Gerçek zamanlı 3D tek parçacık izleme için bir iletişim kuralı
January 3rd, 2018
İnşaat ve gerçek zamanlı 3D tek parçacık izleme mikroskop izleme Nano floresan yetenekli probları yüksek diffusive hızları ve düşük foton sayısı oranları bu protokolü ayrıntıları.
Bu protokolün genel amacı, gerçek zamanlı, 3 boyutlu, tek parçacık izleme mikroskobu uygulamaktır. Bu tekniğin temel avantajı, tek bir difüzyon nano ölçekli nesnenin foton sınırlı zamansal çözünürlükle sürekli olarak izlenebilmesidir. Bu teknik, tüm enfeksiyon süreci boyunca tek bir viryonu takip etmek gibi viroloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.
Cihazı optik bir masa üzerinde hazırlayın. Bu kurulum kalibrasyon için hazırdır. Temel bileşenler arasında 488 nanometre katı hal lazeri, ışının yolu boyunca uzanan iki elektro-optik deflektör, ayarlanabilir bir akustik gradyan lensi ve mikro ve nano konumlandırıcılara sahip bir numune aşaması bulunur.
Kurulumun bu şeması ek ayrıntılar sağlar. İşte numune aşamasına giden lazer ışını yolu. Elektro-optik deflektörler ve ayarlanabilir akustik lens, ışının yolu boyuncadır.
Bu cihazlar, numune aşamasında lazer noktasını dinamik olarak hareket ettirir. Numuneden alınan fotonlar bir çığ foto diyotu ile sayılır. Bir kamera parçacığın konumunu izler.
Numunenin konumu mikro ve nano kontrolörler kullanılarak ayarlanır. Alanda programlanabilir bir kapı dizisi, lazer noktasını, gerçek zamanlı parçacık konumu hesaplamasını, aşama geri bildirimini ve foton sayımını kontrol eder. İki numune hazırlanmalıdır.
Birincisi, fosfat tamponlu tuzlu su içinde seyreltilmiş 190 nanometre floresan boncuk gerektirir. Sabit bir partikül numunesi hazırlamak için bir kapak fişi kullanın. 400 mikrolitre boncuk solüsyonunu kapak fişinin üzerine yerleştirin.
Şimdi, serbest hareket eden parçacıklar örneğini üretin. Suda seyreltilmiş 110 nanometre floresan boncuk gerektirir. 400 mikrolitre çözeltiyi bir kapak kızağı üzerine yerleştirerek serbest hareket eden bir parçacık örneği oluşturun.
Sabit parçacık örneğini monte etmek için mikroskoba alın. Örnek, XY nano konumlandırıcı üzerindedir. Lazeri, fotoğraf dedektörünü, ışın hattı elemanları için kontrolörleri ve konumlandırıcıları açın.
Piezo nano konumlandırıcıyı kapalı bir döngüde çalıştırın. Ardından, floresan emisyon filtresini fotoğraf dedektörünün önünden çıkarın. Ardından, mikro konumlandırıcı ile numunenin z konumunu değiştirin.
Konum değiştikçe, lazerin yansımasının yoğunluğunu izlemek için fotoğraf dedektörünü kullanın. Objektif merceğin odak düzlemini belirlemek için yoğunluğu en üst düzeye çıkarın. Örnek odak düzlemindeyken, floresan emisyon filtresini değiştirin.
Şimdi, bilgisayar kontrol yazılımı ile çalışın. Örneği raster taramak için özel yazılım kullanın. İlk olarak, başlangıç ve bitiş arasındaki fark olan geniş bir tarama aralığı ayarlayın.
Burada, aralık Y'de 10 mikrometre ve X'te 10 mikrometredir.Ayrıca, her yönde büyük bir adım boyutu ayarlayın. Burada, 200 nanometre. Her iki Z alanını da odak düzleminin önceden tanımlanmış konumuna ayarlayın.
Taramaya basıldığında Raster taraması başlatılır. Taramayı başlatın. Yazılım, elektro-optik deflektörleri bir gece turunda çalıştırır, fotoğraf dedektöründen sayımları toplar, nano konumlandırıcıyı çalıştırır ve konum hesaplamaları yapar.
Tarama, yazılımda bir plata floresan yoluyla tanımlanabilen bir parçacık bulacaktır. Taramadaki her bölge için yazılım, elektro nesne saptırıcı taramasının merkezine göre X ve Y'deki parçacık konumunun tahminlerini de belirleyecektir. Parçacığı bulduktan sonra, etrafındaki tarama aralığını X ve Y'de iki mikrometreye küçültün.Ayrıca, her ikisi için de adım boyutunu 100 nanometreye düşürün.
Floresan odağı braketlemek için Z yönünde iki mikrometrelik bir tarama aralığı ekleyin. Z adım boyutunu 200 nanometre olarak ayarlayın. Floresan odağı bulmak için 3D tarama taramasını başlatın.
Taramadan üretilen veriler, ayarlanabilir akustik gradyan lensi açılmadan önce odak düzlemini gösterir. Kontrol yazılımındaki ayarlanabilir akustik lens ayarıyla çalışmaya devam edin. Önce bağlan'a tıklayın, ardından gücü açın.
Darbe ve geçit kontrolü bölümüne gidin, çıkış tetikleme modunu RGB'den çok düzlemli olarak değiştirin. Ardından, çıkış fazının değiştirilmesine izin vermek için tekrar RGB olarak değiştirin. Çıkış fazını sıfır derece, 90 derece ve 270 derece arasında ayarlamak için kaydırıcıları kullanın.
Ardından, frekans kontrolü bölümüne gidin. Orada, 68, 500 hertz'lik bir rezonans frekansı seçin. Ekranın üst kısmına gidin ve gelişmiş'i tıklayın.
Ardından, ayarlar sekmesini seçin. Yeni ekranda, sıfır sütununun maksimum frekansını bulun. Frekans arama aralığını değiştirmek için ayarlayın.
Tıklayın, kalibrasyonu kaydedin, ardından kalibrasyondan çıkın. Frekans kontrollerine dönün ve rezonans frekansını değiştirin. Kalibrasyonun etkili olması için hemen tekrar 68.500 hertz olarak değiştirin.
Genlik kontrolü bölümünde, genliği yavaşça %35'e yükseltmek için kaydırıcıyı kullanınBundan sonra, rezonansı kilitle'yi tıklayın. Frekans kilitlendiğinde, rezonansın kilidini aç'a tıklayın. Raster tarama yazılımına geri dönün.
X ve Y'deki parçacık merkezli iki mikrometre tarama aralığı girin.100 nanometrelik bir adım boyutu kullanın. Parçacığı, 200 nanometrelik bir adım boyutuyla Z'de dört mikrometre aralığında ortalayın. Elde edilen tarama görüntüsünde, parçacığı temsil eden aydınlatma bölgesi yaklaşık bir mikrometre genişliğindedir.
Buna dayanarak, XY ölçek parametresini, X ve Y'deki tahmini konumlar negatif 0,5 ila 0,5 mikrometre arasında olacak şekilde ayarlayın. Z ölçeği ile benzer bir prosedürden sonra, nano konumlandırıcıyı sıfır konumuna ayarlayın. Devam etmeden önce nano konumlandırıcıya giden gücü kapatın.
Sabit partikül numunesini serbestçe hareket eden partikül numunesi ile değiştirin. Ardından, tüm ekipmanın açık olduğundan emin olun. Piezo nano konumlandırıcıyı açık döngüde çalıştırın.
Bilgisayarda, ayarlanabilir akustik gradyan lens yazılımını daha önce olduğu gibi ayarlayın. Floresan emisyon filtresini fotoğraf dedektörüne giden yoldan çıkarın. Örnek Z konumunu değiştirerek ve kapak kaymasından lazer yansımasının yoğunluğunu en üst düzeye çıkararak odak düzlemini bulun.
Odak düzlemini bulduktan sonra, odak konumunu çözeltiye 15 mikrometre artırın. Floresan emisyon filtresini değiştirin. Özel izleme yazılımını açın.
Konum tahmin parametrelerini optimizasyon sırasında bulunan değerlere ayarlayın. Şimdi, nano konumlandırıcının tepki hızını belirleyen entegre kontrol sabitlerini ayarlayın. X sabiti ile başlayın.
Düşük bir değer girin ve yavaşça artırın. Parçacık konumu okumasında salınımlar başladığında, kontrol sabitinin değerini not edin. İntegral kontrol sabitini, salınımın başlangıcındaki değerinin yaklaşık %70'ine düşürün.
Y ve Z kontrol sabitleri ile adımları tekrarlayın. Parça eşiğini izlemeye başlamak için tetiği üç kilohertz'e ayarlayın. İzlemeyi sonlandırmak için tetikleyici olan minimum parça değerini 1,5 kilohertz olarak ayarlayın.
Aramayı ve ardından otomatik izlemeyi tıklayarak denemeyi başlatın. Bu film, sudaki 110 nanometre floresan nano parçacığın difüzyon hareketini izlemek için üç boyutlu, dinamik foton lokalizasyon izleme mikroskobunun kullanılmasının sonucunu göstermektedir. Nano konumlandırıcının konum okuması kullanılarak ölçülen parçacığın konumu, 3D eksenlerde gösterilir.
İç kısım, bilimsel deniz yosunu kamerasının okunmasıdır. Parçacığın, izleme sistemi tarafından odak hacminde kilitlendiğini gösterir. Parçacık izlendi ve konumu iki dakikadan fazla bir süre boyunca kaydedildi.
Bir kez ustalaştıktan sonra, sistem uygun şekilde hizalanmışsa ve kalibrasyon parametreleri ayarlanmışsa, bu teknik 50 dakikadan kısa sürede yapılabilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, ilaç dağıtımı alanındaki araştırmacıların, hücresel yükün içselleştirilmesi ve taşınması yollarını keşfetmelerine yardımcı olacaktır. Bu videoyu izledikten sonra, sıfır zamanlı, 3D tek parçacık izleme mikroskobunun nasıl çalıştırılacağını iyi anlamış olmalısınız.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, nanoölçekli floresan probları izlemek üzere tasarlanmış gerçek zamanlı, 3D, tek partikül izleme mikroskobunun uygulamasını ayrıntılandırmaktadır. Bu teknik, foton sınırlı koşullar altında bile, tek yayılım gösteren nesnelerin sürekli gözlemlenmesini sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikroskopi
- Tek partikül izleme
- Viroloji
Arka Plan
- Nanoölçekli parçacıkların gerçek zamanlı izlenmesi çeşitli bilim alanlarında kritik öneme sahiptir.
- Tek viryonların dinamiklerinin anlaşılması, enfeksiyon süreçleri hakkında bilgiler sağlayabilir.
- Bu teknik, yüksek yayılma hızındaki parçacıkların incelenmesi yetisini artırır.
- Foton sayımı sınırlamaları, gelişmiş optik kurulumlarla ele alınır.
Çalışmanın Amacı
- Gerçek zamanlı tek partikülleri izleyebilen bir mikroskop geliştirmek.
- Bireysel viryonları izleyerek viral enfeksiyonların incelenmesini kolaylaştırmak.
- Nanoölçekli nesnelerin izlenmesinde zamansal çözünürlüğü artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- 3D tek partikül izleme mikroskobunun inşası.
- 488 nanometre katı hal lazerin kullanımı.
- Elektro-optik deflektörler ve ayarlanabilir akustik gradyan lensin dahil edilmesi.
- Hassas konumlandırma ile optik bir masada aparatın kalibrasyonu.
Ana Sonuçlar
- Mikroskop, nanoölçekli floresan probları başarıyla izler.
- Düşük foton sayımı oranlarında parçacıkları izleme kabiliyeti gösterilmiştir.
- Enfeksiyon sırasında tek viryonların sürekli izlenmesini sağlamıştır.
- Viral süreçlerin dinamikleri hakkında bilgiler sağlamıştır.
Sonuçlar
- Bu protokol, gerçek zamanlı partikül izleme için sağlam bir yöntem kurar.
- Viroloji ve ilgili alanlarda araştırma için yeni yollardır açar.
- Teknik, viral davranışları anlamamızı önemli ölçüde geliştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Real-time 3D single particle tracking enables continuous monitoring of nanoscale objects under photon-limited conditions, addressing a critical gap in observing fast, three-dimensional cellular processes. This capability supports mechanistic de-risking in early discovery by providing high-resolution dynamic data on molecular interactions and trafficking pathways. The method enhances predictive confidence in target validation and lead identification by delivering quantitative, reproducible spatiotemporal data essential for informed go/no-go decisions in drug delivery and virology research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by tracking single virions or nanoparticles through infection processes with high spatiotemporal resolution.
- Operational Value: Provides functional target validation through direct observation of molecular dynamics in near-native environments.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by generating quantitative data on particle diffusion, binding, and transport kinetics under physiologically relevant conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative dependent variable measurements (position, trajectory, diffusion coefficient) essential for assay standardization and hit confirmation.
- Operational Value: Enables preparation of validated biological systems for downstream screening via precise 3D localization and tracking of fluorescent probes.
- Scalability: Supports platform reuse through robust single-excitation/single-detection layout and calibrated electro-optic and acoustic gradient lens control.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical work by enabling real-time observation of cellular cargo internalization and transport pathways relevant to drug delivery.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in viral entry and intracellular trafficking models through direct visualization of single-particle behavior in solution.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by providing reproducible, high-fidelity data on nanoparticle behavior under low photon flux conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, particularly for studies requiring dynamic, nanoscale resolution in three dimensions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling continuous tracking of single particles in 3D space under physiological mimicry.
- Screening: Enhances assay readiness through reproducible particle localization and tracking, facilitating reliable compound or nanoparticle evaluation.
- Analytics: Generates quantitative outputs (position, velocity, confinement) that allow objective comparison of experimental conditions and therapeutic candidates.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling drug delivery pathways and viral infection dynamics in biologically relevant systems.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform capability due to its modular optical layout, calibration protocol, and adaptability to different sample types and tracking objectives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in nanoscale biological processes.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through calibrated raster scanning, position estimation algorithms, and feedback-controlled nano-positioning.
- Strategic Value: Improves capital efficiency and reduces late-stage biological risk by enabling early, data-driven decisions on target druggability and delivery mechanism feasibility.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantitative, high-resolution tracking data that inform advancement criteria in drug delivery and antiviral development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical alignment, laser safety, and real-time control systems including FPGA-based feedback loops.
- Depends on specialized instrumentation: 488 nm solid-state laser, 2D electro-optic deflectors, tunable acoustic gradient lens, avalanche photodiode, and nano-positioning stages.
- Necessitates cross-team standardization for calibration protocols, position estimation parameters, and integral control constant tuning across users and labs.
- Involves adaptation considerations when transitioning from fixed bead samples to freely moving particles in viscous or complex biological media.
- Practical limitations include sensitivity to photon count rates and the need for careful optimization of tracking thresholds (e.g., 3 kHz start, 1.5 kHz end) to maintain lock-on under low-signal conditions.
