Name: ΓH2AX ve 53BP1 oluşumu ve DNA çift iplikli kırılmalara tamiri analiz etmek için ayirt mikroskobu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Öğrenin, γH2AX ve 53BP1 immünofloresan mikroskobisi ile DNA çift iplikli kırıklarının oluşumunu ve onarımını analiz etmeyi. Bu yöntem, tümör hücrelerinde genetik instabiliteyi anlamak için kritik öneme sahiptir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Proje Alman Jose Carreras lösemi Vakfı (DJCLS 14 R/2017) tarafından desteklenmiştir.

Tüm yöntem tanımlamak burada Heidelberg Üniversitesi Tıp Fakültesi Mannheim Etik Komitesi II tarafından onaylanmıştır. Aydınlatılmış onam tüm bireyler elde edilen yazılı.
 1. hazırlık malzemeleri <ol><li>antikoagülan hisse senedi çözüm: mL % 0,9 Sodyum Klorür başına 200 IU heparin bir antikoagülan hisse senedi çözüm hazırlamak. Her koleksiyon tüpleri doldurun (birim çizmek 9 mL) 2 mL kan veya kemik iliği örnekleri geri çekilmesi önce antikoagülan stok çözeltisi ile.</li>
	<li>Lizis çözüm kırmızı hücreleri için: hazırla 10 x kırmızı hücreleri 82.91 g amonyum klorür, 7,91 g amonyum bikarbonat ve 2 mL ajanları eriterek tarafından 8,0 pH için 0, 5 M ethylenediaminetetraacetic asit çözeltisi ile lizis çözüm Çift distile su için toplam hacmi 1 L.</li>
	<li>Fiksasyon çözüm: ekleyin 8.3 µL 360 mg paraformaldehyde (PFA) bir microtiter tüp bir 1 M potasyum hidroksit çözüm. Tüp, tüp ve ısı Isıtma blok 95 ° C'de 1 mL % 36 PFA çözeltisi almak için tüpe 1 mL işaretine fosfat tamponlu tuz (PBS) ile doldurun. 1 mL % 36 PFA çözüm 15 mL kapasiteli bir tüp aktarın. 8 mL PBS 9 mL % 4 İngiltere'de yılın stok çözeltisi almak için 1 mL % 36 PFA, ekleyin. Aliquot % 4 İngiltere'de yılın hisse senedi çözüm ve mağaza-18 ° c kadar kullanmak için hücrelerin fiksasyon. 
	Dikkat: 1) potasyum hidroksit aşındırıcı bir çözümdür. Göz ve deri korunması unutmayın. 2) İngiltere'de yılın kanserojen. Ciltle temas ve inhalasyon kaçının. Bir başlık altında fiksasyon çözüm hazırlayın.</li>
	<li>Permeabilization çözüm: ekleyin 50 µL Octoxinol 9-50 mL PBS yaklaşık % 0.1 bir çözüm elde etmek için Octoxinol 9.</li>
	<li>Çözüm engelleme: hazırlamak % 5 ve 6'protein engelleme aracı PBS ve mağaza ile karıştırılarak çözümleri engelleme % 2 &#8211; 8 ° C.</li>
</ol> 2. Örnekleri hazırlanması <ol><li>fibroblast hücre kültüründe: insan fibroblast hücre satırının NHDF oksijen %5 yetiştirmek CO 2 atmosfer RPMI 1640 orta % 10 fetal buzağı serum, 4 mM ile desteklenmiş olarak 37 ° C'de glutamin ve % 1 penisilin/streptomisin.
	<ol><li>Bir mikroskop slayt hazırlanması ile yapışık fibroblastlar <ol><li>Orta NHDF fibroblastlar katlanarak büyüyen ile şişeye (75 cm 2 büyüme alanı) kaldırın. 10 mL PBS şişesi için ekleyin. Yapisan fibroblastlar hafifçe el ile 1 dk. şişeye sallayarak yıkama</li>
			<li>PBS kaldırın ve 1 mL tripsin balonun ekleyin. Yavaşça tüm yapışık hücreleri tripsin tarafından karşılanmaktadır sağlamak için balonun sallamak. Tripsin balonun kaldırın. 37 5 min için kuluçka şişeye koyun ° C.</li>
			<li>Kuluçka makinesi dışında şişesi alıp 10 mL RPMI 1640 orta balonun ekleyin. Yukarı ve aşağı fibroblastlar dağıtmak için birkaç kez orta pipette.</li>
			<li>Her iki alanın mikroskop slaydın üzerine dağınık fibroblastlar 0.3 mL pipet ve böylece fibroblastlar slayt için uygun kuluçka makinesi 24 h için slayt koymak. Adıma 3.1 için immunostaining γH2AX ve 53BP1 fibroblastlar çekirdekleri içinde geçin.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Hasta numuneleri <ol><li>kan örnekleri: 2 mL antikoagülan stok çözeltisi ile doluydu koleksiyonu tüpler kullanıp 7 mL kan tüpler içine ekleyebilirsiniz. Örnekleri gecede oda sıcaklığında (Yani, 18-20 ° C) depolar. Ertesi gün, mononükleer hücreler tarafından yoğunluk gradient Santrifüjü (Adım 2.2.3) dinlenme G0/G1 evresi yalıtmak.</li>
		<li>Kemik iliği örnekleri: 2 mL antikoagülan stok çözeltisi (Adım 1.1) ile doluydu koleksiyonu tüpler kullanıp 7 mL kemik iliği tüpler içine ekleyebilirsiniz. Örnekleri gecede oda sıcaklığında (Yani, 18-20 ° C) depolar. Ertesi gün, mononükleer hücreler tarafından yoğunluk gradient Santrifüjü (Adım 2.2.3) dinlenme G0/G1 evresi yalıtmak. CD34 lastikteki kullanma ve ayırma sütunlar için yalıtım CD34 + hücre hücre.</li>
		<li>Yalıtım mononükleer hücre yoğunluğu degrade Santrifüjü tarafından 
		Not: Mononükleer hücreler kemik iliği örnekleri ve kan yoğunluk gradient Santrifüjü 17 , 18 , 19 tarafından izole edilmiştir.
		<ol><li>Dilute PBS ile 1:1 oranında heparinized kan örneğinde ve oranı 1:3 PBS ile heparinized kemik iliği örneği. Hücreleri nazikçe onları iki kez girip pipet çizerek askıya alma.</li>
			<li>Yoğunluğu degrade orta hacmi için taze bir tüp ekleyin. Yavaşça seyreltilmiş kan veya kemik iliği üzerine yoğunluk gradient orta katman. İki kat karıştırmak için değil dikkat.</li>
			<li>Tüp, oda sıcaklığında 30 dakika santrifüj kapasitesi ve 400 x g. uzaklaştırmak üst plazma katmanın pipet ile. O zaman dikkatle üzerinde yoğunluk gradient orta katman mononükleer hücrelerde hasat. Mononükleer hücreler taze bir tüpün içine transfer.</li>
			<li>Tüp mononükleer hücrelerde en az üç PBS hacimleri ekleyin. Hücreleri nazikçe onları iki kez girip pipet çizerek askıya alma. Tüp için oda sıcaklığında ve 400 x g. 10 dk santrifüj kapasitesi</li>
			<li>Sonra spin süpernatant kaldırmak ve 4 ° C, 1 kırmızı hücreleri için lizis çözüm x 10 mL ekleyin. Hücreleri nazikçe onları iki kez girip pipet çizerek resuspend ve 5 min için buz tüpü yerleştirin. Daha sonra 4 ° C'de 30 mL PBS ekleyin ve 10 dakika oda sıcaklığında ve 400 x g. tüp santrifüj kapasitesi</li>
		</ol></li> <li>Cytospins hazırlanması <ol><li>(Yani, γH2AX ayirt boyama için bir cytospin ve γH2AX ve 53BP1 için bir cytospin hasta örnekleri mononükleer hücreler ile iki cytospins hazırlamak ayirt boyama kombine) tarafından Santrifüjü (300 x g, 10 dk) 1.0 x 10 5 hücreler için her hazırlık ( şekil 3 ve 4).</li>
		</ol></li></ol></li></ol> 3. γH2AX ve 53BP1 ayirt boyama <ol><li>fiksasyon ve permeabilization: %4 200 µL ile hücreleri tamir PFA 10 dk için. Fiksasyon sonra hücreleri nazikçe üç kez PBS 30 mL bir laboratuvar shaker üzerinde her 5 min için yıkayın. Hücreleri permeabilize %0,1 200 µL ile Octoxinol 9 10 dakika süreyle yıkayın hücreleri nazikçe bir laboratuvar shaker üzerinde her 5 min için 30 mL % 5 engelleme çözeltisi ile üç kez. 30 mL taze %5 1 h. için çözüm engelleme hücrelerde blok</li>
	<li>Kuluçka antikorlar ile <ol><li>kuluçkaya bir fare monoklonal anti-γH2AX antikor (1:500) içeren hücrelerin bir hazırlık ve hücreleri bir fare monoklonal anti-γH2AX antikor (1:500) ile diğer hazırlanması ve bir poliklonal tavşan anti-53BP1 antikor (1:500) bir gecede, 4 ° C.</li>
		<li>Kuluçka yıkadıktan sonra hücreleri nazikçe bir laboratuvar shaker üzerinde her 5 min için 30 mL % 2 engelleme çözeltisi ile 3 kez.</li>
		<li>Engelleme çözümü kaldırmak ve bir Alexa488 Birleşik keçi Anti-fare ikincil antikor (1:500) içeren hücrelerin ilk hazırlık ve bir Alexa488 Birleşik keçi Anti-fare ikincil antikor (hücrelerle ikinci hazırlanması kuluçkaya 1:500) ve bir eşek Alexa555 Birleşik Anti-tavşan ikincil antikor (1:500) oda sıcaklığında 1 h için.</li>
	</ol></li> <li>Montaj orta: hücreleri içeren bir kaseye ve hücreleri nazikçe bir laboratuvar shaker üzerinde her 5 min için PBS 30 mL ile üç kez yıkayın. PBS kaldırmak ve montaj orta 4,6-diamidino-2-phenylindole içeren hücrelerin bağlayabilirsiniz. Böylece hiçbir hava kabarcıkları dikkatli bir coverslip montaj orta üstüne koymak gömülü. Hücreleri floresan mikroskopi tarafından analiz önce montaj orta sertliği için en az 3 saat bekleyin.</li>
</ol> 4. ΓH2AX ve 53BP1 analizi Foci <ol><li>Floresans mikroskobu: hücre çekirdeği içinde γH2AX ve 53BP1 resimde DAPI, Alexa 488 ve Cy3 için düşsel vasıl 100 X amaç sırasında filtreleri ile donatılmış bir floresan mikroskop ile analiz büyütme. Bir kamera ile görüntüleri kaydetmek ve uygun görüntüleme yazılımlarıyla görüntüleri işlemek.</li>
</ol>

<ol><li>Hoeijmakers, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+maintenance+mechanisms+for+preventing+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome maintenance mechanisms for preventing cancer.</a> Nature. 411 (6835), 366-374 (2001).</li>
<li>Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instability+and+decay+of+the+primary+structure+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Instability and decay of the primary structure of DNA.</a> Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).</li>
<li>Zeman, M. K., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+consequences+of+replication+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Causes and consequences of replication stress.</a> Nat Cell Biol. 16 (1), 2-9 (2014).</li>
<li>IAEA. Biological effects of low doses of ionizing radiation: A fuller picture. , 
 <a target="_blank" href="https://www.iaea.org/sites/default/files/36405843745.pdf">https://www.iaea.org/sites/default/files/36405843745.pdf</a> (1994).</li>
<li>Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+DNA+double-strand+breaks%3A+production%2C+fidelity+of+repair%2C+and+induction+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12871-12876 (2003).</li>
<li>Simsek, D., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+end-joining+is+suppressed+by+the+canonical+NHEJ+component+Xrcc4-ligase+IV+during+chromosomal+translocation+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation.</a> Nat Struct Mol Biol. 17 (4), 410-416 (2010).</li>
<li>Weinstock, D. M., Brunet, E., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+NHEJ-derived+reciprocal+chromosomal+translocations+does+not+require+Ku70%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Formation of NHEJ-derived reciprocal chromosomal translocations does not require Ku70.</a> Nat Cell Biol. 9 (8), 978-981 (2007).</li>
<li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+phosphorylation+on+serine+139%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139.</a> J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li>
<li>Scully, R., Xie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+strand+break+repair+functions+of+histone+H2AX%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Double strand break repair functions of histone H2AX.</a> Mutat Res. 750 (1-2), 5-14 (2013).</li>
<li>Walters, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+ongoing+DNA+damage+in+multiple+myeloma+cells+as+revealed+by+constitutive+phosphorylation+of+H2AX%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Evidence for ongoing DNA damage in multiple myeloma cells as revealed by constitutive phosphorylation of H2AX.</a> Leukemia. 25 (8), 1344-1353 (2011).</li>
<li>Yu, T., MacPhail, S. H., Banath, J. P., Klokov, D., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+expression+of+phosphorylated+histone+H2AX+in+tumors+in+relation+to+DNA+double-strand+breaks+and+genomic+instability%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Endogenous expression of phosphorylated histone H2AX in tumors in relation to DNA double-strand breaks and genomic instability.</a> DNA Repair (Amst). 5 (8), 935-946 (2006).</li>
<li>Sedelnikova, O. A., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GammaH2AX+in+cancer+cells%3A+a+potential+biomarker+for+cancer+diagnostics%2C+prediction+and+recurrence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">GammaH2AX in cancer cells: a potential biomarker for cancer diagnostics, prediction and recurrence.</a> Cell Cycle. 5 (24), 2909-2913 (2006).</li>
<li>Chen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAK2V617F+promotes+replication+fork+stalling+with+disease-restricted+impairment+of+the+intra-S+checkpoint+response%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">JAK2V617F promotes replication fork stalling with disease-restricted impairment of the intra-S checkpoint response.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (42), 15190-15195 (2014).</li>
<li>Popp, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+of+DNA+damage+and+alteration+of+the+DNA+damage+response+in+myelodysplastic+syndromes+and+acute+myeloid+leukemias%5BTitle%5D)+AND+%22Leuk+Res%22%5BJournal%5D)">Increase of DNA damage and alteration of the DNA damage response in myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemias.</a> Leuk Res. 57, 112-118 (2017).</li>
<li>Panier, S., Boulton, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-strand+break+repair%3A+53BP1+comes+into+focus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (1), 7-18 (2014).</li>
<li>Escribano-Diaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+cycle-dependent+regulatory+circuit+composed+of+53BP1-RIF1+and+BRCA1-CtIP+controls+DNA+repair+pathway+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A cell cycle-dependent regulatory circuit composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP controls DNA repair pathway choice.</a> Mol Cell. 49 (5), 872-883 (2013).</li>
<li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+White+Blood+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Separation of White Blood Cells.</a> Nature. 204, 793-794 (1964).</li>
<li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mononuclear+cells+and+granulocytes+from+human+blood.+Isolation+of+monuclear+cells+by+one+centrifugation%2C+and+of+granulocytes+by+combining+centrifugation+and+sedimentation+at+1+g%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Clin+Lab+Invest+Suppl%22%5BJournal%5D)">Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g.</a> Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 77-89 (1968).</li>
<li>Bain, B., Pshyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+reactivity+in+mixed+leukocyte+cultures+after+separation+of+mononuclear+cells+on+Ficoll-Hypaque%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Enhanced reactivity in mixed leukocyte cultures after separation of mononuclear cells on Ficoll-Hypaque.</a> Transplant Proc. 4 (2), 163-164 (1972).</li>
<li>Popp, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+DNA+damage+after+reduced+and+conventional+absorbed+radiation+doses+using+3rd+generation+dual-source+CT+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Radiol+Open%22%5BJournal%5D)">Leukocyte DNA damage after reduced and conventional absorbed radiation doses using 3rd generation dual-source CT technology.</a> Eur J Radiol Open. 3, 134-137 (2016).</li>
<li>Rothkamm, K., Balroop, S., Shekhdar, J., Fernie, P., Goh, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+DNA+damage+after+multi-detector+row+CT%3A+a+quantitative+biomarker+of+low-level+radiation+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Leukocyte DNA damage after multi-detector row CT: a quantitative biomarker of low-level radiation exposure.</a> Radiology. 242 (1), 244-251 (2007).</li>
<li>Lobrich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+formation+and+repair+of+DNA+double-strand+breaks+after+computed+tomography+examinations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo formation and repair of DNA double-strand breaks after computed tomography examinations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (25), 8984-8989 (2005).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fixatives+for+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell fixatives for immunostaining.</a> Methods Mol Biol. 588, 55-61 (2010).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilization+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Permeabilization of cell membranes.</a> Methods Mol Biol. 588, 63-66 (2010).</li>
<li>Rothkamm, K., Lobrich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+lack+of+DNA+double-strand+break+repair+in+human+cells+exposed+to+very+low+x-ray+doses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Evidence for a lack of DNA double-strand break repair in human cells exposed to very low x-ray doses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5057-5062 (2003).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

ΓH2AX ve 53BP1 ayirt mikroskobu oluşumu ve DSB tamiri araştırma konuları geniş bir yelpazede yapılan analiz etmek için kullanışlı bir yöntemdir. Deneyler sonucu etkileyen kritik hücre döngüsünün fiksasyon ve permeabilization hücrelerinin antikor ve donanım seçimi ve floresan mikroskop bilgisayar yazılımı için kullanılan ajanlar aşamasında parametreleridir.
Hücre döngüsünün etkisi γH2AX foci örgülerine katlanarak büyüyen hücre kültürünü NHDF normal fibroblastlar tarafından sunuldu. ΓH2AX resimd...

DNA sürekli zarar görmüş endojen tarafından (örneğin, çoğaltma stres, Reaktif oksijen türleri, DNA'ın iç istikrarsızlık) ve eksojen (örneğin, kimyasal radikaller, ışınlama) (Resim 1)1,2 kaynakları ,3,4. DNA hasarı arasında DNA çift iplikli kırılmalara (DSB) özellikle ciddi lezyonlardir ve hücre ölümü veya karsinojenezis neden olabilir. Yaklaşık 50 DSB hücre ve hücre döngüsü5başına ortaya çıkabilir. Memeli hücrelerinde homolog rekombinasyon (İK) ve nonhomologous sonu-katılma (NHEJ) DSB (Şekil 2) tamiri için büyük yollar olarak geliştirilmiştir. Saat geç S/G2 aşamasında oluşur ve sağlam bir kız kardeşi kullanır Kromatit potansiyel olarak hatasız onarım için bir şablon olarak. Baz çifti eklendiğinde veya kırık uçları ligasyonu önce rezeke karşılık, hücre döngüsü boyunca aktif ve potansiyel olarak mutajenik NHEJ. Buna ek olarak, alternatif son katılma NHEJ eksikliği6,7durumunda yavaş mutajenik yedekleme onarım mekanizması olarak meşgul olabilir.
DSB fosforilasyon Histon H2AX serin 139 birkaç megabase çiftleri her DSB çevresinde bir bölgede, bir neden. Şekillendirme nükleer resimde γH2AX foci adlı ve ayirt mikroskobu8tarafından algılanabilir. ΓH2AX daha fazla DSB-duyarlı protein alımı teşvik ve Kromatin remodeling, DNA tamiri ve sinyal iletim9ilgilenmektedir. Her γH2AX odak tek bir DSB temsil etmek için kabul edilir gibi DSB miktar ayirt mikroskobu tarafından hangi kanser hücre satırları ve hasta örnekleri10,11, göstermiş olduğu, mümkün 12 , 13 , 14. 53BP1 (p53 bağlayıcı protein 1) DSB onarım arabuluculuk içinde başka bir anahtar protein olduğunu. DSB-duyarlı proteinler, denetim noktası sinyal ve DSB biter15synapsis istihdamı ilgilenmektedir. Buna ek olarak, 53BP1 DSB onarım yolu seçiminde kritik bir rol oynamaktadır. İK EngellediBRÜKSEL16iken NHEJ doğru DSB tamiri tetikler. ΓH2AX ve 53BP1 DSB tamir hakiki fonksiyonları göz önüne alındığında, γH2AX ve 53BP1 ayirt mikroskobu tarafından eş zamanlı analiz oluşumu ve DSB tamiri kesin çözümleme için yararlı bir yöntem olabilir.
Bu el yazması ayirt mikroskobu, γH2AX ve 53BP1 hücre çekirdeği içinde gerçekleştirmek için adım adım bir protokol sağlar. Özellikle, teknik hücre kültürünü NHDF, x-ışını ışınlanmış lenfositler sağlıklı bir bireyin ve CD34 + bir hastada akut myeloid lösemi hücrelerinin normal fibroblastlar uygulanır. Yöntem ayrıntıları sunulan sonuçları bağlamında dikkat çekti.

<table><tbody><tr><td>RPMI ortamı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0883</td><td>Hücre kültürü için</td></tr><tr><td>ortam Heparin sodyum</td><td>oranı</td><td>PZN 3029843</td><td>&nbsp; Heparin 5.000 IU / mL</td></tr><tr><td>Sodyum klorür çözeltisi% 0.9</td> <td>B. Braun</td><td>PZN 1957154</td><td>Antikoagülan stok çözeltisinin bileşeni</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Premium</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-02</td><td>Mononükleer hücrelerin izolasyonu için ortam</td></tr><tr><td>Tripsin çözeltisi 10X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59427C</td><td>Hücre kültüründe fibroblastların ayrışması için enzim</td></tr><tr><td>CD34 Mikro Boncuk Kiti</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-046-702</td><td>CD34+ miyeloid progenitör hücrelerin izolasyonu</td></tr><tr><td>Tanısal mikroskop slaytları</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER-203B-CE24</td><td>Mikroskop slaytları</td></tr><tr><td>Megafuge 1.0 R</td><td>Heraeus</td><td>75003060</td><td>&nbsp; Masa üstü santrifüj&nbsp;</td></tr><tr><td>Cytospin cihazı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kapağı</td><td>Heraeus</td><td>76003422</td><td>Mikro tüpler olmadan çalışmak için kapak</td></tr><tr><td>Cyto konteyner</td><td>Heraeus</td><td>75003416</td><td>2 konik delikli Cyto konteyner</td></tr><tr><td>Klips taşıyıcı</td><td>Heraeus</td><td>75003414</td><td>Bir cyto kabı ve bir sürgü tutmak için taşıyıcı</td></tr><tr><td>Destek eki</td><td>Heraeus</td><td>75003417</td> Destek <td>eki bir klips taşıyıcı tutan</td></tr><tr><td>Triton X-100 (Okoksinol 9)</td><td>Thermo Scientific</td><td>85112</td><td>Hücre zarlarının geçirgenliği için deterjan</td></tr><tr><td>Potasyum hidroksit çözeltisi 1M</td><td>Merck Millipore</td><td>109107</td><td>Paraformaldehit çözeltisini hazırlamak için gereklidir</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Fiksasyon ajanı</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>Dengeli tuz çözeltisi</td></tr><tr><td>Chemiblocker</td><td>Merck Millipore</td><td>2170</td><td>Bloke edici ajan</td></tr><tr><td>Fare monoklonal anti-&gama; H2AX antikoru (JBW301)</td><td>Merck Millipore</td><td>05-636</td><td>&gamma tespiti için birincil antikor; H2AX</td></tr><tr><td>Poliklonal tavşan anti-53BP1 antikoru (NB100-304)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-304</td><td>53BP1'in tespiti için birincil antikor</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-konjuge keçi anti-fare antikoru</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>İkincil antikor</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555-konjuge eşek anti-tavşan antikoru</td><td>Invitrogen</td><td>A-31572</td><td>İkincil antikor</td></tr><tr><td>Vectashield montaj ortamı</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>H-1200</td>, <td>DNA'nın boyanması için DAPI içerir</td></tr><tr><td>Axio Scope.A1</td>, <td>Zeiss</td><td>490035</td><td>Floresan mikroskobu,</td></tr><tr><td>Cool Cube, 1, CCD kamera</td>, <td>Metasystems</td><td>H-0310-010-MS</td>, <td>Dijital kayıt için kamera sistemi</td></tr>, <tr><td>Isis yazılımı, Metasystems</td><td></td><td>, Uygulanamaz</td><td>Mikroskop yazılımı</td></tr></tbody></table>

Γh2ax ve 53bp1 oluşumu ve dna çift iplikli kırılmalara tamiri analiz etmek için ayirt mikroskobu

Immunofluorescence Microscopy of &#947;H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

DNA çift iplikli kırılmalara (DSB) ciddi DNA lezyonlardir. Oluşumu ve DSB tamiri analizi araştırma alanlarına genom bütünlük, genotoxicity, radyasyon biyolojisi, yaşlanma, kanser ve ilaç geliştirme de dahil olmak üzere geniş bir yelpazede uygun olur. DSB yanıt olarak, Histon H2AX serin 139 ayrı nükleer foci tespit şekillendirme birkaç megabase çiftleri bir bölgede, ayirt mikroskobu tarafından fosforile. Buna ek olarak, 53BP1 (p53 bağlayıcı protein 1) başka bir önemli DSB-duyarlı protein DSB tamiri katılarak nonhomologous sonu-homolog rekombinasyon önlenmesi ise teşvik olduğunu. ΓH2AX ve 53BP1 belirli fonksiyonları göre γH2AX ve 53BP1 ayirt mikroskobu ile kombine analizi DSB ayrıntılı bir analiz için makul bir yaklaşım olabilir. Bu el yazması teknik gerçekleştirmek için metodik notları ile desteklenmiş bir adım adım iletişim kuralı sağlar. Özellikle, hücre döngüsünün etkisi γH2AX foci örgülerine hücre kültürünü NHDF normal fibroblastlar içinde gösterilmiştir. Ayrıca, γH2AX resimde değeri bir biyomarker olarak sağlıklı bir bireyin ışınlanmış x-ray lenfosit tasvir edilir. Son olarak, genetik istikrarsızlık tarafından γH2AX ve 53BP1 ayirt mikroskobu hücrelerdeki CD34 + olan bir hastanın akut myeloid lösemi soruşturma.

ΓH2AX foci hücrelerdeki G0/G1 evresi ve ne zaman γH2AX foci farklı floresan noktalar (5A rakam) görünür G2 faz en doğru analizidir. Buna ek olarak, γH2AX foci S aşamasında hücrelerdeki analizi (şekil 5B) çoğaltma işlemi tarafından neden dağınık pan-nükleer γH2AX speckles tarafından karmaşıktır.
Hücreleri fiksasyonu %4 ile gerçekleştirilen PFA (10 dakika) ve % 0.1 ile pe...

Bu el yazması bir iletişim kuralı tarafından γH2AX ve 53BP1 ayirt mikroskobu DNA çift iplikli kırılmalara analiz için sağlar.

ΓH2AX ve 53BP1 oluşumu ve DNA çift iplikli kırılmalara tamiri analiz etmek için ayirt mikroskobu

DNA double-strand breaks (DSB) are serious DNA lesions. Analysis of the formation and repair of DSB is relevant in a broad spectrum of research areas ...

Gama-H2AX ve 53BP1 immünofloresan mikroskobunun genel amacı, çeşitli dokularda DNA çift sarmallı kırılmaların oluşumunu ve onarımını analiz etmektir. Bu yöntem, tümör hücrelerinde genetik kararsızlığın nasıl ortaya çıktığı gibi kanser araştırmalarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tek DNA çift ip kopmalarının görselleştirilebilmesi ve onarım süreçlerinin analiz edilebilmesidir.Prosedürü göstermek, laboratuvarımızın bir teknisyeni olan Susanne Brendel olacaktır. Deneye, yüzde 0,9 sodyum klorür içinde mililitre başına 200 Uluslararası Birim heparin içeren pıhtılaşma önleyici stok çözeltisinden başlayarak çözeltiler hazırlayarak başlayın. Kan veya kemik iliği örneklerini çekmeden önce toplama tüplerinin her birini iki mililitre antikoagülan stok solüsyonu ile doldurun.Daha sonra, 82.91 gram amonyum klorür, 7.91 gram amonyum bikarbonat ve iki mililitre 0.5 molar etilendiamenetetracedik asit çözeltisi ile kırmızı hücreler için 10X Lysis solüsyonunu, ajanları toplam bir litre hacim için çift damıtılmış suda çözerek 8.0 pH'a hazırlayın. Daha sonra, bir mikrotitre tüpünde 360 miligram paraformaldehit veya PFA'ya 8.3 mikrolitre bir molar pot

immunofluorescence-microscopy-h2ax-53bp1-for-analyzing-formation

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bir moleküler marker olarak γH2AX oluşumu kullanarak DNA çift iplikli çizgiler Niceleme radyasyon biyoloji paha biçilmez bir araç haline gelmiştir. Burada hücreler radyasyona maruz kaldıktan sonra γH2AX odakları ölçümü için immünofloresan testinin kullanımını göstermek.

İyonlaştırıcı Radyasyon Cevabı γH2AX Foci Kantitasyonu

ΓH2AX odaklarının dayanarak DNA çift iplikli sonlarının kantitasyonu doku radiosensitivity ve radyasyon değiştirerek bileşikler etkileri değerlendirilmesi için, özellikle radyasyon biyoloji, paha biçilmez bir araç haline gelmiştir. Burada doku örnekleri γH2AX odaklarının kantitatif bir immünofloresan testinin kullanımını göstermek.

Doku Örnekleri γH2AX Foci kantitasyonu

DNA çift iplikli tatili yanıt Ser-139 H2AX fosforilasyon aşağıdaki formu γH2AX odakları, mikroskobik analiz radyasyon biyoloji paha biçilmez bir araç haline gelmiştir. Burada çekirdeğin içinde radyasyona bağlı γH2AX oluşumu uzamsal dağılımını değerlendirmek için, aktif transkripsiyonu ökromatin bir epigenetik işaretleyici olarak mono-metil histon H3 lizin 4 antikor kullanılır.

Radyasyondan aşağıdaki γH2AX Mekansal Dağılımı Değerlendirilmesi

Bu videoda, ışınlanmış hücre çekirdeğindeki çift sarmallı DNA kırılma bölgelerinde DNA onarım proteinleri γH2AX ve 53BP1'in lokalizasyonunu görselleştirmek için immünofloresan yöntemini açıklıyoruz.

DNA Onarım Protein Etkileşimlerinin İmmünofloresan Tabanlı Görselleştirilmesi

Bu videoda, insan mononükleer hücrelerinde DNA çift sarmallı kırılma bölgelerinde lokalize olan spesifik DNA hasar yanıt proteinlerini tespit etmek için immünofloresan mikroskopi tekniğini açıklıyoruz. Proteinler, spesifik birincil antikorlar tarafından tanınır ve bu antikorlar, mikroskobik görselleştirme sırasında floresan olan florofor etiketli ikincil antikorlara bağlanır ve proteinlerin hücre çekirdeği içinde farklı floresan odaklar olarak görselleştirilmesini sağlar.

DNA Çift İplikli Kırılmaların Analizi için İmmünofloresan Mikroskobu

DNA hasar onarım Kinetik eğitim lezyonlar tanımlanmış alt nükleer bölgeler itibariyle ikna etmek için bir sistem gerektirir. Biz bir yöntem bir 405 nm lazer ile donatılmış lazer tarama confocal mikroskop kullanarak yerelleştirilmiş çift iplikçikli kesmeleri oluşturmak ve tamir faktörler bu lezyonlar, dinamikleri ölçmek için otomatik yordamlar sağlar açıklar.

Soruşturma 405 Nm lazer mikro-ile kullanarak DNA lezyonlar için Protein alımı

Çift iplikli kırılmalara DNA tamiri lezyon ele sonra sadece onarım kompleksleri, tatili, aynı zamanda onların çözünürlük oluşumu gerektiren dinamik bir süreçtir. Burada, ayirt mikroskobu geçici ve uzun ömürlü çift iplikçikli tatili için bir araç olarak bu genom bakım mekanizma incelemek için kullanırız.

DNA onarım işlemleri, Darbe Gerilimlerinden ve uzun süreli iki iplikçikli DNA sonları ayirt mikroskobu ile karakterize

Bor nötron yakalama terapisinde (BNCT) kullanılan nötron karışık ışınıile aktive edilen radyasyona bağlı DNA hasar tepkisi tam olarak belirlenmemiştir. Bu protokol, nötron-karışık ışın ile ışınlama sonra insan kolon kanseri hücre hatlarında immünofloresan boyama tarafından onarım proteinlerinin radyasyonkaynaklı foci (RIF) tespit etmek için adım adım bir prosedür sağlar.

İnsan Kolon Kanseri Hücrelerinde DNA Hasarı ve Onarım Foci İmmünofloresan Görüntüleme

DNA hasarının ardından, insan hücreleri genomlarının bütünlüğünü geri yüklemek için gerekli onarım yollarını aktive ederler. Burada, dolaylı immünoffloresan yöntemini DNA onarım proteinlerini tespit etmek, mekansal ve zamansal işe alımlarını analiz etmek ve DNA hasarı nın olduğu yerlerde protein-protein etkileşimini sorgulamaya yardımcı olmak için bir araç olarak tanımlıyoruz.

DNA Onarım Proteinlerinin İmmünfluoresan Etkileşiminin Görselleştirilmesi

Bu protokol, bleomisin ile tedavi edilen insan periferik lenfositlerinin interfaz çekirdeklerinde γH2AX ve 53BP1 odaklarının eşzamanlı tespiti yoluyla DNA çift iplikçik kırılmalarının oluşumunu ve onarımını değerlendirmek için bir yöntem sunmaktadır.

İnsan Periferik Lenfositlerinde γH2AX ve 53BP1'in İkili İmmünofloresansı

Burada, DNA hasar bölgelerinde protein etkileşiminin tespiti için basit ve hızlı bir protokol sunuyoruz.

DNA Hasar Bölgelerindeki Proteinleri Lokalize Etmek için Yakınlık Ligand Testi

Öğrenin, γH2AX ve 53BP1 immünofloresan mikroskobisi ile DNA çift iplikli kırıklarının oluşumunu ve onarımını analiz etmeyi. Bu yöntem, tümör hücrelerinde genetik instabiliteyi anlamak için kritik öneme sahiptir.

ΓH2AX ve 53BP1 oluşumu ve DNA çift iplikli kırılmalara tamiri analiz etmek için ayirt mikroskobu

Daha fazla video keşfet