Birden çok nükleik asit kapiller bir dizi görsel algılama
November 15th, 2017
Bu iletişim kuralı birden fazla Nükleik asitlerin kullanımı kolay bir tek, testinde görsel algılama için uygulanan küçük, kullanıma hazır bir kaset imalatı açıklar. Bu yaklaşım, kılcal bir dizi GDO hedefleri çok katmanlı ve yüksek verimli tespiti için kullanıldı.
Bu prosedürün genel amacı, kullanımı kolay tek bir testte birden fazla nükleik asidin görsel tespiti için uygulanabilen küçük, kullanıma hazır bir kaset üretmektir. Bu yöntem, genetiği değiştirilmiş organizmalar veya GDO tespiti gibi multipleks nükleik asit algılama alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Kılcal damarları temizlemek için laboratuvar üniforması, koruyucu gözlük ve kimyasal koruyucu eldiven giyin.
Kılcal damarları bir behere yerleştirin. Organik maddeyi uzaklaştırmak için kılcal damarları 30 mililitre asetonla beş dakika boyunca temizleyin. Ardından, kılcal damarları deiyonize suyla yıkayın.
Daha sonra, behere yaklaşık on mililitre hidrojen peroksit dökerek piranha çözeltisini hazırlayın. Ardından, aşırı ısınmayı önlemek için hidrojen peroksitin içine yavaş çalkalayarak 30 mililitre sülfürik asit ekleyin. Solüsyonun kılcal damarları en az 30 dakika boyunca tamamen kapladığından emin olun.
Ardından, piranha çözeltisini bol miktarda su ile yıkayın. Kılcal damarları etanol ve deiyonize su ile her biri beş dakika yıkayın. Kılcal damarları bir kurutma fırınında kurutun.
Ardından, PDMS tabanını ve dişli reaktiflerini 50 mililitrelik bir tüpte bire bir oranında tartın. Tipik olarak, beş gram elastomer bazını beş gram elastomer kürleme maddesi ile karıştırın. Karışımı bir cam çubukla yaklaşık beş dakika iyice karıştırın.
Gazdan arındırmak için beheri PDMS ile otuz dakika boyunca vakumlu bir çan kavanozuna yerleştirin. Ardından, PDMS'yi yavaşça paslanmaz çelik kalıbın silindirine dökün. PDMS'nin 60 santigrat derecede bir kurutma fırınında üç saat kürlenmesine izin verin.
PDMS sertleştikten sonra kalıbı silindirik ile dışarı çekerek kalıbı çıkarın. Kalıbın kenarını bir neşter ile keserek PDMS'yi silindirden çıkarın. PDMS'yi etanol ve deiyonize su ile üç kez yıkayın.
Ardından, PDMS desteğini nitrojen ile kurulayın. PDMS desteğini bir saniye boyunca süper hidrofobik bir kaplamaya batırarak PDMS desteğinin alt yüzeyini hidrofobik hale getirin. Daha sonra oda sıcaklığında on dakika kurutun.
Ardından, temizlenmiş dört milimetrelik kılcal damarları PDMS desteğinin deliklerine yerleştirin ve kılcal damarların sıfır noktası beş milimetreyi PDMS desteğinin üst yüzeyinin dışında bırakın. Kılcal damarların uçlarının aynı seviyede olduğundan emin olun. Kılcal damarların dış yüzeyini ve PDMS desteğinin üst yüzeyini hidrofobik hale getirmek için, PDMS desteğinin yüzeyinin üzerine 15 mikrolitre süper hidrofobik kaplama ekleyin.
Süper hidrofobik modifiye edilmiş kılcal damar dizisini havayla kurutun. Daha sonra, önceden tasarlanmış bir sıraya göre kılcal dizinin karşılık gelen bir kılcal damarını doldurmak için bir set astarın astar sabitleme karışımından bir nokta altı mikrolitre ekleyin. Diziyi standart düz tabanlı 96 oyuklu bir plakanın şeffaf bir kuyusuna sabitleyin ve diziyi en az iki saat boyunca 60 santigrat derecede kurutun.
Kaseti monte etmek için, bağlantılı dizinin üstüne bir yükleme adaptörü yerleştirin. Adaptörün çanağının on kılcal damarın tümünün açıkta kalan kısımlarını kapladığından emin olun. LAMP reaksiyon karışımını hazırlamak için, metin protokolüne göre karışıma reaktifler ekleyin ve kalsin ekledikten sonra reaksiyon karışımını beş saniye boyunca girdaplayın.
Bst polimeraz eklendikten sonra tüpü yirmi kez yavaşça ters çevirin. Çevrede bulunan eser DNA, LAMP karışımını vermeden önce litre başına bir mol hidroklorik asit ile daha önce temizlenerek elimine edilebilir. Standart 100 mikrolitrelik bir uç ile 20 mikrolitre LAMP reaksiyon karışımını aspire edin.
Kilitlemek için ucu yükleme adaptörünün girişine sokun. Reaksiyon karışımını yavaşça adaptör kabına enjekte edin. Reaksiyon karışımı tabağı hızlı bir şekilde dolduracak ve daha sonra kılcal damarları kılcal kuvvet yoluyla otomatik olarak yükleyecektir.
Adaptörü kilit ucuyla çıkarın ve kuyuyu PCR uyumlu şeffaf bir sızdırmazlık filmi ile kapatın. Ardından, kılcal diziyi bir saat boyunca 63 santigrat derecede bir inkübatörde inkübe edin. Floresan emisyonunun görüntülerini elde etmek için, ayrışmış kalsini floresan yaymak üzere uyarmak için bir UV el feneri kullanın.
Bir dijital kamera veya akıllı telefon ile kılcal dizinin tepesinden görüntüler yakalayın. Bir görüntü çekerken, yüksek kaliteli ve net görüntüler elde etmek için kameranın kılcal damarların bulunduğu alana mümkün olduğunca yakınlaştırıldığından emin olun. Ardından, görüntüyü görüntü analiz yazılımı ile açın.
Ve sonra görüntü, kalıp, gri tonlamalı, evet ve görüntü, kalıp, 16 bit, evet seçin. Görüntüyü 16 bit TIFF formatına dönüştürmek için dosya, farklı kaydet, format, TIFF'i seçin. Floresan yoğunluğunun değerini çıkarmak için mikrodizi analiz yazılımını açın.
16 bit TIFF formatındaki görüntüyü yazılımın arayüzüne sürükleyin ve ardından görüntüyü görüntülemek için 532 nanometre dalga boyunu ve yeşil rengi seçin. Ardından, kılcal damarlardan gelen floresan sinyalini bulmak için yeni bir blok oluşturun. Araçları, yeni blokları seçin ve ardından sütun ve satır sayısını bloklara ve özellikler arayüzlerine ayrı ayrı bire bir ve ikiye beş olarak yerleştirin.
Sağ tıklayın ve özellik modelini seçin. Ardından, kılcal damarların floresan alanına uyacak şekilde konumu ve çapı ayarlayın. Floresan yoğunluğunun değerini çıkarmak için analiz et'i seçin.
Son olarak, bloğun belgelerini kaydetmek için dosyayı seçin, ayarları farklı kaydedin. Ardından, floresan yoğunluğu sonuçlarını kaydetmek için sonuçları seçin, dosyalayın, kaydedin. Burada kılcal dizinin düzeni gösterilmektedir.
Bir ila sekiz arasında kılcal damarlar, LAMP astar setleri ile önceden eklenmiştir. Dokuzuncu ve onuncu kılcal damarlar ikiyi temsil eder, astar kontrolü yoktur. Burada, genetiği değiştirilmiş mısır MON863'ün tespiti için floresan fotoğraf gösterilmektedir, burada yeşil renk pozitif LAMP amplifikasyonunu temsil eder.
Başarılı amplifikasyon, sadece beklenen kılcal damarlarda bir, altı, yedi ve sekizde, boş kılcal damarlar arasında kontaminasyon olmadan sunulur. Bu floresan fotoğraf, GDO karışımının tespiti içindir. Yeşil renk, pozitif LAMP amplifikasyonunu sundu.
Başarılı amplifikasyon sadece beklenen kılcal damarlarda bir, dört, beş, altı, yedi ve sekizde boş kılcal damarlar arasında kontaminasyon olmadan sunulmuştur. Burada gösterilen floresan fotoğraf, genetiği değiştirilmemiş mısırın tespiti içindir ve yeşil renk pozitif LAMP amplifikasyonunu sunar. Başarılı amplifikasyon sadece beklenen kılcal sekizde ve boş kılcal damarlar arasında kontaminasyon olmadan ortaya çıktı.
Bir kez ustalaştıktan sonra, bu algılama prosedürü düzgün bir şekilde gerçekleştirilirse bir nokta beş saat içinde yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, çoklu nükleik asit tespiti yapmak için kılcal damar bazlı kasetin nasıl üretileceğini iyi anlamış olmalısınız.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, tek bir, kullanımı kolay testte birden fazla nükleik asidin görsel tespiti için küçük, kullanıma hazır bir kasetin üretimini açıklamaktadır. Bu yöntem, çoklu tespit için bir kılcal dizi kullanılarak genetik olarak modifiye edilmiş organizmaların (GDO'lar) tespiti için özellikle yararlıdır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyoteknoloji
- Moleküler Biyoloji
- Genetik Mühendisliği
Arka Plan
- Birden fazla nükleik asidin tespiti çeşitli alanlarda kritik öneme sahiptir.
- Genetik olarak modifiye edilmiş organizmalar (GDO'lar) gıda güvenliğinde önemli zorluklar yaratmaktadır.
- Hızlı analiz için verimli tespit yöntemlerine ihtiyaç vardır.
- Kılcal diziler çoklu tespit yeteneklerini artırabilir.
Çalışmanın Amacı
- Nükleik asit tespiti için kullanıcı dostu bir kaset geliştirmek.
- GDO tespitinin verimliliğini artırmak.
- Çoklu nükleik asit tespiti araştırmalarını kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Nükleik asit tespiti için küçük bir kasetin üretimi.
- Çoklu tespit için kılcal dizilerin kullanımı.
- Kılcalların aseton ve deiyonize su ile temizlenmesi.
- Kullanım kolaylığı için görsel tespit yöntemleri.
Ana Sonuçlar
- Kaset, aynı anda birden fazla nükleik asidin tespit edilmesine izin verir.
- Kılcal diziler, tespit sürecinin verimliliğini artırır.
- Yöntem basit ve kullanıcı dostudur.
- GDO tespiti ve diğer alanlarda potansiyel uygulamalar.
Sonuçlar
- Bu protokol, nükleik asit tespiti için yeni bir yaklaşım sunar.
- Geliştirilmiş kaset, çoklu testler için etkilidir.
- Gelecek araştırmaları, biyoteknolojideki uygulamalarını genişletebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This platform enables multiplex nucleic acid detection in a single cassette, supporting high-throughput screening needs in GMO testing and microbial monitoring. By combining capillary array technology with LAMP amplification, it reduces assay complexity and resource requirements while maintaining specificity and sensitivity. The visual readout via UV illumination allows rapid, instrument-free results, aligning with decentralized testing demands in biopharma and agricultural biotechnology workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables simultaneous interrogation of multiple genetic targets for hypothesis testing in pathway analysis.
- Operational Value: Reduces reagent consumption and hands-on time through capillary-force-driven sample loading.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides standardized, isolated reaction chambers for reproducible amplification across targets.
- Operational Value: Supports parallel processing of up to eight assays with internal controls for assay validation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates detection of genetically modified elements in complex matrices, supporting GMO safety assessment.
- Operational Value: Enables field-deployable testing with minimal equipment, suitable for process monitoring in biomanufacturing.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to preclinical workflows where rapid nucleic acid profiling informs target selection and assay readiness.
- Discovery Biology: Allows parallel testing of gene variants or constructs to clarify functional roles in biological pathways.
- Screening: Generates quantitative fluorescence intensity data for hit confirmation and cross-capillary comparison.
- Analytics: Outputs enable signal threshold setting and contamination assessment via blank capillary controls.
- Translational Research: Supports continuity from target identification to preclinical validation through consistent nucleic acid readouts.
- Enterprise Reuse: Cassette design allows reuse across multiple nucleic acid panels with reconfiguration of primer sets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in multiplex assays by minimizing cross-talk and false positives.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized capillary preparation and isolated reaction volumes.
- Strategic Value: Reduces time-to-result for critical decision points in GMO detection and microbial monitoring.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on simultaneous multi-parameter readouts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in surface treatment and capillary array assembly for hydrophobic/hydrophilic patterning.
- Depends on access to vacuum degassing and thermal curing equipment for PDMS microfluidic fabrication.
- Necessitates standardization of primer fixation protocols across capillary arrays for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when extending beyond eight targets due to capillary array limitations.
- Relies on user training for consistent UV excitation and image capture to ensure fluorescence quantification accuracy.
