Name: Yukarı doğru hareket: Bir basit ve esnek Vitro üç boyutlu işgali tahlil iletişim kuralı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Keşfedin ters dikey işgal analizi ile üç boyutlu ortamda nadir ve hassas hücrelerin göç ve işgal kapasitelerini ölçme yöntemini. Bu teknik kanser araştırmalarında mikroçevreyi koruyarak ilaç taraması yapılmasına olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından (NIMHD-G12MD007581) Jackson Devlet Üniversitesi ve savunma, fikir Ödülü 11-1-0205 ABD Bakanlığı çevre sağlığı için RCMI merkezinden destek verdi.

Not: Bu protokol McArdle vd. anlatılan 11. bir zaman çizelgesi şekil 1' de verilmiştir.
1. kültür plaka hazırlanması
<ol><li>Bir 10 mm cam alt 1 mL 1 M hidroklorik asit (HCl) ile iyi 15dk için cam alt hydrophobicity alt içeren 35-mm kültür bulaşık yıka.</li>
	<li>Kültür plaka fosfat tampon salin (PBS) tüm HCl kurtulmak için 1 mL ile iki kez yıkayın.</li>
	<li>Kültür plaka 1 mL % 70 etanol ile iki kez yıkayın.</li>
	<li>Hücre belirli kültür orta 1 mL ile kültür plaka durulama (burada, kullanım α-MEM % 10 ısı ile desteklenmiş FBS ve % 1 esansiyel olmayan amino asitler inaktive olur). Not: Kültür ortamı içeren tedavi kültür plaka CO2 kuluçka 37 ° C'de bir nemlendirici ile ertesi güne kadar saklanabilir.</li>
	<li>(MSCs ve MCF-7 ortak kültür) hücreleri tedavi cam-alt içinde de 35 mm kültür çanak % 100 confluency için büyümek. 35.000 MSC hücreleri ve 75.000 MCF7 hücre 24 h için ortak kültür.</li>
</ol>2. kollajen jel hazırlanması
<ol><li>Kollajen temas üzerine polimerizasyon önlemek için kollajen jel dondurucuya pipetting için kullanılan micropipette ipuçları saklayın. Not: Bu en önemli adımdır.</li>
	<li>Bir birim belirlemek sıçan kuyruk kollajen ben kullanılmak üzere kollajen hisse senedi toplama üzerinde tabanlı. Kollajen jel 100 µL bu tahlil için hazırlayın. Not: Ben stok sıçan kuyruk kollajen yüksek yoğunlukta daha iyi çalışır. 10 x kollajen buna göre sulandırmak için kullanılmak üzere Dulbecco'nın modifiye kartal orta hacmi belirlemek.</li>
	<li>Birleştirmek buz sıçan kuyruk kollajen üzerinde ben (3.8 µg/mL hisse senedi), 10 x Dulbecco'nın modifiye kartal orta ve 1 x hücre kültür % 2 fetal sığır serum ve kollajen 2.4 mg/ml nihai bir konsantrasyon için uygun chemoattractant ile takıma orta boy.</li>
	<li>Kollajen jel nötralize etmek için sodyum bikarbonat çözüm karışımı %4,5 ekleyin. Not: Sodyum bikarbonat çözüm eklendi hacmi diğer reaktifleri tam pH göre değişebilir. Bu karışımı tarafsız çözüm sağlamak veya bir pH göstergesi kültür ortamında kullanmak için pH şeritler ile test etmek en iyisidir.</li>
	<li>80 µL kollajen karışımı cam-alt de kültür çanak içindeki hücreleri üzerinde yatıyordu.</li>
	<li>Kollajen jel 30 dk 37 ° C'de bir nemlendirici ile CO2 kuluçka için polimerize izin</li>
	<li>Kollajen jel hücre orta düşük serum (% 2) ile 2 mL ile kapak ve CO2 kuluçka bir nemlendirici ile 24, 48 veya 72 h 37 ° C'de hücreler kuluçkaya. Uyarı: Plaka cam alttan ayırma kollajen jel önlemek için itina ile ele alınmalıdır.</li>
</ol>3. hazırlık kollajen örneği jel 3.8 µg /mL bir sıçan kuyruk kollajen stokunun kullanarak
<ol><li>Buz üzerinde birleştirmek 114.5 µL sıçan kuyruk kollajen, 10 DMEM x 16,6 µL ve kültür chemoattractant içeren orta 33.1 µL.</li>
	<li>Kollajen karışımı sodyum bikarbonat 14,0 µL ile etkisiz hale getirin.</li>
	<li>Adım 2,5 olduğu gibi devam edin.</li>
</ol>4. hücreleri görüntüleme
<ol><li>Yavaşça medya çanak çıkarın.</li>
	<li>Yavaşça jel PBS 1 mL ile yıkayın.</li>
	<li>%4 paraformaldehyde 15dk için 1 mL ile hücreleri tamir.</li>
	<li>Hücreleri iki kez PBS 1 mL ile yıkayın.</li>
	<li>DAPI çözüm (100 ng/mL) oda sıcaklığında 20 dk için hücrelerle leke.</li>
	<li>Hücreleri farklı yerlerde confocal bir mikroskop kullanarak ve 400 µm z-yığın görüntüleri her iki yerde de 16 µm adımları alarak görüntü. Kullanılan mikroskop kullanarak bir beyaz ışık, ark uyarma kaynak confocal görüntüleme sağlar birim tarama bir diski var. 0,75 sayısal diyafram ile kullanılan bir 20 X lens kullanabilirsiniz.</li>
	<li>Görüntüleri yeniden oluşturma.<ol>
<li>Görüntüler için verilen jel (yaklaşık 25 resim) açın ve görüntü → yığınları → görüntüler yığmak için tıklatarak görüntü yığını oluşturun. İlk görüntü jel altına denk (z = 0 µm), z yönde ilk adım için ikinci görüntü denk (z = 16 µm), üçüncü resim z yönünde ikinci adımına tekabül (z 32 µm =). Her çekirdek her görüntü derinlikte değerlendirmek ve hangi keskin odak olarak işgal derinliği belirli hücre için çekirdek yapıldı derinliği belirleyebilirsiniz.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Friedl, P., Brocker, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+cell+locomotion+within+three-dimensional+extracellular+matric%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matric.</a> Cell Mol Life Sci. 57, 41-64 (2000).</li>
<li>Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+architecture%3A+the+ultimate+regulator+of+breast+epithelial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function.</a> Curr Opin Cell Biol. 15, 753-762 (2003).</li>
<li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-cell+invasion+and+migration%3A+diversity+and+escape+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nat Rev Cancer. 3, 362-374 (2003).</li>
<li>Yarrow, J. C., Perlman, Z. E., Westwood, N. J., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+cell+migration+assay+using+scratch+wound+healing%2C+a+comparison+of+image-based+readout+methods%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A high-throughput cell migration assay using scratch wound healing, a comparison of image-based readout methods.</a> BMC Biotechnol. 4, 21(2004).</li>
<li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensation+mechanism+in+tumor+cell+migration%3A+mesenchymal-amoeboid+transition+after+blocking+of+pericellular+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis.</a> J Cell Biol. 160, 267-277 (2003).</li>
<li>Sahai, E., Marshall, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differing+modes+of+tumour+cell+invasion+have+distinct+requirements+for+Rho%2FROCK+signalling+and+extracellular+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differing modes of tumour cell invasion have distinct requirements for Rho/ROCK signalling and extracellular proteolysis.</a> Nat Cell Biol. 5, 711-719 (2003).</li>
<li>Kam, Y., Guess, C., Estrada, L., Weidow, B., Quaranta, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+circular+invasion+assay+mimics+in+vivo+invasive+behavior+of+cancer+cell+lines+and+distinguishes+single-cell+motility+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">A novel circular invasion assay mimics in vivo invasive behavior of cancer cell lines and distinguishes single-cell motility in vitro.</a> BMC Cancer. 8, 198(2008).</li>
<li>Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+analysis+of+current+in+vitro+and+in+vivo+angiogenesis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays.</a> Int J Exp Pathol. 90, 195-221 (2009).</li>
<li>Poujade, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+migration+of+an+epithelial+monolayer+in+response+to+a+model+wound%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 15988-15993 (2007).</li>
<li>Noubissi, F. K., Harkness, T., Alexander, C. M., Ogle, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis-induced+cancer+cell+fusion%3A+a+mechanism+of+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Apoptosis-induced cancer cell fusion: a mechanism of breast cancer metastasis.</a> FASEB J. 29, 4036-4045 (2015).</li>
<li>McArdle, T. J., Ogle, B. M., Noubissi, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+In+Vitro+Inverted+Vertical+Invasion+Assay+to+Avoid+Manipulation+of+Rare+or+Sensitive+Cell+Types%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cancer%22%5BJournal%5D)">An In Vitro Inverted Vertical Invasion Assay to Avoid Manipulation of Rare or Sensitive Cell Types.</a> J Cancer. 7, 2333-2340 (2016).</li>
<li>Noubissi, F. K., Ogle, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+Cell+Fusion%3A+Mechanisms+Slowly+Unravel%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Cancer Cell Fusion: Mechanisms Slowly Unravel.</a> Int J Mol Sci. 17, (2016).</li>
<li>Meyvantsson, I., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+models+in+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Cell culture models in microfluidic systems.</a> Annu Rev Anal Chem. 1, 423-449 (2008).</li>
<li>Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+migration+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+In+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Tumor cell migration in three dimensions.</a> Methods In Enzymol. 406, 625-643 (2006).</li>
<li>Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+memory+and+dosing+influence+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Materials%22%5BJournal%5D)">Mechanical memory and dosing influence stem cell fate.</a> Nat Materials. 13, 645-652 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar rakip hiç ilgi var olduğunu ilan etti.

Burada, nadir ve/veya onların microenvironment bağımlı olan hücreleri de dahil olmak üzere hücre türü için uygun olan bir basit ters dikey işgali tahlil açıklayın. Bu 3D işgali tahlil hücreler içinde onların orijinal microenvironment kalır ve bir chemoattractant içeren kollajen jel tarafından karşılanmaktadır. Hücreler göç ve kollajen istila. Bu tahlil, hücreler lekeli ve kolayca jel içinde izlenir. Basitlik ve tekrarlanabilirlik Bu testin bir 3D sisteminde kanser hücre göç ve işgali için uygun bir araç yapar. Ancak, güç...

Hücre hareketliliği hücreleri bir normal gelişim ve fizyolojik süreçtir. Ancak, değişiklikleri desen ve üretilen hücre göç ve istila için inflamatuar hastalıkları ve kanser metastaz1,2,3gibi patolojik koşullarla ilişkilidir. Metastaz tartışmalı Kanserinde en kötü anlaşılır yönüdür. Metastaz için kanser hücrelerinin ekstra hücresel matris (ECM) aşağılamak, yerel doku ve intravasate istila. Bir kez dolaşımda, kanser hücrelerinin uzak siteye yaymak, extravasate ve ikincil tümörler oluşturur. Bu nedenle, yetenek hücreleri ECM aşağılamak için göç ve istila metastatik potansiyellerini ilgilidir. Çözümlemek ve hücrelerin göç ve işgal yeteneklerini ölçmek için farklı yaklaşımlar geliştirilmiştir. En çok kullanılan yaklaşımlar tahlil, hızlandırılmış mikroskobu ve Boyden odası tahlil şifa yara içerir. Yara iyileşme tahlil4 ve zaman atlamalı mikroskobu hücre göç içine ön fikir verecek basit ve kolay deneyleri var. Ancak, her iki hücre içinde vivovar 3D çevre yansıtmıyor 2D deneyleri vardır. Hücreleri farklı bir 2D bir5,-6karşılaştırıldığında 3D ortamına yanıt çalışmalar göstermiştir. Ayrıca, yara iyileştirici deneyleri çoğaltmak ve nicel sonuçları7,8,9verim için zordur. Tahlil şifa yara 3D bir değişiklik olduğunu, hücre dışlama bölgesi tahlil daha fizyolojik ilgili bir tahlil ama hücre içinde sayı hücre füzyon olaylar10,11 kaynaklanan hibrit hücreler gibi düşük için uygun değil .
Boyden odası tahlil için hücresel çalışmalar ilgili microenvironments sağlar 3 boyutlu bir tahlil olduğunu. Ancak, hücrelerin kendi özgün microenvironment kaldırılacak ve geçirmek ve aşağıya doğru chemoattractant içeren orta istila Boyden tahlil sisteminin üst odaya yatırılması için gerekli. Bu 3D yaklaşım onların microenvironment ve/veya sınırlı sayı10,11,12güvenlik açığı bulunan hücrelerin göç ve işgal yeteneği analiz uygun değildir. Hücre göç ve işgal çözümlemek için yeni bir yaklaşım mikrosıvısal degrade odası tahlil13yaşında. Her ne kadar uygun ve güvenilir geçiş ve işgal çalışmaları, bu tahlil daha pahalı ve teknik olarak tipik bir laboratuvar için zor olabilir. Biz burada hücreleri için onların microenvironment duyarlı da dahil olmak üzere birçok hücre tipleri ile uyumlu ve/veya sınırlı sayıda bir basit ters dikey işgali tahlil tanımlamak. Bu tahlil Hooper ve ark. tarafından önerilen iletişim kuralından adapte oldu 14. bu tahlil, hücreleri kendi özgün microenvironment ve onların geçiş kalır ve işgal chemoattractant11içeren kollajen jel içinde yukarı doğru ilerlerken izlenir. Bu tahlil tekrarlanabilir ve yapılmış en iyi duruma getirilmiş ve 35 mm kültür tabakta doğrulanmış. Farklı hücre kültür boyutları, farklı matrisler veya gücü yapışma ve farklı chemoattractants de dahil olmak üzere farklı tahlil şartlarına adapte. Bu tahlil ilaç bulma işleminin başlangıç tarama için bir vitro platform olarak hizmet verebilir.

<table><tbody><tr><td>MatTek P35G-1.5-10C</td><td>MatTek Corporation, Ashland, MA</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td>mattek cam alt tabaklar</td></tr><tr><td>Sıçan kuyruğu kollajen I</td><td>Corning, Corning, NY, ABD</td><td>354236</td><td>Kollajen jel</td></tr><tr><td>Hidroklorik asit</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 ABD</td><td>H1758</td><td>HCl</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, ABD</td><td>10010023</td><td>Pbs</td></tr><tr><td>10X Dulbecco'nun Modifiye Edilmiş Kartal'ın Orta</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 ABD</td><td>D2429</td><td>10X DMEM</td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 ABD</td><td>S5761</td><td>NaHCO3</td></tr><tr><td>Konfokal Floresan mikroskop</td><td>Olympus America, Center Valley, PA, ABD</td><td>Olympus IX81</td><td>Konfokal ve nbsp; mikroskop</td></tr><tr><td>Tanımlı Fetal Sığır Serumu</td><td>GE Sağlık Yaşam Bilimleri HyClone Laboratuvarları, Utah, ABD</td><td>SH30070.03</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Ti: Safir çoklu foton lazer tarama mikroskobu</td><td>Prarie Technologies, Sioux Falls, SD, ABD</td><td>40x NA 0.8 objektif</td><td>MPLSM</td></tr><tr><td>Imaris yazılımı</td><td>Bitplane Inc. Zürih, CH</td><td>Imaris 7.5.2</td><td>Imaris yazılımı</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, ABD</td><td>D9542</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, ABD</td><td>50980487</td><td>PFA</td></tr><tr><td>&alfa;-minimum esansiyel ortam</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, ABD</td><td>M0894</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>ATCC; Manassas, VA, ABD</td><td>HBT-22</td><td></td></tr><tr><td>MSC</td><td>Trivedi ve Hematti, 2007</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20X lens UPLAPO</td><td>Olympus America, Center Valley, PA, ABD</td><td>36-064</td><td>Olympus UPLSAPO 20X Objektif</td></tr></tbody></table>

yukarı doğru hareket: bir basit ve esnek vitro üç boyutlu işgali tahlil iletişim kuralı

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

3D işgali deneyleri geliştirilmiştir rağmen onların microenvironment bütünlüğünü etkilemeden hücreleri çalışmaya meydan kalır. Boyden odası gerektiren hücreleri özgün kültür konumdan yerlerinden ve yeni bir ortama taşınmış gibi geleneksel 3D deneyleri. Sadece bu microenvironment için içsel hücresel süreçler bozmak yok, ama bu kez bir hücre kaybolmasına neden. Bu nadir, ya da onların microenvironment için son derece hassas hücreler ile ilgili özellikle zorlu sorunlardır. Burada, her iki endişelerini önler bir 3D işgali tahlil gelişimi açıklayın. Bu tahlil, hücreler de içinde küçük bir kaplama ve bir chemoattractant içeren bir ECM Matris hücreleri koydu. Bu herhangi bir hücre öteleme gerektirir ve hücreleri matrisin yukarı doğru istila sağlar. Bu tahlil, hücre işgali gibi hücre morfolojisi kollajen jel içinde değerlendirilebilir. Bu tahlil kullanarak, nadir ve hassas hücreler invaziv kapasitesini karakterize; füzyon meme kanseri hücreleri MCF7 ve Mezenkimal/multipotent arasında ortaya çıkan melez hücreleri (MSCs) kök/stroma hücreleri.

Biz-si olmak kullanılmış bir 35 mm kültür yemek bir cam alt ve sıçan kuyruk kollajen ile ben geliştirmek ve vitro 3D istila en iyi duruma getirmek için tahlil protokolü. Bu tahlil, bu meme kanseri hücreleri MCF7 ve MSC gösterdik kullanarak hücreleri kollajen jel 0,04 ± 1.8 µm ve 41,3 ± 76.0 µm ortalama bir mesafe içine sırasıyla 48 saat sonra işgal ne zaman IGF1 (18,6 ng/mL) chemoattractant (Şekil 2) kullanılmıştır. Daha da önemlisi, füzyon ürünleri ...

Bu iletişim kuralı hücreleri hücre microenvironment koruma sırasında bir üç boyutlu ortamda göç ve işgal yeteneklerini ölçmek için kullanılabilir bir ters dikey işgali tahlil açıklar. Bu tahlil nadir ve/veya hassas hücreler için uygundur.

Yukarı doğru hareket: Bir basit ve esnek Vitro üç boyutlu işgali tahlil iletişim kuralı

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Bu istila testinin genel amacı, nadir ve hassas hücrelerin göç ve istilacı kapasitelerini, hücreleri mikro çevrelerinden çıkarmadan 3 boyutlu bir ortamda ölçmektir. Bu yöntem, kanser hücresi füzyon ürünü gibi hassas ve oray olaylarının istila kabiliyeti hakkında kanser araştırma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hücrelerin orijinal mikro ortamlarında bir 3D ayar kullanılarak analiz edilmesidir.Bu tekniğin etkileri, kanser hücresi istilasını ve metastazı inhibe edebilen farmakolojik ajanları taramak için kullanılabildiği için kanser tedavisine kadar uzanır. Bu tekniğin görsel gösterimi çok önemlidir. Kollajen karışımının sıcaklığındaki ve pH'ındaki aspirasyon, polimerizasyonunu etkiler ve kaba kullanım jelin ayrılmasına neden olur.Camın hidrofobikliğini azaltmak için 35 milimetrelik bir kültür kabını 10 milimetrelik bir cam tabanlı kuyuya bir mililitre bir molar hidroklorik asit ile işlemden geçirerek başlayın. 15 dakika sonra, plakayı yıkama başına bir mililitre PBS ile iki kez yıkayın, ardından bir mililitre% 70 etanol ile bir yıkama yapın. Daha sonra, plakayı, kullanılacak ilgili hücrelere özgü bir mililitre kültür ortamı ile durulayın.Ve tabağı ilgilenilen hücrelerle tohumlayın. Ardından plakayı bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Hücreler% 100 birleşmeye ulaştığında, 114.5 mikrolitre taze hazırlanmış sıçan kuyruğu kollajeni, 16.6 mikrolitre 10 X DMEM ortamı ve 33.1 mikrolitre kültür ortamını buz üzerinde bir mikrosantrifüj tüpünde ilgilenilen kemoterapi çekici ile birleştirin.Kollajen karışımını 14 mikrolitre sodyum bikarbonat ile nötralize edin ve hücreleri 80 mikrolitre jel ile kaplayın. Kollajenin nemlendirilmiş 37 santigrat derece ve yüzde beş karbondioksit inkübatörde 30 dakika boyunca polimerize olmasına izin verin. Daha sonra, jelin üzerine iki mililitre indirgenmiş yüzde iki serum hücre kültürü ortamı yerleştirin ve kollajeni yerinden çıkarmadan hücreleri uygun deneysel süre boyunca dikkatlice inkübatöre geri koyun.Kuluçka işleminin sonunda, ortamı nazikçe çıkarın ve jeli bir mililitre PBS ile dikkatlice durulayın. Hücreleri 15 dakika boyunca bir mililitre yüzde dört paraformaldehit ile sabitleyin, ardından yıkama başına bir mililitre PBS'de iki yıkama yapın. Daha sonra hücreleri oda sıcaklığında 20 dakika boyunca DAPI solüsyonu ile etiketleyin ve konfokal mikroskopi ile in vitro üç boyutlu kollajen istilasını görüntüleyin.Burada, 48 saatlik bir migrasyon periyodu boyunca bir kemoterapi cezbediciye yanıt olarak bir meme kanseri hücre hattı ve meme kanseri hücresi füzyon ürünleri tarafından kollajen jelinin istilasının nicelleştirilmesi gösterilmektedir. Özellikle, nadir meme kanseri hücre füzyon ürünlerinin kemoterapi cezbedicisine yanıt olarak kollajen jele göçü de gözlendi. Hücreler, jel polimerizasyonundan 48 saat sonra sağlam hücre sayılarını ve morfolojilerini korumaları ile kanıtlandığı gibi, kollajen jel deneyi boyunca sağlıklı kalır.Bu dikey kollajen jel testi aynı zamanda istila sırasında hücre göçünün kinetiğinin, Z serisindeki hücre göçünün yanı sıra göç eden hücrelerin morfolojisinin yerinde yakalanmasıyla analiz edilmesine izin verir. Bu prosedürü denerken, mikroskobunuzla uyumlu bir kültür kabı kullanmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, ECM katılımının hücre istilası üzerindeki etkileri veya farklı kemoterapi cezbedicilerin hücre istilası üzerindeki etkileri hakkında ek soruları yanıtlamak için kollajenin gücünü değiştirmek veya farklı kemoterapi cezbediciler kullanmak gibi diğer değişkenler tanıtılabilir.Geliştirildikten sonra, bu teknik, biyoloji ve kanser alanındaki araştırmacıların metastazın farmakolojik inhibitörlerini taramasının yanı sıra in vivo olarak tüm inflamatuar yanıtlarda yara iyileşmesini araştırmalarının yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, nadir ve hassas hücrelerin göç ve istilacı yeteneklerini, 3 boyutlu bir ortamda, mikro tutulum üzerindeki hücreleri bozmadan nasıl değerlendireceğinizi iyi anlamış olmalısınız. İnsan kanser hücreleri, hidroklorik asit, paraformaldehit ve DAPI ile yürümenin son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken iki numaralı biyoseptik dolap ve duman tutma gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

moving-upwards-simple-flexible-vitro-three-dimensional-invasion-assay

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu video ile hücre işgali bir floresan tabanlı bir metodoloji kullanarak hücre kültürü ekler nasıl ölçüleceğini gösteriyor.

Bir In vitro FluoroBlok Tümör Invasion Testi

Üç boyutlu hücre dışı matriks içine tümör hücresi invazyonu modelleri daha iyi...

Modelleme ve Görüntüleme 3-Boyutlu Toplu Hücre Invasion

Yaygın olarak kullanılan, in vitro olarak hücre göçü ve işgali incelenmesi için oldukça erişilebilir yöntemler tarif edilmiştir. Birinci yöntem, hücre motilitesini büyüklüğüne hücre yara kapatma deneyidir. İkinci yöntem kemotaktik ve hücrelerin invaziv kapasitesini değerlendirir transwell göç ve istila testtir.

Vitro Hücre Göç ve Invasion Tahliller

Bu makalede, meme kanseri hücre istilasını ölçmek için üç boyutlu (3D) tahlillerin kullanımı için ayrıntılı yöntemler sağlar. Özellikle, biz hücreleri istila oluşur membran bütünlüğünün kaybı incelemek için bu tür deneyleri kurmak için gerekli prosedürleri, ölçümlerini ve veri analizi gibi yöntemleri tartışmak.

Üç boyutlu (3D) Modeli Kullanılarak Meme Kanseri Hücre invazivliğinin Kantitasyonu

Çevredeki normal dokuların invazyonu, malign tümörlerin tanımlayıcı bir özelliğidir. Burada, bir dizi ileri insan kanseri modeliyle örneklenmiş doğal bir 3D biyomatrise basit, yarı otomatik bir mikro plaka istila testi sunuyoruz.

Üç boyutlu (3D) Tümör Sfero Yayılması deneyindeki

Bu yöntem, kanser hücresinin sferoidlerden çevredeki bir 3B matrise invazyonunu değerlendirir.  Sferoidler, asılı damla kültürü yöntemi ile üretilir ve daha sonra bazal membran malzemeleri ve tip I kollajenden oluşan bir matrise gömülür.  Spheroidlerin istilası daha sonra izlenir.

Bir Kanseri Hücre Sfero Testi 3D ortamda Invasion Değerlendirmek için

Epitelden mezenkimal geçişe (EMT) kanserlerin invaziv hale gelmesine izin verir. EMT'yi araştırmak için, serum ve enzimlerden yoksun bir nöral kök hücre (NSC) tabanlı in vitro model tanımlanmıştır. Bu standartlaştırılmış sistem, hücre göçünün, gen ve protein ekspresyonunun kantitatif ve kalitatif değerlendirmesine izin verir. Model, ilaç keşfi için uygundur.

Ilaç keşfi için uygundur EMT araştırma için enzim ve serum içermeyen nöral kök hücre kültürü modeli

Mesane kanseri istila yönetim süreçleri biyomarker ve terapötik geliştirme fırsatları temsil eder. Burada hangi 3-b kültür tümör pulcuklarının, hızlandırılmış görüntüleme ve confocal mikroskobu birleştirmek bir mesane kanseri istila modeli mevcut. Bu teknik invaziv işlem özelliklerini tanımlamak için ve terapötik ajanlar süzmek için yararlıdır.

3-b hücre kültür sistemi istila eğitim ve Mesane kanserinde tedavi değerlendirmek için

Geçerli protokol kanser hücre göç ve gerçek zamanlı olarak tek bir platformda işgali araştırma, kolayca tekrarlanabilir ve zamanı verimli bir seçenek hücre hareketlilik ve morfoloji çalışmaya sağlayan entegre bir yöntemini açıklar.

Otomatik bir canlı hücre Imager kullanarak basit geçiş/işgali iş akışı

Bu tahlil, filizlenen anjiyogenezi in vitro olarak kontrol eden biyolojik süreçleri analiz etmek için 3D-kollajen jel içinde kültürlenmiş embriyoid cisimlere farklılaştırılmış fare embriyonik kök hücrelerini kullanır. Bu teknik, ilaçları test etmek, hastalıkları modellemek ve embriyonik olarak ölümcül olan delesyonlar bağlamında spesifik genleri incelemek için uygulanabilir.

In Vitro Vasküler Hastalık Modellemesi ve İlaç Testi için Fare Embriyonik Kök Hücreleri Kullanılarak Anjiyogenezin Üç Boyutlu Filizlenme Testi

İstila, kanserin gelişiminde ve ilerlemesinde önemli bir biyolojik olgudur. Bu süreç, neoplastik olmayan hücreler ve tümör mikroçevresinin bileşenleri tarafından etkilenir. Bu çalışmanın amacı, üç boyutlu (3D) kültürler kullanarak in vitro olarak tümör hücresi istilasını analiz etmek için alternatif bir yöntemi tanımlamaktır.

3D Kültürlerin İn Vitro Hücre İnvazyonunu Analiz Etmek İçin Alternatif Strateji

Keşfedin ters dikey işgal analizi ile üç boyutlu ortamda nadir ve hassas hücrelerin göç ve işgal kapasitelerini ölçme yöntemini. Bu teknik kanser araştırmalarında mikroçevreyi koruyarak ilaç taraması yapılmasına olanak tanır.

Yukarı doğru hareket: Bir basit ve esnek Vitro üç boyutlu işgali tahlil iletişim kuralı

Daha fazla video keşfet