Bir roman In Vitro canlı görüntüleme Astrocyte tahlil-aracılı fagositoz kullanarak pH göstergesi Birleşik Synaptosomes

Bu iletişim kuralı bir vitro canlı görüntüleme fagositoz tahlil astrocytes fagositik kapasitesini ölçmek için sunar. Arıtılmış sıçan astrocytes ve microglia pH göstergesi Birleşik synaptosomes ile birlikte kullanılır. Bu yöntem gerçek zamanlı engulfment ve yıkımı Kinetik algılayabilir ve astrocyte fagositoz oransal faktörleri tanımlamak için uygun tarama platformu sağlar.

Bu deneyin genel amacı, pH indikatörü konjuge sinaptozomların fagositozunun in vitro canlı görüntülenmesi yoluyla astrositler ve mikroglia gibi glial hücrelerin gerçek zamanlı yutulma ve bozunma kinetiğini tespit etmektir. Bu yöntem, sağlıklı ve hastalıklı beyinlerde glial hücre fagositozunun nasıl düzenlendiği gibi sinirbilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, in vitro kültürlenmiş hücrelerin canlı görüntülenmesi yoluyla glial hücrelerin gerçek zamanlı fagositik kinetiğini etkin bir şekilde izleyebilmemiz ve analiz edebilmemizdir.

Bu yöntem aynı zamanda glial hücrelerin yutulma ve bozunma kapasitesini düzenleyen faktörleri ve bileşikleri taramak için de kullanılabilir. Çözülmüş sinaptozom örneklerini 21.092 G ve dört santigrat derecede üç ila dört dakika santrifüjleyerek başlayın. Süpernatanları aspire ettikten sonra, peletleri tüp başına 200 mikrolitre 0.1 molar sodyum karbonat içinde yeniden süspanse edin ve iyice karıştırıldıktan sonra her numuneye iki mikrolitre pH indikatörü ekleyin.

Hafif bir girdaptan sonra, çözeltileri alüminyum folyo kapaklarla ışıktan koruyun ve numuneleri oda sıcaklığında iki saat boyunca hafif çalkalama ile bir büküm çalkalayıcıya yerleştirin. Kuluçka işleminin sonunda, bir mililitre Dulbecco'nun PBS'si veya DPBS'si ekleyin ve sinaptozomları santrifüjleme yoluyla toplayın, peleti yıkama başına bir mililitre taze DPBS'de yeniden süspanse edin. Son santrifüjlemeden sonra, işlevsel olmayan sinaptozom peletini% 5 DMSO ile desteklenmiş 200 mikrolitre DPBS içinde yeniden askıya alın.

Sinaptozom yutulmasının canlı görüntülenmesi için, önce süpernatanı birleşik bir astrosit kültürünün her bir oyuğundan çıkarın ve hücreleri yıkama başına bir mililitre DPBS ile üç kez hızlı bir şekilde yıkayın. Son yıkamadan sonra, 300 mikrolitre immünopanlı astrosit bazik ortamı ve beş mikrolitre pH indikatörü konjuge sinaptozomların yanı sıra glial hücre fagositozunu modüle edebilen herhangi bir ek faktör ekleyin. Sinaptozomların kuyucukların dibine yerleşmesine ve 37 santigrat derece ve% 5 Co2'de astrositler üzerindeki fosfatidil serin reseptörlerine bağlanmasına izin verin.

40 dakika sonra, süpernatanları atın ve kuyuları yıkama başına bir mililitre DPBS ile üç kez hızlı ama nazikçe yıkayın. Son yıkamadan sonra, ilgilenilen faktörlerle desteklenmiş 500 mikrolitre taze besiyerini uygun kuyucuklara ekleyin ve plakayı canlı bir görüntüleme cihazına aktarın. Görüntüleme konumlarını seçin, odağı, pozlama süresini, parlaklığı ve LED gücünü ayarlayın ve canlı görüntüleme için görüntü formatını, zaman aralığını ve toplam döngü sayısını deneysel olarak uygun şekilde ayarlayın.

Ardından, fagositoz deneylerini canlı görüntülemeye başlayın. Uygun deneysel uç noktada, bir hayal etme analiz programı açın ve zaman atlamalı görüntü dizisini içe aktarın. Görüntüleri 8 bit gri tonlamaya dönüştürün ve 50 piksellik bir yuvarlanma çubuğu yarıçapı ile bir arka plan çıkarma işlemi başlatın.

Ardından, Time Series Analyzer V3 eklentisini açın ve ilgilendiğiniz bölgeyi eklentiye sürükleyin. İlgi alanı yöneticisinde, Ekle'ye tıklayın. Time Series V3 eklentisinde Get Total Intensity'ye tıklayın.

Ardından sonuçları kaydedin ve verileri entegre edin. Hazırlandıktan sonra, sinaptozomlar dış zarlarında fosfatidil serin eksprese eder, bu da bir fonksiyon kaybına işaret eder ve bu, astrositler ve mikroglia üzerindeki fosfatidil serin reseptörleri tarafından tanınabilir. pH indikatörü konjuge sinaptozomlar fagosite edildiğinden, parlak kırmızı floresanlar yayarlar.

Glial hücre fagositozunu ölçmek için, kırmızı floresan sinyalinin alanı veya fagositik indeks ölçülebilir. Astrositler, çok sayıda pH indikatörü konjuge sinaptozomun fagositozunda etkili olmasına rağmen, mikroglia, sinaptozomları yutmada ve parçalamada daha hızlıdır. İlginç bir şekilde, astrosit şartlandırılmış ortamda bulunan astrosit salgılanan faktörler, hem astrosit hem de mikroglia aracılı fagositozu artırmak için gereklidir.

Ayrıca, fare MEGF10 nakavt astrositleri, vahşi tip hücrelere kıyasla önemli ölçüde bozulmuş fagositik kapasite gösterdi. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, sinirbilim ve glial hücre biyolojisi alanındaki araştırmacıların, çeşitli nörolojik bozuklukların tedavisi için potansiyel bir yöntem olarak glial hücre fagositozunun modülasyonunda yer alan mekanizmaları keşfetmelerinin yolunu açtı.