Diyabet ile gözleri bir balık eğitim: mikrodiseksiyon, görselleştirme ve yetişkin tg(fli:EGFP) Zebra balığı retina damarlara analizi
December 26th, 2017
Burada, Yetişkin tg(fli:EGFP) Zebra balığı retina damarlara kolay bir analizini neoangiogenesis ve yapısal değişiklikler bağlantılı uzun vadeli vasküler patolojiler ayarlarında bir hızlı okuma olarak sağlayacak bir yöntem protokol tartışmak.
Erişkin Zebra Balığı Retinal Vaskülatürü için bu diseksiyon protokolünün genel amacı, floresan veya lazer taramalı konfokal mikroskopi ile neoanjiyogenez ve yapısal değişikliklere bağlı uzun süreli vasküler patolojilerin ayarlarında hızlı bir okuma sağlamaktır. Bu yöntem, diyabetik retinopati gelişimi gibi mikrovasküler komplikasyonlar alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tüm retinovaskülasyonun, herhangi bir intervasküler floresan uygulaması olmadan nispeten hızlı ve standart bir şekilde fizyolojik ve hastalık süreçlerinde sunulabilmesi ve analiz edilebilmesidir.
Başlamak için, numune başına altı mililitre taze hazırlanmış yüzde dört PFA PBS çözeltisini altı kuyucuklu plakanın kuyucuklarına aktarın. Yetişkin zebra balıklarını metin protokolüne göre ötenazi yaptıktan sonra, onları taze kağıt havluların üzerine koyun ve kurulayın. Bir neşter kullanın ve operkulumun arkasındaki kafaları kesin.
Daha sonra kafaları doğrudan taze hazırlanmış fiksatifin kuyularına aktarın. Fiksatifin daha derin retina katmanlarına nüfuz etmesini sağlamak için balık kafalarını içeren plakaları en az 24 saat boyunca dört santigrat derecede saklayın. Isıtılmış yüzde iki agaroz ile, bir Petri kabını üçte birine kadar doldurun ve agar sertleşene kadar bekleyin.
Gözleri incelemek için bir çalışma alanı oluşturmak için agar plakasını bir X PBS ile örtün. Sabitlenen numuneyi Petri kabına aktarın. Ve kafayı bir cımbızla kesilen yüzeyde tutarak, orbital boşlukta göz küresinin altına birbirine tutturulmuş bir cımbız daha yerleştirin.
Cımbızı gözün altında yavaşça açın ve optik siniri kavrayın. Sonra gözü dikkatlice yırtın ve çıkarın. Göze bağlı dört rektus ve iki eğik göz dışı kasın herhangi birini ve gözü orbital boşluğa bağlayan artık göz dışı dokuyu çıkarmak için, gözü yarı kapalı bir cımbızla geri tutun ve diğer cımbızla yapıyı kavrayarak çapsal bir hareket kullanın yumuşak bir şekilde koparmak için.
Ardından, korneayı dış aralıktan delmek için 27 gauge tek kullanımlık bir iğne kullanın. Bu açıklıktan korneayı tutmak için her iki cımbızı da kullanın ve hafifçe yırtın. Ardından, ilgili öğrencinin büyüklüğü hakkında ortalanmış bir yırtık oluşturmak için dikkatlice çalışın.
Oküler kürenin kornea tarafına, irisin üzerindeki dış kornea kenarına baskı uygulayın. Bu, küçük bir çukur oluşturacak ve lensi kornea yırtığının yüksekliğine itecektir. Ardından cımbızı lensin altından geçirin ve çıkarın.
Ardından, optik sinir yukarı bakacak şekilde gözü ters çevirin. Sklera ve korneanın birbirine bağlı olduğunu ve fincan şeklindeki retinayı korumak için göz ampulünün lifli tuniğini oluşturduğunu unutmayın. Korneosklera olarak adlandırılan bu kabuk, optik sinirin etrafındaki alanı ayırır.
Sklera ve retina arasında bir açıklık oluşturmak için bu kesilmeye bir iğne sokun. Daha sonra bu erişimi her iki cımbızla kullanarak, optik sinirin etrafındaki açıklığı artırmak için sklerayı eksenel olarak dikkatlice şeritler halinde yırtın. Kornea yan çevresine geçişte korneosklerayı sağlam tutmaya dikkat edin.
Korneosklerayı kalan göz içi dokusundan çıkarmadan önce, diğer yapılara bağlanma kritik bir nokta olacağından herhangi bir bağlantıyı kesmeye çalışın. Daha sonra sklerayı bir cımbızla tutun ve diğer elinizle optik siniri tutup çekerek korneosklerayı gözden tamamen çıkarın ve atın. Bu adım, retina damar sistemini içeren uvea ve retinadan oluşan fincan şeklinde bir yapı sağlayacaktır.
Ardından, 27 gauge bir iğneyi kalan bardağa yanlamasına tutarak ve dış yüzeyi iğne ucunun kenarı ile sıyırarak koroid ve RPE tabakasında bir yırtılma oluşturun. Koroidal ve RPE katmanını kavramak için yırtılmayı bir erişim noktası olarak kullanın ve iris bağlantısını sağlam tutarak şeritler halinde yırtmak için her iki cımbızı da kullanın. Daha sonra, irisin altına bir cımbız çalıştırın ve kesilen koroid ve RPE katmanını çekerek gerilim oluştururken dışarıdan bir devre içinde hareket ettirin ve birleşik yapıyı ayırın.
İrisin bazı kısımları çıkarılamıyorsa ve koroid ve RPE tabakasının çıkarılmasından sonra fincan şeklindeki retinaya bağlı kalamıyorsa, yetişkin zebra balığı gözünün fotoreseptör tabakası içinde sergilediği başka bir doğal kırılma noktasını kullanın. Benzer bir şekilde sadece irisi çıkarmak için gösterilmiştir. Fotoreseptör tabakasında kesilmelere neden olmak için kalan fincan şeklindeki retinayı kazıyın.
Ardından, iris ile olası bağlantıyı sağlam tutarken katmanı kaldırmak için oluşturulan erişimi kullanın. Daha sonra, cımbızı irisin altında çalıştırın ve birleşik yapıyı ayırmak için bu videoda daha önce gösterildiği gibi bir devrede devam edin. Damarların görselleştirilmesi sırasında doğrudan iç optik dairenin üzerindeki floresansı engelleyeceğinden, irisin alttaki dokusundan mantıklı bir şekilde ayrılması çok önemlidir.
Aşırı doğrudan bir yaklaşım damar kırılmasına neden olabilir. Ardından, optik siniri retinaya mümkün olduğunca yakın kesmek için düz iki nokta beş milimetre kesme kenarlı mikrodiseksiyon yaylı makas kullanın. Bu, dokunun daha iyi düz bir şekilde monte edilmesini sağlayacaktır.
Retina damar sistemini monte etmek ve görselleştirmek için, diseke retinayı her biri beş dakika boyunca iki kez yıkamak için bir X PBS kullanın. Bir cam slayta bir damla PBS yerleştirin. Daha sonra mikrokaşık uçlu bir laboratuvar spatulası kullanarak retinayı damlacığa aktarın.
Bir cımbızla, retina boyutuna bağlı olarak düz dört yapraklı veya beş yapraklı bir şekil oluşturmak için fincan şeklindeki yapıyı kesmek için bir neşter kullanırken dokuyu yerinde tutun. İnce bir kağıt parçasıyla, retinaya dokunmamaya dikkat ederek PBS'den kalanları emdirin. Daha sonra düz monte edilmiş retinayı montaj ortamına kaplayın ve lamel ile örtün.
Hava kabarcıkları retina damarlarının görünümünü bozabileceğinden köpük oluşturmamaya dikkat edin. Kapağı kapatmak için oje kullanın. Son olarak, retina damar sistemini görselleştirmek için floresan veya lazer tarama mikroskobu yapın.
Burada, bir floresan mikroskobu ile görüntülenen yetişkin transgenik sinek EGFP zebra balığındaki retinal vaskülatür morfolojik bir örneği ve arka plan floresansını azaltan bir konfokal lazer tarama mikroskobu ile görüntülenen ikinci bir örnek gösterilmektedir. Ortaya çıkan retina yapısı oldukça organize bir model gösterir. Optik arter, optik sinir başındaki retinaya nüfuz eder ve çoğu örnekte beş ila yedi ana damara yayılır.
Ana damarlar daha sonra bir dizi kemere dallanır ve düz monte edilmiş retinanın çevresindeki optik diski çevreleyen, çevresel ven olarak da adlandırılan iç optik daireye veya IOC'ye bağlanır. Yetişkin Zebra Balığı retinası, içten dışa aşağıdaki katmanlardan oluşur. Ganglion hücre tabakası, iç pleksiform tabaka, iç nükleer tabaka, dış pleksiform tabaka, dış nükleer tabaka, fotoreseptör tabakası ve retinal pigmentli epitel.
Retinal vaskülatür görselleştirmesinden vasküler parametrelerin tahmini burada gösterilmiştir. İç retinal vaskülatür, ganglion hücre tabakası üzerinde yer alırken, kordinyal kılcal damarlar retinal pigmente epitel ile ilişkili olacaktır. Bir kez eğitildikten sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa 20 dakikadan kısa sürede yapılabilir.
Bu prosedürü denerken, hazırlıktan uzun süre uzak kalmak damar bütünlüğünün sonucunu azalttığı için düzenli olarak pratik yapmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, yetişkin zebra balıklarında diyabet ve nörovasküler patolojiler analiz edilebilir.
Genel Bakış
Bu makale, yetişkin tg(fli:EGFP) zebra balığı retina vaskülatürünü analiz etmek için bir diseksiyon protokolü sunmaktadır. Yöntem, neoanjiyogenez ve yapısal değişikliklerle ilgili vasküler patolojilerin hızlı bir şekilde değerlendirilmesini sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Vasküler Biyoloji
- Zebra Balığı Modelleri
Arka Plan
- Retina vaskülatürünü anlamak, mikrovasküler komplikasyonları incelemek için çok önemlidir.
- Diyabetik retinopati, vasküler değişikliklerle bağlantılı önemli bir endişe alanıdır.
- Fluoresans ve lazer tarama mikroskobu, görselleştirme için gereklidir.
- Protokol, daha iyi tekrarlanabilirlik için diseksiyon sürecini standartlaştırmayı amaçlamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Retina vaskülatürünü analiz etmek için hızlı ve etkili bir yöntem sağlamak.
- Uzun vadeli vasküler patolojiler üzerinde araştırmayı kolaylaştırmak.
- Retina hastalıklarındaki neoanjiyogenezi daha iyi anlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Fiksatif hazırlama ve zebra balığının ötenazisi.
- Retina yapılarını izole etmek için göz diseksiyonu.
- Dokular üzerinde dikkatli manipülasyon için forseps ve iğnelerin kullanılması.
- Dissekte edilmiş retinanın floresans mikroskobu kullanılarak görselleştirilmesi.
Ana Sonuçlar
- Protokol, retina vaskülatürünün kapsamlı analizini sağlar.
- Standartlaştırılmış yöntemler, araştırmada tekrarlanabilirliği artırır.
- Çeşitli hastalık modellerinde vasküler değişikliklerin incelenmesini kolaylaştırır.
- Diyabetik retinopatinin mekanizmaları hakkında bilgiler sağlar.
Sonuçlar
- Diseksiyon protokolü, retina vaskülatürünü incelemek için etkilidir.
- Zebra balığı modellerinde vasküler patolojileri anlamak için katkıda bulunur.
- Bu yöntem, vasküler biyoloji alanındaki çeşitli araştırma ortamlarında uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This protocol enables rapid, standardized assessment of retinal vascular pathology in a genetically tractable model, supporting early-stage target validation for diabetic retinopathy and related vasculopathies. By providing quantitative visualization of neoangiogenesis and structural vascular changes, it enhances predictive confidence in preclinical de-risking strategies. The approach aligns with discovery-stage needs for mechanistic insight and translational biomarker alignment in neurovascular disease research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to retinal vascular integrity and neoangiogenic pathways.
- Operational Value: Supports biological de-risking through standardized visualization of vasculopathy phenotypes in adult zebrafish.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by linking vascular readouts to disease-modifying target engagement.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated retinal tissue for high-content imaging assays that quantify vascular architecture changes.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through standardized dissection and mounting procedures minimizing vessel breakage.
- Scalability: Enables rapid (<20 min) sample processing for screening campaigns in vascular biology.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Provides disease-relevant system for modeling long-term vascular pathologies linked to diabetic retinopathy.
- Mechanistic De-risking: Allows analysis of vascular layer-specific changes (inner vs. outer retina) to clarify pathophysiological mechanisms.
- Biomarker Alignment: Supports quantification of vascular parameters (e.g., vessel branching, inner optic circle integrity) as translational readouts.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through preclinical validation, particularly for neurovascular and metabolic disease programs.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and target validation via direct visualization of EGFP-labeled retinal vasculature.
- Screening: Delivers quantitative, fluorescence-based outputs suitable for automated image analysis and compound effect assessment.
- Analytics: Enables measurement of vascular parameters (e.g., main vessel count, arcade formation, IOC integrity) to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling human-relevant vascular pathologies in a genetic model.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable vascular phenotyping platform applicable across multiple vasculopathy indications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in retinal vasculopathy models.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across labs through defined dissection and visualization steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early vascular phenotype data, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on vascular safety and efficacy signals.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish handling, microsurgery, and tissue dissection.
- Dependent on fluorescence or laser scanning confocal microscopy infrastructure.
- Necessitates standardization of fixation, dissection, and mounting techniques across users.
- Adaptation considerations include alternative transgenic lines or disease models affecting retinal integrity.
- Practical limitations include tissue fragility and risk of vascular damage during dissection if not performed with precision.
