Site yönettiği immobilizasyon kemik morfogenetik protein 2 katı yüzeyler için tıklayın kimya tarafından

Bu çalışmanın genel amacı, yeni tasarlanmış bir BMP2 varyantının tıklama kimyası ile bölgeye yönelik ve kovalent eşleşmesi yoluyla bir osteojenik iskelenin sağlam ve tekrarlanabilir üretimidir. Bu yöntem, uzun kemik kusurlarının iyileşmemesinin tedavisi için yaygın olarak kullanılan tekniklerle bağlantılı sorunların üstesinden gelmeye yardımcı olabilir. Absorpsiyon veya kapsülleme yöntemleri, birkaç ciddi yan etkiye neden olan süper fizyolojik miktarlarda BMP2 gerektirir.

Bu tekniğin ana avantajı, iskelelere yandan yönlendirilmiş bir şekilde kovalent olarak bağlanan yeni tasarlanmış BMP2 varyantının daha düşük miktarlarının kullanılmasıdır. Tek bir koloniyi, mililitre kanamisin başına 50 mikrogram ve 37 santigrat derecede mililitre ampisilin başına 100 mikrogram ile 50 mililitre LB ortamında gece boyunca çoğaltın. Gece boyunca kültürleri bir ila 20 mililitre ila 800 mililitre müthiş et suyu ortamına seyreltin, mililitre kanamisin başına 50 mikrogram ve mililitre ampisilin başına 100 mikrogram ile desteklenmiştir.

Kültürleri, 600 nanometrede 0.7'lik bir optik yoğunluğa ulaşılana kadar 37 santigrat derecede büyütün. Daha sonra propofol L-Lycine 10 milimolar nihai konsantrasyona ekleyin. Bir milimolar nihai konsantrasyon için IPTG ilavesiyle gen ekspresyonunu indükleyin.

Kültürü 180 RPM'de bir orbital çalkalayıcıda 16 saat boyunca 37 santigrat derecede büyütün. İnkübasyondan sonra, tüm kültürü 30 dakika boyunca 9.000 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve bakteri peletini 30 mililitre TBSE tamponunda yeniden süspanse edin.

Boş bir santrifüj kabını tartın ve yeniden askıya alınan peleti boş behere aktarın. Daha sonra yeniden askıya alınmış peleti 20 dakika boyunca 6, 360 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve kabı pelet ile tartın.

Peletin ağırlığını hesaplamak için boş beherin ağırlığını çıkarın. Ardından peleti STE tamponunda yeniden askıya alın. Her 10 gram pelet için 200 mililitre STE tamponu kullanın.

20 dakika boyunca 6, 360 kez g'de santrifüjlemeden önce süspansiyonu buz üzerinde sonikasyona tabi tutun. Süpernatanı atın ve peleti tartın. Sonikasyon ve santrifüjleme adımlarını dört kez tekrarladıktan sonra, peleti 100 mililitre TBS tamponunda tekrar askıya alın.

20 dakika boyunca 6, 360 kez g'de santrifüjleyin. Ardından süpernatanı atın ve peleti tartın. Bir gram pelet başına 10 mililitre kullanarak peleti yeni eklenmiş nükleaz ile nükleaz tamponunda yeniden süspanse edin.

Süspansiyonu gece boyunca oda sıcaklığında 30 RPM'de bir karıştırma plakası üzerinde inkübe edin. Ertesi gün süspansiyona Triton Buffer ekleyin. Eklenecek Triton Tamponunun hacmi, süspansiyonun 0,5 hacimlik bir kısmına karşılık gelir.

Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe ettikten sonra, süspansiyonu 20 dakika boyunca 6.360 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti tartın. Ardından, gram pelet başına sekiz mililitre kullanarak peleti TE Buffer içinde yeniden askıya alın.

Daha önce olduğu gibi santrifüjledikten sonra, süpernatanı atın ve peleti tartın. Şimdi gram başına dört mililitre 25 milimolar sodyum asitat, PH5 ve bir milimolar DTT ile gram başına beş mililitre altı molar guanidinyum klorür ekleyerek peleti yeniden askıya alın. Süspansiyonu bir karıştırma plakası üzerinde gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

20 dakika boyunca 75.500 kez g'de santrifüjlemenin ardından, süpernatant katlanmamış, monomerik BMP2 proteinini içerir. Süpernatanı toplayın ve bu ekstraktı, konsantre bir hücrede üç kilodalton moleküler ağırlıklı bir kesme zarı kullanarak mililitre başına 20'lik bir optik yoğunluğa konsantre edin. Karıştırırken konsantre monomerleri tek damlalar halinde Renatürasyon Tamponuna ekleyin.

Daha sonra çözeltiyi karanlıkta 120 saat oda sıcaklığında inkübe edin. Çözeltiyi bir milimolar hidroklorik aside karşı diyalize etmeden önce konsantre hidroklorik asit kullanarak çözeltinin pH'ını 3.0'a ayarlayın. Diyaliz çözeltisini, konsantre edici bir hücrede 10 kilodalton moleküler ağırlıklı bir kesme membranı kullanarak konsantre edin.

Daha sonra protein çözeltisini dengelenmiş kolona yükleyin, iki mililitre fraksiyon toplayarak doğrusal bir Tampon B gradyanı kullanarak fraksiyonları seyreltin. Monomer içeren fraksiyonları ve dimer içeren fraksiyonları belirlemek için SDS Poliakrilamid jel elektroforezi ve ardından Coomassie Brilliant Blue boyama ile her fraksiyonun 20 mikrolitresini analiz edin. Daha sonra kesirler içeren dimer'ı çekin.

Fraksiyonlar içeren dimer havuzunu, beş litre bir milimolar hidroklorik aside karşı gece boyunca dört santigrat derecede diyalize edin. Nihai ürünü SDS-PAGE ve Coomassie Brilliant Blue boyama ile analiz etmeden önce 10 kilodalton konsantre santrifüj filtre ünitesi kullanarak ürünü konsantre edin. Negatif kontrol olarak kullanılan 20 mikromolar BMP2-K3Plk veya BMP2-while tipi ile 20 mikrolitre Azid aktif agaroz boncukları toplam 500 mikrolitre hacminde Reaksiyon Tamponunda birleştirin.

20 RPM'de dönen bir karışım üzerinde oda sıcaklığında iki saat inkübe edin. Beş milimolar EDTA'nın son konsantrasyonunu ekleyerek reaksiyonu durdurun. Çözeltiyi oda sıcaklığında 20 RPM'de dönen bir karıştırıcı üzerinde 15 dakika inkübe edin.

Daha sonra numuneleri oda sıcaklığında bir dakika boyunca 20.000 kez g'de santrifüjleyin ve süpernatanları toplayın. Daha sonra boncukları içeren peleti 1.000 mikrolitre HBS 500 Tampon ile yıkayın. Numuneyi oda sıcaklığında bir dakika boyunca 20.000 kez g'de santrifüjleyin ve süpernatanı toplayın.

Bu yıkama işlemini HBS 500 Tamponu ile iki kez daha, dört molar magnezyum klorür ile üç kez ve PBS ile iki kez tekrarlayın ve her seferinde süpernatanı toplayın. Birleştirilmiş boncukları dört santigrat derecede 1.000 mikrolitre PBS'de saklayın. ALP testini metin protokolünde açıklandığı gibi gerçekleştirin.

ALP boyamayı gerçekleştirmek için, DMEM'deki promiyoblastik C2C12 hücrelerini% 10 fetal buzağı serumu ve ayrıca mililitre başına 100 birim Penisilin G ve Streptomisin'i 37 derecede 37 derece karbondioksitte nemlendirilmiş bir atmosferde kültürleyin. C2C12 hücrelerini, 96 oyuklu bir mikroplakada kuyu başına 30.000 hücre yoğunluğunda besleyin. Hücrelerin gece boyunca bağlanmasına izin verdikten sonra, ortamı çıkarın ve PMB2-K3PLK birleştirilmiş boncukların oyuğu başına 20 mikrolitre ekleyin.

Daha sonra her bir oyuğa 20 mikrolitre% 0.4 düşük erime noktalı agaroz ekleyin. 96 kuyulu mikro plakayı 2.000 kez g'de 20 santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Sonra aynı ortamdan 80 mikrolitre ekleyin.

37 santigrat derecede% 5 karbondioksitte nemlendirilmiş bir atmosferde 72 saat boyunca inkübe edin. İnkübasyondan sonra, katılaşmış %0.4 agarozu ayırmamaya dikkat ederek ortamı çıkarın. Bir adımlı MBT-BCIP alt düz çözeltisinin kuyusu başına 100 mikrolitre ekleyin.

Mor lekelenme belirginleştikten hemen sonra ışık mikroskobu kullanarak alkalin fosfatidat lekelenmesini analiz edin. Parlak alan mikroskobu kullanın ve fotoğraf çekin. Yeni üretilen BMP2-K3Plk varyantının biyoaktivitesi, C2C12 hücrelerinde alkalin fosfataz gen ekspresyonunun indüksiyonu ile doğrulanmıştır.

İn vitro test, tip BMP2 veya BMP2-K3Plk tarafından indüklenen benzer alkalin fosfataz gen ekspresyon seviyelerini gösterir. Kapak katalizli azid alkin siklo ilavesi yoluyla BMP2-K3Plk ile kaplanmış boncuklar, dilabelli BMP reseptörü 1A eko-alanı ile inkübe edildiğinde floresanlar verdi. BMP reseptörü 1A'nın BMP2-K3Plk'ya bağlanması, eşleşmeden sonra biyoaktivitenin tutulmasını doğrular.

BMP2-K3Plk işlevselleştirilmiş boncukların biyoaktivitesi, ALP aracılı boyama ile kanıtlanmıştır. Boyama, yalnızca BMP2-K3Plk işlevselleştirilmiş boncuklarla doğrudan temas halinde olan hücrelerde meydana geldi ve proteinin gerçekten boncuklara kovalent olarak bağlı olduğunu ve sadece emilmediğini doğruladı. Protein emilen durumda serbest bırakılırsa, burada çözünür BMP2-K2Plk ile muamele edildikten sonra alkalin fosfataz boyaması için görüldüğü gibi, daha büyük mesafelerde daha geniş bir boyama gözlenirdi.

Bu videoyu izledikten sonra, genetik genişleme ile biyolojik olarak aktif proteinlerin nasıl ifade edileceğini ve üretileceğini ve kurgusal bir proteinin tıklama kimyası reaksiyonu ile mikrokürelere nasıl kovalent olarak bağlanacağını iyi anlamış olmalısınız. Genetik genişleme ile protein varyansı üretmek, prensip olarak, birincil protein dizisinin herhangi bir pozisyonunda yapay amino asidin sokulmasına izin verir. BMP2 dizisine bir mutasyon eklemek, yeniden katlama verimliliğini etkileyebilir ve ayrıca protein parametrelerini de değiştirebilir.

BMP2-K3Plk üretimi, while tipi BMP2'nin ifadesi için yerleşik yöntemin bir modifikasyonunu gerektirdi. Üretilen BMP2-K3Plk, while tipi proteininkiyle karşılaştırılabilir biyolojik aktivite gösterdi. BMP2 varyantını, tıklama kimyası ile azire kurgulu agaroz boncuklara kovalent olarak birleştirme yaklaşımımız, yüksek verimlilikle gerçekleştirilebilir, bu da in vitro bir genetik farklılaşma bulan kurgusal boncuklarla sonuçlanabilir.

İyi laboratuvar uygulamalarına göre standart koruma sağlanmalıdır.