Kromatin Immunoprecipitation üzerinden fare kas iskelet için geliştirilmiş iletişim kuralı
6 Kasım 2017
Kromatin yetişkin fare iskelet kas kas lifleri gen düzenlemesi çalışmanın Kromatin immunoprecipitation tarafından uyarlanmış üzerinden hazırlanması için yeni bir protokol sunulmuştur.
Bu prosedürün genel amacı, yetişkin fare iskelet kasından kromatin hazırlamaktır. Bu yöntem, gen regülasyonu ve iskelet kası lifleri ile ilgili temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, fare iskelet kasından ChIP dereceli kromatinin hazırlanmasına izin vermesidir.
Yüksek miktarda yapısal protein içeren fiziksel olarak dirençli bir doku. Bu yöntem fikrine ilk olarak, fare iskelet kası liflerindeki gluko-eklemli reseptör, DNA bağlanma bölgelerinin tanımlanmasını gerektiren gluko-eklemli kullanım kas atrofisinin altında yatan moleküler mekanizmaları karakterize etmeye çalışırken sahip olduk. Prosedürü gösteren, laboratuvarımızdan bir doktora sonrası olan Shilpy Joshi olacak.
Bu işleme başlamak için donmuş veya yeni kesilmiş arka bacak kaslarını kurtarın. Daha sonra, ince makas kullanarak küçük parçaların homojen bir şekilde hazırlanmasına kadar bir mililitre buz gibi soğuk hipotonik tampon içeren iki mililitrelik bir test tüpünde kasları kıyın. Daha sonra, tüpü beş ila 10 dakika boyunca dört santigrat derecede bir tezgah üstü karıştırıcı üzerinde sallayarak bırakın.
Daha sonra, diseke edilen dokuyu dört mililitre soğuk hipotonik tampon içeren 14 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın. Kıyılmış dokuyu 15 ila 30 saniye boyunca mekanik bir doku homojenizatörü kullanarak homojenize edin. Daha sonra homojenatı 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.
10 mililitre numune elde etmek için soğuk hipotonik tampon ekleyin ve bir sonraki fareye devam etmeden önce homojenatı sabitleyin. Bu prosedürde, %1 nihai konsantrasyon elde etmek için numuneye formaldehit ekleyin. Ve sonra oda sıcaklığında 10 dakika çalkalayın.
Daha sonra, fiksasyonu durdurmak için her tüpte 0.125 molar'lık bir nihai konsantrasyonla sonuçlanacak şekilde glisin ekleyin. Ve oda sıcaklığında beş ila 10 dakika çalkalayın. Bundan sonra, gevşek bir dounce kullanarak sabit lizatı homojenize edin.
Daha sonra, 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve çekirdek ve hücresel kalıntılar elde etmek için dört santigrat derecede beş dakika boyunca 1000 g'da santrifüjleyin. Beş dakika sonra, süpernatanı çıkarın ve peleti beş mililitre taze hipotonik tampon içinde yeniden süspanse edin. Lizatı 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik bir tüpe süzün
.Bir pipet ucu kullanarak, filtreyi bir mililitre soğuk hipotonik tamponla yıkayın. Bunu takiben, süzüntüyü 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirin. Daha sonra, süzüntüyü 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.
Ve nükleer peleti elde etmek için dört santigrat derecede beş dakika boyunca 1000 g'da santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra, üç peleti bir araya getirmek için bir mililitre hipotonik tampon kullanın ve 1.5 ila iki mililitrelik bir tüpe aktarın. Beş dakika boyunca 1000 g'da santrifüjleyin.
Daha sonra, bilinen bir hacimde sıvı içeren tüplerle karşılaştırıldığında nükleer peletin hacmini değerlendirin ve paketlenmiş nükleer hacmin üç ila dört katına kadar sonikasyon tamponunda yeniden askıya alın. Daha sonra, bir sonikatör kullanarak süspansiyonu dört santigrat derecede 10 ila 15 dakika boyunca sonikleştirin. Sonikasyonlu numuneyi santrifüjleyin ve kromatin süpernatantını 1.5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın.
Çapraz bağlamayı çözmek için, 1,5 mililitrelik bir test tüpüne 30 mikrolitre kromatin alın ve 20 mikrolitre beş molar sodyum klorür ve 450 mikrolitre su ekleyin. Hacmi 500 mikrolitreye tamamlayın ve gece boyunca 65 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, bir mikrolitre Proteinaz K, pH 6.8'de 10 mikrolitre iki molar tris ve 42 santigrat derecede bir saat boyunca 10 mikrolitre 0.5 molar EDTA ile bir tedavi uygulayın.
Ardından, düzenli bir fenol-kloroform kloroform ekstraksiyonu gerçekleştirin ve DNA'yı bir hacim sodyum asetat ve iki hacim %100 etanol ile eksi 80 santigrat derecede bir saat veya gece boyunca eksi 20 santigrat derecede çökeltin. Daha sonra, DNA'yı 15 dakika boyunca 13.500 g'da santrifüjleme ile peletleyin. Süpernatanı boşaltın ve peleti soğuk %70 etanol ile iyice yıkayın ve tekrar beş dakika santrifüjleyin.
Ardından süpernatanı boşaltın ve peleti havayla kurutun. Bundan sonra, peleti orijinal tris HCl EDTA tamponu hacminde yeniden askıya alın. Bir spektrofotometredeki DNA konsantrasyonunu 260 nanometre, 280 nanometredeki emicilerle ölçün.
Daha sonra, 500 ila 1000 nanogram DNA'yı,% 1.5'lik bir agaroz jelin ayrı şeritlerinde DNA büyüklüğünde bir merdivenle birlikte pipetleyin. Ve kromatinin parça boyutunu değerlendirmek için elektroforez yapın. Optimize etmek için homojenizasyon, 18.000 ve 22.000 RPM olmak üzere iki hızda 15 saniye veya 45 saniye boyunca gerçekleştirildi.
Her koşulda, çekirdekler doku kalıntılarından ayrılabilirdi, ancak verim daha düşük hız kullanılarak optimaldi. Çekirdekler ayrıca üç ila beş dakika boyunca sıçrayarak da hazırlanabilir. Ancak mekanik homojenizasyon, optimum çekirdek veriminin 15 saniye gibi kısa bir sürede elde edilebilmesi ve özellikle birden fazla numunenin işlenmesi gerektiğinde önemli bir zaman kazancı sağlaması nedeniyle tercih edilen yöntemdir.
Bu protokolü kullanarak, 100 mikrogram kromatin üretmek için 500 miligram dokudan 10 ila yedi çekirdek 2.7 kata kadar izole edilebilir. Bu şekilde hazırlanan kromatin, ChIP dizileme deneylerinde temiz, yüksek kaliteli sonuçlar verir. Kas eksprese edilen Desmond lokusunda yüksek asetillenmiş K27 histon H3 ve RNA polimeraz 2 seviyeleri ile gösterildiği gibi.
Kas lifi için özgüllük, kasta eksprese edilmeyen Pecam1 ve Vcam1 lokuslarında düşük veya eksik sinyal ile gösterilir. Bu prosedürü denerken, köpürmeyi önlemek, numuneler arasında probu temizlemek ve kromatin parçalanmasını optimize etmek için homojenizatör probunu numuneye uygun şekilde daldırmak önemlidir. Bu şekilde hazırlanan kromatin, genom çapında transkripsiyon faktörü doluluğunu haritalamak için ChIP'nin uğruna başarıyla kullanılmıştır ve ayrıca kromatin doğrulama yakalama teknikleri için de uygun olmalıdır.
Geliştirildikten sonra, bu teknik, farelerden iskelet kasındaki gen regülasyonunu keşfetmek için genomik alanındaki araştırmaların yolunu açtı. Prosedür ayrıca sıçan kaslarına ve insan hastalardan alınan biyopsilere de uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, mekanik homojenizasyonun nasıl kullanılacağını iyi anlamanız ve ardından immünopresipitasyon için iskelet kasından kromatin hazırlamak için formaldehitle sabitlenmiş çekirdeklerin saflaştırılması gerekir.
Formaldehit, fenol, kloroform ve Proteinaz K ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın. Eldiven ve gözlük takılması gibi önlemler alınmalıdır. Bu reaktifleri içeren adımlar bir başlık altında gerçekleştirilmelidir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, kromatina yetişkin fare iskelet kası hücrelerinden hazırlamak için yeni bir protokol sunmaktadır; bu yöntem, kromatina immünopresipitasyonu (ChIP) kullanarak kas liflerindeki gen düzenlemesinin incelenmesi için özel olarak uyarlanmıştır. Yöntem, iskelet kası dokusunun fiziksel direnci ve yapısal protein içeriğinin yarattığı zorlukları ele almaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Gen düzenlemesi
- Kromatina immünopresipitasyonu
- İskelet kası biyolojisi
Arka Plan
- Kromatina hazırlığı, gen düzenlemesinin incelenmesi için çok önemlidir.
- Fare iskelet kası, yüksek yapısal protein içeriğine sahip karmaşık bir dokudur.
- Kas atrofisindeki moleküler mekanizmaların anlaşılması, terapötik stratejiler için gereklidir.
- DNA bağlanma bölgelerinin tanımlanması, gen düzenlemesinin karakterizasyonu için gereklidir.
Çalışmanın Amacı
- Fare iskelet kasından ChIP sınıfı kromatina hazırlamak için güvenilir bir yöntem geliştirmek.
- Kas liflerinde gen düzenlemesinin incelenmesini kolaylaştırmak.
- Kas atrofisinin altında yatan moleküler mekanizmaları araştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Yetişkin fare iskelet kasından kromatina hazırlama.
- Kromatina immünopresipitasyon tekniklerinin uygulanması.
- Gluko-artiküle edilmiş reseptörlerin ve DNA bağlanma bölgelerinin karakterizasyonu.
- Yöntemin bir post-doc araştırmacı tarafından gösterilmesi.
Ana Sonuçlar
- Fiziksel olarak dirençli iskelet kası dokusundan ChIP sınıfı kromatina başarılı bir şekilde hazırlanması.
- Kas gen düzenlemesi ile ilgili önemli DNA bağlanma bölgelerinin tanımlanması.
- Kas atrofisinin moleküler mekanizmalarına ilişkin bilgiler.
- Yöntemin gelecekteki araştırmalar için etkinliğinin doğrulanması.
Sonuçlar
- Geliştirilen protokol, iskelet kasta gen düzenlemesinin incelenmesini geliştirmektedir.
- Kas biyolojisi araştırmalarını yürüten araştırmacılar için değerli bir araç sunmaktadır.
- Gelecekteki uygulamalar, kas atrofisi ve ilgili durumların daha iyi anlaşılmasına yol açabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Preparing high-quality chromatin from physically resistant tissues like skeletal muscle remains a bottleneck in epigenetic target validation. This protocol enables reproducible isolation of nuclei and sonication of chromatin suitable for immunoprecipitation, supporting mechanistic de-risking of transcription factor and histone modifier targets in muscle-related disease models. By providing a scalable, standardized approach to ChIP-grade chromatin preparation, it enhances predictive confidence in early discovery workflows focused on skeletal muscle pathophysiology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional regulation in skeletal muscle fibers to validate targets involved in atrophy and metabolic pathways.
- Operational Value: Delivers consistent chromatin yields from resistant tissue, reducing variability in target engagement assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces ChIP-ready chromatin for high-throughput screening of compounds affecting epigenetic regulators in muscle.
- Operational Value: Standardized nuclei purification and sonication steps support assay reproducibility across laboratories.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates biomarker alignment by mapping histone modifications and transcription factor occupancy in disease-relevant muscle models.
- Operational Value: Enables longitudinal chromatin analysis from frozen tissue, supporting preclinical continuity and target validation across study phases.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum by enabling chromatin preparation for target validation, followed by immunoprecipitation and sequencing to inform lead identification and preclinical assessment of epigenetic modulators in skeletal muscle.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of gene regulatory mechanisms in muscle atrophy and metabolic disease models.
- Screening: Provides standardized chromatin substrate for evaluating compound effects on epigenetic targets.
- Analytics: Generates quantitative ChIP-seq readouts for comparing target binding across conditions.
- Translational Research: Connects discovery-stage epigenetic findings to preclinical validation through consistent chromatin preparation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable nuclei isolation and chromatin preparation platform for skeletal muscle epigenetics programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves target validation confidence by reducing noise from non-muscle cell chromatin in skeletal muscle samples.
- Operational Value: Increases throughput through rapid mechanical homogenization, enabling processing of multiple samples in short timeframes.
- Strategic Value: Supports go/no-go decisions in epigenetic target programs by providing reliable muscle-specific chromatin data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on reproducible epigenetic profiling in disease-relevant tissue.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue homogenization, nuclei isolation, and chromatin handling to avoid degradation.
- Depends on access to sonication equipment optimized for chromatin fragmentation without overheating.
- Necessitates standardized buffer conditions and filtration steps to ensure reproducibility across users and sites.
- Must account for tissue-specific variables such as fiber type and injury status when applying the protocol to disease models.
- Practical limitations include the need for careful optimization of sonication time and temperature to achieve optimal fragment size.
