Monosit ve bir hücre dışı matriks içinde birincil meme kanseri hücreleri arasındaki iletişimi analiz özü (ECME)-üç boyutlu sistem tabanlı

Bu protokolün genel amacı, üç boyutlu bir ko-kültür sisteminde primer meme kanseri hücreleri ve monositler arasındaki doğrudan ve dolaylı iletişimi incelemektir. Bu yöntem, meme kanseri alanının enflamatuar mikro ortamında, bağışıklık hücrelerinin nasıl yeniden derecelendirildiği ve aktive edildiği, bu hücrelerin tümör enflamatuar mikro çevresini sürdürmeye nasıl yardımcı olduğu ve bu mikro çevrenin tümör hücresi istilasını nasıl kolaylaştırdığı gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tümör içi iletişimi incelemek için uygun fiyatlı bir alternatif sunması ve tümör biyolojisinin spesifik özelliklerini sorgulamak için in vitro, 3 boyutlu hücre sistemlerinin potansiyelini göstermesidir.

Özellikle tümör saldırganlığı ile ilgili olanlar. Başlamak için, yüzde 10 FBS ve yüzde 1 antibiyotik antimikotik ile desteklenmiş 10 mililitre RPMI1640 ortamında 10 ila altıncı U937 ve THP1 monositlerini iki kez yetiştirin. Ayrıca takviye edilmiş DMEMF12 ortamında taze PM'ler yetiştirin.

Hücreleri 37 santigrat derecede nemlendirilmiş yüzde beş karbondioksit ortamında inkübe edin. Plaka, karşılık gelen ortamlarının oyuğu başına bir mililitrede dört kez 10 ila beşinci monositler. Her bir oyuğa bir ek yerleştirin ve ilgili ortamdaki beşinci BrC hücre süspansiyonuna dört çarpı 10'dan 900 mikrolitre ekleyin.

Kültürleri 37 santigrat derecede nemlendirilmiş yüzde beş karbondioksit ortamında beş gün boyunca inkübe edin ve süpernatanları geri kazanın. Daha sonra analiz yapılırsa hücreleri tripsinizasyon ile geri alın. İlgili ortam ile tek tek hücre kültürlerinin kontrollerini dahil edin.

BrC hücrelerini ve monositleri hücre kültüründen önce ticari olarak temin edilebilen kümerin ve rodamin ile etiketlemek için, ilgilenilen altıncı BrC hücresine 10 kez iki kez bir tek tabaka hazırlayın ve standart ortamı floresan boyanın yeterli, önceden ısıtılmış çalışma çözeltisiyle değiştirin. Hücreleri 37 santigrat derecede nemlendirilmiş yüzde beş karbondioksit ortamında 30 dakika inkübe edin. Daha sonra boya solüsyonunu aspire edin ve hücreleri nazikçe durulamak için yeterli miktarda XPBS kullanın.

PBS'yi aspire edin ve standart ortamı ekleyin. Hücreleri tripsinize etmek için, şişeye iki mililitre yüzde 05 tripsin ve 0.48 milimolar EDTA ekleyin ve hücreleri 37 santigrat derecede beş ila 10 dakika inkübe edin. Tripsinizasyonu durdurmak için 200 mikrolitre FBS ve takviye olmadan karşılık gelen ortamdan yedi mililitre ekleyin.

Hücreleri pipetleme ile yeniden süspanse edin, ardından 10 mikrolitre hücreyi bir Nuebauer odasına aktarın ve sayın. Daha sonra, hücreleri 430 kez g ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca peletleyin, daha sonra süpernatanı atın ve hücreleri yeniden süspanse etmek için üç mililitre önceden ısıtılmış floresan boya çalışma çözeltisi kullanın. Hücre süspansiyonunu 37 santigrat derecede nemlendirilmiş yüzde beş karbondioksit ortamında 30 dakika inkübe edin.

Hücreleri tekrar peletledikten sonra, boya işleme solüsyonunu atın ve hücreleri nazikçe yeniden süspanse etmek için beş ila yedi mililitre bir XPBS kullanın. Daha sonra, hücreleri bir kez daha peletledikten ve PBS'yi attıktan sonra, hücreleri beş ila yedi mililitre standart ortamda yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunun 10 mikrolitresini sayın.

Dört kuyulu bir kızak sisteminin her bir oyuğunda eşit bir tabaka oluşturmak için kuyunun dibine yeterli ECME yayarak bir ko-kültür oluşturun. Plaka 20 mikrolitre tek hücre süspansiyonu, kuyucuk başına beş kez 10 ila beşinci etiketli BrC hücresi içerir. 37 santigrat derecede 15 ila 20 dakika sonra, yüzde 60 ECME ile desteklenmiş 80 mikrolitre tahlil ortamında beşinci etiketli monositlere 2,5 kat 10 oranında bir süspansiyon ekleyin.

ECME'nin 37 santigrat derecede 15 ila 20 dakika katılaşmasına izin verin. Şimdi bir mililitre BrC hücreleri ve monosit kültür ortamının bire bir karışımını ekleyin. Farklı zaman noktalarındaki değişiklikleri izlemek için ko-kültürleri nemlendirilmiş yüzde beş karbondioksit ortamında 37 santigrat derecede 24 saat, 48 saat veya beş gün boyunca inkübe edin.

ECM proteinlerini parçalamak ve hücreleri kültürlerden geri kazanmak için, ortamı aspire edin ve atın, ardından kültüre yüzde 0.1 tripsin ve yüzde 0.25 EDTA içeren 0.5 mililitre bir XPBS ekleyin. Hücreleri üç saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyonun ardından, tripsini nötralize etmek için yüzde 10 FBS ile 0,5 mililitre bir XPBS ekleyin ve tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için kuvvetli bir şekilde pipetleyerek hücreleri yeniden süspanse edin.

Hücreleri peletledikten sonra, süpernatanı atın ve hücreleri yüzde 10 FBS ile bir XPBS'nin beş mililitresinde yeniden askıya alın. Bu adımı bir kez tekrarlayın. Hücre süspansiyonunu uygun aletle faksa tabi tutun.

Nihai popülasyonların en az yüzde 95 saf olduğundan emin olun. Sekiz kuyucuklu bir slayt sisteminin her bir oyuğuna 40 mikrolitrelik bir ECME tabanı yayın ve 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede katılaşmasına izin verin. Metin protokolüne göre 400 mikrolitre takviye edilmiş DMEM F12 kültür ortamında kuyu başına 800 MCF10 A hücresi tohumlayın.

Daha sonra, mililitre insan rekombinant IL1 beta başına 20 nanogram ile 400 mikrolitre şartlandırılmış ortam veya takviye edilmiş DMEM F12 kültür ortamı ekleyin. Hazne sürgüsünü, iki mililitre PBS ile doldurulmuş 35 mililitrelik bir petri kabı içeren bir cam petri kabına yerleştirin. MCF 10A hücreleri, ECME tabanının zarar görmesini önlemek ve hücrelerin çökelmesini ve bir monoly oluşturmasını önlemek için her bir oyuğa çok yavaş bir şekilde tohumlanmalıdır.

Optik mikroskop kullanarak, 14 gün boyunca her 24 saatte bir glandüler asini oluşumunu kaydedin. 14 günlük kültürden sonra, bir XPBS'ye 100 mikrolitre 100 nanomolar dapy ekleyin ve numuneleri 25 dakika boyunca sürekli karıştırarak oda sıcaklığında inkübe edin. Numuneleri oda sıcaklığında bir XPBS ile, her biri sürekli karıştırarak beş dakika boyunca üç kez durulayın.

Preparatları monte etmek için floresan boyamaya özel montaj ortamı kullanın. Daha sonra monte edilen numuneleri şeffaf cila ile kapatın ve slaytları dört santigrat derecede ışıktan koruyarak koruyun. Konfokal mikroskopta prosedürü göstermek, Ulusal İleri Mikroskop Laboratuvarı'ndan bir araştırmacı olan Vadim Perez olacak.

Asini'yi konfokal bir mikroskopla analiz edin ve asini'nin farklı derinliklerindeki enine yığınların görüntülerini alın. Uygun boyama protokolleri ile asindeki farklı hücresel proteinleri görselleştirin. Örneğin, hücreden hücreye yapışmayı, hücre polaritesini ve oralimen oluşumunu değerlendirmek için burada caheren boyandı.

Düşük ve yüksek yoğunluklarda 3D kültürlerde büyüyen birincil BrC hücrelerinin morfolojisi beş gün boyunca incelenmiştir. İlk 48 saat boyunca, hücreler ECME'ye uzun bir iğ şekli ile yapışır ve beş gün içinde örgü benzeri yapılar oluşturur. 3D ko-kültürlerde beş gün sonra, hem MCF7 hem de MDA-MB-231 ticari BrC hücreleri düzensiz agregalar oluşturdu.

Bununla birlikte, uzun formlara sahip agregalar için agresif MDA-MB-231 hücreleri, MDA-MB-231 hücrelerinden daha yoğun şekilde sıkıştırılmış yuvarlak şekillere sahip agregalar için agresif olmayan MCF7 hücreleri. Dolaylı etkileşim 3D primer BrC kültürlerinden ve bunların primer monositlerle beş günlük ko-kültürlerinden süpernatanlar hasat edildi. Primer BrC hücre monosit ko-kültürlerinde önemli ölçüde artmış IL1, beta ve IL8 seviyeleri gözlenmiştir.

Daha önce malign progresyon ile ilişkilendirilmiş olan hem önemli hem de inflamatuar sitokinler. MCF10A hücreleri, anoykis'e direncin bir ölçüsü olarak lümen oluşumunu gözlemlemek için iki birincil BrC hücre hattından iki farklı süpernatan ile yetiştirildi. Standart koşullar altında büyütülen MCF10A hücrelerinin aksine, 14. günde bi-konfokal mikroskopi, sferoidlerin enine kesimleri, MCF10A hücrelerinin, asini'deki merkezi hücrelerin sayısını sayarak ölçüldüğü gibi anoykis'ten kaçtığını göstermektedir.

Bu prosedürü takiben, ek soruları cevaplamak için tıbbi analiz gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Her iki kanser göçünde de sinyal yolaklarını test edin. Geliştirilmesinden sonra bu teknik, tümör mikro ortamları alanındaki araştırmacıların, meme kanseri hücrelerinin kitle hücreleri, fibroblastlar, nötrofiller ve hatta 3D ko-kültür sistemlerinde tümör hücrelerinin farklı klonları ile iletişimini keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, tümör mikro ortamını modellemek için bir 3D kültür sisteminin nasıl kurulacağını iyi anlamış olmalısınız.