bu şekilde hazırlanan kromatin, ChIP dizileme deneylerinde temiz, yüksek kaliteli sonuçlar verir. Kas eksprese edilen Desmond lokusunda yüksek asetillenmiş K27 histon H3 ve RNA polimeraz 2 seviyeleri ile gösterildiği gibi.Kas lifi için özgüllük, kasta eksprese edilmeyen Pecam1 ve Vcam1 lokuslarında düşük veya eksik sinyal ile gösterilir. Bu prosedürü denerken, köpürmeyi önlemek, numuneler arasında probu temizlemek ve kromatin parçalanmasını optimize etmek için homojenizatör probunu numuneye uygun şekilde daldırmak önemlidir. Bu şekilde hazırlanan kromatin, genom çapında transkripsiyon faktörü doluluğunu haritalamak için ChIP'nin uğruna başarıyla kullanılmıştır ve ayrıca kromatin doğrulama yakalama teknikleri için de uygun olmalıdır.Geliştirildikten sonra, bu teknik, farelerden iskelet kasındaki gen regülasyonunu keşfetmek için genomik alanındaki araştırmaların yolunu açtı. Prosedür ayrıca sıçan kaslarına ve insan hastalardan alınan biyopsilere de uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, mekanik homojenizasyonun nasıl kullanılacağını iyi anlamanız ve ardından immünopresipitasyon için iskelet kasından kromatin hazırlamak için formaldehitle sabitlenmiş çekirdeklerin saflaştırılması gerekir.Formaldehit, fenol, kloroform ve Proteinaz K ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın. Eldiven ve gözlük takılması gibi önlemler alınmalıdır. Bu reaktifleri içeren adımlar bir başlık altında gerçekleştirilmelidir.

improved-protocol-for-chromatin-immunoprecipitation-from-mouse

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Biz fare embriyonik doku doku-spesifik gen ekspresyonu başlangıcı sırasında veya sonrasında doku spesifik genlerin faktör etkileşimleri belirlemek için yöntem bir kromatin immunoprecipitation (ChIP) göstermektedir. Bu protokol, normal embriyonik gelişim sırasında ortaya çıkan doku-spesifik gen aktivasyon çalışması için yaygın olarak uygulanabilir olmalıdır.

Erken evre Fare Embriyolar kullanarak Doku özel Genler Kromatin Immunoprecipitation Testi

Biz primer T hücreleri kullanarak kromatin immunoprecipitation için bir sağlam bir yöntem tarif. Metodu standart yaklaşımlar üzerine kurulmuştur, ama hücrelerin sınırlı bir miktarda için verimliliği artırmak koşulları ve reaktifler belirli bir kümesi kullanır edilir. Önemli olarak, veriler analiz aşaması bölgesinin, bir ayrıntılı bir açıklama sunulmaktadır edilir.

Biyokütle Limit Tutarlar kullanarak Verimli Kromatin Immunoprecipitation

Bu çalışma olgun bir fare T-hücresi hattı kullanarak kromatin immüno çökeltme (ChIP) için bir protokolü açıklamaktadır. Bu protokol, spesifik histon marklarının belirli promotör alanlarında veya genom çapında dağılımını araştırmak için uygundur.

Fare T-hücresi Hatlarında Kromatin İmmünopresipitasyonu (ChIP)

Çapraz bağlantılı fare iskelet kasında yüksek kaliteli çekirdekleri izole etmek için filtrasyon tabanlı bir protokol sunuyoruz ki, ultra-santrifüj ihtiyacını ortadan kaldırdık ve kolay uygulanabilir hale getirdik. Çekirdeklerden hazırlanan kromatin, kromatin immünopresipitasyonu ve muhtemelen kromatin immünopresipitasyon sıralama çalışmaları için uygun olduğunu göstermektedir.

Kromatin İmmunopresipitasyon için Çapraz Bağlı İskelet Kasında Yüksek Kaliteli Nükleerlerin Hazırlanması İçin Filtrasyona Dayalı Bir Yöntem

Biz yalıtmak ve nöral progenitör hücreler embriyonik ve postnatal beyin dokusundan Kromatin immunoprecipitation (ChIP) Histon 3 lizin 79 dimethylation (H3K79me2) - içinde yer alan bir Histon işareti için kültür için etkili ve tekrarlanabilir bir yöntem mevcut Histon 3 küresel etki alanı.

Yalıtım ve sinirsel ataları Kromatin-Immunoprecipitation Histon 3 lizin 79 Dimethylation Mark tarafından takip tarımı

Burada, tomurcuklanma Maya Saccharomyces cerevisiaeüzerinden değiştirilmiş Histon Kromatin immunoprecipitation için bir protokol açıklayın. Immunoprecipitated DNA kantitatif PCR için daha sonra bereket ve Histon translasyonel modifikasyonlar genom boyunca yerelleştirilmesini sorguya eskiden.

Histon değişiklikler Saccharomyces cerevisiae üzerinden Kromatin Immunoprecipitation (ChIP)

Burada verimli kromatin immunoprecipitation (ChIP) için bir protokol yüksek üretilen iş DNA sıralama (ChIP-seq) kahverengi yağ dokusundan izole bir fare (BAT), ardından açıklayın. Bu iletişim kuralı, hem histon değişiklikler eşleme ve genom çapında yerelleştirme sigara histon proteinleri ilgi içinde vivo, soruşturma için uygundur.

Kromatin Immunoprecipitation fare kahverengi yağ dokusunun

Chromatin immünoprecipitation (ChIP) gen yönetmeliğinin moleküler mekanizmalarını anlamak için güçlü bir araçtır. Ancak, yöntem mekanik kesme tarafından tekrarlanabilir kromatin parçalanma elde zorlukları içerir. Burada, enzimatik sindirim kullanarak bir çip tahlil için geliştirilmiş bir protokol sağlar.

Mammalin hücrelerinde Micrococcal Nüklenleri kullanarak kromatin Immünopmamitasyon tahlil

Bu protokol, dondurulmuş dokulardan kromatin preparatına odaklanır ve Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) ve ardından kantitatif PCR analizi (X-ChIP-qPCR) veya yeni nesil dizileme yaklaşımları (X-ChIP-seq) için uygundur.

Kromatin İmmünopresipitasyon Analizi için Dondurulmuş Kimerik Karaciğer Dokusundan Kromatin Ekstraksiyonu

Burada sunulan, fare uzuv kas uydu hücrelerinin floresanla aktive edilen hücre sıralama (FACS) izolasyonu için, hedeflerin altında bölünme ve nükleaz (CUT &amp;RUN) kullanılarak salım yoluyla kas liflerinde transkripsiyon regülasyonu çalışmasına uyarlanmış etkili bir protokoldür.

FACS ile İzole Edilmiş Fare Uydu Hücrelerinin CUT&amp;RUN Analizi için Etkili Bir Protokol

Epigenetik alanda yeni olan araştırmacılar, CUT &amp; Tag'i ChIP tahlillerine göre önemli ölçüde daha kolay bir alternatif bulacaklar. CUT &amp; Tag, nadir ve birincil hücre popülasyonları üzerindeki epigenetik çalışmalardan büyük ölçüde yararlandı ve çok az hücreden yüksek kaliteli veriler üretti. Bu protokol, fare arka bacak kaslarından izole edilen fare miyoblastları üzerinde H3K4me1 CUT &amp; Tag testlerinin gerçekleştirilmesini açıklar.

Fare Miyoblast Araştırmalarında Hedefler Altında Bölünme ve Etiketleme (CUT &#38; Tag) Testinin Kullanılması

Öğrenin, fare iskelet kasından ChIP-grade kromatin hazırlama yöntemini. Bu protokol, kas liflerinde gen regülasyonunu ve kas atrofisi mekanizmalarını araştırmak için güvenilir bir araç sunar.

Kromatin Immunoprecipitation üzerinden fare kas iskelet için geliştirilmiş iletişim kuralı

Daha fazla video keşfet