Yukarı doğru hareket: Bir basit ve esnek Vitro üç boyutlu işgali tahlil iletişim kuralı

Bu iletişim kuralı hücreleri hücre microenvironment koruma sırasında bir üç boyutlu ortamda göç ve işgal yeteneklerini ölçmek için kullanılabilir bir ters dikey işgali tahlil açıklar. Bu tahlil nadir ve/veya hassas hücreler için uygundur.

Bu istila testinin genel amacı, nadir ve hassas hücrelerin göç ve istilacı kapasitelerini, hücreleri mikro çevrelerinden çıkarmadan 3 boyutlu bir ortamda ölçmektir. Bu yöntem, kanser hücresi füzyon ürünü gibi hassas ve oray olaylarının istila kabiliyeti hakkında kanser araştırma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hücrelerin orijinal mikro ortamlarında bir 3D ayar kullanılarak analiz edilmesidir.

Bu tekniğin etkileri, kanser hücresi istilasını ve metastazı inhibe edebilen farmakolojik ajanları taramak için kullanılabildiği için kanser tedavisine kadar uzanır. Bu tekniğin görsel gösterimi çok önemlidir. Kollajen karışımının sıcaklığındaki ve pH'ındaki aspirasyon, polimerizasyonunu etkiler ve kaba kullanım jelin ayrılmasına neden olur.

Camın hidrofobikliğini azaltmak için 35 milimetrelik bir kültür kabını 10 milimetrelik bir cam tabanlı kuyuya bir mililitre bir molar hidroklorik asit ile işlemden geçirerek başlayın. 15 dakika sonra, plakayı yıkama başına bir mililitre PBS ile iki kez yıkayın, ardından bir mililitre% 70 etanol ile bir yıkama yapın. Daha sonra, plakayı, kullanılacak ilgili hücrelere özgü bir mililitre kültür ortamı ile durulayın.

Ve tabağı ilgilenilen hücrelerle tohumlayın. Ardından plakayı bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Hücreler% 100 birleşmeye ulaştığında, 114.5 mikrolitre taze hazırlanmış sıçan kuyruğu kollajeni, 16.6 mikrolitre 10 X DMEM ortamı ve 33.1 mikrolitre kültür ortamını buz üzerinde bir mikrosantrifüj tüpünde ilgilenilen kemoterapi çekici ile birleştirin.

Kollajen karışımını 14 mikrolitre sodyum bikarbonat ile nötralize edin ve hücreleri 80 mikrolitre jel ile kaplayın. Kollajenin nemlendirilmiş 37 santigrat derece ve yüzde beş karbondioksit inkübatörde 30 dakika boyunca polimerize olmasına izin verin. Daha sonra, jelin üzerine iki mililitre indirgenmiş yüzde iki serum hücre kültürü ortamı yerleştirin ve kollajeni yerinden çıkarmadan hücreleri uygun deneysel süre boyunca dikkatlice inkübatöre geri koyun.

Kuluçka işleminin sonunda, ortamı nazikçe çıkarın ve jeli bir mililitre PBS ile dikkatlice durulayın. Hücreleri 15 dakika boyunca bir mililitre yüzde dört paraformaldehit ile sabitleyin, ardından yıkama başına bir mililitre PBS'de iki yıkama yapın. Daha sonra hücreleri oda sıcaklığında 20 dakika boyunca DAPI solüsyonu ile etiketleyin ve konfokal mikroskopi ile in vitro üç boyutlu kollajen istilasını görüntüleyin.

Burada, 48 saatlik bir migrasyon periyodu boyunca bir kemoterapi cezbediciye yanıt olarak bir meme kanseri hücre hattı ve meme kanseri hücresi füzyon ürünleri tarafından kollajen jelinin istilasının nicelleştirilmesi gösterilmektedir. Özellikle, nadir meme kanseri hücre füzyon ürünlerinin kemoterapi cezbedicisine yanıt olarak kollajen jele göçü de gözlendi. Hücreler, jel polimerizasyonundan 48 saat sonra sağlam hücre sayılarını ve morfolojilerini korumaları ile kanıtlandığı gibi, kollajen jel deneyi boyunca sağlıklı kalır.

Bu dikey kollajen jel testi aynı zamanda istila sırasında hücre göçünün kinetiğinin, Z serisindeki hücre göçünün yanı sıra göç eden hücrelerin morfolojisinin yerinde yakalanmasıyla analiz edilmesine izin verir. Bu prosedürü denerken, mikroskobunuzla uyumlu bir kültür kabı kullanmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, ECM katılımının hücre istilası üzerindeki etkileri veya farklı kemoterapi cezbedicilerin hücre istilası üzerindeki etkileri hakkında ek soruları yanıtlamak için kollajenin gücünü değiştirmek veya farklı kemoterapi cezbediciler kullanmak gibi diğer değişkenler tanıtılabilir.

Geliştirildikten sonra, bu teknik, biyoloji ve kanser alanındaki araştırmacıların metastazın farmakolojik inhibitörlerini taramasının yanı sıra in vivo olarak tüm inflamatuar yanıtlarda yara iyileşmesini araştırmalarının yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, nadir ve hassas hücrelerin göç ve istilacı yeteneklerini, 3 boyutlu bir ortamda, mikro tutulum üzerindeki hücreleri bozmadan nasıl değerlendireceğinizi iyi anlamış olmalısınız. İnsan kanser hücreleri, hidroklorik asit, paraformaldehit ve DAPI ile yürümenin son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken iki numaralı biyoseptik dolap ve duman tutma gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.