Name: Site yönettiği immobilizasyon kemik morfogenetik protein 2 katı yüzeyler için tıklayın kimya tarafından (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Öğrenin, tıklama kimyası kullanarak BMP2'nin yönlendirilmiş immobilizasyonuyla osteojenik iskeleler üretmeyi. Bu yöntem, kemik iyileşmesinde yan etkileri azaltır ve düşük dozlarda etkili tedavi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Dr. M. Rubini (Konstanz, Almanya) pyrrolysyl-tRNA kodlama plazmid sağlamak için ve pRSFduet-pyrtRNAsynth karşılık gelen aminoasil tRNA sentetaz kodlama sağlamak için teşekkür ederiz.

1. BMP2 değişken BMP2 K3Plk imalatı
<ol><li>Klonlama, BMP2-K3Plk tarafından site yönettiği mutagenesis PCR kullanarak 12<ol>
<li>İnsan olgun BMP2 yükseltmek (hmBMP2) p25N-hmBMP2 vektöründen ( Tablo malzemelerigörmek) ile ileri bir astar (5' GACCAGGACATATGGCTCAAGCCTAGCACAAACAGC 3') ve ters bir astar (5' CCAGGAGGATCCTTAGCGACACCCACAACCCT 3') tanıtan bir kehribar stop kodonu ( «««TAG) BMP2´s olgun bölümünün ilk lizin konumunda. Kullanarak 33,5 µL H2O, 10 µL PCR reaksiyon mix, 1,5 µL 10 µM dNTP hisse senedi çözüm, ileri astar (10 pmol/µL), ters astar (10 pmol/µL), p25N-hmBMP2 (10 ng/µL) 1 µL 1,5 µL 1,5 µL PCR reaksiyonu gerçekleştirmek ve DNA polimeraz 1 µL ( Tablo malzemelerigörmek) termal cycler (95 ° c 5 min için denatürasyon denatürasyon 95 ° C'de 30 döngüleri için 1 dk 1 dk, 1 dk 72 ° C uzama ve son bir uzantısı için 10 dk 72 ° C'de 60 ° C'de tavlama) içinde.</li>
		<li>Aşağıdaki üretici önerileri piyasada bulunan bir seti kullanarak PCR ürünü arındırmak ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
		<li>45 dk 16 µL H2O, 3 µL sindirim arabelleği, DNA'ın 10 µL kullanarak için 37 ° C'de restriksiyon enzimi NdeI PCR ürünü sindirmek (20 ng/µL) ve restriksiyon enzimi 1 µL. Isı-65 ° c enzim 5 dk. sindirmek için 1 h H2O, 3 µL sindirim arabelleği 16 µL, DNA'ın 10 µL kullanarak için 37 ° C'de restriksiyon enzimi BamHI PCR ürünü devre dışı bırakabilirsiniz (20 ng/µL) ve restriksiyon enzimi 1 µL. Enzim 5 min için 80 ° C'de ısı devre dışı bırakabilirsiniz.</li>
		<li>NdeI ile pET11a-pyrtRNA vektör 16 µL H2O, 3 µL sindirim arabelleği, DNA'ın 10 µL kullanarak 2 saat 45 dk için 37 ° C'de sindirmek (20 ng / µL) ve restriksiyon enzimi 1 µL. Isı-devre dışı bırakabilirsiniz 65 ° C'de 5 dk. sindirmek için BamHI ile pET11a-pyrtRNA vektör 1 h H2O, 3 µL sindirim arabelleği 16 µL, DNA'ın 10 µL kullanarak için 37 ° C'de (20 ng/µL) ve restriksiyon enzimi 1 µL. 5 min için 80 ° C'de ısı devre dışı bırakabilirsiniz.</li>
		<li>Sindirilmemiş vektör sindirilir vektör ayrı ve sindirim artıkları tarafından özel Jel Elektroforez (% 0,8 özel, 100 V 60 dk.). Sindirilir BMP2-K3TAG ekleme için 2 h 100 kullanarak (RT) oda sıcaklığında sindirilmiş pET11a-pyrtRNA omurga ile ligate pET11a-pyrtRNA omurga ve 34.5 ng ng BMP2-K3TAG ucun (molar oranı 1:3). Reaksiyon karışımı içeren DNA omurga ve INSERT, 2 µL ligaz arabelleği, DNA ligaz ve H2O 20 µL toplam hacmiyle 1 µL.</li>
		<li>PET11a-pyrtRNA-BMP2-K3Plk ve pSRF-düet-pyrtRNAsynth ortak bir dönüşüm BL21(DE3) bakteri gerçekleştirin:<ol>
<li>50 ekleyin her plazmid bakteri için ng buz 30 dk için 50 42 ° C'de ısı şok karışımı koyun s, on Ice 5 min için yer, Lysogeny suyu (LB) orta 500 µL karışımı ekleyin ve 60 dk için 300 RPM sallamak.</li>
			<li>Önceden ısıtılmış sefaloridin (50 µg/mL) üzerine bakteriyel karışımı 100 µL yaymak / Ampisilin (100 µg/mL) levha ve gecede 37 ° C'de kuluçkaya</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>İfade ve BMP2-K3Plk arıtma 13 , 14<ol>
<li>Bir koloni LB orta 50 mL 50 µg/mL sefaloridin ve Ampisilin 37 ° C'de 100 µg/mL ile geceleme yaymak</li>
		<li>800 mL 50 µg/mL sefaloridin ve 100 µg/mL Ampisilin ile müthiş suyu (TB) orta içine gecede kültür 1:20 oranında seyreltin ve 37 ° C'de 0.7 OD600 ulaşılana kadar büyür. Propargyl-L-lizin 10 mM son bir konsantrasyon için ekleyin. İzopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) indüksiyon önce kültüründen 100 µL örnek toplamak.</li>
		<li>Gen ifadesinin IPTG ek olarak 1 mM son bir konsantrasyon tarafından ikna etmek. Kültür için bir orbital shaker 180 RPM 16 h 37 ° C'de büyümek. 100 µL örnek kültüründen toplamak.</li>
		<li>9000 x g 30 dk at için de bütün kültür süpernatant santrifüj kapasitesi ve bakteriyel Pelet TBSE arabellek (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA)) 30 ml 1: 1000 (v/v) 2-(taze eklendi) mercaptoethanol ile resuspend. Dikkat: 2-mercaptoethanol duman başlık altında ele. Deriyle ve gözle temastan kaçının. Buharı veya duman zehirlenmesinden kaçının. 2-mercaptoethanol duman başlık altında içeren arabellekleri ile tüm resuspension adımları gerçekleştirin.</li>
		<li>Bir boş santrifüj kabı tartmak ve resuspended Pelet boş kabı aktarın. 6,360 x g 20 dk. atma süpernatant de santrifüj kapasitesi ve kabı ile Pelet tartın. Pelet ağırlığını hesaplamak için boş kabı ağırlığı çıkarma. Not: Protokol burada duraklatılmış. Pelet-20 ° c kısa vadeli veya uzun vadede-80 ° C'de dondurmak. Protokol sürdürme üzerine, RT, pelet tezcan</li>
		<li>Pelet STE arabellekte (10 mM Tris pH 8.0; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA, 375 mM Sükroz; 1: 1000 (v/v) 2-mercaptoethanol (taze ekledi)) resuspend. 200 mL STE arabelleği her 10 g Pelet için kullanın.</li>
		<li>Buz (40 s darbe, 20 s fren ve % 30 genlik ile 10 dakika) uzaklaştırılmış solüsyon içeren temizleyicide. 6,360 x g 20 dk. atma süpernatant de santrifüj kapasitesi ve Pelet tartın. Sonication ve Santrifüjü adımları 4 kere tekrar edin.</li>
		<li>Pelet TBS arabellek (10 mM Tris, 150 mM NaCl) 100 mL resuspend. 6,360 x g 20 dk. atma süpernatant de santrifüj kapasitesi ve Pelet tartın.</li>
		<li>Pelet nükleaz arabelleği (100 mM Tris, 1 mM EDTA, 3 mM MgCl2) taze ekledi 80 U/mL nükleaz ile (örneğin, Benzonase) resuspend 10 mL/g Pelet kullanarak. Süspansiyon gecede, RT karıştırma plaka (30 rpm) üzerinde kuluçkaya.</li>
		<li>Triton arabellek ekleyin (60 mM EDTA, 1.5 M NaCl, % 6 (v/v) 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl) fenil-polietilen glikol) süspansiyon için. Eklemek için Triton arabellek hacmi süspansiyon 0.5 birim bölümüne karşılık gelir. RT (karıştırma), 10 min için kuluçkaya. 6,360 x g 20 dk. atma süpernatant de santrifüj kapasitesi ve Pelet tartın.</li>
		<li>Pelet TE arabellek (100 mM Tris, 20 mM EDTA) resuspend 8 mL/g Pelet kullanarak. 6,360 x g 20 dk. atma süpernatant de santrifüj kapasitesi ve Pelet tartın.</li>
		<li>Pelet 4 mL/g 25 mM NaAc pH 5.0 ve 5 mL/g (taze eklendi) 1 mM dithiothreitol (DTT) ile 6 M GuCl ekleyerek resuspend. Süspansiyon gecede 4 ° C'de karıştırma plaka (30 rpm) üzerinde kuluçkaya.</li>
		<li>75,500 x g 20 dk için de santrifüj kapasitesi. Süpernatant şimdi gelişeceğini monomeric BMP2 protein içerir. Toplamak süpernatant ve bu özü 20 OD/ml bir konsantre olarak 3 kDa molekül ağırlığı kesme (MWCO) membran kullanarak hücre ( Tablo malzemelerigörmek) konsantre.</li>
		<li>Konsantre monomerleri tek damla Renaturation arabellek (2 M LiCl, 50 mM Tris, 25 mM arkadaşlar, 5 mM EDTA, 1 mM glutatyon disülfür (GSSG), 2 mM glutatyon (GSH)) (30 rpm) karıştırarak ekleyin. RT karanlıkta 120 h için kuluçkaya. Not: Bu kuluçka döneminde occours refolding. Bu adım ileriye doğru çözüm katlanmış dimerik BMP2 K3Plk içerir.</li>
		<li>Konsantre HCl. Dialyze 1 mM konsantre HCl. karşı çözüm konsantre hücrede 10 kDa molekül ağırlığı kesme (MWCO) membran kullanarak diyaliz solüsyonu kullanarak 3.0 çözüm pH ayarlayın.</li>
		<li>Çözüm arabellek (20 mM NaAc, % 30 isopropanol) ekleyerek equilibrate. Arabellek A bir çözüm % 30 birime karşılık gelen bir birim eklemek. Belgili tanımlık eriyik vasıl 4700 x g 15 dakika santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>İyon değiştirme arabelleği A. yükü dengelenmiş sütuna protein çözüm 150 mL ile bir hızlı protein sıvı Kromatografi (FPLC) sistem15 için sütun equilibrate. Doğrusal gradyan (20 mM NaAc, % 30 isopropanol, 2 M NaCl) arabelleği B kullanarak kesirler elute arabellek B. toplamak 2 mL kesirler 100 mL kullanarak. Not: Toplam sütun hacmine göre sütun için yüklemeden önce protein konsantre. Son protein birim olmalıdır < %5 Toplam sütun biriminin.</li>
		<li>Her kesir 20 µL SDS Polyacrylamide (% 12) Jel Elektroforez (SDS-sayfa) 16 ve Coomassie parlak mavi boyama17 tarafından ( Tablo malzemelerigörmek) analiz. Not: SDS-sayfa jel gösterir kesirler dimer (26 kDa) ve kesirler monomer (13 kDa) içeren içeren Coomassie parlak mavi lekeli.</li>
		<li>Dimer içeren kesirleri havuz. Kesirler gecede 4 ° C'de 1 mM HCl (5 litre hacim) karşı içeren dimer havuzu diyaliz. Santrifüj filtre ünitesi konsantre bir 10 kDa kullanarak nihai ürün konsantre ( Tablo malzemelerigörmek). SDS Polyacrylamide (% 12) Jel Elektroforez (SDS-sayfa) ve Coomassie parlak mavi boyama tarafından nihai ürün analiz. Not: Coomassie parlak mavi bant SDS-sayfa lekeli jel 26 kDa tek bir grup göstermek. Bu son BMP2-K3Plk ürünüdür.</li>
	</ol></li>
</ol>2. bakır (I) getirilmesi-ALKİN-azid Cycloaddition (CuAAC) koşulları katalize
<ol><li>Sodyum askorbat (NaAsc) ve bakır (II) sülfat (CuSO 4 ) etkisi BMP2 vahşi türüne (BMP2-WT)<ol>
<li>20 µM kuluçkaya BMP2-WT NaAsc farklı oranlara CuSO4' e sahip. 0,5 mM NaAsc ve 0,5 mM CuSO4 (başlangıç konsantrasyonu) 50 µL hacmindeki kullanın. NaAsc aşağıdaki oranları ile CuSO4' e devam: (1:1), (1.7:1), (10:1), (20: 1), CuSO4 konsantrasyonu 0.5 mM sabit tutmak ve NaAsc konsantrasyonu buna göre ayarlayarak. H2O dönen Mikser (20 devir/dakika) üzerinde tepki gecede RT. gerçekleştirmek</li>
		<li>Azaltılmış örnekleri %5 2-mercaptoethanol içeren yükleme arabelleği ekleyerek hazırlamak ve örnek 95 ° c 6 dk. analiz azalır ve SDS Polyacrylamide tarafından sigara azaltılmış örnekleri (% 12) Elektroforez (SDS-sayfa) ve Coomassie parlak mavi boyama jel için kuluçkaya. SDS-sayfa jelleri lekeli Coomasie 13 kDa (sınırlı koşullar) 26 kDa ve daha yüksek molekül ağırlıklı (sigara azaltılmış koşullar) aralığında bantları göster.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Etkisi Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl) Amin (THPTA) üzerinde CuAAC tepki
	<ol>
<li>20 µM kuluçkaya BMP2-K3Plk THPTA farklı oranlara CuSO4' e sahip. 5 mM NaAsc ve 200 µM 3-Azido-7-Hidroksikumarin (NaAsc ve 3-Azido-7-Hidroksikumarin sabit tutmak) kullanın. 50 µM THPTA ve 0,5 mM CuSO4 konsantrasyonları başlangıç olarak kullanın. THPTA farklı oranlara CuSO4kullanın: (7:1); (10:1); (12:1); (15:1); (20:1). RT 24 h üzerinde dönen Mikser (20 devir/dakika) reaksiyon H2O (50 µL Toplam hacim) gerçekleştirir.</li>
		<li>Kaplin üzerine bir floresan boya 3-Azido-7-Hidroksikumarin olur. Örnekleri azaltılmış ve sigara azaltılmış koşullarda hazırlamak ve bunları SDS-PAGE tarafından analiz. 3-Azido-7-Hidroksikumarin için belirli dalga boyu ile uyarma kanalın altında jelleri görselleştirmek (λabs 404 = nm; λem = 477 nm).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. BMP2-K3Plk azid için kovalent kaplin tekniği özel boncuk Functionalized
<ol><li>BMP2-K3Plk veya BMP2-WT (negatif kontrol kullanılan) 20 µM azid aktif özel boncuk tepki arabelleği (0.1 M HEPES pH 7,0, 3,9 M üre, 50 µM CuSO4, 250 µM THPTA, 5 mM sodyum askorbat) 500 µL toplam hacmi içinde 20 µL ile bir rotati RT, 2 h için kuluçkaya NG Mikser (20 devir/dakika). Reaksiyon 5 mM EDTA (son konsantrasyonu) ekleyerek durdurmak.</li>
	<li>RT dönen Mikser (20 devir/dakika) üzerinde 15 dakika kuluçkaya. 20.000 x g 1 dk az RT. toplamak için de örnekler santrifüj kapasitesi supernatants.</li>
	<li>Üç kez ile 1.000 µL HBS500 arabelleği (50 mM HEPES, 500 mM NaCl), boncuk içeren Pelet üç kez 4 M MgCl21000 µL ile iki kez 1.000 µL fosfat tamponlu tuz (PBS) ile yıkayın. Her yıkama adımında, RT, 1 dk. için 20.000 x g, santrifüj kapasitesi ve supernatants toplamak. Eşleşmiş boncuk PBS 1.000 µL 4 ° C'de depolayın Dikkat: süpernatant kaldırılırken boncuk Pelet rahatsız etmeyin.</li>
</ol>4. doğrulama varlığı ve biyolojik aktivitesi immobilize BMP2-K3Plk kullanarak Texas kırmızı etiketli BMP reseptör ben bir Ectodomain (BMPR-IA EC )
<ol><li>50 kuluçkaya Texas kırmızı 1 µM ile BMP2-K3Plk functionalized boncuk µL dönen Mikser (20 devir/dakika) 1 h için RT 150 µL HBS500 arabelleği (50 mM HEPES, 500 mM NaCl) ile BMPR-IAEC etiketli.</li>
	<li>Boncuk için 1 dk RT. atma süpernatant az 20.000 x g, santrifüj kapasitesi. Boncuk 1000 µL HBS500 arabelleği ile yıkayın. Ek bir çamaşır adım 3 kez tekrarlayın. Her sonra RT, 1 dk. için 20.000 x g, santrifüj adım yıkama.</li>
	<li>Boncuk PBS 500 µL içinde resuspend ve cam kapak Slayt üzerindeki 50 µL pipet. 561 veya 594 nm arasında mikroskop filtre ayarlayın. Texas kırmızı-BMPR-IAECalgılamak-BMP2-K3Plk functionalized kullanılması floresan mikroskopi ve take Fotoğraflar boncuk.</li>
</ol>5. ölçme alkalen fosfataz (ALP) In Vitro Bioactivity BMP2-K3Plk önce üretilen ve kaplin reaksiyon sonra kanıtlamak için ifade.
<ol><li>
Alkalen fosfataz (ALP) tahlil
	<ol>
<li>Promyoblastic C2C12 hücreleri (ATCC CRL-172) %10 Fetal buzağı Serum (FCS), 100 U/mL penisilin G ve 100 µg/mL streptomisin %5 CO2oksijen bir atmosferde 37 ° C'de Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) içinde kültür.</li>
		<li>C2C12 hücreleri, 3 × 104 hücreleri/iyi bir yoğunluk bir 96-şey Mikroplaka içine tohum. Hücreleri bir gecede eklemek izin. Orta kaldırmak ve C2C12 hücreleri 0,5-200 huzurunda kuluçkaya 100 µL/iyi DMEM (% 2 FCS, 100 U/mL penisilin G ve 100 µg/mL streptomisin), % 5 CO2 72 h için oksijen bir atmosferde 37 ° C'de BMP2-WT veya BMP2-K3Plk nM.</li>
		<li>Orta kaldırmak ve hücreleri PBS 100 µL iyi ücret ile yıkayın. RT 100 µL/iyi lizis arabelleği ile 1 h için hücreleri Parçalayıcı (%1 NP-40, 0.1 M glisin, pH 9,6, 1 mM MgCl2, 1 mM ZnCl2) bir sallayarak plaka (220 devir/dakika).</li>
		<li>100 µL/iyi ALP arabelleği (0.1 M glisin, pH 9,6, 1 mM MgCl2, 1 mM ZnCl2) 1 mg/mL p-(taze eklendi) nitrophenylphosphate ile lysate hücreye ekleyin.</li>
		<li>Ölçmek emme 405 nm içinde renk gelişimi tamamlanana kadar ALP tampon ve her 5 dk ekledikten sonra multiplate bir okuyucu. Doz yanıt eğrileri ve EC50 değerleri logistic bir modeli kullanarak oluşturmak y = A2 + (A1-A2) / (1 + (0x)p).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Alkalen fosfataz (ALP) Boyama
	<ol>
<li>Promyoblastic C2C12 hücreleri (ATCC CRL-172) içinde Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) %10 Fetal buzağı Serum (FCS), 100 U/mL penisilin G ve % 5 CO2oksijen bir atmosferde 37 ° C'de 100 µg/mL streptomisin kültür.</li>
		<li>C2C12 hücreleri, 3 × 104 hücreleri/kuyuda bir 96-şey Mikroplaka yoğunluğu tohum. Hücreleri bir gecede eklemek izin. Orta kaldırın ve 20 µL/iyi BMP2-K3Plk birleştiğinde boncuk ekleyin. BMP2-K3Plk birleştiğinde boncuk bir PBS süspansiyon 1000 µL içinde vardır.</li>
		<li>%0,4 düşük erime noktası özel DMEM içinde bir çözüm hazırlamak. (600 W 3 dk) mikrodalgada eritin ve 37 ° C'de bir su banyosunda soğumasını kadar kullanmak sağlar.</li>
		<li>20 µL % 0,4 düşük erime noktası özel her şey (kaplama boncuk ve hücreleri) ekleyin. 20 ° C'de 5 min için 2000 x g, santrifüj 80 µL DMEM (% 2 FCS, 100 U/mL penisilin G ve 100 µg/mL streptomisin) ekleyin ve %5 CO2 72 h için oksijen bir atmosferde 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>Orta katılaşmış % 0,4 özel ayırmaz için dikkatli olmak, kaldırın. 1-adım NBT 100 µL/kuyu eklemek/BCIP (Nitro-mavi tetrazolium klorür, 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate p-toluidin tuz) substrat çözeltisi.</li>
		<li>Alkalen fosfataz hemen mor boyama belli olduktan sonra ışık mikroskobu kullanarak boyama analiz. Parlak alan mikroskobu kullanın ve fotoğraf çekmek.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Tsiridis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+substitutes%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Injury%22%5BJournal%5D)">Bone substitutes: An update.</a> Injury. 36, Suppl 3. S20-S27 (2005).</li>
<li>Oryan, A., Alidadi, S., Moshiri, A., Bigham-Sadegh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+proteins%3A+A+powerful+osteoinductive+compound+with+non-negligible+side+effects+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Biofactors%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic proteins: A powerful osteoinductive compound with non-negligible side effects and limitations.</a> Biofactors. 40 (5), 459-481 (2014).</li>
<li>Luginbuehl, V., Meinel, L., Merkle, H. P., Gander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+delivery+of+growth+factors+for+bone+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharm+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Localized delivery of growth factors for bone repair.</a> Eur J Pharm Biopharm. 58 (2), 197-208 (2004).</li>
<li>Haidar, Z. S., Hamdy, R. C., Tabrizian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+recombinant+bone+morphogenetic+proteins+for+bone+regeneration+and+repair.+Part+A%3A+Current+challenges+in+BMP+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Lett%22%5BJournal%5D)">Delivery of recombinant bone morphogenetic proteins for bone regeneration and repair. Part A: Current challenges in BMP delivery.</a> Biotechnol Lett. 31 (12), 1817-1824 (2009).</li>
<li>Hollinger, J. O., Uludag, H., Winn, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+release+emphasizing+recombinant+human+bone+morphogenetic+protein-2%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Sustained release emphasizing recombinant human bone morphogenetic protein-2.</a> Adv Drug Deliv Rev. 31 (3), 303-318 (1998).</li>
<li>Uludag, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+of+recombinant+human+bone+morphogenetic+proteins+with+biomaterial+carriers%3A+A+correlation+between+protein+pharmacokinetics+and+osteoinduction+in+the+rat+ectopic+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res%22%5BJournal%5D)">Implantation of recombinant human bone morphogenetic proteins with biomaterial carriers: A correlation between protein pharmacokinetics and osteoinduction in the rat ectopic model.</a> J Biomed Mater Res. 50 (2), 227-238 (2000).</li>
<li>Uludag, H., Golden, J., Palmer, R., Wozney, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinated+bone+morphogenetic+protein-2%3A+In+vivo+and+in+vitro+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Biotinated bone morphogenetic protein-2: In vivo and in vitro activity.</a> Biotechnol Bioeng. 65 (6), 668-672 (1999).</li>
<li>Aono, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+ectopic+bone-inducing+activity+of+bone+morphogenetic+protein-4%2F7+heterodimer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Potent ectopic bone-inducing activity of bone morphogenetic protein-4/7 heterodimer.</a> Biochem Biophys Res Commun. 210 (3), 670-677 (1995).</li>
<li>Suzuki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+hydrogel+linked+with+synthetic+oligopeptide+derived+from+BMP-2+allows+ectopic+osteoinduction+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res%22%5BJournal%5D)">Alginate hydrogel linked with synthetic oligopeptide derived from BMP-2 allows ectopic osteoinduction in vivo.</a> J Biomed Mater Res. 50 (3), 405-409 (2000).</li>
<li>Knaus, P., Sebald, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperativity+of+binding+epitopes+and+receptor+chains+in+the+BMP%2FTGFbeta+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cooperativity of binding epitopes and receptor chains in the BMP/TGFbeta superfamily.</a> Biol Chem. 382 (8), 1189-1195 (2001).</li>
<li>Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+genetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">Expanding the genetic code.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 225-249 (2006).</li>
<li>Costa, G. L., Weiner, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+PCR+site-directed+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Rapid PCR site-directed mutagenesis.</a> CSH Protoc. 2006 (1), (2006).</li>
<li>Kirsch, T., Nickel, J., Sebald, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+recombinant+BMP+receptor+IA+ectodomain+and+its+2%3A1+complex+with+BMP-2%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Isolation of recombinant BMP receptor IA ectodomain and its 2:1 complex with BMP-2.</a> FEBS Lett. 468 (2-3), 215-219 (2000).</li>
<li>Tabisz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+immobilization+of+BMP-2%3A+Two+approaches+for+the+production+of+innovative+osteoinductive+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Site-directed immobilization of BMP-2: Two approaches for the production of innovative osteoinductive scaffolds.</a> Biomacromolecules. 18 (3), 695-708 (2017).</li>
<li>Duong-Ly, K. C., Gabelli, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+ion+exchange+chromatography+to+purify+a+recombinantly+expressed+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Using ion exchange chromatography to purify a recombinantly expressed protein.</a> Methods Enzymol. 541, 95-103 (2014).</li>
<li>Brunelle, J. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-dimensional+SDS-polyacrylamide+gel+electrophoresis+%281D+SDS-PAGE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE).</a> Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).</li>
<li>Brunelle, J. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coomassie+blue+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Coomassie blue staining.</a> Methods Enzymol. 541, 161-167 (2014).</li>
<li>Kirsch, T., Nickel, J., Sebald, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP-2+antagonists+emerge+from+alterations+in+the+low-affinity+binding+epitope+for+receptor+BMPR-II%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">BMP-2 antagonists emerge from alterations in the low-affinity binding epitope for receptor BMPR-II.</a> EMBO J. 19 (13), 3314-3324 (2000).</li>
<li>Hein, J. E., Fokin, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper-catalyzed+azide-alkyne+cycloaddition+%28CuAAC%29+and+beyond%3A+new+reactivity+of+copper%28I%29+acetylides%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">Copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) and beyond: new reactivity of copper(I) acetylides.</a> Chem Soc Rev. 39 (4), 1302-1315 (2010).</li>
<li>Alborzinia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+kinetics+analysis+of+BMP2+uptake+into+cells+and+its+modulation+by+BMP+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantitative kinetics analysis of BMP2 uptake into cells and its modulation by BMP antagonists.</a> J Cell Sci. 126 (Pt 1), 117-127 (2013).</li>
<li>Paarmann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin-dependent+endocytosis+of+Bone+Morphogenetic+Protein2+%28BMP2%29+and+its+receptors+is+dispensable+for+the+initiation+of+Smad+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamin-dependent endocytosis of Bone Morphogenetic Protein2 (BMP2) and its receptors is dispensable for the initiation of Smad signaling.</a> Int J Biochem Cell Biol. 76, 51-63 (2016).</li>
<li>Pohl, T. L., Boergermann, J. H., Schwaerzer, G. K., Knaus, P., Cavalcanti-Adam, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+immobilization+of+bone+morphogenetic+protein+2+via+a+self-assembled+monolayer+formation+induces+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Surface immobilization of bone morphogenetic protein 2 via a self-assembled monolayer formation induces cell differentiation.</a> Acta Biomater. 8 (2), 772-780 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.

Tagged protein değişik genetik kodon genişleme getirici birincil protein dizi herhangi bir konumundaki başta olmak üzere çeşitli doğal olmayan amino asit analogları giriş izin verir. 6-histidin (onun) etiketi yalnızca olabilir gibi BMP2 gibi BMP durumunda ortak Etiketler beri protein´s C-terminal sonuna Tersiyer protein yapısı içinde gömülü ve böylece dışarıdan erişilebilir değil N ölümcül, tanıttı. Diğer konumlarda tanıtılan etiket boyutunu çok büyük olasılıkla sonuç olarak BMP´s bioactivity tıkamak yapısal değişiklikle...

Kemik doku Mühendisliği ve kemik rejenerasyonu nihai hedefi dezavantajları ve sendikasız kırıklar ortak tedaviler sırasında ortaya çıkan sınırlamalar üstesinden gelmektir. Her ikisi de birkaç dezavantajları olsa bile otomatik veya allo nakillerine ağırlıklı olarak geçerli tedavi stratejileri kullanılır. İdeal kemik grefti osteogenesis osteoindiksiyon yanı sıra osteoconduction, kemik greft osteointegrasyon için lider tarafından ikna etmek. Günümüzde, bir ideal kemik grefti tüm özelliklerinin sağladığı yalnızca otomatik nakli "altın standart" kabul edilir. Ne yazık ki, uzun cerrahi kez ve genellikle daha fazla komplikasyonlar (örneğin, kronik ağrı, Hematom oluşumları, enfeksiyonlar, kozmetik kusurları, vb) gerektirdiği ikinci bir travma site gibi önemli olumsuz yönleri de sunar. Allojenik Greftler, öte yandan tüm genel özellikleri1için suboptimal özelliklere sahip. Alternatif kemik greft teknolojileri osteoindüktif, osteoconductive, Biyouyumlu, ve bioresorbable iskele üretmek amacı ile son birkaç yıl içinde geliştirilmiştir. Birçok Biyomalzeme değil göstermek tüm Osteojenik bu özelliklere göre farklı büyüme faktörleri, özellikle BMP2 ve BMP7, belirli iskele2Osteojenik potansiyelini artırmak için dahil edilmiş.
Önemli bir ölçüt olarak hücre işe alım ve eki, hücre ingrowth ve anjiogenezi gibi önemli olaylar kolaylaştırmak amacıyla bir kontrollü doz yayın zamanla böyle büyüme faktörü vasıtalarının sağlamalıdır. Ancak, bmp gibi diğer Osteojenik büyüme faktörleri de sık kovalent olmayan3immobilize. Tuzak ve adsorpsiyon teknikleri genellikle kemik büyüme inducing tarafından çevre dokular etkileyen şiddetli dezavantajları içinde vivo yol açar bir ilk patlama açıklaması nedeniyle protein supra fizyolojik miktarda kullanımını gerektiren, Osteoliz, şişme ve iltihap4. Böylece, büyüme faktörleri daha uzun süreler için teslim yerinde tutma kovalent immobilizasyon yöntemleri tarafından elde edilebilir. Kimyasal olarak değiştirilmiş BMP2 (succinylated5, acetylated6 veya biotinylated7), mühendislik heterodimers8veya türetilmiş oligopeptides9 tasarlanmış ve sınırlamaları aşmak için kullanılan BMP2 ile ilgili emme. Ancak, düzenleme potansiyel olarak immobilize ligand bağlanması için hücresel reseptörleri inhibe. beri biyo-etkinlik bu yapıları, tahmin edilebilir değildir. Olarak daha önce gösterilen, bu tüm dört reseptör zincirleri aktif ligand-reseptör kompleksleri oluşumunda yer alan tüm aşağı akım sinyal cascades10tam olarak etkinleştirmek için immobilize BMP2 ile etkileşim esastır.
Bir inhomogeneous ürün sonucu sorunları açısından bioactivity, istikrar ve bioavailability immobilize faktörünün kısıtlamaları aşmak için kovalent iskele site yönettiği bir şekilde bağlama yetenekli bir BMP değişken tasarlanmıştır. BMP2-K3Plk, olarak adlandırdığı bu varyant genetik kodon genişleme11' de kullanılmaya başlanan yapay bir amino asit oluşur. Bu varyant için iskele süre paraca desteklemek onun biyolojik aktivitesi kovalent kaplin strateji kullanarak başarıyla bağlanmıştır.

<table><tbody><tr><td>< güçlü > Malzeme< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>1 Adımlı NBT / BCIP</td><td>Thermo Fisher</td><td>34042</td><td>Hücrelere çözelti ekleyin</td></tr><tr><td>3-Azido-7-hidroksikumarin</td><td>BaseClick</td><td>BCFA-047-1</td><td>Tıklama reaksiyonu için kullanılan kimyasal</td></tr><tr><td>Agaroz düşük erime noktası</td><td>Biozym</td><td>840101</td><td>ALP testi için agaroz ve nbsp;</td></tr><tr><td>Azide agaroz boncukları</td><td>Jena Bioscience</td><td>CLK-1038-2</td><td></td></tr><tr><td>BamHI (Hızlı Sindirim enzimi)</td> reaksiyonu için kullanılan boncuklar <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FD0054</td><td>Restriksiyon enzimi</td></tr><tr><td>BMP reseptörü IA (BMPR-IAEC)</sub</td><td>>--</td><td>-Laboratuvarımızda</td> <td>üretilmiştir</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue G-250 Boya</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20279</td><td>Coomassie için kullanılan kimyasal SDS PAGE'in parlak mavi boyanması</td></tr><tr><td>Bakır (II) sülfat susuz (CuSO4)</td><td>Alfa Aesar</td><td>A13986</td><td>Tıklama reaksiyonu için kullanılan</td></tr><tr><td>kimyasal DNA Polimeraz ve reaksiyon tamponu&nbsp;</td><td>Kapabiosystems</td><td>KK2102</td><td>KAPA HiFi PCR Kiti</td></tr><tr><td>Dulbecco' s değiştirilmiş Kartal' s ortamı (DMEM) GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>61965-026</td><td>Hücre kültürü ortamı</td></tr><tr><td>etilendiamintetraasetik asit (EDTA)</td> <td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>E5134-1kg</td><td>Tıklama reaksiyonunu durdurmak için kullanılan kimyasal</td></tr><tr><td>İzopropil ve szlig;-D-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>2316.5</td><td>Bakteri indüksiyonu (1mM nihai konsantrasyon)&nbsp;</td></tr><tr><td>NdeI (Hızlı Sindirim enzimi)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ER0581</td><td>Restriksiyon enzimi</td></tr><tr><td>NHS ile aktive edilen Texas Red</td><td>Life teknolojileri</td><td>T6134</td><td>Reseptöre bağlı</td></tr><tr><td>P-Nitrofenil Fosfat</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>N4645-1G</td><td>Alkalin Fosfataz</td></tr><tr><td>p25N-hmBMP2&nbsp;</td><td>--</td><td>-</td><td>Walter Sebald'dan J. Nickel</td></tr><tr><td>pET11a-pyrtRNA'ya</td> sağlanan plazmid<td>--</td><td>--</td><td>Würzburg Üniversitesi Eczacılık ve Biyoeczacılık Kürsüsü tarafından sağlanmıştır</td></tr><tr><td>propargil-L-lizin (Plk)</td><td>--</td><td>--</td><td>Würzburg Üniversitesi Eczacılık ve Biyoeczacılık Kürsüsü tarafından sağlanmıştır</td></tr><tr><td>pSRFduet-pyrtRNAsynth</td><td>--</td><td>--</td><td>Würzburg Üniversitesi Eczacılık ve Biyoeczacılık Kürsüsü tarafından sağlanan Qiagen</td></tr><tr><td>Jel Ekstraksiyon Kiti</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Jel Saflaştırma</td></tr><tr><td>Qiagen PCR saflaştırma Kiti</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>PCR Saflaştırma&nbsp;</td></tr><tr><td>Sodyum L-askorbat</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>A7631-100G</td><td>Tıklama reaksiyonu için kullanılan kimyasal</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaz</td><td>ThermoScientific</td><td>EL0011</td><td>Ligasyonu&nbsp;</td></tr><tr><td>tris (3-hidroksipropiltriazolilmetil) amin (THPTA)</td> <td>BaseClick</td><td>BCMI-006-100</td><td>Tıklama reaksiyonu için kullanılan kimyasal</td></tr><tr><td>4- (1,1,3,3-Tetrametilbutil) fenil-polietilen glikol</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>X100-1L</td><td>Triton X 100&nbsp;</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon konsantre hücre 400 ml &nbsp;</td><td>Merck KGaA</td><td>UFSC40001</td><td>Konsantre ünitesi</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Santrifüj Filtre Üniteleri</td><td>Merck KGaA</td><td>UFC901024</td><td>Konsantre santrifüj ünitesi</td></tr> <tr><td>& Auml; KTA avant FPLC</td><td>&Auml; KTA</td> <td>-</td> <td>FPLC makinesi</td></tr><tr><td>Avanti J-26XP</td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td>393124</td><td>Bakteri kültürü için santrifüj</td></tr><tr><td>Bakteriyel Çalkalama İnkübatörü</td><td>Infors Bakteri</td> kültürü için HT <td></td><td>Çalkalama inkübatörü</td></tr><tr><td>FluorChem Q sistemi</td><td>proteinsimple</td><td>--</td><td>SDS-PAGE için görüntüleme ve analiz sistemi</td></tr><tr><td>Floresan miskroskop</td><td>Keyence</td><td>BZ-9000 (BIOREVO)</td><td></td></tr> <tr><td>Fractogel & reg; EMD SO3- (M)</td><td>Merck KGaA</td><td>116882</td><td>İyon Değişim Kromatografisi kolon malzemesi</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR&reg; &nbsp; 96 kuyulu plakalar</td><td>Sigma</td><td>M5811-40EA</td><td>Hücre kültürü için 96 kuyulu plakalar (ALP Testi)</td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge X1R</td><td>ThermoScientific</td> <td>-</td> <td>Santrifüj</td></tr><tr><td>M-20 Mikroplaka Sallanan Kova Rotoru</td><td>ALP boyama sırasında plaka için Mikrosantrifüj için</td><td>ThermoScientific</td><td>75003624</td> Rotoru</tr><tr><td>Mikrosantrifüj - 5417R</td><td>Eppendorf</td> <td>-</td> <td>Santrifüj</td></tr><tr><td>OriginPro 9.1 G&nbsp;</td><td>OriginLab</td> <td>-</td> <td>ALP tahlil verilerinin statik analizi için yazılım</td></tr><tr><td>Polisin Slaytlar</td><td>ThermoScientific</td><td>10143265</td><td>mikroskop slaytları</td></tr><tr><td>Rotor JA-10</td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td>-</td> <td>Avanti J-26XP santrifüj</td></tr><tr><td>Rotor JLA 8.1</td><td>Beckman Coulter için rotor ve nbsp;</td><td>-</td> <td>Avanti J-26XP santrifüj</td></tr><tr><td>Rotoru JA 25.50</td><td>Beckman Coulter için rotor ve nbsp;</td><td>-</td> <td>Avanti J-26XP santrifüj için rotor</td></tr><tr><td>Tecan infinite M200 çok plakalı okuyucu</td><td>Tecan Deutschland GmbH</td> <td>-</td> <td>ALP testi için çoklu plaka okuyucu</td></tr><tr><td>Thermocycler - Labcycler Gradient</td><td>SensoQuest GmbH</td> <td>-</td> <td>PCR</td></tr><tr><td>TxRed - mikroskop filtresi</td><td>Floresan mikroskop için Keyence</td><td></td><td>Filtresi&nbsp;</td></tr><tr><td>Ultrafiltrasyon rejenere selüloz diskler 3 kDa</td><td>Merck KGaA</td><td>PLBC04310</td><td>amicon konsantre hücre 400ml</td></tr><tr><td>Ultrafiltrasyon rejenere selüloz diskler 10 kDa</td><td>Merck KGaA</td><td>PLGC04310</td><td>amicon konsantre hücre 400ml ile kullanılır</td></tr></tbody></table>

site yönettiği immobilizasyon kemik morfogenetik protein 2 katı yüzeyler için tıklayın kimya tarafından

Site-Directed Immobilization of Bone Morphogenetic Protein 2 to Solid Surfaces by Click Chemistry

Uzun kemik defektleri sigara şifa tedavisi için farklı tedavi stratejileri yoğun bir şekilde araştırdık. Tedaviler mevcut Biyomalzeme kemik morfogenetik proteinler (BMP) gibi Osteojenik büyüme faktörleri ile birlikte kullanımı yol açmıştır bazı sınırlamaları kullanılmakta. Yaygın olarak kullanılan emme veya saklama yöntemleri BMP2, genellikle birkaç ciddi olumsuz yan etkileri kışkırtır bir sözde ilk patlama yayın etkisi sonucu supra fizyolojik miktarda gerektirir. Bu sorunların üstesinden gelmek için strateji kovalent protein için iskele çift olacaktır. Ayrıca, bağlantı site belirli bir şekilde bir tekrarlanabilir ürün sonuç sağlamak için yapılmalıdır. Bu nedenle, biz bir yapay amino asit (propargyl-L-lizin) kodon kullanımı genişletme (BMP2-K3Plk) tarafından BMP2 protein olgun parçası tanıtıldı bir BMP2 değişken oluşturdu. BMP2-K3Plk functionalized boncuk bakır katalize azid ALKİN cycloaddition (CuAAC) ile birleştiğinde. Eşleşmiş BMP2 K3Plk biyolojik aktivitesini vitro kanıtlanmış oldu ve BMP2-K3Plk-functionalized boncuk Osteojenik etkinlik tabanlı hücre deneyleri kanıtlanmış oldu. C2C12 hücreleri ile temas functionalized boncuk boncuk yerel olarak kısıtlı bir mesafede alkalen fosfataz (ALP) ifade ikna edebildik. Böylece, bu tekniği ile functionalized iskele üretilebilir hücre farklılaşması Osteojenik bir soy doğru tetikleyebilir. Ayrıca, alt BMP2 dozlarda eşleşmiş BMP2 site yönettiği kontrollü yönelimi nedeniyle yeterlidir. Bu yöntemle, BMP her zaman onların reseptörleri hücre yüzeyi uygun yönde hangi faktörler site yönettiği kaplin teknikleri ile birleştiğinde Eğer durum böyle değil maruz kalır. Ürün sonucu çok kontrol edilebilir ve böylece, malzeme homojen özellikleri, onların uygulanabilirliği kritik boyutu tamiri için iyileştirilmesi ile sonuçlarında kusurları kemik.

Bu makalede, kovalent bir yeni BMP2 değişken, BMP2-K3Plk, piyasada bulunan azid functionalized özel boncuk (şekil 1) çift için bir yöntem açıklanmaktadır. Üretilen BMP2-K3Plk değişken bioactivity alkalen fosfataz (ALP) gen ekspresyonu C2C12 hücrelerdeki indüksiyon tarafından doğrulandı. Vitro test benzer ALP ifade düzeyleri vahşi türü BMP2 tarafından indüklenen gösterir (BMP2-WT) ve BMP2-K3Plk (Şekil 2).
<p class="jo...

Kemik morfogenetik Protein 2 (BMP2) katkılı Biyomalzeme yeni bir tedavi stratejisi sendikasız Kemik kırıkları iyileşmek için kullanılmaktadır. Yan etkileri faktörü kontrol edilemez bir sürümden kaynaklanan üstesinden gelmek için biz site için yeni bir strateji teklif-doğrudan böylece malzemeleri ile geliştirilmiş Osteojenik yetenekleri oluşturma faktörü, hareketsiz.

Site yönettiği immobilizasyon kemik morfogenetik protein 2 katı yüzeyler için tıklayın kimya tarafından

Different therapeutic strategies for the treatment of non-healing long bone defects have been intensively investigated. Currently used treatments present ...

Bu çalışmanın genel amacı, yeni tasarlanmış bir BMP2 varyantının tıklama kimyası ile bölgeye yönelik ve kovalent eşleşmesi yoluyla bir osteojenik iskelenin sağlam ve tekrarlanabilir üretimidir. Bu yöntem, uzun kemik kusurlarının iyileşmemesinin tedavisi için yaygın olarak kullanılan tekniklerle bağlantılı sorunların üstesinden gelmeye yardımcı olabilir. Absorpsiyon veya kapsülleme yöntemleri, birkaç ciddi yan etkiye neden olan süper fizyolojik miktarlarda BMP2 gerektirir.Bu tekniğin ana avantajı, iskelelere yandan yönlendirilmiş bir şekilde kovalent olarak bağlanan yeni tasarlanmış BMP2 varyantının daha düşük miktarlarının kullanılmasıdır. Tek bir koloniyi, mililitre kanamisin başına 50 mikrogram ve 37 santigrat derecede mililitre ampisilin başına 100 mikrogram ile 50 mililitre LB ortamında gece boyunca çoğaltın. Gece boyunca kültürleri bir ila 20 mililitre ila 800 mililitre müthiş et suyu ortamına seyreltin, mililitre kanamisin başına 50 mikrogram ve mililitre ampisilin başına 100 mikrogram ile desteklenmiştir.Kültürleri, 600 nanometrede 0.7'lik bir optik yoğunluğa ulaşılana kadar 37 santigrat derecede büyütün. Daha sonra propofol L-Lycine 10 milimolar nihai konsantrasyona ekleyin. Bir milimolar nihai konsantrasyon için IPTG ilavesiyle gen ekspresyonunu indükleyin.Kültürü 180 RPM'de bir orbital çalkalayıcıda 16 saat boyunca 37 santigrat derecede büyütün. İnkübasyondan sonra, tüm kültürü 30 dakika boyunca 9.000 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve bakteri peletini 30 mililitre TBSE tamponunda yeniden süspanse edin.Boş bir santrifüj kabını tartın ve yeniden askıya alınan peleti boş behere aktarın. Daha sonra yeniden askıya alınmış peleti 20 dakika boyunca 6, 360 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve kabı pelet ile tartın.Peletin ağırlığını hesaplamak için boş beherin ağırlığını çıkarın. Ardından peleti STE tamponunda yeniden askıya alın. Her 10 gram pelet için 200 mililitre STE tamponu kullanın.20 dakika boyunca 6, 360 kez g'de santrifüjlemeden önce süspansiyonu buz üzerinde sonikasyona tabi tutun. Süpernatanı atın ve peleti tartın. Sonikasyon ve santrifüjleme adımlarını dört kez tekrarladıktan sonra, peleti 100 mililitre TBS tamponunda tekrar askıya alın.20 dakika boyunca 6, 360 kez g'de santrifüjleyin. Ardından süpernatanı atın ve peleti tartın. Bir gram pelet başına 10 mililitre kullanarak peleti yeni eklenmiş nükleaz ile nükleaz tamponunda yeniden süspanse edin.Süspansiyonu gece boyunca oda sıcaklığında 30 RPM'de bir karıştırma plakası üzerinde inkübe edin. Ertesi gün süspansiyona Triton Buffer ekleyin. Eklenecek Triton Tamponunun hacmi, süspansiyonun 0,5 hacimlik bir kısmına karşılık gelir.Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe ettikten sonra, süspansiyonu 20 dakika boyunca 6.360 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti tartın. Ardından, gram pelet başına sekiz mililitre kullanarak peleti TE Buffer içinde yeniden askıya alın.Daha önce olduğu gibi santrifüjledikten sonra, süpernatanı atın ve peleti tartın. Şimdi gram başına dört mililitre 25 milimolar sodyum asitat, PH5 ve bir milimolar DTT ile gram başına beş mililitre altı molar guanidinyum klorür ekleyerek peleti yeniden askıya alın. Süspansiyonu bir karıştırma plakası üzerinde gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.20 dakika boyunca 75.500 kez g'de santrifüjlemenin ardından, süpernatant katlanmamış, monomerik BMP2 proteinini içerir. Süpernatanı toplayın ve bu ekstraktı, konsantre bir hücrede üç kilodalton moleküler ağırlıklı bir kesme zarı kullanarak mililitre başına 20'lik bir optik yoğunluğa konsantre edin. Karıştırırken konsantre monomerleri tek damlalar halinde Renatürasyon Tamponuna ekleyin.Daha sonra çözeltiyi karanlıkta 120 saat oda sıcaklığında inkübe edin. Çözeltiyi bir milimolar hidroklorik aside karşı diyalize etmeden önce konsantre hidroklorik asit kullanarak çözeltinin pH'ını 3.0'a ayarlayın. Diyaliz çözeltisini, konsantre edici bir hücrede 10 kilodalton moleküler ağırlıklı bir kesme membranı kullanarak konsantre edin.Daha sonra protein çözeltisini dengelenmiş kolona yükleyin, iki mililitre fraksiyon toplayarak doğrusal bir Tampon B gradyanı kullanarak fraksiyonları seyreltin. Monomer içeren fraksiyonları ve dimer içeren fraksiyonları belirlemek için SDS Poliakrilamid jel elektroforezi ve ardından Coomassie Brilliant Blue boyama ile her fraksiyonun 20 mikrolitresini analiz edin. Daha sonra kesirler içeren dimer'ı çekin.Fraksiyonlar içeren dimer havuzunu, beş litre bir milimolar hidroklorik aside karşı gece boyunca dört santigrat derecede diyalize edin. Nihai ürünü SDS-PAGE ve Coomassie Brilliant Blue boyama ile analiz etmeden önce 10 kilodalton konsantre santrifüj filtre ünitesi kullanarak ürünü konsantre edin. Negatif kontrol olarak kullanılan 20 mikromolar BMP2-K3Plk veya BMP2-while tipi ile 20 mikrolitre Azid aktif agaroz boncukları toplam 500 mikrolitre hacminde Reaksiyon Tamponunda birleştirin.20 RPM'de dönen bir karışım üzerinde oda sıcaklığında iki saat inkübe edin. Beş milimolar EDTA'nın son konsantrasyonunu ekleyerek reaksiyonu durdurun. Çözeltiyi oda sıcaklığında 20 RPM'de dönen bir karıştırıcı üzerinde 15 dakika inkübe edin.Daha sonra numuneleri oda sıcaklığında bir dakika boyunca 20.000 kez g'de santrifüjleyin ve süpernatanları toplayın. Daha sonra boncukları içeren peleti 1.000 mikrolitre HBS 500 Tampon ile yıkayın. Numuneyi oda sıcaklığında bir dakika boyunca 20.000 kez g'de santrifüjleyin ve süpernatanı toplayın.Bu yıkama işlemini HBS 500 Tamponu ile iki kez daha, dört molar magnezyum klorür ile üç kez ve PBS ile iki kez tekrarlayın ve her seferinde süpernatanı toplayın. Birleştirilmiş boncukları dört santigrat derecede 1.000 mikrolitre PBS'de saklayın. ALP testini metin protokolünde açıklandığı gibi gerçekleştirin.ALP boyamayı gerçekleştirmek için, DMEM'deki promiyoblastik C2C12 hücrelerini% 10 fetal buzağı serumu ve ayrıca mililitre başına 100 birim Penisilin G ve Streptomisin'i 37 derecede 37 derece karbondioksitte nemlendirilmiş bir atmosferde kültürleyin. C2C12 hücrelerini, 96 oyuklu bir mikroplakada kuyu başına 30.000 hücre yoğunluğunda besleyin. Hücrelerin gece boyunca bağlanmasına izin verdikten sonra, ortamı çıkarın ve PMB2-K3PLK birleştirilmiş boncukların oyuğu başına 20 mikrolitre ekleyin.Daha sonra her bir oyuğa 20 mikrolitre% 0.4 düşük erime noktalı agaroz ekleyin. 96 kuyulu mikro plakayı 2.000 kez g'de 20 santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Sonra aynı ortamdan 80 mikrolitre ekleyin.37 santigrat derecede% 5 karbondioksitte nemlendirilmiş bir atmosferde 72 saat boyunca inkübe edin. İnkübasyondan sonra, katılaşmış %0.4 agarozu ayırmamaya dikkat ederek ortamı çıkarın. Bir adımlı MBT-BCIP alt düz çözeltisinin kuyusu başına 100 mikrolitre ekleyin.Mor lekelenme belirginleştikten hemen sonra ışık mikroskobu kullanarak alkalin fosfatidat lekelenmesini analiz edin. Parlak alan mikroskobu kullanın ve fotoğraf çekin. Yeni üretilen BMP2-K3Plk varyantının biyoaktivitesi, C2C12 hücrelerinde alkalin fosfataz gen ekspresyonunun indüksiyonu ile doğrulanmıştır.İn vitro test, tip BMP2 veya BMP2-K3Plk tarafından indüklenen benzer alkalin fosfataz gen ekspresyon seviyelerini gösterir. Kapak katalizli azid alkin siklo ilavesi yoluyla BMP2-K3Plk ile kaplanmış boncuklar, dilabelli BMP reseptörü 1A eko-alanı ile inkübe edildiğinde floresanlar verdi. BMP reseptörü 1A'nın BMP2-K3Plk'ya bağlanması, eşleşmeden sonra biyoaktivitenin tutulmasını doğrular.BMP2-K3Plk işlevselleştirilmiş boncukların biyoaktivitesi, ALP aracılı boyama ile kanıtlanmıştır. Boyama, yalnızca BMP2-K3Plk işlevselleştirilmiş boncuklarla doğrudan temas halinde olan hücrelerde meydana geldi ve proteinin gerçekten boncuklara kovalent olarak bağlı olduğunu ve sadece emilmediğini doğruladı. Protein emilen durumda serbest bırakılırsa, burada çözünür BMP2-K2Plk ile muamele edildikten sonra alkalin fosfataz boyaması için görüldüğü gibi, daha büyük mesafelerde daha geniş bir boyama gözlenirdi.Bu videoyu izledikten sonra, genetik genişleme ile biyolojik olarak aktif proteinlerin nasıl ifade edileceğini ve üretileceğini ve kurgusal bir proteinin tıklama kimyası reaksiyonu ile mikrokürelere nasıl kovalent olarak bağlanacağını iyi anlamış olmalısınız. Genetik genişleme ile protein varyansı üretmek, prensip olarak, birincil protein dizisinin herhangi bir pozisyonunda yapay amino asidin sokulmasına izin verir. BMP2 dizisine bir mutasyon eklemek, yeniden katlama verimliliğini etkileyebilir ve ayrıca protein parametrelerini de değiştirebilir.BMP2-K3Plk üretimi, while tipi BMP2'nin ifadesi için yerleşik yöntemin bir modifikasyonunu gerektirdi. Üretilen BMP2-K3Plk, while tipi proteininkiyle karşılaştırılabilir biyolojik aktivite gösterdi. BMP2 varyantını, tıklama kimyası ile azire kurgulu agaroz boncuklara kovalent olarak birleştirme yaklaşımımız, yüksek verimlilikle gerçekleştirilebilir, bu da in vitro bir genetik farklılaşma bulan kurgusal boncuklarla sonuçlanabilir.İyi laboratuvar uygulamalarına göre standart koruma sağlanmalıdır.

site-directed-immobilization-bone-morphogenetic-protein-2-to-solid

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu yazıda, nasıl bir otomatik tarama konfokal mikroskop kullanılarak bir yüzeye immobilize bireysel DNA molekülleri izleri FRET elde açıklar.

Yüzey immobilize Biyomoleküller Tek Molekül Floresans Ölçümler için Otomatik Sistem

Bir faj gösterim kütüphanesi hedef kemiği de peptit dizileri tanımlamak için kullanılır oldu. Amacı, mezenkimal hücre farklılaşması, bu peptitler etkisini araştırmak ve kemik rejenerasyonu üzerindeki etkisini belirlemek için.

Bakteriyofaj Görüntüleme Kütüphane Peptitler Mezenkimal Hücreler Gen ekspresyonunu modüle ve Unicortical Kemik Hastalıkları Osteogenezi potansiyalize

Biz sıralı on-chip bioorthogonal Siklokatılma kimya ve antikor-antijen yakalama kullanarak, küçük moleküllerin hızlı, geri dönüşümlü immobilizasyon ve Yüzey Plazmon Rezonans (SPR) çalışmaları için işlevselleştirilen nanoparçacık meclisleri için bir yöntem mevcut.

Tersi Küçük Moleküller veya Biosensor Uygulamaları için Çok bileşenli Yapılar hareketsiz için microfluidic On-chip Yakalama sikloeklenme Tepki

Bu yüzeylerde BMP-2 etkin hareketsiz hale getirmeye yönelik bir metodu tarif etmektedir. Yaklaşımımız serbest amin kalıntısı ile BMP-2 bağlanması kovalent elde etmek için bir kendi kendine monte tek tabaka oluşumuna dayanır. Bu yöntem, hücre membranında sinyalini incelemek için yararlı bir araçtır.

Kovalent Öz-monte tabakalı Yaklaşım Kullanarak Yüzeyler üzerinde BMP-2 bağlanması

Biyolojik ligandların mikro ölçekli modelleriyle işlevselleştirilmiş hücre kültürü substratları, doku mühendisliği alanında çok büyük bir faydaya sahiptir. Burada, biyolojik ligandların mekansal olarak hassas ve bölgeye özgü immobilizasyonunu sağlayan ortogonal kimyalar sunan çoklu, mikro desenli poli (etilen glikol) fırçalarla doku kültürü substratlarının çok yönlü ve otomatik üretimini gösteriyoruz.

Robotik Microcontact Baskı (R-μCP) kullanarak Karmaşık Kültürü Substratlar ve Sıralı nükleofilik Giren Fabricating

Tasarlanmış mikro kanallarla kemik benzeri bir şablon oluşturmak için adım adım genel bir süreç sunulmaktadır. Şablonun yüksek emilim ve tutma yetenekleri, mikro kanallar aracılığıyla kılcal hareket ile gösterilir.

Mikro-kanallar tarafından Distinctive Kılcal Eylem Bone gibi şablonları Büyük Kemikli Defekt Restorasyon Hücreleri İşe Alım geliştirin edebilirsiniz

Heparin ve protaminden üretilen kendiliğinden birleşen polielektrolit kompleksleri (PEC), osteojenik büyüme faktörlerinin salınımını yakalamak ve düzenlemek için aljinat boncuklar üzerinde biriktirildi. Bu uygulama stratejisi, spinal füzyon uygulamalarında BMP-2 dozunun 20 kat azaltılmasını sağlar. Bu makale, PEC'lerin faydalarını ve üretimini göstermektedir.

Heparin Binding Domain osteojenik Büyüme Faktörü Teslim polielektrolit Kompleksi

Bu yöntemde, photopolymerization kullanıyoruz ve polietilen glikol (PEG) hydrogels, sağlayan yüzeyinde protein veya peptid desen oluşturmak için tıklatın kimya teknikleri biyoaktif sinyaller hücresel yanıt vitro incelenmesi için immobilize .

Biyoaktif proteinler veya peptidler hidrojel Photochemistry biyolojik uygulamalarda kullanarak üzerinde desenlendirme

Biz bir basit tekniğinde gen uzunluğunda DNA moleküllerinin immobilizasyon için boş hücre gen ifade deneyler biochips üzerinde gerçekleştirmek için kullanılan bir yüzey üzerinde açıklayınız.

Genlerin Multistep Strand deplasman litografi kullanarak işlevsel yüzey immobilizasyon

Burada, bir laboratuvar-on-a-chip platformu içinde kemik remodeling analiz için protokoller sıyoruz. Bir 3D baskılı mekanik yükleme cihazı hücresel matris deforme ederek osteosit mekanostransdüksiyon neden platform ile eşleştirilmiş olabilir. Platform aynı zamanda osteoklastlar ve osteoblastlar (rezorpsiyon / oluşumu) kemik remodeling fonksiyonel sonuçları ölçmek için kullanılabilir.

Osteosit Mekanotransdüksiyonu Uyaran ve Kemik Remodeling Fonksiyonel Sonuçları Analiz için Bir Lab-On-A-Chip Platformu

Bu protokol, jelatin bazlı granüler bir destekte bir kalsiyum fosfat mürekkebi biriktirerek kemik benzeri yapılar üretmek için bir 3D baskı tekniğini açıklar. Baskılı kemik analogları, baskının doğrudan toplanması veya multifazik yapılar için canlı bir hücre matrisi içinde çapraz bağlanma esnekliği ile serbest formda biriktirilir.

Kemik Analoglarının Üretimi için Hücre Yüklü Süspansiyonlarda Seramik Çok Yönlü Biyobaskı

Öğrenin, tıklama kimyası kullanarak BMP2'nin yönlendirilmiş immobilizasyonuyla osteojenik iskeleler üretmeyi. Bu yöntem, kemik iyileşmesinde yan etkileri azaltır ve düşük dozlarda etkili tedavi sağlar.

Site yönettiği immobilizasyon kemik morfogenetik protein 2 katı yüzeyler için tıklayın kimya tarafından

Daha fazla video keşfet