Name: Sürücü yolları için seyir elde hedefe yönelik tedavi direnci: ilaca dirençli Subclone üretimi ve duyarlılık Gene Knock-down tarafından geri yükleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Keşfedin, hedefe yönelik tedavilere karşı kazanılmış direnç mekanizmalarını in vitro yöntemlerle nasıl tanımlayacağınızı. Bu protokol, tümör heterojenitesini anlamak ve kanser tedavisinde direnç alt klonlarını üretmek için zaman ve maliyet açısından etkili bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Dr Veronica Zanoni el yazması düzenleme için teşekkür etmek istiyorum.

Not: Bu protokol özellikle trastuzumab HER pozitif mide kanseri hücre hatları için Edinsel direnç yatan mekanizmaları analizi için ayarlandı. Bütün Laboratuvar Cihazları gerekli Malzemeler tablorapor edilir.
1. nesil hedefli tedavi dayanıklı Subclones
Not: Bu en kritik ve gerçeğini farklı hücre hatları farklı hassasiyetleri için hedeflenmiş tedavi inhibitörü bağımsız olarak kendi tümör histotype ya da ilaç konsantrasyonu sergileyebilirler nedeniyle adım protokolündeki standartlaştırmak zor olduğunu kullanılan.
<ol><li>Kültür ncı N87 cep RPMI Orta olarak 37 ° C'de monolayer fetal buzağı serum (% 10) ve glutamin (2 mM, % 1), takıma giriş ve 25 cm2 kültür şişeler tohum.</li>
	<li>Her şişeye 10 µg/mL trastuzumab kültür ortamında başlangıç dozu ekleyin. Büyüyen yeniden başlatana kadar başlangıç dozu için hücreleri göstermek. Not: Hedefe yönelik tedavi inhibitörü başlangıç dozunun 10 kat onun plazma en yüksek konsantrasyonu düşük olmalıdır. Plazma en yüksek konsantrasyonu genellikle birden fazla doz standart tedavisinin ardından hastanın kanında tespit ilaç konsantrasyonu en yüksek düzeyidir. Bu değer farmakokinetik üzerine çalışmalar alınabilir.</li>
	<li>Hücre büyümesini trypan mavi dışlama yöntemi ile izlemek; (genellikle bir süre 2-3 hafta sonra) hücre büyümesini devam zaman trastuzumab 10 kat daha yüksek doz konsantrasyon için hücreleri göstermek.</li>
	<li>Yüksek ilaç konsantrasyonu (en az 2.5 - 4'e katlanmış plazma pik yüksek) varlığı rağmen (yaklaşık 2 hafta sonra) büyüyen hücreler tutmak kadar hücreleri trastuzumab (üzerinden 100 µg/mL 400 µg/ml) yavaş yavaş artan bir doz için göstermek.</li>
	<li>
Aşağıdakinin her değişiminde hedef terapi inhibitörü kültür orta yoğunlukta hedefe yönelik tedavi direnç düzeyini değerlendirmek için klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar tahlil gerçekleştirmek ve göreli direnç IC50 Endeksi (RR IC50) aşağıdaki gibi tanımlayın.
	<ol>
<li>24 çok iyi kültür plakaları 500 hücrelerde tohum. Not: 5 kuyu her koşul kümesi için hazırlanmalıdır.</li>
		<li>Hücreleri artan hedef terapi inhibitörü (trastuzumab) konsantrasyonları için 100 µg/mL 400 µg/mL kadar--dan göstermek.</li>
		<li>Hücreleri bir CO2 kuluçka 37 ° C'de 15 gün kuluçkaya.</li>
		<li>Kuluçka sonra tamir ve örnekler aşağıdaki gibi leke.<ol>
<li>10 mL 1 x PBS ile orta ve durulama hücre kaldırma. 1 x PBS kaldırın ve 2-3 mL fiksasyon çözeltisi (Asetik asit: metanol, 1:7, (vol/vol)) ekleyin. Fiksasyon çözüm kaldırın ve % 0,5 kristal violet çözüm ekleyin. 2 h için oda sıcaklığında kuluçkaya</li>
			<li>Kristal violet çözüm bir pipet ile alıyorum tarafından dikkatli bir şekilde çıkarın ve plakaları herhangi bir kristal violet çözüm artıkları durulama için musluk suyundaki batırmayın. Oda sıcaklığında 2 güne kadar kuruması.</li>
		</ol>
</li>
		<li>50'den fazla hücre (4 X büyütme) ters bir mikroskop kullanarak koloniler sayılır. Not: İki bağımsız gözlemciler bunun için ihtiyaç vardır.</li>
		<li>RR IC50 ŞA50 değeri hedef terapi dayanıklı subclone hücre ve orijinal/saf hücre değeri arasındaki oran olarak hesaplayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. doğrulama protokolü aday için tedavi direnci gen (R-gen) hedef
Not: gen ekspresyonu karakterizasyonu sonra imzalar ile ilişkili hedef terapi ve herhangi bir aday gen için Edinsel direnç gibi sürücü direnç üzerinden araştırılır: a) RT-PCR ve b) Western blot analizi.
<ol><li>
Gerçek zamanlı RT-PCR
	<ol>
<li>Toplam RNA asit guanidinium thiocyanate-fenol-kloroform karışımı kullanarak hücre satırlarından ayıklamak ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
		<li>Rastgele hexamer primerler kullanılarak ters transkripsiyon (RT) reaksiyonları gerçekleştirmek ve termal cycler aşağıdaki gibi ayarlayın: 5 min, RT 20 dk 46 ° C'de ve RT inactivation 95 ° c için 1 dakika için 25 ° C'de priming.</li>
		<li>20 µL tepki için toplam RNA'ın kullanım 400 ng. Örnek için aşağıdaki gibi tepki karışım hazırlamak: 7 µL RNase free H2O 2 µL cDNA (10 ng/µL), hedef özgü sonda floresan etiketli x 1 µL 20 ve 10 µL 2 x karışımı içeren arabellek, dNTPs ve DNA polimeraz (bkz: Malzemeler tablo).</li>
		<li>Her iyi plakasına 20 µL tepki karışımı ekleyin ve aşağıdaki programı çalıştır: sahne 10 dk (1 dönüşü); 95 ° C'de 2 min için 50 ° C'de tutan o zaman 40 devredir 95 ° C'de 15 s ve 60 ° c için 1 dakika.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Batı leke
	<ol>
<li>2 mL % 0.05 tripsin/EDTA çözeltisi ekleyip 2-3 dk tripsin çalışmak için izin hücre süspansiyonlar kurtarmak.</li>
		<li>Tripsin (örneğin, orta tripsin her 1 mL için 2 mL) etkisiz hale getirmek ve 1200 x g 5 dakika süreyle de atma süpernatant ve yıkama soğuk 1 x PBS hücrelerle santrifüj kapasitesi için orta içeren % 10 fetal sığır serum 2 cilt ekleyin.</li>
		<li>1200 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. Hücre Pelet lizis arabelleği ile resuspend ve 30 dk için 4 ° C'de bir rocker üzerinde kuluçkaya.<ol>
<li>Lizis arabellek hücreler (örneğin, 1 x 106 hücreler için 100 µL); sayısına bağlıdır her zaman taze lizis arabellek hazırlamak emin olun. 1 mL lizis arabellek hazırlık (buz izinde) için: 975 µL M kullanın-memeli lysate arabellek, 15 µL fosfataz ve proteaz inhibitörleri ve 10 µL 100 µM PMSF inhibitörleri başına.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Hücre lysate Santrifüjü 15dk için 4 ° C'de 13.000 x g de tarafından süpernatant protein kurtarmak.</li>
		<li>Protein konsantrasyonları BCA protein tahlil kullanarak belirleyin.</li>
		<li>4 x LaemmLi örnek arabellek protein örnekleri (en az 20-30 µg protein) ve 3 dk 100 ° C'de ısı ekleyin.</li>
		<li>20-30 µg LaemmLi protein çözüm ve 5-10 µL protein örnek standart yük ve prekast 4-%20 jeller kullanabilirsiniz.</li>
		<li>Western blot yüzük TRIS/GLICYNE /SDS 1 x arabellek ile doldurun ve (zaman aksi takdirde birkaç ek dakika çalıştırılır jel boya ulaştı onay durduğunda) jel 110 V 30-60 dakika çalıştırın</li>
		<li>Electroblot protein PVDF membran aktarmak için (bkz. Tablo reçetesi) yarı kuru sistem kullanarak.</li>
		<li>Membran üzerinde oda sıcaklığında shaker 1 h için uygun protein çözüm (süt/BSA % 5) ıslatarak engelleyin.</li>
		<li>1: 400 çözüm anti-IQGAP1 birincil antikor ile %5 süt çözeltilerine olun ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
		<li>Membran birincil antikor çözüm üzerinde bir shaker soğuk bir odada gece yerleştirin.</li>
		<li>Ertesi gün, antikor çözüm atmak ve T-TBS 1 x çözümde emmek (1 x T-TBS: Tris tuzlu arabellek eklendi 1 x Tween20 tarafından % 0,1) oda sıcaklığında bir shaker 7 min için üzerinde.</li>
		<li>T-TBS 1 çözüm ve Değiştir atın. 3 kez tekrarlayın.</li>
		<li>Algılama leke için standart Western antikor ekleyerek 1:10,000 ikincil fare-antikor yapmak a eriyik ( Tablo malzemelerigörmek) ve membran üzerinde bir shaker; 2 h için oda sıcaklığında bırakın.</li>
		<li>Antikor çözüm atmak ve T-TBS 1 x çözüm üzerinde 7 dakika oda sıcaklığında bir shaker içinde ıslatın.</li>
		<li>T-TBS 1 çözüm ve Değiştir atın. 3 kez tekrarlayın.</li>
		<li>Membran 5 min için chemiluminescent bir çözümde emmek ve membran Kemiluminesan Imager üzerinde görüntü.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. geri yükleme hedef-terapi inhibitörü duyarlılık tarafından aday R-gen Knock-down
<ol><li>
Hücre hazırlık
	<ol>
<li>Tek hücre süspansiyon tarafından trypsinization hazırlayın. Transfection hücreleri kaplama gününde gerçekleştirin.<ol>
<li>Yıkama ncı-N87 PBS ile hücreleri ve 5-10 dakika ekleyin 2 birim (örneğin, orta tripsin her 1 mL için 2 mL) tripsin nötralize etmek için RPMI orta içeren % 10 fetal sığır serum için % 0.05 tripsin/EDTA çözüm ile 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
			<li>Trypan mavi boyama kullanarak bir hemasitometre ile hücreleri hesaplama. Her koşul için bir T25 cm2 şişe üzerine tohum 2.5 x 105 hücreleri (%60 izdiham). Not: Uygun için tohum hücrelerinin hücre satır katlama zaman ve deneme süresi tarafından belirlenir. Amaç hedef gen knock-down deneme süresi boyunca elde etmektir. Dokuz T25 cm2 şişe transfection koşulları ve klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar tahlil (denetimler, negatif transfection denetimleri, gen-hedef transfection için 3 Şişeler için 3 Şişeler için 3 şişe) için idealdir.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Geriye doğru transfection
	<ol>
<li>Gen-hedef hazırlamak ve denetim transfection karışımı her T25 cm2 şişe için aşağıdaki gibi negatif.<ol>
<li>Her gen hedefleme siRNA oligonucleotides veya negatif kontrol siRNA oligonucleotides en az önemli transfection orta (oranı 1:55; bkz: Malzemeler tablo) 12.5 µL sulandırmak.</li>
			<li>Katyonik lipozom transfection reaktifi (gen hedefleme siRNA oligonucleotides ile 1:1 oran; bkz: Malzemeler tablo) ekleyin. 20 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya. Not: Toplam transfection Mix 700 µL birimdir.</li>
			<li>Transfection Mix 700 µL her T25 cm2 şişe ekleyin. 37 ° C'de hücreler 1-3 gün kuluçkaya.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Gen knock-down RT-PCR ve Western blot analizi doğrulayın. Sözde R-gen knock-down (tekrar adım 1.5) koloni oluşumu deneyler yoluyla hedeflenen terapötik ajan için duyarlılık restorasyon üzerinde etkisini bir kez daha denetleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Gerber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+therapies%3A+a+new+generation+of+cancer+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Fam+Physician%22%5BJournal%5D)">Targeted therapies: a new generation of cancer treatments.</a> Am Fam Physician. 77 (3), 311-319 (2008).</li>
<li>Zhang, J., Yang, P. L., Gray, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cancer+with+small+molecule+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting cancer with small molecule kinase inhibitors.</a> Nat Rev Cancer. 9 (1), 28-39 (2009).</li>
<li>Nelson, A. L., Dhimolea, E., Reichert, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+trends+for+human+monoclonal+antibody+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Development trends for human monoclonal antibody therapeutics.</a> Nat Rev Drug Discov. 9 (10), 767-774 (2010).</li>
<li>Chabner, B. A., Roberts, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timeline%3A+Chemotherapy+and+the+war+on+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Timeline: Chemotherapy and the war on cancer.</a> Nat Rev Cancer. 5 (1), 65-72 (2005).</li>
<li>Gilbert, L. A., Hemann, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapeutic+resistance%3A+surviving+stressful+situations%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Chemotherapeutic resistance: surviving stressful situations.</a> Cancer Res. 71 (15), 5062-5066 (2011).</li>
<li>Izar, B., Rotow, J., Gainor, J., Clark, J., Chabner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetics%2C+clinical+indications%2C+and+resistance+mechanisms+in+molecular+targeted+therapies+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetics, clinical indications, and resistance mechanisms in molecular targeted therapies in cancer.</a> Pharmacol Rev. 65, 1351-1395 (2013).</li>
<li>Ellis, L. M., Hicklin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+Targeted+Therapies%3A+Refining+Anticancer+Therapy+in+the+Era+of+Molecular+Oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Resistance to Targeted Therapies: Refining Anticancer Therapy in the Era of Molecular Oncology.</a> Clin Cancer Res. 15 (24), 7471-7478 (2009).</li>
<li>Asić, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominant+mechanisms+of+primary+resistance+differ+from+dominant+mechanisms+of+secondary+resistance+to+targeted+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Oncol+Hematol%22%5BJournal%5D)">Dominant mechanisms of primary resistance differ from dominant mechanisms of secondary resistance to targeted therapies.</a> Crit Rev Oncol Hematol. 97, 178-196 (2016).</li>
<li>Arienti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+evidence+of+multiple+mechanisms+underlying+trastuzumab+resistance+in+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Preclinical evidence of multiple mechanisms underlying trastuzumab resistance in gastric cancer.</a> Oncotarget. 7 (14), 18424-18439 (2016).</li>
<li>Tanner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+HER-2+in+gastric+carcinoma%3A+association+with+Topoisomerase+IIalpha+gene+amplification%2C+intestinal+type%2C+poor+prognosis+and+sensitivity+to+trastuzumab%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Amplification of HER-2 in gastric carcinoma: association with Topoisomerase IIalpha gene amplification, intestinal type, poor prognosis and sensitivity to trastuzumab.</a> Ann Oncol. 16 (2), 273-278 (2005).</li>
<li>Bang, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trastuzumab+in+combination+with+chemotherapy+versus+chemotherapy+alone+for+treatment+of+HER2-positive+advanced+gastric+or+gastro-oesophageal+junction+cancer+%28ToGA%29%3A+a+phase+3%2C+open-label%2C+randomised+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastro-oesophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, open-label, randomised controlled trial.</a> Lancet. 376 (9742), 687-697 (2010).</li>
<li>ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01130337. A Study of Capecitabine [Xeloda] in Combination With Trastuzumab [Herceptin] and Oxaliplatine in Patients With Resectable Gastric Cancer. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://clinicaltrials.gov/show/NCT01130337">http://clinicaltrials.gov/show/NCT01130337</a> (2017).</li>
<li>ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01748773. A Study of the Combination of Oxaliplatin, Capecitabine and Herceptin (Trastuzumab) and Chemoradiotherapy in The Adjuvant Setting in Operated Patients With HER2+ Gastric or Gastro-Esophageal Junction Cancer (TOXAG Study). , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.clinicaltrials.gov/show/NCT01748773">http://www.clinicaltrials.gov/show/NCT01748773</a> (2017).</li>
<li>ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01472029. Explorative Phase II Study of Perioperative Treatment in Patients With Adenocarcinoma of the Gastroesophageal Junction or Stomach (HerFLOT). , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01472029">http://www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01472029</a> (2017).</li>
<li>ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01196390. Radiation Therapy, Paclitaxel, and Carboplatin With or Without Trastuzumab in Treating Patients With Esophageal Cancer. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://clinicaltrials.gov/show/NCT01196390">http://clinicaltrials.gov/show/NCT01196390</a> (2017).</li>
<li>Shimoyama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+trastuzumab+and+lapatinib+inefficiency+in+gastric+cancer%3A+Future+steps+%28Review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Unraveling trastuzumab and lapatinib inefficiency in gastric cancer: Future steps (Review).</a> Mol Clin Oncol. 2 (2), 175-181 (2014).</li>
<li>Kelly, C. M., Janjigian, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomics+and+therapeutics+of+HER2-positive+gastric+cancer-from+trastuzumab+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gastrointest+Oncol%22%5BJournal%5D)">The genomics and therapeutics of HER2-positive gastric cancer-from trastuzumab and beyond.</a> J Gastrointest Oncol. 7 (5), 750-762 (2016).</li>
<li>Wong, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+landscape+and+genetic+heterogeneity+in+gastric+adenocarcinoma+revealed+by+whole-genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Genomic landscape and genetic heterogeneity in gastric adenocarcinoma revealed by whole-genome sequencing.</a> Nat Commun. 5, 5477(2014).</li>
<li>Oshima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lapatinib+sensitivities+of+two+novel+trastuzumab-resistant+HER2+gene-amplified+gastric+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Gastric+Cancer%22%5BJournal%5D)">Lapatinib sensitivities of two novel trastuzumab-resistant HER2 gene-amplified gastric cancer cell lines.</a> Gastric Cancer. 17 (3), 450-462 (2014).</li>
<li>Pignatta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+exposure+to+%28R%29-bicalutamide+generates+a+LNCaP+subclone+with+alteration+of+mitochondrial+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Prolonged exposure to (R)-bicalutamide generates a LNCaP subclone with alteration of mitochondrial genome.</a> Mol Cell Endocrinol. 382 (1), 314-324 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Kişiselleştirilmiş ve hedeflenmiş tedaviler büyüyen coşku elicited, bu sözde 'akıllı' tedaviler geleneksel kemoterapi ilaçları, Yani, ilaç direnci hızlı ve öngörülemeyen edinimi olarak aynı büyük engel yüz. Hedefe yönelik tedavi sonuçlarını geliştirmek için ilaç direnci sorunları onları neden mekanizmaları daha iyi bir anlayış ile çözülmesi gerekir. Burada, biz hedefe yönelik tedavi ilaçlar kanser hücre satırı modellerinde Edinsel direnç mekanizmaları araştırmak için yaygın olarak erişilebilir vitro met...

Moleküler ve hücre biyolojisi çok önemli keşifler üzerinde takip, bir dizi yeni sentezlenmiş antikanser molekülleri seçmeli olarak tümör türleri geniş bir dizi oncogenic sinyal yollar hedeflemek için geliştirilmiştir. Özellikle, Onkoloji benzersiz özellikleri ile hedeflenen terapötik ajanlar iki kategoriye, yani sentetik kimyasal maddeler ve birleşimler ve rekombinant monoklonal antikorlar, klinik başarı ve önemli ölçüde değişmiş kanser bakımında elde ettik bilinmektedir son yıllarda1,2,3.
Yine de, onların etkileyici ilk tepki rağmen tedavi, kanser hastalarının çoğunluğu ilaç direnci tüm hedeflenen terapötik ajanlar, Monoklonal antikor ve kinaz inhibitörleri ile geliştirdik. Sonuç olarak, ilaç direnci, klasik Anti-kanser ilaçlar4için büyük engel hala gelişmekte olan hedefli tedaviler5,6için büyük bir mücadele var.
Hedefe yönelik tedavi direnci içsel olabilir (örneğin, birincil) veya (örneğin, ikincil) satın aldı. Yanıt-e doğru ilaç tedavisi7bir süre sonra ikincil direnç oluşur, ancak iç direnci tedaviye, yanıt de novo eksikliği açıklar. İkinci veya distal şifreli anatomik nişler içinde yer alan küçük tabur toplu ilkel tümör içindeki tümör hücreleri salgınları neden olduğu, % 90'a kadar sergileyen direnç birine veya daha fazlasına terapötik ajanlar hedef. Moleküler mekanizmalar hedefe yönelik tedavi için bir direnç geliştirme ağırlıklı olarak temel hedef gen mutasyonlarının ve hala tam8çok uzak olan anlayıştır diğer yanlısı hayatta kalma sinyal yolları gereksiz aktivasyonu neden.
Bu çalışmada, biz vitro mekanizmaları hedeflenen terapötik ajanlar, ilaca dirençli hücresel subclones nesilden damping açıklamaya başlayarak Edinsel direnç araştırmak için bir zaman ve cost effective yaklaşım önerdi duyarlılık engelleyici, test ve çalışma hipotezler doğrulama için kullanılan çok önemli bir aracı geri yüklemek için kullanılan yordamlar. Özellikle, bizim yaklaşım, mide kanseri, direnç mekanizmaları trastuzumab (örneğin, Herceptin), bir insanlaşmış Monoklonal antikor HER2 protein9ekstrasellüler etki alanı hedefleme için araştırmaya kullanıldı. Trastuzumab + kemoterapi yaygın HER2-pozitif metastatik meme kanseri için Standart birinci basamak tedavi olarak kabul edilir. Bu anti-HER2 gösterilen son preklinik çalışmalar sayesinde tedaviler önemli etkinliği içinde her iki vitro var ve in vivo HER2-pozitif mide kanseri10,11modelleri, moleküler uyuşturucu HER2 hedefleme olmuştur kapsamlı klinik çalışmalar incelendiğinde, bazıları Gastroözofageal kanser12,13,14,15olan hastalar üzerinde hala devam etmektedir.
Bu çalışmalar benzer şekilde ne için hedeflenen diğer tedavi inhibitörleri görülmektedir trastuzumab16, direnç karşılaşan hastaların artan sayıda vurgulamıştık. Özellikle, trastuzumab yanıt oranı % 47, ve ortalama genel sağkalım trastuzumab + kemoterapi hastalar için sadece 2,7 ay kemoterapi yalnız17hastalar için daha uzun oldu. Bu birincil trastuzumab direnç yaygın olmakla birlikte, ikincil trastuzumab direnç kaçınılmaz olduğunu ileri sürdü. Bu nedenle, içi tumoral genetik heterojenite bu neoplazi18göz önüne alındığında daha da sorunlu olan mide Kanserinde HER2 hedefli tedavi direnci neden mekanizmaları netleştirmek için acil bir ihtiyaç vardır.
Buna ek olarak, trastuzumab mide Kanserinde direnç mekanizmaları güvenilir preklinik modelleri temsilcisi bu durumun elde zorluk nedeniyle, kısmen açıklamak zor kanıtlamıştır. Oshima ve ark. trastuzumab dayanıklı mide kanseri hücre hatları, küçük bir kalıntı Periton metastaz tekrarlanan bir kültürünün trastuzumab19ile tedavi sonrası oluşan bir vivo içinde seçim yöntemi bildirdi. Ancak, bir muhafaza, belirli hayvan işleme uzmanlık ve hayvan Etik Kurulu onayı ihtiyacı zaman ve maliyet alıcı yöntemi yapmak için katkıda bulunmuştur. Biz bu çalışmada tarif yaklaşım basit ve yaygın olarak uygulanabilir ve kolayca farklı tümör histotypes20tedavi diğer ilaçlara direnç mekanizmaları incelemek için uzun olabilir.

<table><tbody><tr><td>Trizol Reaktifi</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td>TRIzol Reaktifi, yüksek kaliteli toplam RNA'yı izole etmek veya çeşitli biyolojik örneklerden RNA, DNA ve proteini aynı anda izole etmek için kullanılan bir reaktiftir</td></tr><tr><td>ISCRIPT CDNA sentez kiti</td><td>Bio-Rad</td><td>1708891</td><td>iScript cDNA sentez kiti, gerçek zamanlı qPCR kullanarak gen ekspresyon analizi için hassas ve kullanımı kolay bir birinci sarmallı cDNA sentez kitidir.</td></tr><tr><td>TaqMan gen ekspresyon testi</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>4331182</td><td>Uygulamalı Biyosistemler TaqMan Gen Ekspresyon Testleri, bir çift etiketlenmemiş PCR primeri ve 5' ucunda Applied Biosystems FAM veya VIC boya etiketi bulunan bir TaqMan probundan ve 3' ucunda küçük oluk bağlayıcı (MGB) ve floresan olmayan söndürücüden (NFQ) oluşur.</td></tr><tr><td>M-PER Memeli Protein Ekstraksiyon Reaktifi</td><td>Thermo Scientific</td><td>78501</td><td>Thermo Scientific M-PER Memeli Protein Ekstraksiyon Reaktifi, kültürlenmiş memeli hücrelerinden yüksek verimli toplam çözünür protein ekstraksiyonu sağlamak üzere tasarlanmıştır.</td></tr><tr><td>Halt Proteaz ve Fosfataz İnhibitör Kokteyli (100X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>78440</td><td>Thermo Scientific Halt Proteaz ve Fosfataz İnhibitör Kokteyli (100X), hücre ve doku lizatları için tam protein örneği koruması ile tek bir çözeltinin rahatlığını sağlar.</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Test Kiti</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>Thermo Scientific Pierce BCA Protein Test Kiti, bir protein standardına kıyasla toplam protein konsantrasyonunu (A562nm) ölçmek için ayarlanmış, iki bileşenli, yüksek hassasiyetli, deterjanla uyumlu bir tahlil reaktifidir.</td></tr><tr><td>4x Laemmli Numune Tamponu</td><td>Bio-Rad</td><td>1610747</td><td>SDS PAGE için numunelerin hazırlanması için 4x Laemmli Numune Tamponu kullanın. Numunelerin azaltılması için, numune ile karıştırmadan önce tampona 2-merkaptoetanol gibi bir indirgeyici madde ekleyin.</td></tr><tr><td>4&ndash; %20 Mini-PROTEAN TGX Prekast Protein Jelleri</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1094</td><td>Uzun Ömürlü TGX (Tris-Glycine eXtended) Jeller yeni bir formülasyona sahiptir ve hem standart denatüre edici protein ayrımları hem de doğal elektroforez için kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Precision Plus Protein WesternC Blotting Standartları</td><td>Bio-Rad</td><td>1610376</td><td>Precision Plus Protein Prestained Standartları, Çift Renkli, Tüm Mavi, Kaleydoskop ve Çift Xtra formatlarında mevcuttur. Dördü de 3 yüksek yoğunluklu referans bandı (25, 50 ve 75 kD) ile aynı jel migrasyon modellerine sahiptir.</td></tr><tr><td>10x Tris/Glisin/SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td>10x Tris/glisin/SDS, protein örneklerini SDS-PAGE ile ayırmak için önceden karıştırılmış bir çalışma tamponudur.</td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Paketleri Trans-Blot Turbo Transfer Sistemini</td> kullanarak mini jellerden proteinlerin hızlı ve verimli bir şekilde aktarılması için <td>Bio-Rad</td><td>1704156</td><td>Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Paketleri. Her vakumla kapatılmış, kullanıma hazır transfer paketi, iki tamponla doymuş iyon rezervuar yığını ve önceden ıslatılmış bir PVDF membranı içerir.</td></tr><tr>Precision Plus <td>Protein Boyanmamış Protein Standartlarının veya Precision Plus Protein WesternC Protein Standartlarının batı lekelerinde kemilüminesan veya kolorimetrik tespiti için Precision Protein StrepTactin-HRP Konjugatı Bio-Rad 1610381 StrepTactin-Yaban Turpu Peroksidaz (HRP) Konjugatı.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immun-Star WesternC solüsyonu</td><td>Bio-Rad</td><td>5572</td><td>Bir protein tayini yöntemi olan Immun-Star WesternC solüsyonu, proteinin orta femtogram miktarlarını tespit eder.</td></tr><tr><td>Evrensel Negatif Kontrol</td><td>İnvitrojeni</td><td>12935300</td><td>Negatif Kontrol siRNA'nın fare, sıçan veya insan gen dizilerine önemli bir dizi benzerliği yoktur. Kontrol ayrıca hücre bazlı ekranlarda test edilmiş ve hücre proliferasyonu, canlılığı veya morfolojisi üzerinde önemli bir etkisi olmadığı kanıtlanmıştır.</td></tr><tr><td>opti-MEM Glutamax Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51985026</td><td>Opti-MEM Medium, büyüme hızında veya morfolojide herhangi bir değişiklik olmaksızın Fetal Sığır Serumu takviyesinin en az %50 oranında azaltılmasına izin veren geliştirilmiş bir Minimal Esansiyel Ortamdır (MEM).</td></tr><tr><td>Susturucu Seçimi Önceden Tasarlanmış & Doğrulanmış siRNA</td><td>Ambion</td><td>4390824</td><td>RNA girişimi (RNAi), çok çeşitli hücre tiplerinde protein fonksiyonunu incelemek için gen ekspresyonunu etkili bir şekilde yıkmanın en iyi yoludur.</td></tr><tr><td>Lipofektamin RNAiMAX Transfeksiyon Reaktifi</td><td>Invitrogen</td><td>13778075</td><td>Lipofektamin RNAiMAX Transfeksiyon Reaktifi, siRNA iletimi için gelişmiş, verimli bir çözüm sunar. Başka hiçbir siRNA'ya özgü transfeksiyon reaktifi, yaygın hücre tipleri, kök hücreler ve birincil hücrelerin yanı sıra geleneksel olarak transfekte edilmesi zor hücre tipleri dahil olmak üzere çok çeşitli hücre hatlarında bu kadar kolay ve verimli siRNA iletimi sağlamaz.</td></tr><tr><td>Fare anti-IQGAP1</td><td>Invitrigen</td><td>33-8900</td><td>çalışma konsantrasyonu:% 5 süt çözeltisinde 1:400</td></tr><tr><td>keçi anti-fare IgG-HRP: sc-2005</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2005</td><td>çalışma konsantrasyonu:% 5 süt çözeltisinde 1: 10000</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P 7626</td> bu, RT-PCR MJ Araştırması için serin <td>proteazlar ve asetilkolinesteraz Thermocycler'ın bir inhibitörüdür</td></tr><tr><td></td><td></td><td>MJ Research MJ Research PTC-200 Termal Döngüleyici</td><td>, sıcaklık homojenliği ve 3 dereceye kadar rampa hızı sağlar; C/sn'dir. Protokol diğer termal döngüleyicilerle de gerçekleştirilebilir</td></tr><tr><td>Gerçek Zamanlı RT-PCR cihazı</td><td>Applied Biosystems</td><td>7500 RT-PCR sistemi</td><td>Bu, karşılaştırmalı CT tahlil tipi kullanarak nispi bir miktar tayini sağlamak için floresan bazlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) reaktifleri kullanan beş renkli bir platformdur. Protokol diğer termal döngüleyicilerle de yapılabilir</td></tr><tr><td>Mikrohacim Spektrofotometreleri</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop</td><td>Az miktarda numune kullanarak doğru ve hızlı bir asit nükleid ölçümü sağlar</td></tr><tr><td>Blotting sistemi</td><td>Bio-Rad</td><td>Trans-Blot Turbo sistemi</td><td>Birkaç dakika içinde semy-dry transferi gerçekleştirir</td></tr><tr><td>Görüntü elde etme sistemi ve jel dokümantasyonu</td><td>Bio-Rad</td><td>Chemidoc görüntüsü sistem</td><td>Kemilüminesan tespiti için kullanımı kolaydır</td></tr></tbody></table>

sürücü yolları için seyir elde hedefe yönelik tedavi direnci: ilaca dirençli subclone üretimi ve duyarlılık gene knock-down tarafından geri yükleme

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

Son yirmi yılda hedefe yönelik tedavi tıbbi Onkoloji sitotoksik ilaçların bir kayma gördüm. Hedeflenen terapötik ajanlar daha etkileyici klinik etkinliğinin ve geleneksel tedaviler daha simge durumuna küçültülmüş olumsuz etkileri göstermiştir rağmen ilaç direnci kendi yararları için ana sınırlama haline gelmiştir. Preklinik/tüp bebek/içinde vivo modelleri çeşitli klinik pratikte hedeflenen acentelere Edinsel direnç esas olarak iki stratejileri kullanarak geliştirilmiştir: genotip Edinsel direnç ve II) tüp bebek modelleme i) genetik manipülasyon / içinde vivo dayanıklı modeller yelpazesi. Mevcut çalışma, birleştirici bir çerçeve temel mekanizmaları hedeflenen terapötik ajanlar, ilaca dirençli hücresel subclones nesilden açıklaması için başlangıç için Edinsel direnç sorumlu soruşturma için Önerdiğimiz duyarlılık için engelleyici geri yüklemek için kullanılan yordamlar susturmak. Bu basit zaman ve cost effective yaklaşım yaygın olarak uygulanabilir ve kolayca farklı tümör histotypes diğer hedefli tedavi ilaçlara direnç mekanizmaları incelemek için uzun olabilir.

Şekil 1 deneysel işlemin çerçevesinde özetliyor. Üç mide kanseri hücre-çizgi HER2 ve duyarlı trastuzumab için yüksek düzeyde ifade (IC50 &lt; en yüksek plazma düzeyini uyuşturucu, şekil 2A, sol grafik) kültür hedeflenen terapötik ajan içeren ortamda yetiştirilmiştir. Bir doz daha trastuzumab (10 µg/mL) en yüksek plazma konsantrasyonu başlangıç dozu ayarla ve yavaş yavaş artan 400 µg/mL 8-12 aylık bir süre üzerinde 10 k...

Bu kanser yönetimi yüksek karşılanmamış bir tıbbi ihtiyaç olduğu hedeflenen terapötik ajanlar, Edinsel direnç mekanizmaları araştıran bir zaman ve cost effective vitro protokoldür.

Sürücü yolları için seyir elde hedefe yönelik tedavi direnci: ilaca dirençli Subclone üretimi ve duyarlılık Gene Knock-down tarafından geri yükleme

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

Bu klinik öncesi platformun genel amacı, hedefe yönelik tedavilere karşı kazanılmış direnci yönlendiren mekanizmaları tanımlamak ve karakterize etmek için standart bir prosedür sağlamaktır. Bu yöntem, onkolojide genom sürücüsünün uygulanmasına yardımcı olabilir, özellikle tümör heterojenliği ve hedefe yönelik tedaviye edinilmiş dirençten sorumlu çoklu mekanizmalar hakkındaki temel soruları ele alabilir. Bu tekniğin en önemli avantajı, hedefe yönelik tedaviye direnç mekanizmalarının in vitro olarak araştırılmasına olanak tanıyan zaman ve maliyet etkin yaklaşımıdır.Bu tekniğin anlamı, akciğer direnci ortaya çıkan hedefe yönelik tedaviler için hala zorlayıcı olduğundan, kanser tedavisine kadar uzanır. Bu yöntem, hedefe yönelik tedavi direncinde rol oynayan mekanizma hakkında bilgi sağlayabilir, ancak aynı zamanda geleneksel kemoterapötik ajanların etkinliğini incelemek için de kullanılabilir. Genel olarak, bu yöntemi kullanan operatörler, standartlaştırılması en zor adım olan ilaca dirençli alt klonlar nesli ile sendeleyecektir.Bu yöntem fikrini ilk olarak, HER pozitif mide kanseri hücre hatlarında trastuzumab'a karşı edinilmiş dirençli mekanizmayı karakterize ettiğimizde tasarladık.

looking-for-driver-pathways-acquired-resistance-to-targeted-therapy

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Klinik başlangıcından önce aşağıdaki ya da - - hedefli tedavilerin ilaç direnci yaygın ve direniş mekanizmaları tanımlamak için ihtiyaç alternatif klinik yönetim stratejileri rehberlik için kritik öneme sahiptir. Burada, bu mekanizmaların keşfini hızlandırmak için sıralama ile in vitro ilaca dirençli hatların çift türetme bir protokol mevcut.

Uygulanması<em&gt; İn Vitro</em&gt; İlaç Direnci Tahliller: Klinik İlgili Direnç Mekanizmaları ortaya çıkararak yönelik Potansiyeli maksimize

Burada katı tümörler ve hematolojik malignitelerde ilaç direnci üzerinde anormal yapıştırma etkisini araştıran amaçlayan bir protokol açıklar. Bu hedefe, biz RNA seq ile ebeveyn ve in vitro dirençli modellerin transkriptomik profillerini analiz ve aday genler doğrulamak için bir QRT-PCR tabanlı bir yöntem kurdu.

İlaç Direnci İlgili Roman Splice türevlerini algılamak için RNA sıralamayı kullanarak<em&gt; İn Vitro</em&gt; Kanser Modelleri

Burada bir iletişim kuralı açıklamak yüksek üretilen iş RNAi tarama oncolytic virüs tedavisi geliştirmek için manipüle edilebilir ana hedefleri ortaya çıkarmak için istihdam için özellikle rhabodvirus ve vaksinia virüs tedavisi, ama -ebilmek var olmak diğer oncolytic için kolayca adapte virüs platformlar veya virüs çoğaltma genellikle modüle ana bilgisayar genler keşfetmek için.

Tedavi Oncolytic virusu modüle ana faktörleri tanımlamak için genom çapında RNAi tarama

Burada, c-Fos ve Dusp1 genetik ve kimyasal doğrulama uyuşturucu hedef olarak tüp bebek ve içinde vivo genetik ve insanlaşmış fare modelleri kullanarak lösemi için iletişim kuralları açıklar. Bu yöntem, herhangi bir hedef için genetik doğrulama ve terapötik geliştirme için uygulanabilir.

C-Fos rolü ve Dusp1 onkogen bağımlılığı değerlendirme yöntemleri

Bir gen gen işlev eğitim ilgi overexpressing bir istikrarlı hücre kültürünü kuran istikrarlı transfection-toplama tek klonlar tarafından via retroviral enfeksiyon transfecting sonra yapılabilir. İşte bu şekilde oluşturulan HT29-DR3 hücre hatları tarafından hangi ölüm reseptör 3 (DR3) antimitotics kaynaklı apoptosis katkıda mekanizmaları aydınlatmak göstermektedir.

Anti-mitotik Therapeutics apoptotik yanıtı değerlendirmek için DR3 Overexpressing hücre satırları oluşturma

Burada sunulan kolorektal HT29 hücrelerinden elde edilen kurulan kanser kök benzeri hücreleri koruyan aşırı ifade sürücü genleri keşfetmek için bir protokoldür. RNAseq mevcut biyoinformatik ile araştırılmış ve hedeflenen tümör hücrelerinin hayatta kalma dahil potansiyel bir mekanizma açıklığa kavuşturmak için gen ekspresyonu ağları ekran.

Kolorektal HT29 türetilmiş Kanser Kök Benzeri Tümörkürelerde Sürücü Genlerinin Keşfi

Bu protokol, NSCLC hasta kaynaklı organoid modellerde hedeflenen sinyal inhibitörlerine karşı ilaç duyarlılıklarının standartlaştırılmış bir değerlendirmesini açıklamaktadır.

EGFR-Mutant NSCLC Hasta Kaynaklı Organoidlerde Hedefe Yönelik Tedavilere Duyarlılığın Profillenmesi

Bir lentiviral shRNA havuzu kullanılarak yüksek verimli RNA girişimi (RNAi) taraması, malignitelerde terapötik olarak ilgili sentetik ölümcül hedefleri tespit etmek için bir araç olabilir. Akut miyeloid lösemide (AML) epigenetik efektörleri araştırmak için havuzlanmış bir shRNA tarama yaklaşımı sunuyoruz.

Bir İlaç Direnci Fenotipini Modüle Eden Faktörleri Tanımlamak için Havuzlanmış shRNA Kütüphanesi Taraması

Genetiği değiştirilmiş fare modellerinde ortaya çıkan tümörlerde terapötik hedefleri ve karşılık gelen insan tümör tipini belirlemek ve karşılaştırmak için genomik analizler ve fonksiyonel genomik ekranlar kullanan türler arası karşılaştırmalı bir onkogenomik yaklaşım geliştirdik.

Malign Periferik Sinir Kılıfı Tümörünün Fare Modellerinde Terapötik Hedefleri Belirlemek için Genetik Profilleme ve Genom Ölçeğinde Bırakma Taraması

Burada, doz yükseltme yaklaşımıyla kemodirençli hücreler üretmek için bir protokol sunuyoruz; ardından edinilmiş kemodirenç düzenleyicilerini belirlemek için epigenetik modifikatörleri hedefleyen odaklı bir sgRNA kütüphanesi kullanılarak CRISPR/Cas9 tabanlı bir ekran sunuluyor. Protokol ayrıca, kemodirençli hücre modellerine uyarlanmış çoklu optimizasyon noktaları sunar ve direnç mekanizmalarını araştıran araştırmacılar için sağlam bir çerçeve sunar.

Kemodirençli Hücrelerde Epigenom Genelinde CRISPR-Cas9 Tabanlı Knockout Screen'ler

Keşfedin, hedefe yönelik tedavilere karşı kazanılmış direnç mekanizmalarını in vitro yöntemlerle nasıl tanımlayacağınızı. Bu protokol, tümör heterojenitesini anlamak ve kanser tedavisinde direnç alt klonlarını üretmek için zaman ve maliyet açısından etkili bir yaklaşım sunar.

Sürücü yolları için seyir elde hedefe yönelik tedavi direnci: ilaca dirençli Subclone üretimi ve duyarlılık Gene Knock-down tarafından geri yükleme (Video) | JoVE Journal

Sürücü yolları için seyir elde hedefe yönelik tedavi direnci: ilaca dirençli Subclone üretimi ve duyarlılık Gene Knock-down tarafından geri yükleme

Daha fazla video keşfet