Name: Rab10 fosforilasyon algılama SDS-sayfa bir fosfat bağlayıcı etiketi ile kullanarak LRRK2 etkinliğini tarafından (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Öğrenin, fosfat bağlayıcı etiketli SDS-PAGE kullanarak LRRK2 tarafından Rab10 fosforilasyonunu nasıl tespit edeceğinizi. Bu yöntem, Parkinson hastalığı araştırmalarında mutasyon etkilerini incelemeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo, Japonya) lütfen 3xFLAG-LRRK2 WT ve mutantlar kodlama plazmid verdiğiniz için teşekkür ederiz. Biz de Dr Dario Alessi (Dundee Üniversitesi, İngiltere) nazikçe mlı-2 ve HA-Rab10 kodlama plazmid verdiğiniz için teşekkür ederiz. Bu eser bilim promosyon (JSP'ler) KAKENHI Grant numarası JP17K08265 (G.I.) için Japonya Derneği tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Sveinbjornsdottir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+symptoms+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">The clinical symptoms of Parkinson's disease.</a> J. Neurochem. 139 (Suppl. 1), 318-324 (2016).</li>
<li>Hernandez, D. G., Reed, X., Singleton, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+in+Parkinson+disease%3A+Mendelian+versus+non-Mendelian+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Genetics in Parkinson disease: Mendelian versus non-Mendelian inheritance.</a> J. Neurochem. 139 (Suppl. 1), 59-74 (2016).</li>
<li>Paisán-Ruíz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+the+gene+containing+mutations+that+cause+PARK8-linked+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease.</a> Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).</li>
<li>Zimprich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+LRRK2+cause+autosomal-dominant+parkinsonism+with+pleomorphic+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology.</a> Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).</li>
<li>Gilks, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+LRRK2+mutation+in+idiopathic+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">A common LRRK2 mutation in idiopathic Parkinson's disease.</a> Lancet. 365 (9457), 415-416 (2005).</li>
<li>Satake, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+association+study+identifies+common+variants+at+four+loci+as+genetic+risk+factors+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome-wide association study identifies common variants at four loci as genetic risk factors for Parkinson's disease.</a> Nat. Genet. 41 (12), 1303-1307 (2009).</li>
<li>Simón-Sánchez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+association+study+reveals+genetic+risk+underlying+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson's disease.</a> Nat. Genet. 41 (12), 1308-1312 (2009).</li>
<li>Klein, C., Ziegler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imputation+of+sequence+variants+for+identification+of+genetic+risks+for+Parkinson%27s+disease%3A+a+meta-analysis+of+genome-wide+association+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Imputation of sequence variants for identification of genetic risks for Parkinson's disease: a meta-analysis of genome-wide association studies.</a> Lancet. 377 (9766), 641-649 (2011).</li>
<li>Cookson, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+leucine-rich+repeat+kinase+2+%28LRRK2%29+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) in Parkinson's disease.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11 (12), 791-797 (2010).</li>
<li>Ozelius, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRK2+G2019S+as+a+Cause+of+Parkinson%E2%80%99s+Disease+in+Ashkenazi+Jews%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">LRRK2 G2019S as a Cause of Parkinson’s Disease in Ashkenazi Jews.</a> N. Engl. J. Med. 354 (4), 424-425 (2006).</li>
<li>Lesage, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRK2+G2019S+as+a+Cause+of+Parkinson%E2%80%99s+Disease+in+North+African+Arabs%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">LRRK2 G2019S as a Cause of Parkinson’s Disease in North African Arabs.</a> N. Engl. J. Med. 354 (4), 422-423 (2006).</li>
<li>Bouhouche, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRK2+G2019S+Mutation%3A+Prevalence+and+Clinical+Features+in+Moroccans+with+Parkinson%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Parkinsons.+Dis%22%5BJournal%5D)">LRRK2 G2019S Mutation: Prevalence and Clinical Features in Moroccans with Parkinson's Disease.</a> Parkinsons. Dis. , 1-7 (2017).</li>
<li>West, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease-associated+mutations+in+leucine-rich+repeat+kinase+2+augment+kinase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease-associated mutations in leucine-rich repeat kinase 2 augment kinase activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (46), 16842-16847 (2005).</li>
<li>Ito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTP+binding+is+essential+to+the+protein+kinase+activity+of+LRRK2%2C+a+causative+gene+product+for+familial+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">GTP binding is essential to the protein kinase activity of LRRK2, a causative gene product for familial Parkinson's disease.</a> Biochemistry. 46 (5), 1380-1388 (2007).</li>
<li>Steger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteomics+reveals+that+Parkinson%27s+disease+kinase+LRRK2+regulates+a+subset+of+Rab+GTPases%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteomics reveals that Parkinson's disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Ito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phos-tag+analysis+of+Rab10+phosphorylation+by+LRRK2%3A+a+powerful+assay+for+assessing+kinase+function+and+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Phos-tag analysis of Rab10 phosphorylation by LRRK2: a powerful assay for assessing kinase function and inhibitors.</a> Biochem. J. 473, 2671-2685 (2016).</li>
<li>Kinoshita, E., Kinoshita-Kikuta, E., Takiyama, K., Koike, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphate-binding+tag%2C+a+new+tool+to+visualize+phosphorylated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Phosphate-binding tag, a new tool to visualize phosphorylated proteins.</a> Mol. Cell. Proteomics. 5 (4), 749-757 (2006).</li>
<li>Database, J. S. E. Using a Hemacytometer to Count Cells. J. Vis. Exp. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells">https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells</a> (2017).</li>
<li>Ni, D., Xu, P., Gallagher, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27038386">Immunoblotting and Immunodetection.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. (114), 10.8.1-10.8.37 (2016).</li>
<li>Reith, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GSK2578215A%3B+a+potent+and+highly+selective+2-arylmethyloxy-5-substitutent-N-arylbenzamide+LRRK2+kinase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem.+Lett%22%5BJournal%5D)">GSK2578215A; a potent and highly selective 2-arylmethyloxy-5-substitutent-N-arylbenzamide LRRK2 kinase inhibitor.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 22 (17), 5625-5629 (2012).</li>
<li>Fell, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MLi-2%2C+a+potent%2C+selective+and+centrally+active+compound+for+exploring+the+therapeutic+potential+and+safety+of+LRRK2+kinase+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">MLi-2, a potent, selective and centrally active compound for exploring the therapeutic potential and safety of LRRK2 kinase inhibition.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 355, 397-409 (2015).</li>
<li>Dzamko, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+LRRK2+kinase+activity+leads+to+dephosphorylation+of+Ser%28910%29%2FSer%28935%29%2C+disruption+of+14-3-3+binding+and+altered+cytoplasmic+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization.</a> Biochem. J. 430 (3), 405-413 (2010).</li>
<li>Thévenet, J., Pescini Gobert, R., Hooft van Huijsduijnen , R., Wiessner, C., Sagot, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+LRRK2+expression+points+to+a+functional+role+in+human+monocyte+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Regulation of LRRK2 expression points to a functional role in human monocyte maturation.</a> PLoS One. 6 (6), e21519(2011).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada, Rab10 fosforilasyon tarafından LRRK2 P-etiket yöntembilimi'ne dayalı endojen düzeylerde tespit facile ve sağlam yöntemi açıklanmaktadır. Fosforile Rab10 karşı şu anda mevcut antikor ile sadece15overexpressed proteinler çalıştığından, P-tan SDS-sayfası kullanan mevcut yöntemi Rab10 fosforilasyon endojen düzeylerini değerlendirmek için tek yolu bu. Ayrıca, mevcut yöntemi Rab10 fosforilasyon hücrelerdeki stoichiometry tahmin sağlar. P-etiket metodoloji fosfo-proteinler için genel olarak uygul...

PD en sık görülen nörodejeneratif hastalıklar, ağırlıklı olarak orta dopaminerjik nöronlarda disfonksiyon yaşlı insanlar1motor sistemleri sonuçlanan etkileyen biridir. Hastaların çoğunda PD sporadik bir şekilde geliştirmek iken hastalığı devralan aileler. Bazı genlerdeki mutasyonlar FPD2ile bağlantılı olarak tespit edilmiştir. FPD için sorumlu gen biridir LRRK2, sekiz missense PARK8 denilen bir baskın devralınan FPD bağlı mutasyonlar (N1437H, R1441C/G/H/S, Y1699C, G2019S ve I2020T) şimdiye bildirilen3,4,5olmuştur. Çeşitli genom çapında dernek çalışmaları (GWAS) sporadik PD hastaların da LRRK2 odağı genomik varyasyonları bir risk faktörü PD, anormallik LRRK2 işlevindeki ateş sporadik hem de yaygın bir nedeni olduğunu düşündüren için belirledik ve PARK8 FPD6,7,8.
LRRK2 lösin yönünden zengin tekrar alanının bir etki alanı, GTP bağlayıcı Ras karmaşık proteinleri (ROC) etki alanı, C-terminal ROC (COR) etki alanı, bir serin/treonin protein kinaz etki ve WD40 tekrar etki alanı9oluşan büyük bir protein (2527 amino asitler) olduğunu. Sekiz FPD mutasyonlar bu işlevsel etki alanlarında bulun; N1437H ve R1441C/G/H/S Y1699C COR etki alanında, G2019S ve I2020T kinaz etki alanındaki ROC etki alanında. Bu yana en sık mutasyon PD hastalar10,11,12' bulundu, G2019S mutasyon LRRK2 kinaz aktivitesinin 2-3 kat vitro13tarafından artırır, onaylanmadığına karar LRRK2 substrate(s) fosforilasyon anormal artış nöronlar için toksik. Ancak, fizyolojik ilgili LRRK2 yüzeylerde fosforilasyon hasta türetilmiş örneklerinde değerlendiren yöntemler eksikliği nedeniyle ailesel/sporadik PD hastalarında değişmiş olup olmadığını incelemek mümkün olmuştur.
Protein fosforilasyon genellikle immunoblotting ya da özellikle devletin fosforile proteinlerin veya kitle spektrometrik analizi tarafından tanıma antikorları kullanarak enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) tarafından algılanır. Ancak, eski strateji fosforilasyon özgü antikor oluşturma zorlukları nedeniyle bazen uygulanamaz. Radyoaktif fosfat içeren hücrelerin metabolik etiketleme fosforilasyon özel antikorlar kolayca kullanılabilir olduğunda fosforilasyon fizyolojik düzeyleri incelemek için başka bir seçenektir. Ancak, radyoaktif malzeme büyük miktarda gerektirir ve bu nedenle bazı özel ekipman radioprotection14için içerir. Kitle spektrometrik analizi daha duyarlı bu immunochemical yöntemlerine göre ve protein fosforilasyon analiz popüler oldu. Ancak, örnek hazırlıktır zaman alıcı ve pahalı aletler analiz için gereklidir.
LRRK2 için doğrudan fizyolojik yüzeylerde bir büyük ölçekli phosphoproteomic analiz15sonucuna dayalı olarak bir alt Rab10 ve Rab8 de dahil olmak üzere Rab GTPazlar ailesinin son zamanlarda bildirildi. O zaman Rab10 fosforilasyon FPD mutasyonlar fare embriyonik fibroblastlar ve fareler16knockin akciğerler yükseltilmiştir gösterdi. Bu raporda, biz bir Sodyum Lauryl Sülfat polyacrylamide Jel Elektroforez (SDS-sayfa) istihdam için seçti-P-etiket molekül Rab10 fosforilasyon, endojen düzeylerini saptamak için SDS-sayfa jelleri (P-tan SDS-sayfası) içine co polimerli yöntemi dayalı Çünkü son derece hassas antikor için fosforile Rab10 belirli hala eksik. Şu anda kullanılabilir antikorlar kötü selectivity nedeniyle endojen Rab8 fosforilasyon için toplam Rab8 algılamak başarısız oldu. Bu nedenle, Rab10 fosforilasyon üzerinde odaklanmaya karar verdi. LRRK2 Rab10 Thr73 son derece korunmuş geçiş"II" bölgesinin ortasında bulma phosphorylates. Yüksek koruma Rab proteinler arasında fosforilasyon sitelerin neden farklı Rab proteinler tanıma phosphospecific antikorlar yapmak zor nedenlerinden biri olabilir.
Rab8A LRRK2 tarafından fosforilasyon Rabin8, GTP15ile ilişkili GSYİH değiş tokuş ederek Rab8A etkinleştiren bir guanin nükleotid Satım faktörü (GEF) bağlama engeller. Fosforilasyon, Rab10 ve LRRK2 tarafından Rab8A de GSYİH bağlı Rab proteinler membran15ayıklayarak Rab proteinleri harekete geçirmek için gerekli olan GSYİH-ayrılma inhibitörleri (GDIs), bağlama engeller. Topluca, hassas moleküler mekanizması ve fosforilasyon fizyolojik sonuçları belirsiz kalır, ancak fosforilasyon tarafından LRRK2 Rab proteinlerin onları aktivasyon engellediğini onaylanmadığına karar.
P-etiket SDS-sayfa 2006 yılında Kinoshita vd tarafından icat edilmiştir: Bu yöntemde, Akrilamid kovalent P etiketi ile birleştiğinde, bir molekül fosfat SDS-sayfa copolymerized yüksek benzeşimli yakalama17jelleri. SDS-sayfa jel P etiketi molekülleri seçerek fosforile proteinlerin elektroforetik hareketlilik geri zekalı çünkü P etiketi SDS-sayfa fosforile proteinlerin sigara fosforile olanlardan ayırabilirsiniz (şekil 1). Faiz protein üzerinde birden fazla artıkları fosforile Eğer bir merdiven differentially fosforile biçimlerine karşılık gelen gruplarından gözlenir. Rab10 söz konusu olduğunda, biz Rab10 sadece Thr73 fosforile gösteren tek bir grup değiştirdi, gözlemlemek. İmmunoblotting fosforilasyon özel antikorlar ile büyük avantaj P etiketi SDS-sayfanın fosforile Rab10 fosforilasyon spesifik antikorlar (Yani, tanıma toplam Rab10) ile immunoblotting tarafından tespit edilebilir olduğunu membranlar transfer sonra genellikle ticari/akademik kaynaklardan daha belirli, hassas ve kullanılabilir olduğu. Bir immunoblotting fosforilasyon özel antikorlar ile veya radyoaktif hücrelerle metabolik etiketlerine göre hangi imkansız fosforilasyon, stoichiometry yaklaşık tahmini elde edebilirsiniz P etiketi SDS-sayfa kullanmanın bir diğer avantajı olduğunu fosfatlar.
Ucuz P etiketi Akrilamid ve bazı küçük değişiklikler ile ilgili kullanımı dışında Rab10 fosforilasyon LRRK2 tarafından algılanması için mevcut yöntemi immunoblotting genel bir protokol izler.Bu nedenle, immunoblotting örnek saf proteinler, hücre lysates ve doku homogenates dahil herhangi bir türde her zamanki bir uygulama nerede herhangi bir laboratuarlarında basit ve kolayca çalıştırılabilir olması gerektiği.

<table><tbody><tr><td><güçlü >Reaktifler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu su (DPBS)</td> <td>ev yapımı</td><td></td><td>150 mM NaCl, 8 mM Na2HPO4-12H2O, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4 in MilliQ suda ve otoklavlama ile sterilize edilmiştir</td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Nacalai Tesque</td><td>31320-34</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Disodyum Hidrojenfosfat 12-Su</td><td>Wako</td><td>196-02835</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Wako</td><td>163-03545</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Dihidrojen Fosfat</td><td>Wako</td><td>169-04245</td><td></td></tr><tr><td>%2,5 Tripsin (10X)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T4549</td><td>Çalışma solüsyonu</td></tr> <tr><td>hazırlamak için steril DPBS ile 10 kat seyreltinDulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle medium (DMEM)</td> <td>Wako</td><td>044-29765</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>BioWest</td><td>S1560</td><td>56 ° C'de ısıyla inaktive edilmiş; 30 dakika için C</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (100X)</td> <td>Wako</td><td>168-23191</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Wako</td><td>342-01375</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>Wako</td><td>198-13765</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimin HCl MAX, Doğrusal, Mw 40.000 (PEI MAX 40000)</td> <td>PolySciences, Inc.</td><td>24765-1</td><td>Stok çözeltisi 20 mM HEPES-NaOH pH 7.0'da 1 mg / mL'de hazırlandı ve daha sonra pH NaOH ile 7.0'a ayarlandı</td></tr>. <tr><td>Dimetil sülfoksit</td><td>Wako</td><td>045-28335</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>STAR</td><td>RSP-THA500G</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik asit</td><td>Wako</td><td>080-01066</td><td></td></tr><tr><td>Polioksietilen (10) Oktilfenil Eter</td><td>Wako</td><td>160-24751</td><td>Triton X-100'e eşdeğer</td></tr><tr><td>Etilen glikol-bis (2-aminoetileter) -N, N, N ', N'-tetraasetik asit (EGTA)</td> <td>Wako</td><td>346-01312</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum ortovanadat (V)</td> <td>Wako</td><td>198-09752</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum florür</td><td>Kanto Chemical</td><td>37174-20</td><td></td></tr> <tr><td>ve beta; -Gliserofosforik Asit Disodyum Tuzu Pentahidrat</td><td>Nacalai Tesque</td><td>17103-82</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum pirofosfat dekahidrat</td><td>Kokusan Kimyasal</td><td>2113899</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosistin-LR</td><td>Wako</td><td>136-12241</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Wako</td><td>196-00015</td><td></td></tr><tr><td>Komple EDTA içermeyen proteaz inhibitörü kokteyli</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>Bir tableti -20 ° C'de saklanabilen 1 mL suda çözün; Bir ay boyunca C. Hücre lizisi için 1:50 seyreltmede kullanın</td></tr><tr><td>Pierce Coomassie (Bradford) Protein Test Kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23200</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum dodesil sülfat</td><td>Nacalai Tesque</td><td>31607-65</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Wako</td><td>075-00616</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenol mavisi</td><td>Wako</td><td>021-02911</td><td></td></tr> <tr><td>ve beta; -merkaptoetanol</td><td>Kanto Kimyasal</td><td>25099-00</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Wako</td><td>056-06967</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Wako</td><td>136-01837</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat bağlayıcı etiket akrilamid</td><td>Wako</td><td>AAL-107</td><td>P-etiket akrilamid</td></tr><tr><td>% 40 (a / h) akrilamid çözeltisi</td><td>Nacalai Tesque</td><td>06119-45</td><td>Akrilamid: Bis = 29: 1</td></tr><tr><td>Tetrametiletilendiamin (TEMED)</td> <td>Nacalai Tesque</td><td>33401-72</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum persülfat (APS)</td><td>Wako</td><td>016-08021</td><td>%10 (a/h) çözelti, amonyum persülfat tozunun MilliQ su</td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Wako</td><td>166-04831</td><td></td></tr><tr><td>Manganez klorür tetrahidrat</td> içinde çözülmesiyle hazırlandı <td>Sigma-Aldrich</td><td>M3634</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Önceden Boyanmış Standart</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374, 1610373, 1610377</td><td>GENİŞ GÖRÜNÜM protokolünde kullanılan moleküler ağırlık işaretleyicisi</td></tr><tr><td>Önceden Boyanmış Protein Boyutu İşaretleyicisi III</td><td>Wako</td><td>230-02461</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Nacalai Tesque</td><td>17109-64</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Protran NC 0.45</td><td>GE Sağlık</td><td>10600007</td><td>Nitroselüloz membran</td></tr><tr><td>Durapore Membran Filtre EMD</td><td>Millipore</td><td>GVHP00010</td><td>PVDF membran</td></tr><tr><td>Filtre Kağıtları No.1</td><td>Advantec</td><td>00013600</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Nacalai Tesque</td><td>28322-72</td><td></td></tr><tr><td>Asetik asit</td><td>Wako</td><td>017-00251</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>polioksietilenorbitan monolaurat</td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)</td> <td>Wako</td><td>345-01865</td><td></td></tr><tr><td>Yağsız süt tozu</td><td>Difco Laboratuvarları</td><td>232100</td><td></td></tr><tr><td>Immunostar</td><td>Wako</td><td>291-55203</td><td>ECL çözeltisi (Normal duyarlılık)</td></tr><tr><td>Immunostar LD</td><td>Wako</td><td>290-69904</td><td>ECL çözeltisi (Yüksek hassasiyet)</td></tr><tr><td>CBB boyama çözeltisi</td><td>ev yapımı</td><td></td><td>1 g CBB R-250, %50 (h/h) metanol, 1 L MilliQ suda %10 (h/h) asetik asit</td></tr><tr><td>CBB R-250</td><td>Wako</td><td>031-17922</td><td></td></tr><tr><td>CBB leke giderme çözelti</td><td>ev yapımı</td><td></td><td>% 12 (h / h) metanol,% 7 (h / h) asetik asit 1 L MilliQ su</td></tr> <tr><td>< güçlü > İsim< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Şirket < / güçlü ></td> <td>< güçlü > Katalog Numarası < / güçlü ></td> <td>< güçlü > Yorumlar< / güçlü ></td></tr> <tr><td>< güçlü > Antikorlar< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>anti-HA antikoru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11583816001</td><td>0.2 & mu'da kullanılır; immünoblotlama için g / mL.</td></tr><tr><td>anti-Rab10 antikor</td><td>Hücre Sinyal Teknolojisi</td> <td># 8127</td><td>İmmünoblotlama için 1: 1000'de kullanılır. Özgüllük, Ito ve ark., Biochem J, 2016'da CRISPR KO ile doğrulandı.</td></tr><tr><td>anti-pSer935 antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab133450</td><td>1 & mu'da kullanılır; immünoblotlama için g / mL.</td></tr><tr><td>anti-LRRK2 antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab133518</td><td>1 & mu'da kullanılır; immünoblotlama için g / mL.</td></tr><tr><td>anti-&alfa;-tubulin antikoru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9026</td><td>1 & mu'da kullanılır; immünoblotlama için g / mL.</td></tr><tr><td>anti-GAPDH antikoru</td><td>Santa-Cruz</td><td>sc-32233</td><td>0.02 & mu'da kullanılır; immünoblotlama için g / mL.</td></tr><tr><td>Peroksidaz AffiniSaf Koyun Anti-fare IgG (H + L)</td> <td>Jackson ImmunoResearch</td><td>515-035-003</td><td>0.16 & mu'da kullanılır; immünoblotlama için g / mL.</td></tr><tr><td>Peroksidaz AffiniSaf Keçi Anti-Tavşan IgG (H + L)</td> <td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-035-003</td><td>0.16 & mu'da kullanılır; immünoblotlama için g / mL.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Inhibitors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GSK2578215A</td><td>MedChem Express</td><td>HY-13237</td><td>Stok çözeltisi DMSO'da 10 mM'de hazırlandı ve -80 °C'de depolandı; C</td></tr><tr><td>MLi-2</td><td>Dr Dario Alessi (Dundee Üniversitesi) tarafından sağlandı.</td><td></td> <td>Stok çözeltisi DMSO'da 10 mM'de hazırlandı ve -80 ° C'de saklandı; C</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Plasmids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rab10/pcDNA5 FRT'den HA'ya</td><td>Dr Dario Alessi (Dundee Üniversitesi)</td><td></td> tarafından sağlanmıştır<td>. Bu plazmit, amino-terminal HA etiketli insan Rab10'u ifade eder.</td></tr><tr><td>LRRK2 WT/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Dr Takeshi Iwatsubo (Tokyo Üniversitesi)</td><td></td> tarafından sağlanmıştır <td>Ito ve diğerleri, Biyokimya, 46: 1380&ndash; 1388 (2007). Bu plazmit, amino-terminal olarak 3xFLAG etiketli vahşi tip insan LRRK2'yi ifade eder.</td></tr><tr><td>LRRK2 K1906M/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Dr Takeshi Iwatsubo (Tokyo Üniversitesi)</td><td></td> tarafından sağlanmıştır, <td>Ito ve diğerleri, Biyokimya, 46: 1380&ndash; 1388 (2007). Bu plazmit, insan LRRK2'nin amino-terminal 3xFLAG etiketli K1906M kinaz inaktif mutantını eksprese eder.</td></tr><tr><td>LRRK2 N1437H/p3xFLAG-CMV-10</td><td></td><td></td><td>Bu kağıt. Bu plazmit, insan LRRK2'nin amino-terminal 3xFLAG etiketli N1437H FPD mutantını ifade eder.</td></tr><tr><td>LRRK2 R1441C/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Dr Takeshi Iwatsubo (Tokyo Üniversitesi) tarafından sağlanmıştırKamikawaji</td><td></td> <td>ve diğerleri, Biyokimya, 48: 10963&ndash; 10975 (2013). Bu plazmit, insan LRRK2'nin amino-terminal 3xFLAG etiketli R1441C FPD mutantını ifade eder.</td></tr><tr><td>LRRK2 R1441G/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Dr Takeshi Iwatsubo (Tokyo Üniversitesi) tarafından sağlanmıştırKamikawaji</td><td></td> <td>ve diğerleri, Biyokimya, 48: 10963&ndash; 10975 (2013). Bu plazmit, insan LRRK2'nin amino terminal 3xFLAG etiketli R1441G FPD mutantını ifade eder.</td></tr><tr><td>LRRK2 R1441H/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Dr Takeshi Iwatsubo (Tokyo Üniversitesi) tarafından sağlanmıştırKamikawaji</td><td></td> <td>ve diğerleri, Biyokimya, 48: 10963&ndash; 10975 (2013). Bu plazmit, insan LRRK2'nin amino-terminal 3xFLAG etiketli R1441H FPD mutantını ifade eder.</td></tr><tr><td>LRRK2 R1441S/p3xFLAG-CMV-10</td><td></td><td></td><td>Bu kağıt. Bu plazmit, insan LRRK2'nin amino-terminal 3xFLAG etiketli R1441S FPD mutantını ifade eder.</td></tr><tr><td>LRRK2 Y1699C/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Dr Takeshi Iwatsubo (Tokyo Üniversitesi)</td><td></td> tarafından <td>sağlanmıştırKamikawaji ve diğerleri, Biyokimya, 48: 10963&ndash; 10975 (2013). Bu plazmit, insan LRRK2'nin amino-terminal 3xFLAG etiketli Y1699C FPD mutantını eksprese eder.</td></tr><tr><td>LRRK2 G2019S/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Dr Takeshi Iwatsubo (Tokyo Üniversitesi) tarafından sağlanmıştırKamikawaji</td><td></td> <td>ve diğerleri, Biyokimya, 48: 10963&ndash; 10975 (2013). Bu plazmit, insan LRRK2'nin amino terminal 3xFLAG etiketli G2019S FPD mutantını ifade eder.</td></tr><tr><td>LRRK2 I2020T/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Dr Takeshi Iwatsubo (Tokyo Üniversitesi) tarafından sağlanmıştırKamikawaji</td><td></td> <td>ve diğerleri, Biyokimya, 48: 10963&ndash; 10975 (2013). Bu plazmit, insan LRRK2'nin amino-terminal 3xFLAG etiketli I2020T FPD mutantını ifade eder.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company< / strong</td><td>>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 inkübatörü</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Forma Serisi II 3110 Su Ceketli</td><td></td></tr><tr><td>Otomatik Pipet</td><td>Drummond</td><td>Pipet Yardımı PA-400</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet P10</td><td>Nichiryo</td><td>00-NPX2-10</td><td>0.5&ndash; 10 & mu; L</td></tr><tr><td>Mikropipet P200</td><td>Nichiryo</td><td>00-NPX2-200</td><td>20&ndash; 200 &mu; L</td></tr><tr><td>Mikropipet P1000</td><td>Nichiryo</td><td>00-NPX2-1000</td><td>100&ndash; 1000 &mu; L</td></tr><tr><td>Mikropipet P10</td><td>STAR</td><td>RST-481LCRST</td><td>için Steril Uçlar</td></tr><tr><td>Mikropipet P200</td><td>FUKAEKASEI</td><td>1201-705YS</td><td>için Steril Uçlar</td></tr><tr><td>Mikropipet için Steril Uçlar P1000</td><td>STAR</td><td>RST-4810BRST</td><td>Steril</td></tr><tr><td>5 mL disporlanabilir pipet</td><td>Greiner</td><td>606180</td><td>Steril</td></tr><tr><td>10 mL disporlanabilir pipet</td><td>Greiner</td><td>607180</td><td>Steril</td></tr><tr><td>25 mL disporlanabilir pipet</td><td>Falcon</td><td>357535</td><td>Steril</td></tr><tr><td>Hematositometre</td><td>Sunlead Glass</td><td>A126</td><td>Geliştirilmiş Neubeuer</td></tr><tr><td>Mikroskobu</td><td>Olympus</td><td>CKX53</td><td></td></tr><tr><td>10 cm tabaklar</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td>Doku kültürü için</td></tr><tr><td>6 oyuklu plakalar</td><td>AGC Techno Glass</td><td>3810-006</td><td>Doku kültürü için</td></tr><tr><td>Vorteks karıştırıcı</td><td>Bilimsel Endüstriler</td><td>Vortex-Genie 2</td><td></td></tr><tr><td>Hücreli sıyırıcılar</td><td>Sumitomo Bakalit</td><td>MS-93100</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL tüpler</td><td>STAR</td><td>RSV-MTT1.5</td><td></td></tr><tr><td>15 mL tüpler</td><td>AGC Techno Glass</td><td>2323-015</td><td></td></tr><tr><td>50 mL tüpler</td><td>AGC Techno Glass</td><td>2343-050</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüjler</td><td>TOMY</td><td>MX-307</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu plakalar</td><td>Greiner</td><td>655061</td><td>Doku kültürü için değil</td></tr><tr><td>Plaka okuyucu</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>SpectraMax M2e</td><td></td></tr><tr><td>SDS&ndash; SAYFA tankları</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1010</td><td></td></tr><tr><td>Transfer tankları</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1510B</td><td></td></tr><tr><td>Jel plakalar (çentikli)</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1000-1</td><td></td></tr><tr><td>Jel plakalar (düz)</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1000-2</td><td></td></tr><tr><td>Silikon ara parçalar</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1000-16</td><td></td></tr><tr><td>17 kuyulu taraklar</td><td>Nihon Eido</td><td>Özel yapım</td><td></td></tr><tr><td>Bağlayıcı klipsler</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1000-15</td><td></td></tr><tr><td>5 mL şırınga</td><td>Terumo</td><td>SS-05SZ</td><td></td></tr><tr><td>21G</td><td>Terumo</td><td>NN-2138R</td><td></td></tr><tr><td>Güç İstasyonu 1000 VC</td><td>ATTO</td><td>AE-8450</td><td>SDS için güç kaynağı; SAYFA ve transfer</td></tr><tr><td>Büyük tartı tekneleri</td><td>Ina Optika</td><td>AS-DL</td><td></td></tr><tr><td>Plastik kaplar</td><td>BİR PS</td><td>KUTUSU No.4</td><td>10 x 80 x 50 mm</td></tr><tr><td>Sallanan çalkalayıcı</td><td>Titech</td><td>NR-10</td><td></td></tr><tr><td>Stiren köpük kutu</td><td>jenerik</td><td></td><td>İç boyutlar bir transfer tankına (200 x 250 x 250 mm) uygun olmalıdır.</td></tr><tr><td>ImageQuant LAS-4000</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>ECL'yi algılamak için soğutulmuş bir CCD kamera ile donatılmış bir görüntüleyici</td></tr></tbody></table>

rab10 fosforilasyon algılama sds-sayfa bir fosfat bağlayıcı etiketi ile kullanarak lrrk2 etkinliğini tarafından

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Lösin yönünden zengin tekrar kinaz 2 (LRRK2) mutasyonların ailesel Parkinson hastalığı ile (FPD) bağlanacak şekilde gösterilmiştir. LRRK2 kinaz aktivitesinin anormal harekete geçirmek PD patogenezinde karıştığı olmuştur, bu LRRK2 kinaz aktivitesinin fizyolojik düzeylerini değerlendirmek için bir yöntem kurmak için gereklidir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda LRRK2 fizyolojik koşullar altında Rab10, Rab GTPazlar ailesinin üyeleri phosphorylates ortaya koydu. Her ne kadar tarafından LRRK2 kültürlü hücrelerde endojen Rab10 fosforilasyon tarafından kütle spektrometresi tespit edilemedi, immunoblotting için şu anda mevcut fosforilasyon özgü antikorların zavallı duyarlılık nedeniyle tarafından tespit etmek zor oldu Rab10. İşte, biz basit bir tarif Rab10 fosforilasyon tarafından LRRK2 endojen düzeylerini tespit yöntemi bir fosfat bağlayıcı etiketi (P-etiket), ile birlikte Sodyum Lauryl Sülfat polyacrylamide Jel Elektroforez (SDS-sayfa) kullanan immunoblotting dayalı olan N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl) -N,N',N'- tris (pyridin-2-yl-metil) - 1,3 - diaminopropan-2-ol. Mevcut Protokolü sadece P etiketi kullanan metodoloji örneği sağlar ama aynı zamanda hücre ve dokulara LRRK2 aşağı akım sinyal mutasyonlar yanı sıra inhibitörü tedavisi/yönetim veya herhangi bir diğer etken nasıl değiştirmek değerlendirmek sağlar .

Overexpression sistemi: HA-Rab10 3 tarafından fosforilasyon × bayrak-LRRK2 içinde HEK293 hücreleri:
HEK293 hücreleri HA-Rab10 vahşi tipi ve 1,066 µg 3 × bayrak-LRRK2 (yaban-tipi, etkin olmayan kinaz mutant (K1906M) veya FPD mutantlar) 0,266 µg ile transfected. Rab10 fosforilasyon P etiketi SDS-sayfa bir anti kullanarak immunoblotting tarafından takip tarafından muayene-HA antikor (Şekil 2). proteinleri...

Bu da çalışmanın Rab10 fosforilasyon endojen düzeyleri lösin yönünden zengin tekrar kinaz 2 algılama basit bir yöntem açıklanır.

Rab10 fosforilasyon algılama SDS-sayfa bir fosfat bağlayıcı etiketi ile kullanarak LRRK2 etkinliğini tarafından

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Bu deneyin genel amacı, fosfat bağlayıcı bir etikete sahip SDS-PAGE kullanarak LRRK2 ile Rab10 fosforilasyonunu tespit etmektir. Bu yöntem, LRRK2'deki hastalık mutasyonlarının Rab10 fosforilasyonunu nasıl etkilediği gibi Parkinson araştırma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, basit bir western blot kullanarak Rab10 fosforilasyonunun stokiyometrisinin kaba bir tahminine sahip olabilmesidir.Bu protokolün adımlarının çoğu oldukça standarttır ve bu videoya eşlik eden metin protokolü tarafından yeterince ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Burada, size görsel talimatlardan en çok yararlanan adımları göstermek istiyoruz. Metin protokolünde açıklandığı gibi transfekte edilmiş HEK293 hücrelerinin plakalarını hazırlayın.Plakalar buz üzerindeyken, ortamı aspire edin ve atın. Daha sonra, her bir plakanın köşesine dikkatlice iki mililitre DPBS ekleyin ve çözeltiyi yaymak için plakaları sallayın. Ardından DPBS'yi çıkarın ve atın.Daha sonra, her plakaya 100 mikrolitre lizis tamponu ekleyin. Plakayı eğin ve tamponu yaymak ve hücre lizatını serbest bırakmak için bir kazıyıcı kullanın. Daha sonra lizatları aspire edin ve buz üzerinde önceden soğutulmuş mikrofüj tüplerine aktarın ve 10 dakika bekleyin.Daha sonra, tüpleri santrifüjleyerek ve süpernatanları buz üzerindeki yeni tüplere aktararak kalıntısız hücre lizatlarını toplayın. Daha sonra Bradford testini kullanarak temizlenmiş lizatların protein konsantrasyonlarını ölçün. Konsantrasyon verileri için, jel analizi için 100 mikrolitrelik lizat numunesi hazırlayın.Aşırı eksprese edilen hemaglutinin Rab10'a kıyasla endojen Rab10'u ölçmek için daha yoğun lizatlar hazırlayın. Numunelerin hazırlanmasını, beş dakika boyunca 100 santigrat derecede inkübe ederek bitirin. Daha sonra numuneleri altı aya kadar veya daha uzun süre ihtiyaç duyulana kadar eksi 20 santigrat derecenin altında saklayın.Başlamak için, SDS-PAGE hücrelerini metin protokolüne göre hazırlayın. Ardından jeli tanka yükleyin ve bağlayıcı klipslerle sabitleyin. Daha sonra, tankı çalışan tamponla doldurun ve bir şırıngaya bağlı bir iğne kullanarak kuyucuklardaki ve jelin altındaki hava kabarcıklarını çıkarın.Şimdi numunelere manganez klorür ekleyin ve çökeltileri çıkarmak için döndürün. Daha sonra jeli eşit hacimlerde numune, aşırı eksprese edilmiş hemaglutinin Rab10'u analiz etmek için 10 mikrogram protein veya endojen Rab10'u analiz etmek için 30 mikrogram protein ile yükleyin. Boş şeritleri sampmanganez klorür içeren tampon.Ayrıca, numunelerle aynı hacimde olmasını sağlamak için moleküler ağırlık işaretleyicisini tampon ve manganez klorür ile destekleyin. Şimdi jeli 50 voltta çalıştırmaya başlayın. Örnek yığınından sonra, ayırma elde etmek için voltajı 120'ye yükseltin.Boya cephesi jellerin dibine ulaştığında voltajı kesin. Daha sonra, jeli aşağıdaki gibi üç kez yıkayın. Ayırma jelini, EDTA ve SDS eklenmiş temiz bir transfer tamponu banyosuna yükleyin.Daha sonra oda sıcaklığında 10 dakika çalkalayıcı üzerinde sallanmasına izin verin. Üç yıkamadan sonra, SDS eklenmiş ancak EDTA içermeyen transfer tamponu kullanarak bir yıkama daha yapın. Ardından jeli ıslak bir tank kullanarak aktarın.Depoyu buz gibi soğuk suyla dolu bir köpük kutuya yükleyin, depoyu bir güç kaynağına bağlayın ve aktarımı başlatın. Prosedür için verimli soğutma ile uzun bir transfer şarttır. Transferden sonra, membranı Ponceau S ile boyayarak transferi kontrol edin, ardından metin protokolüne göre TBST'de yıkayın.Ardından, bir blok uygulayın. Lekeyi sütlü TBST'ye batırın ve lekeyi oda sıcaklığında bir saat boyunca bir çalkalayıcı üzerinde sallayın. Daha sonra bloke edici solüsyonu çıkarın ve atın ve birincil antikor solüsyonunu uygulayın.Şimdi zarı gece boyunca dört santigrat derecede sallayın. Ertesi gün, birincil antikor çözeltisini çıkarın. Daha sonra membranı daha önce olduğu gibi üç kez taze TBST ile yıkayın.Yıkamalardan sonra, lekeyi ikincil antikor çözeltisine batırın ve zarı oda sıcaklığında yaklaşık bir saat boyunca bir külbütör üzerinde inkübe edin. İnkübasyondan sonra, zarı bir kez daha TBST ile üç kez yıkayın. Şimdi zarı geliştirin.Büyük bir plastik sargı tabakasına bir mililitre ECL çözeltisi ekleyin. Ardından zarı ECL'ye yerleştirin ve her iki tarafını da ıslatmak için hızlıca ters çevirin. Ardından, zarı kaldırın ve boşalmasına izin verin.Boşalttıktan sonra, fazla çözeltiyi emmeye yardımcı olmak için bir kenarın yaklaşık beş saniye boyunca bir kağıt havluya dokunmasına izin verin. Daha sonra zarı kırışıklık olmadan sert ve şeffaf bir filme sarın ve görüntüleme için siyah bir tepsiye aktarın. HEK293 hücreleri hemaglutinin Rab10 vahşi tip ve 3xFLAG-LRRK2 ile transfekte edildi.Ailesel Parkinson hastalığında inaktif olan vahşi tip kinaz, LRRK2 mutasyonları test edildi. LRRK2 ve Rab10'un birlikte aşırı ekspresyonu, P-tag jelinde büyük bir bant kaymasına neden oldu. Buna karşılık, bir kinaz inaktif mutant ile birlikte ekspresyon, Rab10 hareketliliğinde herhangi bir değişikliğe neden olmadı ve bu da bant kaymasının nedeni olarak kinazı ima etti.Ayrıca beklendiği gibi, ailesel PD mutasyonlarının tümü bant kaymasını artırdı. P-tag jel sistemi, bir LRRK2 inhibitörü ile tedavi edilen fare 3T3-İsviçre albino embriyonik fibroblast hücrelerini analiz etmek için de kullanıldı. Fosforile endojen Rab10'a karşılık gelen bant kayması, hücreler GSK2578215A ile tedavi edildiğinde kayboldu.Aynı test, insan A549 hücreleri kullanılarak da gerçekleştirildi. Bu deneylerde, LRRK2 inhibitörünün etkinliği, LRRK2 inhibisyonunun iyi bilinen bir belirteci olan anti-p serin 935 LRRK2 antikoru kullanılarak doğrulandı. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, transferden önce jelleri yıkamak için olan normal bir western blotting prosedürüne kıyasla sadece 14 dakikaya ihtiyaç duyar.Bu prosedürü takiben, FPD mutantlarının aynı Rab10 kalıntısını fosforile edip etmediği gibi ek soruları yanıtlamak için kütle spektrometresi gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, Parkinson araştırmaları alanındaki araştırmacıların, kültürlerdeki hücrelerde ve dokularda Rab10 fosforilasyonunun endojen seviyelerini keşfetmelerinin yolunu açtı. Lizis tamponuna eklenen mikrosistin ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve hücre lizatlarını hazırlarken her zaman uygun kişisel koruyucu ekipman giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.

rab10-phosphorylation-detection-lrrk2-activity-using-sds-page-with

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Lösin Zengin Kinaz 2 tekrarlayın büyük bir multidomain kinaz, mutasyonlar olan Parkinson hastalığı, en sık rastlanan genetik nedenidir. Bu protein kinaz aktivitesinin analizi, biyoloji ve bu protein disfonksiyonu anlamada çok önemli bir araç olduğu kanıtlanmıştır. Bu...

LRRK2 Kinaz Aktivitesi Assaying In vitro</em

Bu video, tek moleküllü bir aşağı çekme testi kullanarak protein fosforilasyonunun hassas bir miktar belirleme tekniğini göstermektedir. Polietilen glikol-biyotinin işlevselleştirilmesi ve etiketli antikorların kullanılması, fosforile tirozinin özgüllük ile saptanmasını arttırır.

Protein Fosforilasyon Analizi için Tek Moleküllü Aşağı Çekme Testi: Hücre Lizatında Protein Fosforilasyonunu Ölçmek İçin Yüksek Verimli Bir Teknik

Lösin açısından zengin tekrar kinazlar 1 ve 2 (LRRK1 ve LRRK2) GTPaz ve kinaz alanları hem kodlama yapan ve hücrelerde fosforile edilmiş olan alanlı proteinlerdir. Burada, bu şekilde genel hücresel fosforilasyonunu seviyelerini ölçmek için bir araç sağlayan 32P ortofosfat ile hücrelerde LRRK1 ve LRRK2 etiketlemek için bir protokol mevcut.

Lösin zengin metabolik etiketleme Fosfat ile radyoaktif Kinazlar 1 ve 2, tekrar

Burada, IRF3 transkripsiyon faktörünün fosforilasyona bağlı aktivasyonunun ayrıntılı bir analizine izin veren bir prosedürü açıklıyoruz. Bu, yüksek çözünürlüklü bir SDS-PAGE ve çoklu fosfospesifik antikorlar kullanılarak immünoblotlara bağlı bir doğal PAGE'nin kombinasyonu ile elde edilir.

Bir Yüksek Çözünürlüklü Yöntem IRF3 fosforilasyonu bağımlı Aktivasyon Monitör

Peptid rekabet testleri, çeşitli moleküler ve immünolojik deneylerde yaygın olarak kullanılır. Bu makale , in vitro oligopeptitle rekabet eden kinaz testi için ayrıntılı bir yöntem ve ilgili fosforilasyon sitelerini bulmak için yararlı olabilen ilişkili validasyon prosedürlerini açıklamaktadır.

Fosforilasyon Saha Tespiti İçin Oligopeptide Rekabet Testi

Lösin bakımından zengin tekrarlayan kiaz 2 genindeki (LRRK2) mutasyonlar kalıtsal Parkinson hastalığına neden olur. İnsan periferik kan nötrofillerinde Rab10'un LRRK2 kontrollü fosforilasyonunun değerlendirilmesi için kolay ve sağlam bir yöntem geliştirdik. Bu artmış LRRK2 kinaz yolu aktivitesi olan bireylerin belirlenmesine yardımcı olabilir.

Rab10 Fosforilasyon Değerlendirilmesi tarafından Parkinson İlişkili LRRK2 Kinas yolu Sorgulama için İnsan Periferik Kan Nötrofil İzolasyon

Etiket, zenginleştirmek ve protein kinaz CK2 hücre lysate veya doku homogenate gibi karmaşık bir biyolojik örnekten yüzeylerde belirlemek için bu iletişim kuralını hedefidir. Bu yöntem CK2 Biyoloji benzersiz özelliklerini bu amaç için kaldıraç görevi yapar.

Kimliği roman CK2 kinaz yüzeylerde çok yönlü bir biyokimyasal yaklaşım kullanarak

Biz güçlü biyokimyasal yaklaşımlar kullanarak yeni bir kinaz protein karakterize: farklı hücre hatları ve dokularda adanmış spesifik antikor ile Batı Blot analizi, coimmunoprecipitation deneyler ile etkileşimler, Batı tarafından tespit kinaz aktivite Fosho spesifik antikor ve γ [32P] ATP etiketleme kullanarak Blot.

Yeni kinaz proteinin sağlam biyokimyasal yaklaşımlar kullanılarak moleküler düzeyde karakterize edilmesi

Bu protokol, ısmarlama bir taşınabilir FRET analizörü kullanarak Förster rezonans enerji transferi (FRET) sensörü verilerinin hızlı ve son derece hassas ölçümü açıklanır. Cihaz şeker içeriğinin pratik ve etkili bir değerlendirme sağlayan saptama hassasiyetini maksimuma kritik sıcaklık aralığında maltoz tespit etmek için kullanıldı.

Taşınabilir FRET Analyzer ile son derece hassas ve hızlı Floresan Algılama

Bu çalışma, asidik pH koşulları altında E. coli HdeB bir şaperon aktivitesinin karakterize edilmesi için, biyofiziksel, biyokimyasal ve moleküler teknikler tarif eder. Bu yöntemler, örneğin başarılı bir şekilde HdeA gibi diğer asit koruma şaperonlar için uygulanmış ve diğer şaperonlar ve stres koşullarında çalışmak için modifiye edilebilir.

pH bağımlı aktivitenin tespiti<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; İn Vitro</em&gt; ve<em&gt; İn Vivo</em

Öğrenin, fosfat bağlayıcı etiketli SDS-PAGE kullanarak LRRK2 tarafından Rab10 fosforilasyonunu nasıl tespit edeceğinizi. Bu yöntem, Parkinson hastalığı araştırmalarında mutasyon etkilerini incelemeye yardımcı olur.

Rab10 fosforilasyon algılama SDS-sayfa bir fosfat bağlayıcı etiketi ile kullanarak LRRK2 etkinliğini tarafından

Daha fazla video keşfet