Name: Vivo EPR pH, pO2, Redox durumu ve fosfat konsantrasyonları ve glutatyon tümör Microenvironment olarak değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Öğrenin, meme kanseri fare modellerinde tümör mikroçevresindeki oksijenasyon ve metabolik parametreleri nicel ve noninvaziv olarak değerlendirmek için düşük alan elektron paramanyetik rezonans teknolojisini.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser kısmen NIH tarafından desteklenen CA194013, CA192064 ve U54GM104942 verir. WVCTSI start-up VVK, AB, ve TDE için kabul edilmektedir. Yazarlar Dr. M. Gencheva ve K. Steinberger açıklayıcı deneyleri ile yardım için teşekkür ederiz. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka NIH resmi görüşlerini temsil etmiyor.

Tüm hayvan iş onaylı WVU IACUC Protokolü uygun olarak gerçekleştirildi.
1. araştırma sentezi ve Kalibrasyon
<ol><li>Partikül pO2-hassas LiNc BuO sonda Not: LiNc BuO microcrystals sentezlenen ve başvuru13' te açıklandığı gibi hazır. Onlar çok kararlı ve oda sıcaklığında yıllardır tutulabilir. LiNc BuO partikül sonda EPR linewidth pO2' dir-duyarlı parametre. PO2 kısmi basıncı13yokluğunda içsel linewidth değerleri ile 760 mmHg kadar anoksik koşullarından linewidth oksijen konsantrasyonu aralığı üzerinde ideal lineer bağımlılık LiNc BuO microcrystals göstermek oksijen ve biraz (mG/mmHg ölçülür) oksijen bağımlılık eğimi microcrystal hazırlık farklı toplu işlemleri için farklı. Bu nedenle, kalibrasyon belirli her toplu işlem için gereklidir.<ol>
<li>LiNc BuO microcrystals 60 mg tartın.</li>
		<li>Oksijen duyarlılık kalibrasyonunun microcrystals Dulbecco'nın modifiye kartal medya (DMEM) ortamda (20 mg/mL konsantrasyonu) 3 ml askıya alma ve buz bir sonda sonicator 5 mL cam yuvarlak alt tüp içinde 7 W güç kullanarak 20 kHz ile 5 min için solüsyon içeren temizleyicide.</li>
		<li>Bir cam sonicated microcrystals yer 1 mL L-bandı (1.2 GHz) EPR Spektrometre yüzey bobin rezonatör tüp ve sürekli dalgalar (CW) EPR spectra, 0, 1, 2, 4, 8 37 ° C ve oksijen konsantrasyonları fizyolojik sıcaklığında elde ve ,9. Bir gaz denetleyicisinden teslim gaz karışımı ile çözüm köpüren tarafından oksijen konsantrasyonu sağlamak ve korumak bir termostat için bağlı bir su banyosu kullanarak sıcaklık. Aşağıdaki EPR Spektrometre edinme parametreleri kullanın: Genlik modülasyonu, 100 mG; modülasyon frekansı, 100 kHz; süpürme genişliği, 5 G; süpürme zaman, 60 s.</li>
		<li>Daha iyi bir sinyal / gürültü oranı (SNR) elde etmek için modülasyon genlik değeri linewidth % 60'ı kullanın (örneğin, bir modülasyon genlik 0.6 G kullanmak için 1 G linewidth).</li>
		<li>Alternatif kalibrasyon prosedürü Basitleştirilmiş: Hava bubbled ve anoksik çözümleri14' te EPR spectra kaydetmek. İkinci durumda, kanda oksijen azlığı örneklerde 10 mM glikoz ve 100 U/mL glikoz oksidaz 1 mL sonda çözümlere göre başvuru14eklenmesi ile sürdürmek.</li>
		<li>EPR spectra çizgi genişliği LW bulmak için Lorentzian işlevi ile uygun. Microcrystals pO2 duyarlılık bağımlılığı LW pO2, yani (LWhava−LWkanda oksijen azlığı) değeri olarak eğimli olarak değerlendirmek /pO2air, nerede LWhava ve LWkanda oksijen azlığı spectra linewidth hava ve kanda oksijen azlığı koşullarda sırasıyla; p O2air 152 mmHg =.</li>
	</ol></li>
	<li>Çift fonksiyon pH ve Redoks sonda, NR Not: NR sonda başvuru11' de açıklandığı gibi sentezlenir. Bir katı olarak ve sulu çözümler içinde oda sıcaklığında stabil. Sentezlenmiş NR sonda 4 ° C'de tutulur Azot hyperfine bölme,Nve sinyal genlik çürüme hızı NR sonda pH için hassas spektral parametreler şunlardır (pKbir sonda 6,6 37 ° c, 5.6 pH hassasiyeti 7,6 için aralığı =) ve azalan bakiyeli kapasitesi ile prob microenvironment, anılan sıraya göre.<ol>
<li>NR dondurucudan kaldırmak ve oda sıcaklığında (10-15 dk) ısıtmak kapsayıcı sağlar. NR 6.34 mg tartmak, 1 mL serum fizyolojik çözüm geçiyoruz ve pH 7.2 ile HCl veya NaOH pH metre kullanarak küçük aliquots için ayarlayın. Hazırlanan NR çözüm (10 mM) hisse senedi bir çözüm olarak kullanın.</li>
		<li>NR sonda pH kalibrasyon aşağıdaki gibi (başvuru11bakınız) yapın. İlk olarak, 2 mM Na-fosfat tampon, 150 mM NaCl 0.9 mL 0.1 mL NR stok çözeltisi ekleyin. Elde edilen 1 mM NR çözüm aliquots için pH metre kullanarak gerekli pH HCl ve NaOH ile titre. Bir termostat için bağlı bir su banyosu kullanarak sıcaklık kontrol.</li>
		<li>EPR spectra örneklerin L-bandı EPR Spektrometre kullanılarak 1.5 mL microcentrifuge tüplerde kaydedin. Aşağıdaki EPR Spektrometre edinme parametreleri kullanın: Genlik modülasyonu, 2.5 G; modülasyon frekansı, 100 kHz; süpürme genişliği, 60 G; süpürme zaman, 20 s.</li>
		<li>(N) sabit bölme hyperfine EPR spectra ürününün düşük ve yüksek alanı bileşenleri arasındaki mesafenin yarısı olarak ölçmek ve pH kalibrasyon eğrisi pH L-bandı EPR ölçülerini sağlamak için karşı arsa.</li>
	</ol></li>
	<li>GSH-duyarlı RSSR sonda Not: RSSR sonda başvuru15' te açıklandığı gibi sentezlenir. Sentezlenmiş NR sonda 4 ° C'de depolayın Lipofilik RSSR disülfür biradical bileşik ile hücre içi GSH tepki ve GSH vivo içinde EPR16,17kullanarak belirlemek için güvenilir bir yaklaşım sağlamak için hücre zarı arasında kolayca dağılır. Bu yöntem ile RSSR probe GSH thiols baskın hücre içi havuzu yüksek tepki oranları üzerinde temel alır. RSSR biradical onun disülfür bağ ( düzeni 1bakınız) GSH bölmeleri ile reaksiyon iki radikal parçaları ve biradical spektral bileşenlerin bir düşüş tezahür ve karşılık gelen arasındaki spin Satım iptali sonuçlanan monoradical bileşenleri artırılır. Biradical RSSR sonda için monoradical bileşen genliği artış oranını GSH konsantrasyon ile doğru orantılıdır ve uygun bir GSH-duyarlı EPR spektral parametresi. GSH konsantrasyon vivo içinde EPR ölçümleri üzerinden değerlendirmek için karşılık gelen sıcaklık ve pH GSH ile RSSR reaksiyon oranı önceki kalibrasyonu aşağıdaki gibi yapılması gerekiyor.<ol>
<li>RSSR dondurucudan kaldırmak ve oda sıcaklığında (10-15 dk) ısıtmak kapsayıcı sağlar. NR 4,05 mg tartmak ve 1 mL DMSO çözeltisi içinde çözülür. Hazır RSSR çözüm (10 mM) hisse senedi bir çözüm olarak kullanın.</li>
		<li>Oranı sabit, kobs, RSSR arzu edilen sıcaklık ve pH GSH ile tepki değerini aşağıdaki gibi belirler.</li>
		<li>İlk olarak, RSSR hisse senedi çözüm (10 mM) 20 µL 0,98 mL 1 mM Na-fosfat tampon ekleyin, pH 7.2, 150 mM NaCl 0.2 mM RSSR elde etmek için yoklama çözüm.</li>
		<li>1, 2 ve 5 mM GSH konsantrasyonları 0.1 M Na-fosfat tampon pH 7.2 çözümleri hazırlayın. Doğru hedef organ dan in vivo ölçümleri GSH konsantrasyonu hücrelerdeki değerlendirmek için vitro kalibrasyon hücre içi pH değerini yakın bir pH yapılması gerekiyor.</li>
		<li>0.2 mM RSSR çözüm ve 1.3.4 adımda hazırlanan GSH çözümlerden birini eşit miktarda karıştırın. bir son konsantrasyon sonda 0.1 mm ve GSH için 0.5, 1 ya da 2.5 mM.</li>
		<li>Karıştırma hemen RSSR ve GSH çözüm sonra örnek EPR rezonatör yerleştirin ve EPR spectra 12 saniyede 10 dakika kayıt. Sonra monoradical spektral genlik artış Kinetik hesaplamak. Aşağıdaki EPR Spektrometre edinme parametreleri kullanın: Genlik modülasyonu, 1 G; modülasyon frekansı, 100 kHz; süpürme genişliği, 60 G; süpürme zaman, 10-60 s.</li>
		<li>Ölçülen EPR Kinetik monoexponents için uygun ve Üstel Kinetik, τ zaman sabiti hesaplayın. Doğrusal regresyon (1/τ = kobs × [GSH]) tepki GSH ve RSSR arasında gözlenen oranı sabit değer sağlar (örneğin, 34 ° C ve pH 7.2, kobs 2.8 ± 0.2 M-1s-1=)11.</li>
	</ol></li>
	<li>Çok fonksiyonlu umut sonda pO2, pH ve Pi değerlendirme Not: UMUT sonda açıklandığı gibi sentezlenir monophosphonated trityl12 başvuru ve 4 ° C'de tutulur UMUT CW EPR spectra pH &lt;&lt; pKa (A - asit form) ve pH &gt;&gt; pKa (B - temel form), bölme, birPfosfor hyperfine nedeniyle birini tarafından temsil edilir. Tipik araç ayarlar şunlardır: Genlik modülasyonu, 37.5 mG; modülasyon frekansı, 100 kHz; süpürme genişliği, 0.9 G; süpürme zamanı, 20-60 s. Ara pH (5 &lt; pH &lt; 8) umut sonda EPR spektrum bir dörtlü tarafından karakterize zaman her iki A ve B Birleşik mevcut. Bireysel EPR linewidth umut bir pO2 belirtecidir (doğruluk, ≈ 1 mmHg; p O2 Aralık, 1-100 mmHg). Protonated umut (form) kısmını 8.0 (doğruluk, ± 0,05) ile 6 Aralık içinde bir pH belirtecidir. Proton (mG ifade edilir) kuru spectra simülasyon tarafından çıkarılan Pi ile bir Pi işaretleyici (doğruluk, ± 0,1 mM, aralığı, 0.1-20 mM) değeridir. Kalibrasyon işlemleri fizyolojik sıcaklık (37 ° C), çözüm iyonik gücü (NaCl, 150 mM) ve umut sonda konsantrasyonu 0.2 mM, daha önce açıklanan başvurular12,18' ve aşağıda ayrıntılı olarak gerçekleştirilir.<ol>
<li>UMUT sonda dondurucudan kaldırmak ve oda sıcaklığında (10-15 dk) ısıtmak kapsayıcı sağlar.</li>
		<li>UMUT sonda 10.7 mg tartmak, 1 mL serum fizyolojik çözüm geçiyoruz ve pH 7.4 için ayarlayın. Ekle 20 µL 0.2 mM umut elde etmek için umut (10 mM) 0,98 mL serum fizyolojik çözeltisi için hazırlanan hisse senedi çözümün çözüm sonda.</li>
		<li>PH probu kalibrasyonu için umut sonda çözüm 0.2 mM küçük hacmi NaOH veya HCl, Örnek % 1'den daha az son seyreltme ile eklenmesiyle titre. Ulusal büro standartları (ABD tarafından) önerilen başvuru çözüm pH değerleri kullanarak 37 ° C'de kalibre bir pH elektrodu ile pH ölçmek. Sirkülatörün için bağlı bir ceketli tepki ölçek dikkatle ısısını başvuru ve titre çözümler pH ölçümleri sırasında korumak için kullanın. 10 mM glukoz eklenmesiyle anoksik koşulların ve 100 U/mL glikoz oksidaz sonda çözümleri için korumak.</li>
		<li>EPR spectra pH ≤ 5 ve pH ≥ 8, A ve B formlarının sırasıyla, anoksik şartlarda fosfat, yokluğunda elde etmek.</li>
		<li>Karşılık gelen spectra içsel spektral parametrelerini elde etmek için kullanın. Yani, tayf çizgi umut sonda çözümlenmemiş süper hyperfine yapısını yaklasik Gauss fonksiyonu ile Lorentzian işlevinin evrişim olarak benzetimini yapmak. Hesaplanan EPR spectra deneysel spectra için uygun birP ve Lorentzian linewidth (ΔLs), enine gevşeme hızı, 1/T2 belirlenen değerleri verir (burada 1/T2 = (√3/2) Ls için CW EPR RF emme satırında ölçülen türevi) ve Gauss dağılımı, G. linewidth Not: 1.4.2. adımda belirtilen koşulları ölçü vasıl spectra elde edilen parametreler şunlardır:P(A) 3.63 G, birP= (B) = 3.37 G; 1/T2(A) = 23,6 mG; 1/T2(B) = 9 mG; G(A) = 40 mG; G(B) = 45 mG (başvuru8bakınız).</li>
		<li>EPR spectra umut elde ara pH (5 &lt; pH &lt; 8). Başvuru19 yukarıda açıklanan18olarak uyarlanmış sigara birleştiğinde veya gevşek biçimde eşleşmiş sistemlerindeki bazı siteler arasında değişim teorisi kullanarak alınan EPR spectra ürününün yüksek under bileşen simülasyonu. Kullanım iç parametrelerin elde için A ve B Birleşik (bkz. Adım 1.4.5) değişkenlerin sayısını azaltmak için. Hesaplanan spectra kesir bir (pA) değerleri bulmak için deneysel olanlar için uygun ve pA değer bağımlılığını pH arsa. PA bağımlılık daha fazla çalışmalar pH pH kalibrasyon eğrisi kullanın. Not: PA bir standart titrasyon eğrisi ile pH bağımlılığı uygun sağlar ayrılma sürekli, pKbir (umut) değeri 6,98=. İn vivo çalışmalarda umut inceleyebilirsek tam EPR spectra edinme EPR spektrumunda bölme fosfor hyperfine düşük ve yüksek alan bileşenleri arasındaki boşluğu elde etmek için gerekli ek süre nedeniyle zordur. Bu nedenle, daha fazla örneği çalışmalarda EPR spektrumunun yalnızca yüksek under bileşeni ölçülen analiz ve.</li>
		<li>PO2sonda kalibrasyon EPR spectra umut inceleyebilirsek, çeşitli oksijen konsantrasyonları elde etmek.</li>
		<li>Gaz karışımı ile köpüren tarafından Çözümleri Denetim pO2 değerlerini bir gaz denetleyicisinden teslim. Denetim bir termostat için bağlı bir su banyosu kullanarak çözüm sıcaklık (37 ° C).</li>
		<li>EPR spectra taklit ve bunları oksijen kaynaklı gevşeme oranları değerlerini belirlemek için 1.4.6. adımda açıklandığı gibi deneysel olanlar için uygun. Not: Oksijen kaynaklı gevşeme oranları değerlerini 0,49 mG/mmHg her iki a vardı ve 37 ° C8' de ölçülen B formları umut sonda.</li>
		<li>[Pi] sonda kalibrasyon EPR spectra umut inceleyebilirsek çeşitli fosfat konsantrasyonlarda elde etmek. PKbir yakınındaki bir pH değeri ile umut radikal çözüm kullanın (pKbir 6,9 37 ° C'de =)18 ve çeşitli fosfat konsantrasyonları ile titre. Sıcaklık ve gaz kompozisyon adımları açıklandığı gibi korumak.</li>
		<li>EPR spectra benzetimini yapmak ve onları döviz kuru Pi kaynaklı değerlerini belirlemek için adım 1.4.6 açıklandığı gibi deneysel olanlar için uygun. Not: Pi kaynaklı Döviz Kuru bağımlılığını [Pi] ayarı'nda daha fazla çalışmalar olarak kullanılır.</li>
	</ol></li>
</ol>2. fare modelleri meme kanseri
<ol><li>MMTV-PyMT spontan tümör modeli<ol>
<li>4-8 hafta kullanın- vivo içinde EPR Etütler kendiliğinden oluşan meme tümörleri ile yaşlı kadın arkadaş virüs B-tipi duyarlılık/NIH (FVB/H) fare meme tümör virüs organizatörü (MMTV) polyoma orta-T antijen (PyMT +) fareler.</li>
		<li>Normal meme dokuları ve tümör doku microenvironments karşılaştırma için yaş eşlemeli littermate kadın PyMT onkogen (PyMT−, "vahşi tür")20dakikaya eksik kullanın.</li>
		<li>L-bandı EPR spektroskopisi isoflurane anestezi sırasında dört hafta boyunca haftada bir kez fareler tabi (bkz: sonda teslimi aşağıda).</li>
		<li>Fareyi kullanarak bir hava-isoflurane karışımı (% 3 isoflurane) anestezi ve yüzey bobin rezonatör yakın tümör (meme dokuları) ile doğru lateral pozisyonda ayarlanabilir bir tablo üzerinde fareyi getirin.</li>
		<li>Sonra fare yerleştirme, sonda intratissual (BT) enjeksiyonu ile yönetmek, EPR Spektrometre ayarlamak ve 5-10dk EPR spectra elde etmek.</li>
		<li>2-3 meme tümörleri ölçmek (--dan MMTV-PyMT + fare) veya sigara-tümörün taşıyan meme dokuları (dan PyMT− fareler) aynı EPR oturumu sırasında.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Orthotopic MET-1 tümör modeli<ol>
<li>FVB/N arka plan Met-1 fare meme kanseri hücrelerinin 37 ° C, % 5 CO2</li><li></li><li><li></li><li><li><li> <img alt="Figure " src="/files/ftp_upload/56624/56624eq1v2.jpg"></li></ol></li></ol><ol><li><ol><li><li><li><li><li></li><li><li></ol></li><li></li><li><ol><li><li></ol></li></ol><ol><li><li><ol><li><li><li></li><li><li></li></ol></li></ol><ol><li></ol>

<ol><li>Siemann, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSiemann%2C+DW+%22Tumor+Microenvironment%22">Tumor Microenvironment</a>. , John Wiley & Sons Ltd.,. Chichester, UK; Hoboken, NJ, USA. (2011).</li>
<li>Tatum, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia%3A+importance+in+tumor+biology%2C+noninvasive+measurement+by+imaging%2C+and+value+of+its+measurement+in+the+management+of+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">Hypoxia: importance in tumor biology, noninvasive measurement by imaging, and value of its measurement in the management of cancer therapy.</a> Int J Radiat Biol. 82 (10), 699-757 (2006).</li>
<li>Brahimi-Horn, M. C., Chiche, J., Pouyssegur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+signalling+controls+metabolic+demand%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Hypoxia signalling controls metabolic demand.</a> Curr Opin Cell Biol. 19 (2), 223-229 (2007).</li>
<li>Haulica, A., Ababei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+glycolytic+activity+in+the+erythrocytes+of+animals+with+chronic+experimental+hypoxia+and+with+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasma%22%5BJournal%5D)">Comparative study of glycolytic activity in the erythrocytes of animals with chronic experimental hypoxia and with tumours.</a> Neoplasma. 21 (1), 29-35 (1974).</li>
<li>Matsumoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+mapping+of+tumor+redox+status+by+magnetic+resonance+imaging+using+nitroxides+as+redox-sensitive+contrast+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">High-resolution mapping of tumor redox status by magnetic resonance imaging using nitroxides as redox-sensitive contrast agents.</a> Clin Cancer Res. 12 (8), 2455-2462 (2006).</li>
<li>Estrela, J. M., Ortega, A., Obrador, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+in+cancer+biology+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Clin+Lab+Sci%22%5BJournal%5D)">Glutathione in cancer biology and therapy.</a> Crit Rev Clin Lab Sci. 43 (2), 143-181 (2006).</li>
<li>Voegtlin, C., Thompson, J. W. <a target="_blank" href="http://www.jbc.org/content/70/3/801.full.pdf">Glutathione content of tumor animals.</a> J. Biol. Chem. 70, 801-806 (1926).</li>
<li>Bobko, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstitial+Inorganic+Phosphate+as+a+Tumor+Microenvironment+Marker+for+Tumor+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Interstitial Inorganic Phosphate as a Tumor Microenvironment Marker for Tumor Progression.</a> Sci Rep. 7, 41233(2017).</li>
<li>Gillies, R. J., Raghunand, N., Garcia-Martin, M. L., Gatenby, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH+imaging.+A+review+of+pH+measurement+methods+and+applications+in+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Eng+Med+Biol+Mag%22%5BJournal%5D)">pH imaging. A review of pH measurement methods and applications in cancers.</a> IEEE Eng Med Biol Mag. 23 (5), 57-64 (2004).</li>
<li>Gade, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intratumoral+convection%3A+pressure-dependent+enhancement+in+chemotherapeutic+delivery+to+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Imaging intratumoral convection: pressure-dependent enhancement in chemotherapeutic delivery to solid tumors.</a> Clin Cancer Res. 15 (1), 247-255 (2009).</li>
<li>Bobko, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+monitoring+of+pH%2C+redox+status%2C+and+glutathione+using+L-band+EPR+for+assessment+of+therapeutic+effectiveness+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Magn+Reson+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors.</a> Magn Reson Med. 67, 1827-1836 (2012).</li>
<li>Dhimitruka, I., Bobko, A. A., Eubank, T. D., Komarov, D. A., Khramtsov, V. V. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja401572r">Phosphonated Trityl Probe for Concurrent In Vivo Tissue Oxygen and pH Monitoring Using EPR-based Techniques.</a> JACS. 135, 5904-5910 (2013).</li>
<li>Pandian, R. P., Parinandi, N. L., Ilangovan, G., Zweier, J. L., Kuppusamy, P. Novel particulate spin probe for targeted determination of oxygen in cells and tissues. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPandian%2C+RP+%22Free+Radic+Biol+Med%22">Free Radic Biol Med</a>. 35 (9), 1138-1148 (2003).</li>
<li>Bobko, A. A., Evans, J., Denko, N. C., Khramtsov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+Longitudinal+EPR+Monitoring+of+Tissue+Oxygenation%2C+Acidosis%2C+and+Reducing+Capacity+in+Mouse+Xenograft+Tumor+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Concurrent Longitudinal EPR Monitoring of Tissue Oxygenation, Acidosis, and Reducing Capacity in Mouse Xenograft Tumor Models.</a> Cell Biochem Biophys. 75, 247-253 (2017).</li>
<li>Khramtsov, V. V., Yelinova, V. I., Glazachev Yu, I., Reznikov, V. A., Zimmer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+determination+and+reversible+modification+of+thiols+using+imidazolidine+biradical+disulfide+label%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem+Biophys+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative determination and reversible modification of thiols using imidazolidine biradical disulfide label.</a> J Biochem Biophys Methods. 35 (2), 115-128 (1997).</li>
<li>Roshchupkina, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+EPR+measurement+of+glutathione+in+tumor-bearing+mice+using+improved+disulfide+biradical+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Rad.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo EPR measurement of glutathione in tumor-bearing mice using improved disulfide biradical probe.</a> Free Rad. Biol. Med. 45, 312-320 (2008).</li>
<li>Hicks, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKhramtsov%2C+VV+%22Stable+Radicals%3A+Fundamentals+and+Applied+Aspects+of+Odd-Electron+Compounds%22">Stable Radicals: Fundamentals and Applied Aspects of Odd-Electron Compounds</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. 537-566 (2010).</li>
<li>Bobko, A. A., Dhimitruka, I., Zweier, J. L., Khramtsov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fourier+Transform+EPR+of+Trityl+Radicals+for+Multifunctional+Assessment+of+Chemical+Microenvironment%29%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Edit%22%5BJournal%5D)">Fourier Transform EPR of Trityl Radicals for Multifunctional Assessment of Chemical Microenvironment).</a> Angew. Chem. Int. Edit. 53, 2735-2738 (2014).</li>
<li>Martin, M. L., Martin, G. J., Delpuech, J. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMartin%2C+ML+%22Practical+NMR+spectroscopy%22">Practical NMR spectroscopy</a>. , Heyden. (1980).</li>
<li>Lin, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+to+malignancy+in+the+polyoma+middle+T+oncoprotein+mouse+breast+cancer+model+provides+a+reliable+model+for+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Progression to malignancy in the polyoma middle T oncoprotein mouse breast cancer model provides a reliable model for human diseases.</a> Am J Pathol. 163 (5), 2113-2126 (2003).</li>
<li>Eubank, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte+macrophage+colony-stimulating+factor+inhibits+breast+cancer+growth+and+metastasis+by+invoking+an+anti-angiogenic+program+in+tumor-educated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Granulocyte macrophage colony-stimulating factor inhibits breast cancer growth and metastasis by invoking an anti-angiogenic program in tumor-educated macrophages.</a> Cancer Res. 69 (5), 2133-2140 (2009).</li>
<li>Khramtsov, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+determination+of+SH+groups+in+low-+and+high-molecular-weight+compounds+by+an+electron+spin+resonance+method%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Quantitative determination of SH groups in low- and high-molecular-weight compounds by an electron spin resonance method.</a> Anal Biochem. 182 (1), 58-63 (1989).</li>
<li>Komarov, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+paramagnetic+resonance+monitoring+of+ischemia-induced+myocardial+oxygen+depletion+and+acidosis+in+isolated+rat+hearts+using+soluble+paramagnetic+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Magnetic+Resonance+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Electron paramagnetic resonance monitoring of ischemia-induced myocardial oxygen depletion and acidosis in isolated rat hearts using soluble paramagnetic probes.</a> Magnetic Resonance in Medicine. 68 (2), 649-655 (2012).</li>
<li>Song, Y. G., Liu, Y. P., Liu, W. B., Villamena, F. A., Zweier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+binding+of+the+Finland+trityl+radical+with+bovine+serum+albumin%5BTitle%5D)+AND+%22Rsc+Advances%22%5BJournal%5D)">Characterization of the binding of the Finland trityl radical with bovine serum albumin.</a> Rsc Advances. 4 (88), 47649-47656 (2014).</li>
<li>Khramtsov, V. V., Bobko, A. A., Tseytlin, M., Driesschaert, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exchange+Phenomena+in+the+Electron+Paramagnetic+Resonance+Spectra+of+the+Nitroxyl+and+Trityl+Radicals%3A+Multifunctional+Spectroscopy+and+Imaging+of+Local+Chemical+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Analyt.+Chem%22%5BJournal%5D)">Exchange Phenomena in the Electron Paramagnetic Resonance Spectra of the Nitroxyl and Trityl Radicals: Multifunctional Spectroscopy and Imaging of Local Chemical Microenvironment.</a> Analyt. Chem. 89 (9), 4758-4771 (2017).</li>
<li>Samouilov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Proton-Electron+Double-Resonance+Imaging+of+Extracellular+Tumor+pH+Using+an+Advanced+Nitroxide+Probe%5BTitle%5D)+AND+%22Analyt.+Chem%22%5BJournal%5D)">In Vivo Proton-Electron Double-Resonance Imaging of Extracellular Tumor pH Using an Advanced Nitroxide Probe.</a> Analyt. Chem. 86 (2), 1045-1052 (2014).</li>
<li>Goodwin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tumour+extracellular+pH+monitoring+using+electron+paramagnetic+resonance%3A+the+effect+of+X-ray+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+Biomed%22%5BJournal%5D)">In vivo tumour extracellular pH monitoring using electron paramagnetic resonance: the effect of X-ray irradiation.</a> NMR Biomed. 27 (4), 453-458 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Sunulan yöntemler yani pO2, pH, redoks durumu ve interstisyel Pi ve hücre içi GSH konsantrasyonları kimyasal TME kritik parametreleri noninvaziv vivo içinde değerlendirilmesi için olanak sağlar. Manyetik rezonans teknikleri, MRI ve düşük alan EPR, gibi noninvaziv vivo içinde bu TME parametrelerinin profil oluşturma için seçtiğiniz yöntemlerdir. MRI anatomik yapıları görüntüler ama fonksiyonel duyarlılık yoksun. MRI aksine, EPR teknikleri fonksiyonel spin probları ile birlikte kullanı...

Kanser ilerlemesi ve tedavi TME önemli bir rol giderek takdir1' dir. TME solid tümör, doku hipoksi2, asidoz3,4, yüksek azalan bakiyeli kapasitesi5, hücre içi GSH6,7yüksek konsantrasyonları önemli fizyolojik parametreler arasında ve interstisyel Pi8 iyi belgelenmiş. Noninvaziv içinde vivo pO2, pH, Pi, GSH ve Redoks Değerlendirmeler TME biyolojik süreçlerinde benzersiz anlayışlar sağlamak ve anti-kanser ilaçlar ve tedavi stratejileri TME hedefli önceden klinik tarama için önceden araçları yardımı. Manyetik rezonans görüntüleme (MRG) ve düşük alan EPR tabanlı teknikleri dokularda makul Radyofrekans penetrasyon derinliği onları bu TME parametrelerin noninvaziv değerlendirme için en uygun yaklaşımlar yapar. MRI büyük ölçüde görüntüleme su proton dayanır ve klinik ayarlarında anatomik çözümlemesi sağlamak için yaygın olarak kullanılır ama fonksiyonel çözünürlük yoksun. Hücre dışı Pi konsantrasyon ve endojen fosfat bir sinyal dayalı pH fosfor-31 Nükleer manyetik rezonans (31P-NMR) ölçümleri TME karakterizasyonu için potansiyel olarak çekici ama normalde tarafından birkaç kez maskeli yüksek hücre içi Pi konsantrasyonları9,10. Bu, aksine EPR ölçümler spektroskopisinin üzerinde itimat ve görüntüleme, özel olarak tasarlanmış fonksiyonel çözünürlük sağlamak için paramagnetic sondalar. Eksojen EPR probları eksojen üzerinde bir avantaj var Not NMR EPR daha yüksek fazla içsel duyarlılık ve endojen arka plan EPR sinyalleri yokluğu nedeniyle sondalar. Bir çift işlevi pH ve Redoks nitroxyl son gelişmeler sonda11 ve çok fonksiyonlu trityl sonda12 eşzamanlı ölçümler birkaç TME parametrelerinin vivo içinde eşsiz fırsatlar sunuyor ve onların korelasyon analizleri bağımsız sonda dağıtım ve ölçüm saati. Bizim bilgi için başka yöntem aynı anda vivo içinde Fizyolojik açıdan önemli kimyasal TME parametreleri pO2, pHe, Pi, Redoks ve GSH gibi yaşayan bireylerde değerlendirmek için kullanılabilir vardır.
İçin probları Vivo Fonksiyonel ölçüleri:
Şekil 1 paramagnetic sondalar partikül ve çözünür probları dahil TME parametreleri erişmek için kullanılan kimyasal yapıları gösterir. Yüksek fonksiyonel hassasiyet, istikrar canlı dokuya ve en az toksisite partikül probları için in vivo EPR pulsoksimetre çözünür probları üzerinden tercih yapmak birkaç faydaları vardır. Örneğin, partikül probları doku implant bırakmak için doku pO2 boyuna ölçümü birkaç hafta içinde çözünür probları göre yerinde tutma kez artmıştır. Öte yandan, çözünür probları partikül probları EPR tabanlı teknikleri Imaging yanı sıra birden fazla işlevleri üzerinden eşlik eden analizler izin kullanarak ölçüleri uzamsal çözüldü sağlayarak daha iyi performans (pO2, faz, Pi, redoks, ve GSH).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56624/56624fig1.jpg"> Şekil 1. TME değerlendirme tahlil bir araya paramagnetic sondalar kimyasal yapılarının. Bu partikül pO2 sonda, LiNc BuO içerir (R = - O (CH2)3CH3) ve çözünür sondalar: Çift işlevi pH ve Redoks sonda, NR; GSH-duyarlı sonda, RSSR; ve çok fonksiyonlu pO2, pH ve hücre dışı microenvironment, umut sonda. probe Pi Bu sonda sentezi sağlanan başvuruları 11,12' tanımlanmıştır. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56624/56624fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

<table><tbody><tr><td>L-bandı EPR spektrometresi</td><td>Magnettech, Almanya</td><td></td><td>Paramanyetik moleküllerin in vitro ve in vivo spektrumlarının toplanması için L-bant (1.2 GHz) elektron paramanyetik rezonans (EPR) spektrometresi</td></tr><tr><td>&nbsp; Sıcaklık & Gaz Kontrol Cihazı&nbsp;</td><td>Noxygen, Almanya</td><td></td><td>Sıcaklık & Sıcaklığı ve gaz bileşimini kontrol etmek ve ayarlamak için tasarlanmış Gaz Kontrol Cihazı&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GSH (L-Glutatyon azaltılmış)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>MMTV-PyMT ve nbsp; fareler</td><td>Evde</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Met-1 murin meme kanseri hücreleri</td><td>Evde</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57Bl / 6 vahşi tip fareler&nbsp;</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavisi Dışlama Boyası&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Ohmeda Fluotec 3&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>İzofluran (IsoFlo)</td><td>Abbott Laboratuvarları</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat dibazik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat monobazik</td><td>sigma-Aldrich</td><td>S07051</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik asit</td><td>sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Hidroksit</td><td>sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>sigması-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glikoz oksidaz</td><td>sigması-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lauda Sirkülatör E100</td><td>Lauda-Brikmann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH metre Orion</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LiNc-BuO probu</td><td>Kurum içinde</td><td></td><td>Octa-n-Butoksi-Naftalosiyanin probu, ref 13 NR probuna göre sentezlendi</td></tr><tr><td></td><td>Kurum</td><td></td> içi <td>Nitroksit probu, ref 11</td></tr><tr><td>RSSR probuna</td> göre sentezlendi <td>Kurum</td><td></td> içi <td>Di-Nitroksit probu, ref 15'e göre sentezlendi</td></tr><tr><td>HOPE probe</td><td>Kurum içi</td><td></td><td>Monofosfonlanmış Triarilmetil probu, ref 12'ye göre sentezlendi</td></tr></tbody></table>

vivo epr ph, po2, redox durumu ve fosfat konsantrasyonları ve glutatyon tümör microenvironment olarak değerlendirilmesi

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

Bu iletişim kuralı düşük alan elektron paramagnetic rezonans (EPR) kapasitesini gösterir-kimyasal tümör microenvironment (TME), nicel bilgi sağlamak için fonksiyonel paramagnetic probları ile birlikte teknikleri dayalı dahil olmak üzere p O2, pH, redoks durum, interstisyel inorganik fosfat (PI) ve hücre içi glutatyon (GSH) konsantrasyonları. Özellikle, son zamanlarda geliştirilen çözünür çok fonksiyonlu trityl sonda bir uygulama eşsiz vivo içinde pH, pO2 ve Peşzamanlı ölçümler sağlar ben e xtracellular alanı (umut sonda). Üç parametre kullanarak tek bir sonda ölçümleri onların korelasyon analizleri için bağımsız soruşturma dağıtım ve ölçümlerin zaman izin verir.

Doku p O 2 LiNc BuO kullanarak değerlendirme probları:
1.1. adım açıklanan yordamı kullanarak, taze hazırlanmış LiNc BuO microcrystals süspansiyon kalibrasyonu yapılır. Şekil 2 LiNc BuO sonda yanı sıra arabellek süspansiyon ve meme tümör dokusu kadın C57Bl/6 farelerde tümör başlatma sonra hücrele...

Fizyolojik açıdan önemli tümör microenvironment meme kanserinin fare modellerinde parametrelerinde değerlendirilmesi için düşük-alan (L-band, 1.2 GHz) elektron paramagnetic rezonans çözünür nitroxyl ve trityl sonda kullanarak gösterilmiştir.

Vivo EPR pH, pO2, Redox durumu ve fosfat konsantrasyonları ve glutatyon tümör Microenvironment olarak değerlendirilmesi

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Bu in vivo elektron paramanyetik rezonans teknolojisinin genel amacı, hayvan kanser modellerinde klinik öncesi ortamlarda lokal doku mikro çevresinin fizyolojik olarak ilgili parametrelerini kantitatif ve noninvaziv olarak değerlendirmektir. Bu teknik, dock durumunda CDT olarak doku oksijenasyonunun yanı sıra interstisyel organik fosfat ve hücreler arası konsantrasyonlar hakkında kantitatif bilgi sağlamak için florofield APR'nin özel tasarım fonksiyonel paramanyetik problarla kombinasyonuna dayanmaktadır. Bu noninvaziv teknik, tümör mikroçevresi ve tümör regenezi dünyasına benzersiz bir bakış açısı sağlar ve tümör mikroçevresi hedefli antikanser terapötiklerinin gelecekteki rasyonel tasarımına katkıda bulunabilir.Bu tekniğin uygulanması, beynin çok işlevli APR problarının uygulama parametreleri arasındaki ilişkisine kadar uzanır. Bu nedenle, altta yatan biyolojik mekanizmalar hakkında ek bilgi sağlar. Ben ve Andrey'e ek olarak, prosedürü gösteren Marieta Gencheva ve Dr.Benoit Driesschaert ve IMMR Merkezi'nden bir yüksek lisans öğrencisi olan Kayla Steinberger olacak.Partikül oksijene duyarlı probu hazırlamak için önce 60 miligram mikro kristal tartın. Oksijen duyarlılığı kalibrasyonu için, mikro kristalleri üç mililitre dolbeckas modifiye eagle ortamında askıya alın. Beş mililitrelik bir cam yuvarlak tabanlı tüpte yedi watt güç kullanarak 20 kilohertz'de bir prob sonikatörü ile buz üzerinde beş dakika boyunca sonikate.Daha sonra, sonikasyonlu mikro kristallerin bir mililitresini, L-bandı EPR spektrometresinin yüzey bobini istifasındaki bir cam tüpe yerleştirin. 37 santigrat derece fizyolojik sıcaklıkta ve sıfır, bir, iki, dört, sekiz ve yüzde 20.9 oksijen konsantrasyonlarında sürekli dalgalar EPR spektrumları elde edin. Çift işlevli pH ve redoks probunu hazırlamak için, probun 6.34 miligramını bir mililitre salin solüsyonunda çözün.Bir pH metre kullanarak küçük hidroklorik asit veya sodyum hidroksit tahsisleri ile pH'ı 7.2'ye ayarlayın. Nitroksit probunun pH kalibrasyonunu gerçekleştirmek için, önce 0.1 mililitre prob stok çözeltisini, 0.9 mililitre iki milimolar sodyum fosfat tamponu, 150 milimolar sodyum klorüre ekleyin. Daha sonra elde edilen bir milimolar prob çözeltisini bir pH metre kullanarak gerekli pH'a hidroklorik asit veya sodyum hidroksit tahsis ederek titre edin.L-bandı EPR spektrometresini kullanarak numunelerin EPR spektrumlarını 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine kaydedin. GSH'ye duyarlı RSSR probunu hazırlamak için, probun 4.05 miligramını bir mililitre DMSO çözeltisi içinde çözün. Daha sonra, RSSR'nin GSH ile reaksiyonunun hız sabitinin değerini belirleyin.Bunu yapmak için, önce 0.2 milimolar RSSR prob çözeltisi elde etmek için 0.98 mililitre bir milimolar fosfat tamponu pH 7.2, 150 milimolar sodyum klorüre 20 mikrolitre RSSR stok çözeltisi ekleyin. Daha sonra, probun 0.1 milimolar ve GSH'nin 0.5, bir veya 2.5 milimolar konsantrasyonu için GSH çözeltilerinden birinde eşit hacimlerde 0.2 milimolar RSSR solüsyonu karıştırın. RSSR ve GSH çözeltisinin karıştırılmasından hemen sonra, numuneyi EPR istifa ettiriciye yerleştirin ve EPR spektrumlarını 10 dakika boyunca her 12 saniyede bir kaydedin.Ardından, oksijen pH'ı ve Pi değerlendirmesi için çok işlevli HOPE probu için monoradikal spektral genlik artışının kinetiğini hesaplayın. Probun 10.7 miligramını bir mililitre tuzlu su çözeltisinde çözün ve pH'ı 7.4'e ayarlayın. Daha sonra, 0.2 milimolar prob çözeltisi elde etmek için hazırlanan stok çözeltisinden 20 mikrolitre tuzlu su çözeltisine 0.98 mililitre ekleyin.pH'ın prob kalibrasyonu için, küçük bir hacimde sodyum hidroksit veya hidroklorik asit ilavesiyle prob çözeltisinin 0.2 milimolarını titre edin, böylece numunenin son seyreltilmesi %1'den az olacak şekilde metin protokolünde açıklandığı gibi ara pH'da EPR spektrumlarını elde edin. Oksijen duyarlılığı probu kalibrasyonu için, metin protokolünde açıklandığı gibi çeşitli oksijen konsantrasyonlarında probun EPR spektrumlarını elde edin. Pi'nin prob kalibrasyonu için, çeşitli fosfat konsantrasyonlarında probun EPR specra'sını edinin.PKA'ya yakın bir pH değerine sahip radikal çözeltiyi kullanın ve çeşitli fosfat konsantrasyonları ile titre edin. Sıcaklığı ve gaz bileşimini daha önce olduğu gibi koruyun. Partikül probunun MET1 hücrelerine içselleştirilmesi için MET1 tümör modeli durumunda, MET1 hücreleri içeren 10 mililitre kültür ortamı içeren bir T75 şişesine 100 mikrolitre sonikasyonlu süspansiyon ekleyin.Tüm işlemler bir biyogüvenlik kabininde gerçekleşir ve ortam potansiyel enfeksiyonu en aza indirmek için penisilin ve streptomisin içerir. Hücreleri 37 santigrat derecede 72 saat veya yaklaşık% 80 birleşmeye ulaşana kadar inkübe edin. Ortamı aspire edin ve hücreleri 10 mililitre PBS ile beş kez yıkayın.Hücreleri beş mililitre tripson EDTA ile ayırın. Hücreleri topladıktan ve daha önce olduğu gibi santrifüjledikten sonra, hücre canlılığını ve miktarını belirlemek için dışlama boyasının hücre örneğini boyayın. Hücreleri minimal DMEM'de 100 mikrolitre başına bir milyon hücre konsantrasyonunda askıya alın.Bir insülin şırıngası kullanarak, içselleştirilmiş mikro kristalleri içeren 100 mikrolitre hücre süspansiyonunu, metin protokolünde açıklandığı gibi sekiz haftalık, dişi, vahşi tip bir farenin dört numaralı meme yağ yastıklarına yavaşça enjekte edin. Tümör başlangıcını ve büyümesini izleyin. EPR spektroskopik ölçümleri için, metin protokolünde açıklandığı gibi bir anestezi makinesi kullanarak hava izofoloran karışımını soluyarak fareleri uyuşturun.Yüzey bobini istifasını normal bir meme bezi veya bir meme tümörü üzerine yerleştirerek bir L-bandı EPR spektrometresi kullanarak fonksiyonel ölçümler yapın. Spektrometreyi ayarlamaya devam edin. Çözünür problar söz konusu olduğunda, prob enjeksiyonundan hemen sonra beş ila 10 dakika boyunca EPR spektrumlarını elde edin.İmplantasyondan sonraki birkaç hafta boyunca beş ila 10 dakika boyunca implante edilmiş partikül probundan EPR spektrumlarını alın. Son olarak, EPR spektrumlarını ve probları metin protokolünde açıklandığı gibi analiz edin. Partikül LiNc-BuO probunun oksijene EPR spektral duyarlılığı burada gösterilmiştir.EPR spektrumu, pO2'nin %0'ında ve 37 santigrat derecede ölçüldü. Prob süspansiyonunun EPR spektrumunun çizgi genişliğinin oksijen kısmi basıncı üzerindeki temsili bağımlıları gösterilmiştir. Çizgi genişliği pO2 ile doğrusal olarak artar.Anestezi uygulanmış bir dişi farenin meme tümör dokusunda ölçülen bir spektrum, 7,5 milimetre cıvanın doku kısmi oksijenine karşılık gelir. NR prob çözeltisinin L-bandı EPR spektrumları, çeşitli pH seviyelerinde 37 santigrat derecede elde edildi. Gözlenen aşırı ince ayrılma sabitinin pH üzerindeki bağımlıları çizilir ve standart titrasyon eğrisi ile donatılır.Burada, oksijene duyarlı LiNc-BuO probunu redoks NR probunda çift fonksiyonlu pH'ta birleştiren çok işlevli tümör mikroçevre değerlendirmesi gösterilmektedir. NR'nin gözlenen üçlü spektrumu, tümör içine gömülü LiNc-BuO probunun tek EPR hattı ile üst üste bindirilir. Hücre içi doku glutatyon konsantrasyonlarının in vivo EPR değerlendirmesi burada gösterilmiştir.RSSR probunun intratissual enjeksiyonundan hemen sonra FVBN farelerinin normal meme bezindeki meme tümöründe L-bandı EPR ile ölçülen monoradikal spektral gözetleme yoğunluğu değişiminin kinetiği gösterilmiştir. Daha hızlı kinetik, tümör dokusundaki daha yüksek GSH konsantrasyonunu yansıtır. Teknik, kanser araştırmaları alanındaki araştırmacılara, tümör mikroçevresinin hücresel fizyolojik önemli parametrelerinin in vivo olarak gerçekleştirilmesi ve translasyon için transpotansiyel için üstün bir fırsatla yardımcı olur.Probların önceki prosedürlere göre hassasiyetleri, sentetik kimyada uzmanlık gerektirir ve sunum için kritik öneme sahiptir. Merkezimiz bu teknolojinin zorluğunu ve iş birliği esasına göre sahalara raporladı.

in-vivo-epr-assessment-ph-po2-redox-status-concentrations-phosphate

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Hipoksi indüklenebilir faktör-1α aktivite Biyoparlaklık görüntüleme, bir meme kanseri beyin metastazı fare modeli intrakranial tümör hipoksi gelişimini izlemek için uygulanır.

Meme Kanseri Beyin metastaz tümör Hipoksi Dynamics in vivo Biyoparlaklık Görüntüleme Fare Modeli

Burada, tümör hücresi metabolizmasının gerçek zamanlı izlenmesi, in vivo tavuk embriyosu koryo-allantoik membran (CAM) metastaz modeli ile birleştirildiğinde, tümör hücrelerini DNA'ya zarar veren kemoterapötiklere duyarlı hale getirme yetenekleri açısından yeni anti-kanser hedeflerini/ajanlarını değerlendirmek için kullanılır.

Kanser İlaç Duyarlılık Etkinliğinin Değerlendirilmesi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Ve<em&gt; İn Vivo</em

Yeni bir elektron para-manyetik rezonanstır (EPR) yöntemi, hızlı tarama EPR (RS-EPR), geleneksel bir sürekli dalga (CW) teknikten üstün ve in vivo görüntüleme için yeni alanları açar 2B spektral mekansal görüntüleme için gösterilmiştir. Sonuçlar 250 MHz'de gösterilmiş, ancak teknik herhangi bir frekansta uygulanabilir.

Hızlı Tarama Elektron Paramagnetik Rezonans Görüntüleme Fizyolojik Önemli Parametreler için Yeni bulvarlar açar<em&gt; İn Vivo</em

Bu el yazması, tümör hipoksisinin metastaz üzerindeki etkilerinin doğrudan test edilmesine ve etki mekanizmalarının deşifre edilmesine izin veren bir hayvan modelinin geliştirilmesini açıklamaktadır. Burada açıklanan deneyler Ewing sarkomuna odaklansa da, benzer bir yaklaşım diğer tümör tiplerine de uygulanabilir.

Tümör metastaz üzerinde Hipoksi Test Etkisinin Vivo Modeli

Biz bir non-invaziv vivo içinde aerodinamik ve maliyet-etkin, protokolü Imaging görselleştirmek ve reaktif oksijen türlerine (ROS) bir fare excisional yara modelinde oluşturulan ölçmek için L-012, bir chemiluminescent luminol-analog, kullanan açıklar.

Vivo Reaktif oksijen türleri içinde bir fare görüntüleme modeli yara

Elektron paramagnetic rezonans (EPR) spektroskopisi serbest radikallerin ölçmek için kesin bir yöntemdir. Farklı hücresel kompartmanlarda serbest radikallerin algılanması için seçici spin sonda kullanımı sağlar. Biz tedavi, depolama ve örnekleri EPR ölçümler için aktarma kolaylaştırmak biyolojik örnekler toplamak için pratik ve verimli bir yöntem mevcut.

Elektron Paramagnetic rezonans ortam sıcaklığı ve 77 K biyolojik örneklerde kullanımı

Biz metastazın tümör mikroortamı ile ilişkili geçici vasküler geçirgenliği değerlendirmek için iki yöntem tarif (tmem) kapı fonksiyonu ve kanser hücresi konvülsyon yüksek molekül ağırlığı İntravenöz enjeksiyon kullanarak (155 kDa) farelerde dekstran. Yöntemleri, canlı hayvanların intravital görüntüleme ve immünofluorescence kullanarak sabit doku analizi içerir.

Intravital görüntüleme ve sabit doku analizi kullanılarak kanserli hücre yaygınlaştırılması ile Ilişkili Metasküler kapı-aracılı vasküler geçirgenlik tümör Mikroortamının değerlendirilmesi

Yüksek hücresel çözünürlüğe sahip bir ATP taşıyıcısı olan nonhidrolize floresan adenozin trifosfatın (ATP) içselleştirilmesini görselleştirmek için tekrarlanabilir bir yöntem geliştirdik. Yöntemimizi bağımsız in vitro ve in vivo tahlil-insan tümör hücre hatları ve insan tümör dokusu ile ksinografted immün yetmezlikli fareler kullanarak doğruladık.

İnsan Tümör Hücrelerinde ve Tümör-ksinografted Farelerde Makropinositoz Aracılı ATP İçselleştirme için Floresan Mikroskopi

Periton yüzeylerine metastaz yapmış insan kanserlerinin üretimi, kültürü ve görselleştirilmesi için bir protokol tanımlıyoruz. Rezeke edilen tümör örnekleri bir vibratom kullanılarak kesilir ve oksijenasyon ve canlılığın artması için geçirgen ekler üzerinde kültürlenir, ardından konfokal mikroskopi ve akış sitometrisi kullanılarak görüntüleme ve aşağı akış analizleri yapılır.

Rezeke Edilen İnsan Tümör Örneklerinden Ex Vivo Organotipik Psödomiksoma Peritonei Tümör Dilimlerinin Kültürü ve Görüntülenmesi

Murin tümörlerinin kantitatif 3D oksijen haritaları, Pulse Elektron Paramanyetik Rezonans kullanılarak noninvaziv olarak görüntülendi. Anatomi ve vasküler yapı için ultrason B-mod ve Power Doppler kullanıldı. Her iki modaliteden alınan görüntüler üst üste bindirilerek multi-parametrik tümör analizi sağlandı.

Tümör Hipoksi Değerlendirmesi: Elektron Paramanyetik Rezonans ile İn Vivo 3D Oksijen Görüntüleme 

Öğrenin, meme kanseri fare modellerinde tümör mikroçevresindeki oksijenasyon ve metabolik parametreleri nicel ve noninvaziv olarak değerlendirmek için düşük alan elektron paramanyetik rezonans teknolojisini.

Vivo EPR pH, pO₂, Redox durumu ve fosfat konsantrasyonları ve glutatyon tümör Microenvironment olarak değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet