Yukarı doğru hareket: Bir basit ve esnek Vitro üç boyutlu işgali tahlil iletişim kuralı
12 Mart 2018
Bu iletişim kuralı hücreleri hücre microenvironment koruma sırasında bir üç boyutlu ortamda göç ve işgal yeteneklerini ölçmek için kullanılabilir bir ters dikey işgali tahlil açıklar. Bu tahlil nadir ve/veya hassas hücreler için uygundur.
Bu istila testinin genel amacı, nadir ve hassas hücrelerin göç ve istilacı kapasitelerini, hücreleri mikro çevrelerinden çıkarmadan 3 boyutlu bir ortamda ölçmektir. Bu yöntem, kanser hücresi füzyon ürünü gibi hassas ve oray olaylarının istila kabiliyeti hakkında kanser araştırma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hücrelerin orijinal mikro ortamlarında bir 3D ayar kullanılarak analiz edilmesidir.
Bu tekniğin etkileri, kanser hücresi istilasını ve metastazı inhibe edebilen farmakolojik ajanları taramak için kullanılabildiği için kanser tedavisine kadar uzanır. Bu tekniğin görsel gösterimi çok önemlidir. Kollajen karışımının sıcaklığındaki ve pH'ındaki aspirasyon, polimerizasyonunu etkiler ve kaba kullanım jelin ayrılmasına neden olur.
Camın hidrofobikliğini azaltmak için 35 milimetrelik bir kültür kabını 10 milimetrelik bir cam tabanlı kuyuya bir mililitre bir molar hidroklorik asit ile işlemden geçirerek başlayın. 15 dakika sonra, plakayı yıkama başına bir mililitre PBS ile iki kez yıkayın, ardından bir mililitre% 70 etanol ile bir yıkama yapın. Daha sonra, plakayı, kullanılacak ilgili hücrelere özgü bir mililitre kültür ortamı ile durulayın.
Ve tabağı ilgilenilen hücrelerle tohumlayın. Ardından plakayı bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Hücreler% 100 birleşmeye ulaştığında, 114.5 mikrolitre taze hazırlanmış sıçan kuyruğu kollajeni, 16.6 mikrolitre 10 X DMEM ortamı ve 33.1 mikrolitre kültür ortamını buz üzerinde bir mikrosantrifüj tüpünde ilgilenilen kemoterapi çekici ile birleştirin.
Kollajen karışımını 14 mikrolitre sodyum bikarbonat ile nötralize edin ve hücreleri 80 mikrolitre jel ile kaplayın. Kollajenin nemlendirilmiş 37 santigrat derece ve yüzde beş karbondioksit inkübatörde 30 dakika boyunca polimerize olmasına izin verin. Daha sonra, jelin üzerine iki mililitre indirgenmiş yüzde iki serum hücre kültürü ortamı yerleştirin ve kollajeni yerinden çıkarmadan hücreleri uygun deneysel süre boyunca dikkatlice inkübatöre geri koyun.
Kuluçka işleminin sonunda, ortamı nazikçe çıkarın ve jeli bir mililitre PBS ile dikkatlice durulayın. Hücreleri 15 dakika boyunca bir mililitre yüzde dört paraformaldehit ile sabitleyin, ardından yıkama başına bir mililitre PBS'de iki yıkama yapın. Daha sonra hücreleri oda sıcaklığında 20 dakika boyunca DAPI solüsyonu ile etiketleyin ve konfokal mikroskopi ile in vitro üç boyutlu kollajen istilasını görüntüleyin.
Burada, 48 saatlik bir migrasyon periyodu boyunca bir kemoterapi cezbediciye yanıt olarak bir meme kanseri hücre hattı ve meme kanseri hücresi füzyon ürünleri tarafından kollajen jelinin istilasının nicelleştirilmesi gösterilmektedir. Özellikle, nadir meme kanseri hücre füzyon ürünlerinin kemoterapi cezbedicisine yanıt olarak kollajen jele göçü de gözlendi. Hücreler, jel polimerizasyonundan 48 saat sonra sağlam hücre sayılarını ve morfolojilerini korumaları ile kanıtlandığı gibi, kollajen jel deneyi boyunca sağlıklı kalır.
Bu dikey kollajen jel testi aynı zamanda istila sırasında hücre göçünün kinetiğinin, Z serisindeki hücre göçünün yanı sıra göç eden hücrelerin morfolojisinin yerinde yakalanmasıyla analiz edilmesine izin verir. Bu prosedürü denerken, mikroskobunuzla uyumlu bir kültür kabı kullanmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, ECM katılımının hücre istilası üzerindeki etkileri veya farklı kemoterapi cezbedicilerin hücre istilası üzerindeki etkileri hakkında ek soruları yanıtlamak için kollajenin gücünü değiştirmek veya farklı kemoterapi cezbediciler kullanmak gibi diğer değişkenler tanıtılabilir.
Geliştirildikten sonra, bu teknik, biyoloji ve kanser alanındaki araştırmacıların metastazın farmakolojik inhibitörlerini taramasının yanı sıra in vivo olarak tüm inflamatuar yanıtlarda yara iyileşmesini araştırmalarının yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, nadir ve hassas hücrelerin göç ve istilacı yeteneklerini, 3 boyutlu bir ortamda, mikro tutulum üzerindeki hücreleri bozmadan nasıl değerlendireceğinizi iyi anlamış olmalısınız. İnsan kanser hücreleri, hidroklorik asit, paraformaldehit ve DAPI ile yürümenin son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken iki numaralı biyoseptik dolap ve duman tutma gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, hücre mikroçevresini korurken, üç boyutlu bir ortamda nadir ve hassas hücrelerin migrasyon ve invazyon kapasitelerini nicel olarak belirleyen ters dikey bir invazyon analizini tanımlamaktadır. Bu yöntem, özellikle kanser araştırmaları için uygundur.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre göçü
- Kanser araştırmaları
- İnvasyon analizleri
Arka Plan
- Bu analiz, hücrelerin orijinal mikro çevrelerinde incelenmesine olanak tanır.
- Nadir ve hassas hücreler için tasarlanmıştır.
- Hücre invazyonunun anlaşılması, kanser tedavisi geliştirme süreci için kritik öneme sahiptir.
- Tekniğin görsel olarak gösterilmesi, uygulamanın doğru şekilde gerçekleştirilmesi için gereklidir.
Çalışmanın Amacı
- Hücrelerin göç etme ve invazyon kapasitelerini nicelleştirmek.
- Hassas hücrelerin invazyon yeteneğini araştırmak.
- Kanser hücresi invazyonunu ve metastazını inhibe eden farmakolojik ajanları taramak.
Kullanılan Yöntemler
- Tersine dikey invazyon deneyi
- Üç boyutlu hücre kültürü
- Hücrelerin mikro çevrelerinde analizi
- Sıcaklık ve pH etkilerinin kolajen polimerizasyonu üzerindeki değerlendirmesi
Temel Sonuçlar
- Hücre davranışının 3 boyutlu bir ortamda analiz edilebileceği gösterilmiştir.
- Hücre mikroçevresinin korunmasının önemi vurgulanmıştır.
- Kanser hücrelerinin invaziv yeteneklerine dair içgörüler sunulmuştur.
- Terapötik ajanların taranması için potansiyel ortaya konmuştur.
Sonuçlar
- Bu analiz, kanser araştırmaları için değerli bir araçtır.
- Hassas hücrelerin mikroortamını korur.
- Kanser invazyonu ve metastazını hedefleyen tedavilerin geliştirilmesine yardımcı olabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yürütücü Sektör Uygunluğu
Bu analiz, biyofarma Ar-Ge ekiplerinin, doğal hücre-ECM etkileşimlerini bozmadan, fizyolojik olarak ilgili bir 3D mikroortamda nadir ve hassas hücre modellerinin invaziv potansiyelini değerlendirmesine olanak tanır. Orijinal hücresel nişi koruyan bu yöntem, metastazla ilişkili hedeflerin mekanistik risk azaltma süreçlerini destekler ve erken aşama hedef doğrulamasındaki öngörülebilir güveni artırır. Geleneksel analizlerin mikroortam bütünlüğünü bozduğu preklinik taramalardaki kritik bir boşluğu doldurarak, keşif aşamasından öncü bileşik optimizasyonuna kadar olan translasyonel sürekliliği geliştirir.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Nadir veya füzyon kaynaklı hücre modellerinde, doğal mikroçevresel koşullar altında invazyonu değerlendirerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Hücre yer değiştirmesinin neden olduğu artefakt kaynaklı değişkenliği azaltarak, deneyler genelinde invazyon fenotiplerinin tekrarlanabilirliğini artırır.
- Öngörücü Değer: Moleküler pertürbasyonları 3D bağlamda fonksiyonel invazyon sonuçlarıyla ilişkilendirerek hedef risklerinin azaltılmasını destekler.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Yüksek içerikli görüntüleme ve otomatik analiz iş akışlarıyla uyumlu, standartlaştırılmış ve kantitatif invazyon metrikleri üretir.
- Tekrarlanabilirlik: Analiz kurulumu sırasında hücre tabakalarının mekanik olarak bozulmasını önleyerek kuyucuklar arası değişkenliği minimize eder.
- Ölçeklenebilirlik: Farklı kolajen konsantrasyonları ve kemoatraktanlarla uyumlu olup, metastaz inhibitörleri için yapı-aktivite ilişkisi (SAR) çalışmalarına olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlgisi: İn vivo ortamdaki stromal-tümör etkileşimlerini yansıtan fibroblast-epitel hibrit hücrelerini kullanarak insan kanser invazyonunu modeller.
- Translasyonel Süreklilik: İnvaziv davranış için kritik olan mikroçevresel ipuçlarını koruyarak, in vitro bulguları preklinik doğrulamaya bağlar.
- Risk Ayarlı Kararlar: Yetersiz mikroçevresel modelleme nedeniyle geç aşama başarısızlığı olasılığı düşük olan hedefleri veya bileşikleri önceliklendirmek için fonksiyonel invazyon verileri sağlar.
Süreç ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu analiz, erken hedef doğrulamadan öncü bileşik tanımlamaya kadar olan keşif sürecine uygun olup, metastazla ilgili programlar için Boyden Odacığı veya transwell sistemlerine karşı mikroçevreyi koruyan bir alternatif sunmaktadır.
- Keşif Biyolojisi: Fizyolojik kolajen jeller içinde hücre migrasyonunun gerçek zamanlı, z-yığını (z-stack) görüntülemesini sağlayarak, invazyon yolaklarının hipotez odaklı test edilmesini destekler.
- Tarama: Özellikle ECM remodelasyonu veya kemotaktik sinyalleri hedefleyen ajanlar için, bileşik kütüphanesi taramasına uygun invazyon son nokta verileri sunar.
- Analitik: İnvaze olan hücre sayısının kantifikasyonunu ve morfometrik analizi mümkün kılarak, yapı-fonksiyon korelasyonu için çok parametreli okumalar sağlar.
- Translasyonel Araştırma: MSC-kanser hibritlerini kullanarak stromal aracılı invazyonu modeller ve biyobelirteç bağlantılı mekanistik çalışmaları destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Kanser türleri ve stromal ko-kültürler genelinde uyarlanabilir olup, metastaz ve yara iyileşmesi programlarında platformun yeniden kullanımını teşvik eder.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Mikroçevre bozulmasından kaynaklanan yalancı pozitifleri azaltarak hedef doğrulama güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Standardize edilmiş jel polimerizasyonu ve kaplama protokolleri aracılığıyla analiz sağlamlığını geliştirir.
- Stratejik Değer: İş akışının erken safhalarında fizyolojik olarak ilgili invazyon verileri sağlayarak devam/durdur kararlarının kalitesini artırır.
- Portföy Etkisi: Fonksiyonel 3D invazyon profillerine dayalı olarak, metastaz inhibitörlerinin risk tabanlı stratejilerle ilerletilmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Hassas invazyon kantifikasyonu için 3D hücre kültürü ve konfokal mikroskopi konusunda uzmanlık gerektirir.
- Tutarlı jel polimerizasyonunu sağlamak için kolajen hazırlığı sırasında hassas sıcaklık ve pH kontrolüne bağlıdır.
- Tekrarlanabilir kemotaktik yanıtlar için standardize kemoatraktan dozlaması ve serum azaltılmış medya koşulları gerektirir.
- Alternatif ECM proteinlerine (örneğin Matrigel, fibrin) adaptasyon, jelleşme kinetiğinin ve konsantrasyonun optimizasyonunu gerektirebilir.
- Bir jel katmanından yukarıya doğru invaze olabilen aderent veya yarı-aderent hücrelerle sınırlıdır; aderent olmayan süspansiyonlar modifikasyon gerektirebilir.
