Bir Neural ağ tabanlı kimlik gelişimsel olarak yetkili veya yetersiz fare köklerin yumurta

Bu prosedürün genel amacı, non-invaziv bir alet kullanılarak arka taraf geliştirme kapasitesine sahip oksisitlerin tanımlanmasıdır. Bu yöntemin temel avantajı, in vitro olgunlaşma sırasında meydana gelen oosit hareketlerini basitçe gözlemleyerek dişi gamet gelişim potansiyelinin değerlendirilebilmesidir. Bu teknik, sinir ağı tabanlı bir analiz olan parçacık görüntü hızı ölçümü ile birleştirilmiş hızlandırılmış görüntülemeye dayanmaktadır.

Burada, germinal vezikalden metafaz iki aşamaya geçiş sırasında fare oositlerinin, gelişimsel yeterlilikleri veya yetersizlikleri ile önemli ölçüde ilişkili olan söz konusu plazmik hareketlerin farklı bir profilini gösterdiğini göstermek için atılan adımları açıklayacağız. Dünya Sağlık Örgütü'ne göre, kısırlık çiftlerin yaklaşık yüzde 20'sini etkileyen bir patolojidir ve ayrıca kanser tedavisi gören kadınların üçte biri erken yumurtalık yetmezliği riski altındadır. Bu, sırasıyla ABD veya İtalya gibi ülkelerde yaklaşık 300.000 veya 30.000 kadına karşılık geliyor.

Oosit gelişimsel yeterliliğinin belirlenmesi için non-invaziv prosedürlerin tasarımı, gebelik sonuçlarının genel başarısını artırmaya yardımcı olacaktır. Burada, sığır veya insanlar gibi diğer memeli türleri için test edilmeye ve kullanılmaya hazır hale getirmek için fare için geliştirilen prosedürün en kritik adımlarının ayrıntılarını veriyoruz. Yumurtalıklar, önceden ısıtılmış ve dengelenmiş M2 ortamı ve 37 derece santigrat ve yüzde beş CO2 içeren bir Petrie kabına aktarılır.

Yumurtalık çevresinde yumurta kanalı ve bir miktar yağ hala mevcutsa, bunların çıkarılması gerekir. Daha sonra, yumurtalık bir cımbızla tutularak, yüzeyi steril bir 1G iğne kullanılarak delinir. Delinmiş yumurtalıklar M2 ortamından çıkarılır ve elle çekilmiş bir mikropipet kullanarak, ilk hareketimizi yeni bir temiz M2 ortamına geçirir ve ardından oositi çevreleyen kümülüs hücreleri tamamen çıkarılana kadar birkaç saniye içeri ve dışarı pipetlenir.

Daha sonra, oositler 20 mikrolitrelik damla M2 ortamında aktarılır ve bazı kümülüs hücreleri devam ederse, kümülüs hücreleri tamamen elimine edilene kadar damladan damlaya birkaç geçişten iyice çıkarılırlar. Hoechst 33342'yi mil başına 0.05 mikrogramlık bir nihai konsantrasyonda hazırlamak için, bir kerelik pbs'de hazırlanan, mil başına beş miligram konsantrasyonda hafif bir Hoechst çözeltisi ile başlarız ve bu, gerekli konsantrasyon elde edilene kadar daha da seyreltilir. 3.5 mikrolitrelik mikrodamla Hoechst çözeltisi bir Petrie kabı kapağının dibine yerleştirilir ve daha sonra her bir seyreltilmiş oosit, Hoechst boyama işlemi sırasında hafif maruziyeti azaltmaya dikkat ederek, tabağı koyu renkli bir kapakla kaplayarak tek bir Hoechst damlasına aktarılır.

On dakikalık boyamadan sonra, oositler UV ışığı ile floresan mikroskobu altında gözlenir. Kromatin konformasyonuna bağlı olarak, nükleolus etrafında bir x-pozitif kromatin halkası sunuyorlarsa Etrafı Sarılmış Nükleol, SN olarak veya nükleolde bir x-pozitif kromatin halkası yoksa ve genel kromatin nükleolde dağılmış görünüyorsa, Çevrelenmemiş Nükleol, NSN olarak sınıflandırılırlar. Dört adet iki mikrolitrelik alfa mem besiyeri damlası, damlaları belirli bir mesafede tutmaya dikkat edilerek cam tabanlı bir Petrie kabına serilir, damlalar önceden ısıtılmış ve dengeli mineral yağ ile kaplanır ve her damlaya toplam üç ila dört oosit aktarılır.

Petrie kabı, sıcaklığın 37 santigrat derece ve yüzde beş CO2'de uzun süreli kilasyon bakımına ve kırmızı LED ışıkla aydınlatmaya izin veren hızlandırılmış bir mikroskobun inkübasyon odasına aktarılır. Hızlandırılmış analizden önce, BioStation yazılımı kullanılarak, hızlandırılmış rutin sırasında bir damladan diğerine geçişi otomatikleştirmek için her damlanın koordinatları ayarlanır. Hızlandırılmış kareler, toplam 15 saat boyunca sekiz dakikalık aralıklarla çekilir.

Kaydedilen filmler daha sonra hız vektörleri cinsinden ifade edilen sitoplazmik hareketlerin algılanmasına izin veren CellPave yazılımı kullanılarak analiz edilir. İlk olarak, CellPave aracıyla, her oositin çevresi manuel olarak sınırlandırılır. Daha sonra yazılım, iki ardışık hızlandırılmış çerçeve arasındaki karşılaştırmada meydana gelen sitoplazmik hareketin hızını hesaplar ve bunu, renk yoğunluğu ve uzunluğunun hareketlerin hızını ve yönünü tanımladığı renkli bir ok yerleştirerek ifade eder.

Burada görülen oositin altındaki histogram, bir SN oositinin 15 saatlik kayıt periyodu boyunca genel sitoplazmik hareketin hızını tanımlar. Aynı tip analiz bir NSN oosit üzerinde de yapılır. SN oosit ile karşılaştırıldığında NSN oosit tarafından gösterilen gecikmiş polar cisim bir ekstrüzyon zirvesine dikkat edin.

Ekranın alt kısmı, oositin sitoplazmik hareket hızının zamansal modelini gösterir. Hız, iki ardışık çerçeve karşılaştırılarak hesaplanır. Sitoplazmik hareket hızının ham verileri daha sonra satırlarda, Frens dizisini ve sütunlarda analiz edilen tek oositi bildiren bir Excel sayfasına aktarılır.

Sol tarafta, bir SN oositinin verileri, sağ tarafta ise NSN oositlerinin verileri. SN veya NSN oositlerinin verileri daha sonra 10 alt gruba ayrılır. Dokuzu eğitim için kullanılır, yeşil renk.

Ve kör test için bir tane, kırmızı renk. Bu işlem toplam 10 kez tekrarlanır. Her seferinde kör test numunesi değiştiriliyor.

Veriler daha sonra ileri beslemeli bir yapay sinir ağı veya FANN aracılığıyla incelenir. FANN, burada Giriş Nöronları olarak adlandırılan tüm hızlandırılmış çerçeveleri analiz etmek için inşa edilmiştir"İkincisi, kendileri iki çıkış nöronuna bağlı olan üç gizli nörona bağlıdır. Bir çıktı, girdinin yetkin bir oosit olma olasılığını verir.

Diğeri, aksine, girdinin yetersiz bir oosit olduğudur. İki çıktı arasındaki karşılaştırma, oosit dula zihinsel yeterliliğini yüzde 91.03'lük bir doğrulukla tahmin ediyor. Teknik, burada gösterildiği gibi fare oositleri için ayarlanmıştır.

Bununla birlikte, gelecekteki hatırlama, insan oositleri üzerinde test etmektir. Aslında, oosit kalitesinin analizinden elde edilen non-invaziv prosedürler özellikle yapay üreme teknolojileri alanında gereklidir.