Birden çok nükleik asit kapiller bir dizi görsel algılama
15 Kasım 2017
Bu iletişim kuralı birden fazla Nükleik asitlerin kullanımı kolay bir tek, testinde görsel algılama için uygulanan küçük, kullanıma hazır bir kaset imalatı açıklar. Bu yaklaşım, kılcal bir dizi GDO hedefleri çok katmanlı ve yüksek verimli tespiti için kullanıldı.
Bu prosedürün genel amacı, kullanımı kolay tek bir testte birden fazla nükleik asidin görsel tespiti için uygulanabilen küçük, kullanıma hazır bir kaset üretmektir. Bu yöntem, genetiği değiştirilmiş organizmalar veya GDO tespiti gibi multipleks nükleik asit algılama alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Kılcal damarları temizlemek için laboratuvar üniforması, koruyucu gözlük ve kimyasal koruyucu eldiven giyin.
Kılcal damarları bir behere yerleştirin. Organik maddeyi uzaklaştırmak için kılcal damarları 30 mililitre asetonla beş dakika boyunca temizleyin. Ardından, kılcal damarları deiyonize suyla yıkayın.
Daha sonra, behere yaklaşık on mililitre hidrojen peroksit dökerek piranha çözeltisini hazırlayın. Ardından, aşırı ısınmayı önlemek için hidrojen peroksitin içine yavaş çalkalayarak 30 mililitre sülfürik asit ekleyin. Solüsyonun kılcal damarları en az 30 dakika boyunca tamamen kapladığından emin olun.
Ardından, piranha çözeltisini bol miktarda su ile yıkayın. Kılcal damarları etanol ve deiyonize su ile her biri beş dakika yıkayın. Kılcal damarları bir kurutma fırınında kurutun.
Ardından, PDMS tabanını ve dişli reaktiflerini 50 mililitrelik bir tüpte bire bir oranında tartın. Tipik olarak, beş gram elastomer bazını beş gram elastomer kürleme maddesi ile karıştırın. Karışımı bir cam çubukla yaklaşık beş dakika iyice karıştırın.
Gazdan arındırmak için beheri PDMS ile otuz dakika boyunca vakumlu bir çan kavanozuna yerleştirin. Ardından, PDMS'yi yavaşça paslanmaz çelik kalıbın silindirine dökün. PDMS'nin 60 santigrat derecede bir kurutma fırınında üç saat kürlenmesine izin verin.
PDMS sertleştikten sonra kalıbı silindirik ile dışarı çekerek kalıbı çıkarın. Kalıbın kenarını bir neşter ile keserek PDMS'yi silindirden çıkarın. PDMS'yi etanol ve deiyonize su ile üç kez yıkayın.
Ardından, PDMS desteğini nitrojen ile kurulayın. PDMS desteğini bir saniye boyunca süper hidrofobik bir kaplamaya batırarak PDMS desteğinin alt yüzeyini hidrofobik hale getirin. Daha sonra oda sıcaklığında on dakika kurutun.
Ardından, temizlenmiş dört milimetrelik kılcal damarları PDMS desteğinin deliklerine yerleştirin ve kılcal damarların sıfır noktası beş milimetreyi PDMS desteğinin üst yüzeyinin dışında bırakın. Kılcal damarların uçlarının aynı seviyede olduğundan emin olun. Kılcal damarların dış yüzeyini ve PDMS desteğinin üst yüzeyini hidrofobik hale getirmek için, PDMS desteğinin yüzeyinin üzerine 15 mikrolitre süper hidrofobik kaplama ekleyin.
Süper hidrofobik modifiye edilmiş kılcal damar dizisini havayla kurutun. Daha sonra, önceden tasarlanmış bir sıraya göre kılcal dizinin karşılık gelen bir kılcal damarını doldurmak için bir set astarın astar sabitleme karışımından bir nokta altı mikrolitre ekleyin. Diziyi standart düz tabanlı 96 oyuklu bir plakanın şeffaf bir kuyusuna sabitleyin ve diziyi en az iki saat boyunca 60 santigrat derecede kurutun.
Kaseti monte etmek için, bağlantılı dizinin üstüne bir yükleme adaptörü yerleştirin. Adaptörün çanağının on kılcal damarın tümünün açıkta kalan kısımlarını kapladığından emin olun. LAMP reaksiyon karışımını hazırlamak için, metin protokolüne göre karışıma reaktifler ekleyin ve kalsin ekledikten sonra reaksiyon karışımını beş saniye boyunca girdaplayın.
Bst polimeraz eklendikten sonra tüpü yirmi kez yavaşça ters çevirin. Çevrede bulunan eser DNA, LAMP karışımını vermeden önce litre başına bir mol hidroklorik asit ile daha önce temizlenerek elimine edilebilir. Standart 100 mikrolitrelik bir uç ile 20 mikrolitre LAMP reaksiyon karışımını aspire edin.
Kilitlemek için ucu yükleme adaptörünün girişine sokun. Reaksiyon karışımını yavaşça adaptör kabına enjekte edin. Reaksiyon karışımı tabağı hızlı bir şekilde dolduracak ve daha sonra kılcal damarları kılcal kuvvet yoluyla otomatik olarak yükleyecektir.
Adaptörü kilit ucuyla çıkarın ve kuyuyu PCR uyumlu şeffaf bir sızdırmazlık filmi ile kapatın. Ardından, kılcal diziyi bir saat boyunca 63 santigrat derecede bir inkübatörde inkübe edin. Floresan emisyonunun görüntülerini elde etmek için, ayrışmış kalsini floresan yaymak üzere uyarmak için bir UV el feneri kullanın.
Bir dijital kamera veya akıllı telefon ile kılcal dizinin tepesinden görüntüler yakalayın. Bir görüntü çekerken, yüksek kaliteli ve net görüntüler elde etmek için kameranın kılcal damarların bulunduğu alana mümkün olduğunca yakınlaştırıldığından emin olun. Ardından, görüntüyü görüntü analiz yazılımı ile açın.
Ve sonra görüntü, kalıp, gri tonlamalı, evet ve görüntü, kalıp, 16 bit, evet seçin. Görüntüyü 16 bit TIFF formatına dönüştürmek için dosya, farklı kaydet, format, TIFF'i seçin. Floresan yoğunluğunun değerini çıkarmak için mikrodizi analiz yazılımını açın.
16 bit TIFF formatındaki görüntüyü yazılımın arayüzüne sürükleyin ve ardından görüntüyü görüntülemek için 532 nanometre dalga boyunu ve yeşil rengi seçin. Ardından, kılcal damarlardan gelen floresan sinyalini bulmak için yeni bir blok oluşturun. Araçları, yeni blokları seçin ve ardından sütun ve satır sayısını bloklara ve özellikler arayüzlerine ayrı ayrı bire bir ve ikiye beş olarak yerleştirin.
Sağ tıklayın ve özellik modelini seçin. Ardından, kılcal damarların floresan alanına uyacak şekilde konumu ve çapı ayarlayın. Floresan yoğunluğunun değerini çıkarmak için analiz et'i seçin.
Son olarak, bloğun belgelerini kaydetmek için dosyayı seçin, ayarları farklı kaydedin. Ardından, floresan yoğunluğu sonuçlarını kaydetmek için sonuçları seçin, dosyalayın, kaydedin. Burada kılcal dizinin düzeni gösterilmektedir.
Bir ila sekiz arasında kılcal damarlar, LAMP astar setleri ile önceden eklenmiştir. Dokuzuncu ve onuncu kılcal damarlar ikiyi temsil eder, astar kontrolü yoktur. Burada, genetiği değiştirilmiş mısır MON863'ün tespiti için floresan fotoğraf gösterilmektedir, burada yeşil renk pozitif LAMP amplifikasyonunu temsil eder.
Başarılı amplifikasyon, sadece beklenen kılcal damarlarda bir, altı, yedi ve sekizde, boş kılcal damarlar arasında kontaminasyon olmadan sunulur. Bu floresan fotoğraf, GDO karışımının tespiti içindir. Yeşil renk, pozitif LAMP amplifikasyonunu sundu.
Başarılı amplifikasyon sadece beklenen kılcal damarlarda bir, dört, beş, altı, yedi ve sekizde boş kılcal damarlar arasında kontaminasyon olmadan sunulmuştur. Burada gösterilen floresan fotoğraf, genetiği değiştirilmemiş mısırın tespiti içindir ve yeşil renk pozitif LAMP amplifikasyonunu sunar. Başarılı amplifikasyon sadece beklenen kılcal sekizde ve boş kılcal damarlar arasında kontaminasyon olmadan ortaya çıktı.
Bir kez ustalaştıktan sonra, bu algılama prosedürü düzgün bir şekilde gerçekleştirilirse bir nokta beş saat içinde yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, çoklu nükleik asit tespiti yapmak için kılcal damar bazlı kasetin nasıl üretileceğini iyi anlamış olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, tek bir kullanımı kolay testte birden fazla nükleik asidin görsel tespiti için küçük, kullanıma hazır bir kasetin hazırlanmasını açıklamaktadır. Bu yöntem, özellikle çoklu tespit için bir kapiler dizi kullanılarak genetiği değiştirilmiş organizmaların (GDO'ların) tespit edilmesinde kullanışlıdır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyoteknoloji
- Moleküler Biyoloji
- Genetik Mühendisliği
Arka Plan
- Birden fazla nükleik asidin tespiti çeşitli alanlarda kritik öneme sahiptir.
- Genetiği değiştirilmiş organizmalar (GDO'lar), gıda güvenliğinde önemli zorluklar teşkil etmektedir.
- Hızlı analiz için verimli tespit yöntemlerine ihtiyaç duyulmaktadır.
- Kılcal diziler, multipleks tespit yeteneklerini artırabilir.
Çalışmanın Amacı
- Nükleik asit tespiti için kullanıcı dostu bir kaset geliştirmek.
- GDO tespitinin verimliliğini artırmak.
- Multipleks nükleik asit tespiti araştırmalarını kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Nükleik asit tespiti için küçük bir kasetin üretimi.
- Multiplex tespit için kapiler dizilerin kullanımı.
- Kapillerlerin aseton ve deiyonize su ile temizlenmesi.
- Kullanım kolaylığı için görsel tespit yöntemleri.
Temel Sonuçlar
- Kaset, birden fazla nükleik asidin eş zamanlı olarak tespit edilmesine olanak tanır.
- Kılcal dizi dizilimleri, tespit sürecinin verimliliğini artırır.
- Yöntem basit ve kullanıcı dostudur.
- GDO tespiti ve diğer alanlarda potansiyel uygulamaları mevcuttur.
Sonuçlar
- Bu protokol, nükleik asit tespiti için yeni bir yaklaşım sunmaktadır.
- Geliştirilen kaset, multipleks testler için etkilidir.
- Gelecekteki araştırmalar, biyoteknolojideki uygulama alanlarını genişletebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluğu
Bu platform, tek bir kaset içinde çoklu nükleik asit tespitine olanak tanıyarak GDO testi ve mikrobiyal izleme süreçlerindeki yüksek hacimli tarama ihtiyaçlarını desteklemektedir. Kapiler dizi teknolojisini LAMP amplifikasyonu ile birleştiren sistem, özgüllük ve hassasiyeti korurken analiz karmaşıklığını ve kaynak gereksinimlerini azaltır. UV aydınlatma aracılığıyla elde edilen görsel okuma, biyofarma ve tarımsal biyoteknoloji iş akışlarındaki merkezi olmayan test talepleriyle uyumlu olarak, cihaz gerektirmeyen hızlı sonuçlar sağlar.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Yolak analizindeki hipotez testleri için birden fazla genetik hedefin eş zamanlı sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Kılcal kuvvetle örnek yükleme sayesinde reaktif tüketimini ve uygulama süresini azaltır.
Tarama ve Deney Geliştirme
- Bilimsel Değeri: Hedefler genelinde tekrarlanabilir amplifikasyon için standartlaştırılmış, izole reaksiyon odaları sağlar.
- Operasyonel Değeri: Analiz doğrulaması için dahili kontrollerle birlikte sekiz adede kadar analizin paralel olarak işlenmesini destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: GDO güvenlik değerlendirmesini destekleyerek, kompleks matrislerdeki genetiği değiştirilmiş elementlerin tespitini kolaylaştırır.
- Operasyonel Değer: Biyoproduksiyonda süreç izleme için uygun, minimum ekipmanla sahada uygulanabilir test imkanı sağlar.
İş Akışı ve Pipeline Entegrasyonu
Bu yöntem, hızlı nükleik asit profillemesinin hedef seçimini ve analiz hazırlığını bilgilendirdiği, erken keşiften preklinik aşamalara kadar uzanan iş akışlarına uygundur.
- Keşif Biyolojisi: Biyolojik yolaklardaki fonksiyonel rolleri netleştirmek için gen varyantlarının veya konstrüktların paralel olarak test edilmesine olanak tanır.
- Tarama: Hit onayı ve kılcal tüpler arası karşılaştırma için kantitatif floresan yoğunluk verileri üretir.
- Analitik: Çıktılar, sinyal eşik değerinin belirlenmesine ve boş kılcal tüp kontrolleri aracılığıyla kontaminasyon değerlendirmesine imkan sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Tutarlı nükleik asit okumaları sayesinde, hedef belirlemeden preklinik doğrulamaya kadar olan sürekliliği destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Kaset tasarımı, primer setlerinin yeniden yapılandırılmasıyla birden fazla nükleik asit panelinde yeniden kullanıma izin verir.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Çapraz etkileşimi ve yanlış pozitifleri minimize ederek multipleks analizlerdeki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Standardize edilmiş kapiler hazırlama ve izole reaksiyon hacimleri aracılığıyla tekrarlanabilirliği geliştirir.
- Stratejik Değer: GDO tespiti ve mikrobiyal izlemedeki kritik karar noktaları için sonuç alma süresini kısaltır.
- Portföy Etkisi: Eşzamanlı çok parametreli okumalar temelinde, hedeflerin risk ayarlı önceliklendirilmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Hidrofobik/hidrofilik desenleme için yüzey işlemi ve kapiler dizi montajı konusunda uzmanlık gerektirir.
- PDMS mikroakışkan üretimi için vakumlu gaz giderme ve termal kürleme ekipmanına erişime bağlıdır.
- Tekrarlanabilir sonuçlar için kapiler diziler genelinde primer sabitleme protokollerinin standartlaştırılmasını gerektirir.
- Kapiler dizi sınırlamaları nedeniyle sekiz hedefin ötesine geçildiğinde adaptasyon değerlendirmeleri gerektirir.
- Floresan kantifikasyon doğruluğunu sağlamak için tutarlı UV eksitasyonu ve görüntü yakalama konusunda kullanıcı eğitimine dayanır.
