ΓH2AX ve 53BP1 oluşumu ve DNA çift iplikli kırılmalara tamiri analiz etmek için ayirt mikroskobu

Gama-H2AX ve 53BP1 immünofloresan mikroskobunun genel amacı, çeşitli dokularda DNA çift sarmallı kırılmaların oluşumunu ve onarımını analiz etmektir. Bu yöntem, tümör hücrelerinde genetik kararsızlığın nasıl ortaya çıktığı gibi kanser araştırmalarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tek DNA çift ip kopmalarının görselleştirilebilmesi ve onarım süreçlerinin analiz edilebilmesidir.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımızın bir teknisyeni olan Susanne Brendel olacaktır. Deneye, yüzde 0,9 sodyum klorür içinde mililitre başına 200 Uluslararası Birim heparin içeren pıhtılaşma önleyici stok çözeltisinden başlayarak çözeltiler hazırlayarak başlayın. Kan veya kemik iliği örneklerini çekmeden önce toplama tüplerinin her birini iki mililitre antikoagülan stok solüsyonu ile doldurun.

Daha sonra, 82.91 gram amonyum klorür, 7.91 gram amonyum bikarbonat ve iki mililitre 0.5 molar etilendiamenetetracedik asit çözeltisi ile kırmızı hücreler için 10X Lysis solüsyonunu, ajanları toplam bir litre hacim için çift damıtılmış suda çözerek 8.0 pH'a hazırlayın. Daha sonra, bir mikrotitre tüpünde 360 miligram paraformaldehit veya PFA'ya 8.3 mikrolitre bir molar potasyum hidroksit çözeltisi ekleyerek fiksasyon çözeltisini hazırlayın. Tüpü fosfat tamponlu salin veya PBS ile tüpün bir mililitre işaretine kadar doldurun ve yüzde 36'lık bir PFA çözeltisinin bir mililitresini elde etmek için tüpü 95 santigrat derecede bir ısıtma bloğunda ısıtın.

Bir mililitre yüzde 36 PFA çözeltisini 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Ve dokuz mililitre yüzde dört PFA stok çözeltisi elde etmek için sekiz mililitre PBS ekleyin. Yüzde dört PFA stok çözeltisini alın ve hücre fiksasyonu için kullanılana kadar eksi 18 santigrat derecede saklayın.

Daha sonra, yaklaşık yüzde 0.1 Octoxynol 9'luk bir çözelti elde etmek için 50 mikrolitre Octoxynol 9 ila 50 mililitre PBS ekleyerek geçirgenleştirme çözeltisini hazırlayın. Son olarak, protein bloke edici ajanı PBS ile karıştırarak yüzde beş ve yüzde iki bloke edici çözeltiler hazırlayın. Kan veya kemik iliği örneklerini hazırlamak için, iki mililitre antikoagülan stok çözeltisi ile doldurulmuş tüpleri alın.

Steril koşullar altında sırasıyla venepunktur veya kemik iliği ponksiyonu ile tüp başına yedi mililitre kan veya kemik iliği çekin. Numuneleri gece boyunca oda sıcaklığında saklayın. Gece boyunca saklandıktan sonra, heparinize kan örneğini PBS ile bire bir ve heparinize kemik iliği örneğini PBS ile bir ila üç oranında seyreltin.

Hücreleri pipetin içine ve dışına iki kez çekerek nazikçe askıya alın. Ardından, yeni bir tüpe bir hacim yoğunluk gradyan ortamı ekleyin. Seyreltilmiş kan veya kemik iliğini yoğunluk gradyan ortamının üzerine nazikçe yerleştirin ve iki katmanı karıştırmamaya dikkat edin.

Tüpü oda sıcaklığında 30 dakika ve 400 G santrifüj edin. Üst plazma tabakasını bir pipetle çekin. Ardından, yoğunluk gradyan ortamının üzerindeki katmandaki mononükleer hücreleri dikkatlice hasat edin. Mononükleer hücreleri yeni bir tüpe aktarın ve en az üç hacim PBS ekleyin.

Hücreleri pipetin içine ve dışına iki kez çekerek nazikçe askıya alın. Tüpü santrifüjleyin. Döndürme işleminden sonra süpernatanı çıkarın.

Kırmızı hücreler için 10 mililitre dört santigrat derece 1x Lizis çözeltisi ekleyin. Hücreleri iki kez pipetin içine ve dışına çekerek nazikçe yeniden askıya alın ve tüpü beş dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. Ardından, dört santigrat derecede 30 mililitre PBS ekleyin ve tüpü santrifüjleyin.

CD34 pozitif hücrelerin izolasyonu için CD34 mikro boncukları ve hücre ayırma kolonlarını kullanın. Her preparat için beş hücrenin bir kez 10 kez santrifüjlenmesi ile hasta numunelerinin mononükleer hücreleri ile iki sito-spin hazırlayın. Hücreleri 10 dakika boyunca 200 mikrolitre yüzde dört PFA ile sabitleyin.

Fiksasyondan sonra, hücreleri bir çalkalayıcı üzerinde her biri beş dakika boyunca 30 mililitre PBS ile üç kez nazikçe yıkayın. Daha sonra, hücreleri 200 mikrolitre yüzde 0.1 Octoxynol 9 ile 10 dakika boyunca geçirgen hale getirin. Hücreleri, bir laboratuvar çalkalayıcıda her biri beş dakika boyunca 30 mililitre yüzde beş bloke edici solüsyonla üç kez nazikçe yıkayın.

Hücreleri bir saat boyunca 30 mililitre taze yüzde beş bloke edici solüsyonda bloke edin. Hücrelerin yüzde 0.1 Octoxynol 9'da yüzde dört paraformaldehit ile sabitlenmesi ve geçirgenleştirilmesi, gama-H2AX ve 53BP1 odaklarını belirgin şekilde korur. Hücrelerin bir preparasyonunu bir fare monoklonal anti-gama-H2AX antikoru ile ve hücrelerin diğer preparatını bir fare monoklonal anti-gama-H2AX antikoru ve bir poliklonal tavşan anti-53BP1 antikoru ile gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

Kanıtlanmış anti-gama-H2AX ve anti-53BP1 antikorlarının kullanılması şiddetle tavsiye edilir. İnkübasyondan sonra, hücreleri bir laboratuvar çalkalayıcıda her beş dakika boyunca 30 mililitre yüzde iki bloke edici solüsyonla üç kez nazikçe yıkayın. Daha sonra, hücrelerin ilk hazırlığını, yüzde iki bloke edici çözelti içinde 500'de bir oranında seyreltilmiş bir Alexa 488 konjuge keçi anti-fare ikincil antikoru ile inkübe edin.

Hücrelerin ikinci hazırlığını, bir Alexa 488 konjuge keçi anti-fare ikincil antikoru ve bir Alexa 555 konjuge eşek anti-tavşan ikincil antikoru ile 500'de bir oranında seyreltilmiş yüzde iki bloke edici çözelti ile inkübe edin. Hücreleri bir laboratuvar çalkalayıcısında 30 mililitre PBS ile üç kez nazikçe yıkayın. PBS'yi çıkarın ve hücreleri montaj ortamıyla monte edin.

Hava kabarcığı oluşmaması için montaj ortamının üzerine dikkatli bir şekilde bir kapak askısı koyun. Hücreleri floresan mikroskobu ile analiz etmeden önce montaj ortamının sertleşmesi için en az üç saat bekleyin. Son olarak, 100x nesneli büyütmede görüntüleme sırasında DAPI, Alexa 488 ve Cy3 için filtrelerle donatılmış bir floresan mikroskobu ile hücre çekirdeğindeki gama-H2AX ve 53BP1 odaklarını analiz edin.

Hücrelerdeki gama-H2AX odaklarının analizi, fibroblastların bu temsili görüntüsünde gösterildiği gibi, gama-H2AX odaklarının farklı floresan noktalar olarak göründüğü G0, G1 fazı ve G2 fazında en doğrudur. Buna karşılık, S fazı sırasında hücrelerdeki gama-H2AX odaklarının analizi, replikasyon işleminin neden olduğu dağınık pan-nükleer gama-H2AX benekleri ile karmaşıklaşır. Işınlanmış dokularda DNA çift iplikçik kırılmalarının nicelleştirilmesi için gama-H2AX'in immünofloresan boyaması kullanıldı ve ışınlanmış lenfositlerdeki gama-H2AX odaklarının seviyelerinin ışınlama dozu ile orantılı olduğu açıklandı.

Akut miyeloid lösemili bir hastanın CD34 pozitif hücrelerinde gama-H2AX ve 53BP1 odaklarının birlikte lokalizasyonu, DNA çift iplikli kopma bölgelerinde 53BP1 aracılı homolog olmayan uç birleştirme onarım mekanizmalarının teşvik edildiğini gösterir. Bu videoyu izledikten sonra, DNA çift iplikçik kırılmalarının analizi için gama-H2AX ve 53BP1 immünofloresan mikroskobunun nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedürü takiben, DNA hasar yanıtındaki değişiklikleri analiz etmek için tümör hücrelerinde fosforla ilişkili ATM, ATR, kontrol noktası kinaz bir, kontrol noktası kinaz iki ve TP53'ün immünoblotlanması gibi diğer yöntemler uygulanabilir.