Ozmotik stres etkisi salgı veziküller ve ekzositozu izleme

Bu birleşik analitik metodolojinin genel amacı, hücrelerdeki salgı veziküllerinin hücre dışı ozmotik basınç gibi fiziksel bir kuvvete nasıl tepki verdiği ve bu organellerin ayarlanmasının ekzositoz sürecini nasıl daha fazla etkilediği hakkında bilgi sağlamaktır. Bu yöntem, nörobilim alanındaki şu gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir: Salgı vezikülleri hücre dışı ortamdaki değişikliklere veya ilaç tedavisine doğrudan nasıl yanıt verir? Bu yaklaşımın temel avantajı, canlı hücrelerdeki veziküler içerik üzerindeki doğrudan etkileri izlemek ve ekzositoz tedavi edilmeden önce ve sonra reh-kimyasal salınımlarındaki değişiklikleri ayırt etmeyi bilmektir.

Düz bir disk elektrot yüzeyi elde etmek için, elektrodu bir mikro öğütücünün tutucusuna yerleştirin ve her bir karbon fiber elektrotu 45 derecelik bir açıyla eğimlendirin. Daha sonra, elektrotu ekzositoz ölçümü için hücrelerin yakınına yerleştirirken disk elektrot yüzeyinin 45 derecelik bir açıyla nasıl yerleştirileceğine dair ileride başvurmak üzere kılcal damarı işaretleyin. Tek hücrelerde amperometrik kayıt yapmak için, yeni eğimli ve test edilmiş karbon fiber disk mikroelektrodunu, bir potansiyostat ile kullanılan kafa aşamasının elektrot tutucusuna monte edin.

Kullanmadan önce, döngüsel voltametri kullanarak çalışma durumu akımını izlemek için her bir karbon fiber mikroelektrodu bir test çözeltisine yerleştirin. Döngüsel bir voltametri taraması için, iyi bir reaksiyon kinetiği sağlamak için saniyede 0.2 milivoltta bir gümüş-gümüş klorür referans elektroduna karşı negatif 0.8 volttan pozitif 100 volta kadar bir üçgen potansiyel dalga formu uygulayın. Ekzositozun amperometri kaydı için, kültürlenmiş kromafin hücreli Petri kabını bir Faraday kafesinde ters çevrilmiş bir mikroskop üzerine izotonik tampon içine yerleştirin.

Hücre deneyleri sırasında 37 santigrat derece sıcaklığı korumak için bir mikroskop ısıtma aşaması kullanın. Ardından, çalışma elektroduna 700 milivoltluk sabit bir pozitif potansiyel uygulamak için düşük gürültülü bir yama kelepçesi aleti kullanın. Kromaffin hücrelerinin ekzositozunu kaydetmek için, sinyali 10 kilohertz'de dijitalleştirin ve kaydedilen sinyali filtrelemek için iki kilohertz'de dahili bir alçak geçiren Bessel filtresi uygulayın.

Oval disk elektrodunun hücrelerin üzerine düz bir şekilde ve Petri kabının yüzeyine paralel olarak yerleştirilmesi gerektiğini unutmayın. Ayrıca, temiz bir elektrot yüzeyi sağlamak için elektrotlar deneylerle aynı gün eğim verilir. Hücre ekzositozunu uyarmak için, hücreden en az 20 mikrometre uzakta beş milimolar baryum klorür çözeltisi ile doldurulmuş bir cam mikropipet yerleştirin.

Ardından, hücre ekzositozunu uyarmak için hücre yüzeyine beş milimolar baryum klorür çözeltisinden oluşan beş saniyelik bir enjeksiyon darbesi uygulayın. Kök pipeti çözeltiye yerleştirin ve amperometrik akım geçici akımlarını yaklaşık üç dakika boyunca kaydederken bir baryum enjeksiyon darbesi uygulayarak hücre ekzositozunu uyarın. İzotonik koşullardaki ekzositotik tepkileri hipertonik koşullarla karşılaştırmak için, hücreleri hipertonik tampon çözeltisinde 10 dakika inkübe edin.

Daha sonra, ekzositozu uyarmak için bir baryum enjeksiyon darbesi uygulayın ve üç dakikalık amperometrik kayıt yapın. Hücrelerin geri dönüşümlü tepkisi için, hücreleri izotonik bir tampon çözeltisinde 10 dakika boyunca tekrar inkübe edin. Bir baryum enjeksiyon darbesi uygulayarak hücreleri uyarın ve ekzositotik yanıtın üç dakikalık kaydını gerçekleştirin.

Veziküler kuantal boyut ölçümleri için elektrotları imal etmek için, beş mikrometre çapında bir karbon fiber elektrot hazırlayın. Mikroskop altında, cam ucundan dışarı uzanan karbon fiberi kesmek için bir neşter kullanın, böylece sadece 30 ila 100 mikrometre kalır. Karbon fiber elektrotun alevle kazınmış bir ucunu hazırlamak için bir bütan alevi kullanın.

Düzgün şekilde kazınmış, silindirik şekilli bir elektrot ucu elde etmek için, silindirik şekilli karbon fiber elektrodu döndürürken tutun. Ve camdan uzanan karbon fiberi, karbonun ucu kırmızı bir renk alana kadar bütan alevinin mavi kenarına yerleştirin. Alevle aşındırma işleminden sonra, elektrot ucunu değerlendirmek için elektrodu mikroskop altına yerleştirin.

Kazınmış elektrot ucu boyutunun çapı yaklaşık 50 ila 100 nanometre olmalıdır. Daha sonra, silindirik nanouçlu mikroelektrodu üç dakika boyunca epoksi çözeltisine yerleştirin ve ardından elektrot ucunu aseton çözeltisine 15 saniye daldırın. Bu, epoksinin karbon fiber ile yalıtkan gaz kılcal duvarı arasındaki potansiyel boşluk boşluğunu kapatmasına izin verir.

Aseton epoksiyi kazınmış karbon fiber elektrot yüzeyinden temizlerken. Epoksiyi sertleştirmek için elektrotları gece boyunca 100 santigrat derecede bir fırında pişirin. Kullanmadan önce, döngüsel voltametri kullanarak her bir karbon fiber mikroelektrotun sabit durum akımını test edin.

Deneyler için, yalnızca 1,5 ila 2,5 nanoamper civarında bir plato akımı gösteren elektrotları kullanın. Hücre içi amperometri ölçümleri için, hücreleri mikroskobun altına yerleştirin ve potansiyostatın aynı deneysel ayarlarını kullanın. Hücrede önemli fiziksel hasarı önleyin.

Nanotip silindirik mikroelektrotu hafif bir mekanik kuvvet ekleyerek hücreye yerleştirin. Elektrodu bir mikromanipülatör kullanarak hücre plazma zarından ve hücre sitoplazmasına itmek için yeterli. Yerleştirdikten sonra ve hücre zarı silindirik elektrotun etrafına kapatıldıktan sonra, canlı hücrede yerinde amperometrik kaydı başlatın.

Elektroda uygulanan oksidasyon potansiyelinde, veziküller elektrot yüzeyine adsorbe olur ve stokastik olarak yırtılır. Bu nedenle, bu süreci başlatmak için herhangi bir uyarana gerek yoktur. Veziküler kuantal boyut üzerindeki ozmotik etkiyi belirlemek için, deneysel koşulu kullanarak izotonik ve hipertonik tamponda inkübe edilmiş bir grup hücreden hücre içi sitometri ölçümlerini toplayın.

Hücre dışı ozmolalitenin ekzositoz aktivitesi üzerindeki etkisi, kromafin hücreleri izotonik, daha sonra hipertonik ve son olarak izotonik koşullarda baryum çözeltisi ile uyarıldığında ekzositoz olaylarının sıklığı olarak sunulur. Bu veriler, ozmotik stres yaşayan hücrelerde ekzositoz aktivitesinde bir inhibisyon olduğunu ve hücreler izotonik bir ortama geri döndükten sonra kısmi bir iyileşme sağlanabileceğini göstermektedir. Kontrol deneyi, izotonik koşullarda kromaffin hücrelerinde art arda üç baryum stimülasyonundan sonra ekzositoz olaylarının sıklığını göstermektedir.

Bu, bu deneylerde kullanılan zaman çerçevesi içinde çoklu baryum stimülasyonunun, ardışık hücre stimülasyonu ile ekzositoz aktivitesinde bir azalmaya neden olduğunu göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, salgı veziküllerinin ve ekzositoz sürecinin hücre dışı ortamdaki değişikliklerden nasıl etkilendiğini karşılaştırmanıza olanak tanıyan bu ücretsiz analitik yöntemlerin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.