Sürücü yolları için seyir elde hedefe yönelik tedavi direnci: ilaca dirençli Subclone üretimi ve duyarlılık Gene Knock-down tarafından geri yükleme

Bu klinik öncesi platformun genel amacı, hedefe yönelik tedavilere karşı kazanılmış direnci yönlendiren mekanizmaları tanımlamak ve karakterize etmek için standart bir prosedür sağlamaktır. Bu yöntem, onkolojide genom sürücüsünün uygulanmasına yardımcı olabilir, özellikle tümör heterojenliği ve hedefe yönelik tedaviye edinilmiş dirençten sorumlu çoklu mekanizmalar hakkındaki temel soruları ele alabilir. Bu tekniğin en önemli avantajı, hedefe yönelik tedaviye direnç mekanizmalarının in vitro olarak araştırılmasına olanak tanıyan zaman ve maliyet etkin yaklaşımıdır.

Bu tekniğin anlamı, akciğer direnci ortaya çıkan hedefe yönelik tedaviler için hala zorlayıcı olduğundan, kanser tedavisine kadar uzanır. Bu yöntem, hedefe yönelik tedavi direncinde rol oynayan mekanizma hakkında bilgi sağlayabilir, ancak aynı zamanda geleneksel kemoterapötik ajanların etkinliğini incelemek için de kullanılabilir. Genel olarak, bu yöntemi kullanan operatörler, standartlaştırılması en zor adım olan ilaca dirençli alt klonlar nesli ile sendeleyecektir.

Bu yöntem fikrini ilk olarak, HER pozitif mide kanseri hücre hatlarında trastuzumab'a karşı edinilmiş dirençli mekanizmayı karakterize ettiğimizde tasarladık. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü in vitro ilaca dirençli modellerin oluşturulması ve doğrulanması için gen yıkımı ile duyarlılığın geri kazanılması da dahil olmak üzere çeşitli tekniklere ihtiyaç vardır. Bu işleme başlamak için, NCI N87 hücrelerini 25 santimetre karelik kültür şişelerine tohumlayın.

Her şişedeki kültür ortamına mililitre trastuzumab başına 10 mikrogram ekleyin. Hücreleri büyümeye devam edene kadar bu başlangıç dozuna maruz bırakın. Hücre büyümesi yaklaşık iki hafta içinde yeniden başladıktan sonra, hücreleri mililitre konsantrasyon dozu başına yüz mikrogram trastuzumab'a maruz bırakın.

Trastuzumab konsantrasyonunu kademeli olarak artırmaya devam edin, her maruziyetten önce hücreler büyümeye devam edene kadar, mililitrede 400 mikrogramlık bir konsantrasyona ulaşılana kadar bekleyin. Bir hücre hattı, farklı ilaçlara karşı farklı bir duyarlılık gösterebilir. Bu soruna bir çözüm, hücreler büyümeye devam edene kadar plazma tepe konsantrasyonunun yaklaşık on katı bir dozdan başlayarak, hücreleri kademeli olarak artan ilaç dozlarına maruz bırakmaktır.

Daha sonra, hücreleri 24 çok kuyulu kültür plakasına tohumlayın. Tohumlanmış hücreleri mililitre başına 100 mikrogramdan mililitre başına 400 mikrograma kadar artan hedef tedavi inhibitörü konsantrasyonlarına maruz bırakın. 15 gün boyunca 37 santigrat derecede bir CO2 inkübatöründe inkübe edin.

Bundan sonra, ortamı çıkarın ve hücreleri 10 mililitre PBS-1X ile durulayın. PBS-1X'i çıkarın ve iki ila üç mililitre sabitleme solüsyonu ekleyin. 20 dakika sonra, sabitleme solüsyonunu çıkarın ve her bir oyuğa iki mililitre% 0.5 kristal viyole solüsyon ekleyin.

Oda sıcaklığında iki saat inkübe edin. Ardından, kristal viyole çözeltisini dikkatlice aspire etmek için bir pipet kullanın. Kalan kalıntıları durulamak için plakaları musluk suyuna batırın.

Oda sıcaklığında iki güne kadar havayla kurutun. Ardından, 50'den fazla hücre içeren kolonileri saymak için 4X büyütmede ters çevrilmiş bir mikroskop kullanın. Metin protokolünde belirtildiği gibi bağıl direnç IC50 oranını hesaplayın.

Başlamak için, metin protokolünde belirtildiği gibi tripsinizasyon yoluyla tek hücreli bir süspansiyon hazırlayın. Bir hemositometre ve Tripan Mavisi boyama kullanarak hücreleri sayın. Ardından, her koşul için bir T-25 şişesine 2,5 kez 10'a beş hücre tohumlayın.

Daha sonra, Minimal Esansiyel Transfeksiyon Ortamında siRNA oligonükleotid veya negatif kontrol siRNA oligonükleotidini hedefleyen her gen hedefleme siRNA oligonükleotidinden 12.5 mikrolitre seyreltin. Oligonükleotidlerle 1: 1 oranında bir katyonik lipozom transfeksiyon reaktifi ekleyin. Oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.

Bundan sonra, her bir T-25 şişesine 700 mikrolitre transfeksiyon karışımı ekleyin. Bir ila üç gün boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Gen yıkımını doğrulamak için RT-PCR ve Western Blot analizini kullanın.

Daha sonra, hücreleri 24 çok kuyulu kültür plakasına tohumlayın. Hücreleri mililitre başına 100 mikrogramdan mililitre başına 400 mikrograma kadar artan hedef tedavi inhibitörü konsantrasyonlarına maruz bırakın. Gen yıkımının etkinliği için, siRNA oligonükleotidlerinin hedef ekspresyonunu azaltmak için spesifik olması gerekir.

Tasarlanan araçlar ve siRNA'nın ölçülmesi bu amaç için aynı hedef gen idi. 15 gün boyunca 37 santigrat derecede bir CO2 inkübatöründe inkübe edin. Ortamı çıkarın ve hücreleri 10 mililitre PBS-1X ile durulayın.

PBS'yi çıkardıktan sonra, iki ila üç mililitre sabitleme çözeltisi ekleyin. Ardından, sabitleme solüsyonunu çıkarın ve% 0.5 kristal viyole solüsyonu ekleyin. Oda sıcaklığında iki saat inkübe edin.

Bir pipet kullanarak kristal viyole çözeltisini dikkatlice aspire edin. Ardından, plakaları musluk suyuna batırın. Oda sıcaklığında iki güne kadar havayla kurutun.

Bundan sonra, 50'den fazla hücre içeren kolonileri saymak için 4X büyütmede ters çevrilmiş bir mikroskop kullanın. Bu çalışmada, yüksek düzeyde HER2 eksprese eden ve trastuzumab'a duyarlı üç mide kanseri hücre hattı, hedeflenen terapötik ajanları içeren bir kültür ortamında büyütülmüştür. Bundan, kararlı bir dirençli fenotip ile karakterize edilen üç alt klon elde edilir.

Alt klonlardan HR NCI N87'nin, 28.57'lik bir Bağıl Direnç IC50'ye ulaşan en dirençli olduğu görülmektedir. Protein ve gen ekspresyonunun analizi, IQGAP1 geninin HR NCI N87 alt hattının direnç fenotipinde çok önemli bir rol oynadığı hipotezini desteklemektedir. Burada gösterildiği gibi, IQGAP1 protein seviyesi, dirençli alt klonda ebeveyn hücrelere göre beş kat daha katmanlıdır.

Ve IQGAP1 gen ekspresyonu, HR NCI N87 alt hattında orijinal alt klona göre 2,5 kat daha katmanlıdır. IQGAP1 geni susturma daha sonra trastuzumab direnç fenotipinin gelişimindeki rolünü değerlendirmek için gerçekleştirilir. Klonojenik bir tahlil, IQGAP'ın önemi hipotezini daha da doğrulamaktadır.

Burada görüldüğü gibi, gen susturma, hücrenin trastuzumab'a duyarlılığını geri kazandırır ve IC50 değerini mililitre başına yedi mikrograma düşürür. Bu prosedür hakkında ne düşündüğüm, ilaca dirençli hücre alt klonları elde etmenin genellikle kolay olmadığını akılda tutmak önemlidir. Ve bu yöntemin potansiyel bir başarısızlık riski taşıdığını.

Bu prosedür sayesinde, hedef tedavilere karşı kazanılmış direnci yönlendiren farklı mekanizmalarla karakterize edilen birkaç klon hücresi elde etmek mümkündür. Hedef tedavi direncinin in vitro modellemesi için standart prosedürün geliştirilmesi, bir onkoloji araştırmacısının, en yeni nesil tedavilere yönelik en büyük eleştiri olan ilaç direncinin üstesinden gelmek için yeni ilaç destekli hedefi araştırmasına izin vermelidir.