Vitro SUMOylation SUMO E3 ligaz etkinlik eğitim için tahlil

Bu deneyin genel amacı, SUMOile edilebilen veya bir SUMO E3 likazı olan ilgilenilen bir proteini doğrulamaktır. Bu yöntem, SUMO E3 lygas tanımlaması gibi SUMOylation alanındaki önemli soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, farklı SUMO iso formlarına karşı SUMO E3 lizaz özgüllüğünün araştırılması için kullanılabilmesidir.

Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir doktora öğrencisi olan Wan-Shan Young olacak. K-bZIP etiketini saflaştırmak için, önce 14 mililitrelik bir polipropilen tüpte 10 mililitre hücresel lizatı 50 mikrolitre antikor etiketli manyetik boncuklarla inkübe edin. Daha sonra tüpü bir süspansiyon karıştırıcısında üç saat boyunca dört santigrat derecede dakikada 50 devirde döndürün.

Protein yakalandıktan sonra, boncukları peletlemek için numuneyi 800 kez g'de, dört santigrat derecede 30 saniye boyunca santrifüjleyin. Boncukları yeniden askıya almak için bir mililitre süpernatan hariç hepsini atın. Ve çözünmüş boncukları 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Yakalanan proteinleri yıkamak için, boncuklarla birlikte tüpü manyetik bir stand üzerine yerleştirin. Boncukların tüpün yan duvarlarına yapışması için yaklaşık üç saniye bekleyin ve ardından süpernatanı çıkarın. Boncukları yıkamak için, 1.5 mililitrelik tüpe bir mililitre lizis tamponu ekleyin.

Ardından tüpü on kez ters çevirin. Ardından, 1,5 mililitrelik tüpü manyetik standın üzerine yerleştirin ve boncuklar duvarlara yapıştığında süpernatanı çıkarın. Boncukları tekrar yıkamak için, 1,5 mililitrelik tüpe bir mililitre fosfat tamponlu salin ekleyin ve on kez ters çevirin.

Ardından tüpü manyetik standa aktarın ve boncuklar yan duvarlara tutturulduktan sonra süpernatanı çıkarın. Antikor etiketli manyetik boncuklardan K-bZIP etiketli proteinleri çıkarmak için, 1.5 mililitrelik tüpte fosfat tamponlu salin içinde seyreltilmiş oktapeptidin mililitresi başına 150 mikrogramda 100 mikrolitre ekleyin. Daha sonra tüpü bir süspansiyon karıştırıcısı üzerinde oda sıcaklığında on dakika boyunca dakikada 50 devirde döndürün.

Tüpü manyetik standa aktarın. Ve sonra süpernatan içeren K-bZIP'i toplayın. Daha sonra, saflaştırılmış K-bZIP etiketini analiz etmek için, saflaştırılmış proteinin bir ila beş mikrolitresini SDS sayfasına tabi tutun ve ardından Coomassie mavisi boyaması yapın.

K-bZIP konsantrasyonunu ölçmek için jel üzerine standart olarak 0.5, 1 ve 2 mikrogram sığır serum albümini yükleyin. Görüntüyü Image J.Next'te işlerken, saflaştırılmış K-bZIP'i fosfat tamponlu tuzlu su içinde seyreltin. Mikrolitre başına 100 nanogramlık bir nihai konsantrasyon elde etmek için.

Ve eksi 80 santigrat derecede küçük alikotlarda saklayın. İn vitro SUMOylation ana karışım reaksiyonunda saflaştırılmış etiketli K-bZIP'in mikrolitresi başına 100 nanogramlık üç mikrolitre ekleyin. Daha sonra ana karışımın içeriğini nazikçe karıştırın ve 30 santigrat derecede üç saat inkübe edin.

Ardından, reaksiyonu durdurmak için yükleme tamponu ile 20 mikrolitre 2X SDS sayfası ekleyin. Daha sonra proteini denatüre etmek için numuneleri beş dakika boyunca 95 santigrat derecede ısıtın. Ardından, 20 mikrolitre numuneyi %10'luk bir SDS sayfa jeli üzerine yükleyin.

Ve boya jelin dibine ulaşana kadar jeli 80 voltta yaklaşık 120 dakika çalıştırın. Elektro parezi bittiğinde, jel aparatının bağlantısını kesin. Ve jeli beş dakika boyunca yarı kuru transfer tamponuna aktarın.

Daha sonra PVDF membranını metanolle dolu başka bir kapta bir dakika bekletin. PVDF membranını metanolden çıkarın ve yarı kuru transfer tamponuna batırın. Ardından zarı beş dakika boyunca nazikçe çalkalayın.

Yarı kuru elektroforetik aparatın güvenlik kapağını çıkarın. Bir filtre kağıdını önceden ıslatın. Ve platin anodun altına bir jel sandviç hazırlayın.

Katot plakasını güvenlik kapağına sabitledikten sonra, lekeyi 15 dakika boyunca 90 volt sabit akımda çalıştırın. Ardından güç kaynağını kapatın ve yarı kuru aparatın bağlantısını kestikten sonra PVDF membranını çıkarın. Şimdi PVDF membranını, dakikada 30 devirde bir orbital çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında bir saat boyunca bloke edici tampon ile bloke edin.

Daha sonra, PVDF membranını anti-p53 antikoru ve bloke edici tampon ile dakikada 30 devirde bir süspansiyon karıştırıcı üzerinde dört santigrat derecede 12 ila 16 saat hibritleyin. Ardından PVDF membranını çıkarın ve Tris tamponlu tuzlu su tween 20 ile dolu bir kaba aktarın. Ardından, PVDF membranını Tris tamponlu tuzlu su arası 20'de 30 dakika orbital çalkalayıcı üzerinde dakikada 45 devirde bekletin.

Daha sonra, PVDF membranını, dakikada 30 devirde oda sıcaklığında oda sıcaklığında bir saat boyunca bloke edici tampon içinde seyreltilmiş yaban turpu peroksidaz ile konjuge edilmiş anti-tavşan antikoru ile hibritleştirin. Ardından, PVDF membranını Tris tamponlu tuzlu su ile 20 kez üç kez yıkayın. Yıkadıktan sonra, PVDF membranını Tris tamponlu tuzlu su arası 20 içinde süspansiyon karıştırıcısında dakikada 45 devirde 30 dakika

Ardından Tris tamponlu salin tween 20'yi fosfat tamponlu salin ile değiştirin. PVDF membranını 12 saate kadar dört santigrat derecede korumak için. Daha sonra, geliştirilmiş kemilüminesan substrat reaktiflerini bir ve iki bire bir oranında karıştırın.

Ardından PVDF membranını fosfat tamponlu tuzlu sudan çıkarın ve fazla nemi emmek için zımba cepleriyle kısa bir süre kurulayın. Hemen 400 mikrolitre Kemilüminesan reaktifi membran yüzeyine ekleyin ve üç ila beş dakika bekleyin. Fazla Kemilüminesan reaktifi boşaltmak için kısa bir süre kurulayın ve zarın tamamen kurumasını önleyin.

Lekeyi ortaya çıkarmak için Luminescent'in görüntüleme sistemini kullanın. Burada, p53 hedeflerini SUMOylate etmek için gereken Ubc9 enziminin konsantrasyonunu göstermek için immünoblot analizi yapıldı. Bu, Ubc9 enziminin konsantrasyonunun 1/2 ve 1/5'inin, SUMO 1 ve SUMO 2 peptitleri kullanılarak bir in vitro SUMOylation testinde p53 enzimini yeterince SUMOylates edebildiğini göstermektedir.

SUMOile p53'ü analiz etmek için membran anti-p53 antikoru ile problandı. SUMO 1, SUMO 2 ve SUMO 3 peptitleri kullanılarak bir in vitro SUMOylation testinde p53 hedefini SUMOylation testinde E1 ve 1/10 Ubc9 enzim konsantrasyonunun yarısının gerekli olduğunu göstermek için benzer immüno-blot analizi yapılmıştır. Burada zar, saflaştırılmış K-bZIP proteinini göstermek için Coomassie ile boyandı.

Saflaştırılmış K-bZIP'i eksprese etmek için bakulovirüs ekspresyon sistemi kullanıldı ve karşılaştırma için standart olarak sığır serum albümini ile SDS sayfasında analiz edildi. K-bZIP konsantrasyonunun arttırılmasında, sırasıyla E1 miktarının yarısı ve Ubc9 enzimlerinin miktarının 1/10'u varlığında p53'ün SUMOylation'ını katalize ettiğini gösteren ek immüno-blot analizi de yapıldı. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa dört saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, in vitro SUMOylation testi için tüm reaktifi buz üzerinde tutmayı ve seri seyreltmeyi tek bir dev seyreltme yerine yapmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü bulun, SUMOylation'ı in vitro olarak doğrulamak için aşırı ifade SUMOlygase gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, SUMOylation alanındaki araştırmacıların daha fazla SUMOlygase keşfetmelerinin ve özgüllük güçlerini doğrulamalarının yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, in vitro simülasyon testi kullanarak bir SUMO e3 lygase'in nasıl tanımlanacağını iyi anlamış olmalısınız.