Rab10 fosforilasyon algılama SDS-sayfa bir fosfat bağlayıcı etiketi ile kullanarak LRRK2 etkinliğini tarafından

Bu deneyin genel amacı, fosfat bağlayıcı bir etikete sahip SDS-PAGE kullanarak LRRK2 ile Rab10 fosforilasyonunu tespit etmektir. Bu yöntem, LRRK2'deki hastalık mutasyonlarının Rab10 fosforilasyonunu nasıl etkilediği gibi Parkinson araştırma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, basit bir western blot kullanarak Rab10 fosforilasyonunun stokiyometrisinin kaba bir tahminine sahip olabilmesidir.

Bu protokolün adımlarının çoğu oldukça standarttır ve bu videoya eşlik eden metin protokolü tarafından yeterince ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Burada, size görsel talimatlardan en çok yararlanan adımları göstermek istiyoruz. Metin protokolünde açıklandığı gibi transfekte edilmiş HEK293 hücrelerinin plakalarını hazırlayın.

Plakalar buz üzerindeyken, ortamı aspire edin ve atın. Daha sonra, her bir plakanın köşesine dikkatlice iki mililitre DPBS ekleyin ve çözeltiyi yaymak için plakaları sallayın. Ardından DPBS'yi çıkarın ve atın.

Daha sonra, her plakaya 100 mikrolitre lizis tamponu ekleyin. Plakayı eğin ve tamponu yaymak ve hücre lizatını serbest bırakmak için bir kazıyıcı kullanın. Daha sonra lizatları aspire edin ve buz üzerinde önceden soğutulmuş mikrofüj tüplerine aktarın ve 10 dakika bekleyin.

Daha sonra, tüpleri santrifüjleyerek ve süpernatanları buz üzerindeki yeni tüplere aktararak kalıntısız hücre lizatlarını toplayın. Daha sonra Bradford testini kullanarak temizlenmiş lizatların protein konsantrasyonlarını ölçün. Konsantrasyon verileri için, jel analizi için 100 mikrolitrelik lizat numunesi hazırlayın.

Aşırı eksprese edilen hemaglutinin Rab10'a kıyasla endojen Rab10'u ölçmek için daha yoğun lizatlar hazırlayın. Numunelerin hazırlanmasını, beş dakika boyunca 100 santigrat derecede inkübe ederek bitirin. Daha sonra numuneleri altı aya kadar veya daha uzun süre ihtiyaç duyulana kadar eksi 20 santigrat derecenin altında saklayın.

Başlamak için, SDS-PAGE hücrelerini metin protokolüne göre hazırlayın. Ardından jeli tanka yükleyin ve bağlayıcı klipslerle sabitleyin. Daha sonra, tankı çalışan tamponla doldurun ve bir şırıngaya bağlı bir iğne kullanarak kuyucuklardaki ve jelin altındaki hava kabarcıklarını çıkarın.

Şimdi numunelere manganez klorür ekleyin ve çökeltileri çıkarmak için döndürün. Daha sonra jeli eşit hacimlerde numune, aşırı eksprese edilmiş hemaglutinin Rab10'u analiz etmek için 10 mikrogram protein veya endojen Rab10'u analiz etmek için 30 mikrogram protein ile yükleyin. Boş şeritleri sampmanganez klorür içeren tampon.

Ayrıca, numunelerle aynı hacimde olmasını sağlamak için moleküler ağırlık işaretleyicisini tampon ve manganez klorür ile destekleyin. Şimdi jeli 50 voltta çalıştırmaya başlayın. Örnek yığınından sonra, ayırma elde etmek için voltajı 120'ye yükseltin.

Boya cephesi jellerin dibine ulaştığında voltajı kesin. Daha sonra, jeli aşağıdaki gibi üç kez yıkayın. Ayırma jelini, EDTA ve SDS eklenmiş temiz bir transfer tamponu banyosuna yükleyin.

Daha sonra oda sıcaklığında 10 dakika çalkalayıcı üzerinde sallanmasına izin verin. Üç yıkamadan sonra, SDS eklenmiş ancak EDTA içermeyen transfer tamponu kullanarak bir yıkama daha yapın. Ardından jeli ıslak bir tank kullanarak aktarın.

Depoyu buz gibi soğuk suyla dolu bir köpük kutuya yükleyin, depoyu bir güç kaynağına bağlayın ve aktarımı başlatın. Prosedür için verimli soğutma ile uzun bir transfer şarttır. Transferden sonra, membranı Ponceau S ile boyayarak transferi kontrol edin, ardından metin protokolüne göre TBST'de yıkayın.

Ardından, bir blok uygulayın. Lekeyi sütlü TBST'ye batırın ve lekeyi oda sıcaklığında bir saat boyunca bir çalkalayıcı üzerinde sallayın. Daha sonra bloke edici solüsyonu çıkarın ve atın ve birincil antikor solüsyonunu uygulayın.

Şimdi zarı gece boyunca dört santigrat derecede sallayın. Ertesi gün, birincil antikor çözeltisini çıkarın. Daha sonra membranı daha önce olduğu gibi üç kez taze TBST ile yıkayın.

Yıkamalardan sonra, lekeyi ikincil antikor çözeltisine batırın ve zarı oda sıcaklığında yaklaşık bir saat boyunca bir külbütör üzerinde inkübe edin. İnkübasyondan sonra, zarı bir kez daha TBST ile üç kez yıkayın. Şimdi zarı geliştirin.

Büyük bir plastik sargı tabakasına bir mililitre ECL çözeltisi ekleyin. Ardından zarı ECL'ye yerleştirin ve her iki tarafını da ıslatmak için hızlıca ters çevirin. Ardından, zarı kaldırın ve boşalmasına izin verin.

Boşalttıktan sonra, fazla çözeltiyi emmeye yardımcı olmak için bir kenarın yaklaşık beş saniye boyunca bir kağıt havluya dokunmasına izin verin. Daha sonra zarı kırışıklık olmadan sert ve şeffaf bir filme sarın ve görüntüleme için siyah bir tepsiye aktarın. HEK293 hücreleri hemaglutinin Rab10 vahşi tip ve 3xFLAG-LRRK2 ile transfekte edildi.

Ailesel Parkinson hastalığında inaktif olan vahşi tip kinaz, LRRK2 mutasyonları test edildi. LRRK2 ve Rab10'un birlikte aşırı ekspresyonu, P-tag jelinde büyük bir bant kaymasına neden oldu. Buna karşılık, bir kinaz inaktif mutant ile birlikte ekspresyon, Rab10 hareketliliğinde herhangi bir değişikliğe neden olmadı ve bu da bant kaymasının nedeni olarak kinazı ima etti.

Ayrıca beklendiği gibi, ailesel PD mutasyonlarının tümü bant kaymasını artırdı. P-tag jel sistemi, bir LRRK2 inhibitörü ile tedavi edilen fare 3T3-İsviçre albino embriyonik fibroblast hücrelerini analiz etmek için de kullanıldı. Fosforile endojen Rab10'a karşılık gelen bant kayması, hücreler GSK2578215A ile tedavi edildiğinde kayboldu.

Aynı test, insan A549 hücreleri kullanılarak da gerçekleştirildi. Bu deneylerde, LRRK2 inhibitörünün etkinliği, LRRK2 inhibisyonunun iyi bilinen bir belirteci olan anti-p serin 935 LRRK2 antikoru kullanılarak doğrulandı. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, transferden önce jelleri yıkamak için olan normal bir western blotting prosedürüne kıyasla sadece 14 dakikaya ihtiyaç duyar.

Bu prosedürü takiben, FPD mutantlarının aynı Rab10 kalıntısını fosforile edip etmediği gibi ek soruları yanıtlamak için kütle spektrometresi gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, Parkinson araştırmaları alanındaki araştırmacıların, kültürlerdeki hücrelerde ve dokularda Rab10 fosforilasyonunun endojen seviyelerini keşfetmelerinin yolunu açtı. Lizis tamponuna eklenen mikrosistin ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve hücre lizatlarını hazırlarken her zaman uygun kişisel koruyucu ekipman giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.