Name: Gerçek zamanlı 3D tek parçacık izleme için bir iletişim kuralı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Keşfedin gerçek zamanlı 3D tek parçacık izleme mikroskobunu, nanometre ölçekli floresan prob ve virionları sürekli gözlemlemek için. Bu yöntem, düşük foton sayılarında bile yüksek zamansal çözünürlük sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser tarafından Ulusal Genel tıbbi Bilimler Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri Ödülü numarası R35GM124868 altında ve Duke Üniversitesi tarafından desteklenmiştir.

1. Kur düzeni ve uyum
<ol>
	<li>Lazer yükleme ve kolimasyon izleme uyarma<ol>
		<li>Lazer optik tabloda bir ev inşa bağlama yoluyla yapıştırmayın. Montaj delikleri lazer baş ve optik tablo için montaj ile basit alüminyum plakadır. Lazer sıkıca istikrar ve ısı dağıtımı için metal bir takma iliştirilmesi gerekir. Dalga boyu belirli bir fluorophore uygun veya deneme için seçilmiş olsa bu iş için 488 nm katı hal lazer aydınlatma (şekil 1) için kullanın. Lazer dalga boyu öncelikle iki yansıtıcılar arasında dalga plaka belirlenir 2D-EOD çalışma aralığı uygun önemli bir faktördür (şekil 1: W2). 488 nm lazer etkili ortak Floresan Etiketler canlı hücre deneylerde olan yeşil veya sarı floresan protein (GFP/YFP), heyecanlandırmak.</li>
		<li>Lazer ışını yükseklik ve Dielektrik aynalar bir çift kullanarak yönünü ayarlamak (şekil 1: M). lazer ışını optik tabloya paralel olduğundan emin olun ve uygun yüksekliğe ayarlayın. Not: Yüksekliği mikroskop platformu dayalı seçilmelidir. Açıkça değil belirtilecektir rağmen bu yükseklik bu protokol için kullanılan tüm sonraki aynalar için sağlanmalıdır.</li>
		<li>Bir çift lens ile ışın collimate (şekil 1: L1 ve L2). Lensler odak uzunlukları 2D EOD diyafram tarafından kırpılan lazer nokta önlemek için dikkatle seçilmelidir. Kırpma 2D EOD geçtikten sonra değişiklik lazer ışını şekli ile belirgindir. Burada kolimasyon kalitesi çok önemli çünkü anomalileri tarafından sonraki lensler AMPLİFİKATÖRLÜ olacaktır ve herhangi bir sapma 2D-EOD saptırma performansı bozulacaktır. İdeal olarak, ışın demeti bir noktaya en az 20 m odaklanarak collimate.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bir iğne deliği yerleştirin (şekil 1: PH) ilk kolimasyon lens odak, uygun büyüklükte (şekil 1: L1).<ol>
		<li>Uygun ölçekli bir iğne deliği seçin. İğne deliği boyutu aşağıdaki hesaplama göre seçilebilir: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56711/56711eq1.jpg"> Lazer, dalga boyu λ nerede f ilk lens odak uzaklığı ise D giriş ışın çapı.</li>
		<li>İğne deliği ve sondaj ilk kolimasyon lens odak tam olarak yerleştirilebilir bir 3B Çevirme sahnede bağlarsınız.</li>
		<li>İğne deliği ve sondaj konumunu ayarlamak. Lazer güç metre sonra iğne deliği yerleştirin ve XYZ güç metre okuma en üst düzeye çıkarmak için iğne deliği konumu ayarlayın. Kırınım halkası gözlem yapılırsa, 2D-EOD önce yerleştirilen bir iris ile engelleyiniz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montajı Glan-Thompson polarize<ol>
		<li>Glan-Thompson polarize koymak (şekil 1: GP) sonra ikinci kolimasyon lens (şekil 1: L2) lazer ışını kutuplaşma temizlemek için. En fazla iletim ile yeti ölçme aygıtı bulmak için polarize döndürün.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>EODs kurulumu<ol>
		<li>2 EODs kullanın (şekil 1: EOD1 &amp; EOD2) X ve Y yönde lazer saptırmak için. Lazer iletim yaw, zift ve her EOD yüksekliğini ayarlayarak en üst düzeye çıkarmak.</li>
		<li>İki EODs saygı ile her yansıtıcı kenarında üretici tarafından sağlanan hizalama işaretçisi kullanarak hizalayın.</li>
		<li>Bir sınama deseni EOD çıktısını denetlemek için 2D EOD denetleyicisine uygulamak. Bu da aşağıda açıklanan FPGA veya basit bir sinüs dalga bir işlev üreteci tarafından sağlanan üzerinden şövalyenin tur (Şekil 2) olabilir. En iyi performans için her yansıtıcı tarafından saptırma piezo nanopositioner X ya da Y yönünü paralel olmalıdır. Bu yönde iletim eksen yansıtıcılar açısal yönünü tarafından dikte edilir. 2D EOD hareket ettirmeden saptırma yönde döndürmek için piezo nanopositioner eksenleri saptırma eksenleri hizalamak için 2D EOD sonra bir güvercin prizma yerleştirin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Yarım dalga plaka yükleme<ol>
		<li>Bir yarı-dalga tabak yerleştirin (şekil 1: W1) Glan-Thompson polarize arasında (şekil 1: GP) ve gelen lazer hizalamak için 2D EOD 2D EOD saptırma eksen ile polarizasyon ışınlayın. Uzun odak lens (300 mm) 2D-EOD sonra yerleştirin ve sCMOS fotoğraf makinesini de lazer odak yerleştirin. Daha sonra (Şekil 2) açıklanan şövalyenin Tur oluşturmak için 2D EOD açın. Bir eşit kare lazer dağıtım fotoğraf makinesinde gözlenen kadar yarım dalga plaka döndür.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Objektif çift ve geçiş objektif çift sokmaksızın bir kiriş montajı<ol>
		<li>Lensler bir çift koyun (şekil 1: L3 ve L4) sonra objektif lens arka diyafram doldurmak için ışın genişletmek için 2D EOD (şekil 1: OL) ve başka bir çift lens (şekil 1: L5 ve L6) için geçiş için mikroskop objektif odak düzlemi. ETİKET objektif bir sonraki adımda aralarında yüklü olarak lensler bu iki çift arasında yeterli yer bıraktığınızdan emin olun.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dikroik filtre, 10/90 ışın bölücü, objektif, APD, objektif lens ve floresan emisyon filtre algılama yolu tamamlamak için odaklanarak yükleyin.<ol>
		<li>Dikroik filtre kurun (şekil 1: DC) lazer objektif lens doğru yansıtacak. Düz bir uzun lens tüp alt ve üst iki süsen kullanarak objektif lens Merkezi aracılığıyla gitmek için lazer hizalayın.</li>
		<li>10/90 ışın splitter kurun (şekil 1: BS) tarafından hangi % 10'u ışık görüntüleme için bir sCMOS kamera (aşağıda açıklanmıştır) ve takibi için APD için üzerinden geçer yüzde 90'ını yansıtır.</li>
		<li>APD hizalayın. Bir coverslip üzerine lazer tarafından objektif lens odak. Coverslip gelen yansıma tüm alt öğeleri de objektif odak bir coverslip koyarak ve APD okuma yoğunluğunu kontrol hizalamak için kullanın. Işın splitter sonra objektif odak APD kurun (şekil 1: L7) APD tarafından bir 3B Çevirme Sahne Alanı'nda izledi. Öyle ki amaç lazer yansımayı lens merkezinden gider objektif getirin.</li></ol></li></ol>APD pozisyon coverslip lazer yansıması dan yoğunluğu en üst düzeye çıkarmak için 3B konumlandırma ayarlayarak optimize edilebilir. Ne zaman bir hareket dedektörü konumu herhangi bir yönde yoğunluğu azalır en uygun konumda APD konumdur.
		<li>Longpass floresan emisyon filtre kurun (şekil 1: F) yansıyan ve dağınık ışık kaldırmak için ışın ayırıcı önce.</li>
	
	
	<li>Yükleme etiketi lens<ol>
		<li>ETİKET objektif lensler iki çift arasında yer ( şekil 1arasında: L4 ve L5) olarak daha önce bahsedilen ve gösterilen şekil 1. Öyle ki ışın dik merkezi etiketi lens aracılığıyla geçer yaw, pitch, yükseklik ve yatay pozisyon ayarlayın.</li>
	</ol>
	</li>

2. numune hazırlama.
<ol>
	<li>Sabit parçacık hazırlık<ol>
		<li>190 nm floresan boncuk için seyreltik ~ 5 × 108 boncuk/mL PBS içinde. Piezoelektrik sahne örnek sahibinin 400 µL boncuk çözüm coverslip ve bağlama üzerine ekleyin (Boncuk hacmi örnek tutucu üzerinde bağlıdır; burada kullanılan örnek sahibi odası çapı 18 mm olduğunu). Burada kullanılan boncuklar için PBS üzerinde coverslip yatırmak parçacıklar neden olur.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ücretsiz hareketli parçacık hazırlık<ol>
		<li>110 nm floresan boncuk için seyreltik ~ 5 × 108 boncuk/mL DI su ile. 400 µL boncuk çözüm bir coverslip üzerine ekleyin ve piezoelektrik sahne örnek tutucu monte.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. izleme parametrelerini optimize edin
<ol>
	<li>Raster tarama sabit parçacıklar<ol>
		<li>Sabit parçacık örnek mikroskobunun koymak.</li>
		<li>Lazer, micropositioner denetleyicisi, piezo nanopositioner denetleyicisi, etiket objektif denetleyicisi ve EOD denetleyicisi üzerinde açın. Not sırası önemli değildir. Piezo nanopositioner kapalı döngüde çalışacak.</li>
		<li>Raster tarama 2D-bomba imha bir şövalyenin tur (Şekil 2) sürücüler, APD sayıları toplar, piezo sürücüler bir özel tarama yazılım programı (Şekil S3, yazılım yazarlar gelen istek üzerine mevcuttur), kullanarak XYZ örnek nanopositioner ve pozisyon hesaplama (Şekil S2) gerçekleştirir. Adım boyutudur 40 nm ve tarama aralığı olduğunu 2 µm.<ol>
			<li>Coverslip de objektif odak yerleştirmek için Floresans emisyon filtreyi kaldırmak ve lazer coverslip gelen yansıma micropositioner Z konumunu bir fonksiyonu olarak sinyal şiddeti en üst düzeye çıkarmak için kullanın. Odak düzlemi, örnek yerleştirdikten sonra Floresans emisyon filtre geri yerleştirin.</li>
			<li>Tarama programını açın. Tarama aralığı ve adım boyu 'Başlat', 'son' ve 'adım' sayıyı yazarak ayarlayın. Önce bir büyük tarama aralığı ve bir parçacık (örneğin, 10 x 10 µm Aralık 200 nm adım boyu ile) bulmak için adım boyu ayarlayın. Parçacık bulma sonra tarama aralığı daraltmak ve adım boyu (örneğin, 2 x 2 µm Aralık 100 nm adım boyu ile) azaltın. Floresan odak bulmak için 3D raster tarama gerçekleştirmek için 'Tarama' düğmesini tıklatın.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>(Ayrıca bkz: şekil 3) etiket objektif ayarları<ol>
		<li>ETİKET objektif kontrol yazılımı üzerinde'yi tıklatın. ', 'Güç' Bağlan' sırayla tıklatın.</li>
		<li>Tetikleyici sinyalleri çıktı aşaması değiştirmek için çıkış tetik modunu değiştirmek gereklidir. Önce 'Multiplane' dan 'RGB' moduna değiştirin ve sonra tekrar değiştir. Şimdi aşama olabilir (şekil 3b) değişti.</li>
		<li>Çıkış Faz 0 °, 90 ° ve 270 ° olarak ayarlayın. Faz uzayı kapsayan herhangi bir üç aşamada kullanılabilir ise, bu üç de ampirik çalışmaya bulunur (şekil 3 c).</li>
		<li>68,500 Hz frekans ayarı seçin.</li>
		<li>Uygun frekans bulmak için genellikle frekans arama aralığı değiştirmek gereklidir. ', 'Ayarı' İleri' seçeneğini tıklatın. Değişim ' Max. Freq(Hz)' sütun 0 70.000 Hz 71,500 Hz. Bu-ebilmek var olmak ayarlamak ne olursa olsun frekans aralığı uygundur. Tıklayın 'Kalibrasyon Kaydet', 'Exit kalibrasyon' (şekil 3d).</li>
		<li>Yeni bir ayar etkin kılmak için başka bir frekans (örneğin, 189,150 Hz) rezonans geçin ve sonra 68,500 Hz frekans ayarları geri (şekil 3e) değiştirdim.</li>
		<li>Genlik yavaş yavaş % 35'e değiştirin. 'Rezonans kilitle' tıklatın. Frekans kilitlendikten sonra 'Rezonans' (şekil 3e) kilidini aç'ı tıklatın. ETİKET objektif artık kullanıma hazırdır.</li>
		<li>F. tarama aralığını x, y giriş kalibre, tahmininde tahmini konumu şekil 4eiçinde gösterildiği gibi gerçek konumuna eşit hale getirmekte kullanılan parametrelerini değiştirmek için ve z ve o zaman tıkırtı 'Tarama' düğme taşımak için XYZ örnekte taramak için parçacık hareketli lazer nokta üzerinden. Lazer odak taranmış parçacık konumunu konum tahmini döngü (Şekil S1) tarafından belirlenen tahmini parçacık pozisyonla anlaşmalıdırlar. Tahmini konumu ve gerçek konumu (şekil 4 d) arasındaki ilişki (şekil 4f) tahmini konumu görüntülerden elde edilebilir. Pozisyonlar kabul etmiyorsanız, konum tahmini döngü (Şekil S1) kullanılan lazer pozisyon (ck) değerlerini ayarlamak.</li>
		<li>ETİKET objektif Hizala<ol>
			<li>ETİKET objektif denetleyicisi kapalıyken, raster (aşağıda açıklanmıştır) parçacık görüntüleri etiketi lens takmadan önce ve sonra yükleme etiketi objektif aynı görünmelidir alınan inceden inceye gözden geçirmek. Ardından, floresan parçacık Z yığın amacı konumu ve etiket lens (şekil 4) açısını ayarlamak için z nanopositioner ile hareket ettirerek tarama gerçekleştirin. Kalmayıncaya kadar hiçbir drift parçacık Albümdeki parçacık XY pozisyonu Z konumunu (şekil 4 d) bir fonksiyonu olarak herhangi bir değişiklik olduğunda elde Z yönünde boyunca XY düzlemde etiketi objektif konumunu ayarlamak. İzleme sistemi etiketi objektif hizalamasını sonra kullanıma hazırdır.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Parçacık izlemek için sCMOS kamera kurulumu<ol>
		<li>Onlar izleniyorsa iken parçacıklar görselleştirmek için bir sCMOS kamera yükleyin. Sonra sadece tüm bileşenleri izleme sisteminin optimize ile yüklenip sCMOS yükleyin.</li></ol></li></ol>Sabit floresan parçacık örnek mikroskop üzerine yük ve objektif odak hacminde bir parçacık kilitlemek için izleme programını çalıştırın. Daha sonra 100 mm odak uzaklığı objektif yükleyin (şekil 1: L8) ve sCMOS. Böylece görüntü parçacık en küçük ve en parlak noktanın üzerine odaklanmıştır sCMOS pozisyonunu ayarlayýn.
	
	

4. serbestçe nano tanecikleri Difüzyon gerçek zamanlı 3D izleme
<ol>
	<li>Yerine 110 nm ücretsiz parçacık örnek üzerinde mikroskop hareket.</li>
	<li>Lazer, mikro-Pozisyoner denetleyicisi, piezo nanopositioner denetleyicisi, etiket objektif denetleyicisi ve EOD denetleyicisi açın. Piezo nanopositioner açık döngüde çalışacak. ETİKET lens yazılım adım 3.2 göre ayarlayın.</li>
	<li>Açın ve izleme yazılımı (yazarlar gelen istek üzerine mevcuttur) çalıştırın. Konumu, Bölüm 3'te bulunan en iyi duruma getirilmiş değerlerine tahmini parametreleri ayarlayın.</li>
	<li>Coverslip de objektif odak yerleştirmek için Floresans emisyon filtreyi kaldırmak ve lazer coverslip gelen yansıma micropositioner Z konumunu bir fonksiyonu olarak sinyal şiddeti en üst düzeye çıkarmak için kullanın. Coverslip bulduktan sonra lazer coverslip uzak ve çözüm içine odaklanmak için odak pozisyon 15 µm artırın. Floresans emisyon filtre geri yer.</li>
	<li>Dahili kontrol sabitler ayarlayın. Dahili kontrol sabitler düşük bir değer başlangıç ve salınım parçacığın konum dökümanları içinde görülebilir kadar yavaş yavaş artan ayarlayabilirsiniz. Salınımlarını gözlenen sonra dahili kontrol sabitler titreşimler neden değeri % 80'i için ayarlayın. Tipik değerleri 0.012 XY 'ayrılmaz kazanç' ve 'ayrılmaz kazanç' Z için 0,004 civarında olacak.</li>
	<li>İzleme eşikleri 'Parça eşik' ve 'Parça en az' ve 'Ara' ve 'Auto Track' tıklayarak izleme deneme başlayın. Eşik Sonlandırıcı takibi için biraz arka plan düzeyi daha yüksek ayarlanır ve izleme tetikleme için eşik yaklaşık iki kat arka plan daha yüksektir. Burada, izleme tetikleme için eşik 3 kHz ve yörünge sona erdirmek için eşik 1.5 kHz.</li>
</ol>

<ol><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Methods. 3 (10), 793-796 (2006).</li>
<li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319 (5864), 810-813 (2008).</li>
<li>Jones, S. A., Shim, S. H., He, J., Fast Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+three-dimensional+super-resolution+imaging+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells.</a> Nat. Methods. 8 (6), 499-505 (2011).</li>
<li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).</li>
<li>Shtengel, G., Galbraith, J. A., Galbraith, C. G., Lippincott-Schwartz, J., Gillette, J. M., Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferometric+fluorescent+super-resolution+microscopy+resolves+3D+cellular+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 3125-3130 (2009).</li>
<li>Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Intracellular+Fluorescent+Proteins+at+Nanometer+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+photoactivated+localization+microscopy+of+nanoscale+adhesion+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics.</a> Nat. Methods. 5 (5), 417(2008).</li>
<li>Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+3D+microscopy+of+live+whole+cells+using+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination.</a> Nat. Methods. 8 (12), 1044(2011).</li>
<li>Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+video+microscopy+of+live+cells+by+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination.</a> Nat. Methods. 6 (5), 339(2009).</li>
<li>Schermelleh, L., Carlton, P. M., Haase, S., Shao, L., Winoto, L., Kner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdiffraction+multicolor+imaging+of+the+nuclear+periphery+with+3D+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy.</a> Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198, 82-87 (2000).</li>
<li>Persson, F., Bingen, P., Staudt, T., Engelhardt, J., Tegenfeldt, J. O., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Nanoscopy+of+Single+DNA+Molecules+by+Using+Stimulated+Emission+Depletion+%28STED%29%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Nanoscopy of Single DNA Molecules by Using Stimulated Emission Depletion (STED).</a> Angew. Chem. 50 (24), 5581-5583 (2011).</li>
<li>Hein, B., Willig, K. I., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulated+emission+depletion+%28STED%29+nanoscopy+of+a+fluorescent+protein-labeled+organelle+inside+a+living+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Stimulated emission depletion (STED) nanoscopy of a fluorescent protein-labeled organelle inside a living cell.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14271-14276 (2008).</li>
<li>Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy+with+diffraction+resolution+barrier+broken+by+stimulated+emission%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (15), 8206-8210 (2000).</li>
<li>Welsher, K., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-resolution+3D+visualization+of+the+early+stages+of+cellular+uptake+of+peptide-coated+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nano%22%5BJournal%5D)">Multi-resolution 3D visualization of the early stages of cellular uptake of peptide-coated nanoparticles.</a> Nat. Nano. 9 (3), 198-203 (2014).</li>
<li>Welsher, K., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+behavior+of+molecules+in+biological+systems%3A+breaking+the+3D+speed+barrier+with+3D+multi-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Faraday+Discuss%22%5BJournal%5D)">Imaging the behavior of molecules in biological systems: breaking the 3D speed barrier with 3D multi-resolution microscopy.</a> Faraday Discuss. 184 (0), 359-379 (2015).</li>
<li>Xu, C. S., Cang, H., Montiel, D., Yang, H. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jp0671796">Rapid and quantitative sizing of nanoparticles using three-dimensional single-particle tracking.</a> J. Phys. Chem. C. 111 (1), 32-35 (2007).</li>
<li>Cang, H., Xu, C. S., Montiel, D., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guiding+a+confocal+microscope+by+single+fluorescent+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Guiding a confocal microscope by single fluorescent nanoparticles.</a> Opt. Lett. 32 (18), 2729-2731 (2007).</li>
<li>Cang, H., Wong, C. M., Xu, C. S., Rizvi, A. H., Yang, H. <a target="_blank" href="http://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.2204652">Confocal three dimensional tracking of a single nanoparticle with concurrent spectroscopic readouts.</a> Appl. Phys. Lett. 88 (22), 223901(2006).</li>
<li>Han, J. J., Kiss, C., Bradbury, A. R. M., Werner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-Resolved%2C+Confocal+Single-Molecule+Tracking+of+Individual+Organic+Dyes+and+Fluorescent+Proteins+in+Three+Dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Time-Resolved, Confocal Single-Molecule Tracking of Individual Organic Dyes and Fluorescent Proteins in Three Dimensions.</a> ACS Nano. 6 (10), 8922-8932 (2012).</li>
<li>Wells, N. P., Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Phipps, M. E., Cutler, P. J., Lidke, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-Resolved+Three-Dimensional+Molecular+Tracking+in+Live+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Time-Resolved Three-Dimensional Molecular Tracking in Live Cells.</a> Nano Lett. 10 (11), 4732-4737 (2010).</li>
<li>Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Werner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tracking+of+individual+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tracking of individual quantum dots.</a> Appl. Phys. Lett. 91 (22), (2007).</li>
<li>McHale, K., Mabuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramolecular+Fluorescence+Correlation+Spectroscopy+in+a+Feedback+Tracking+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Intramolecular Fluorescence Correlation Spectroscopy in a Feedback Tracking Microscope.</a> Biophys. J. 99 (1), 313-322 (2010).</li>
<li>McHale, K., Mabuchi, H. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja906979j">Precise Characterization of the Conformation Fluctuations of Freely Diffusing DNA: Beyond Rouse and Zimm.</a> J. Am. Chem. Soc. 131 (49), 17901-17907 (2009).</li>
<li>McHale, K., Berglund, A. J., Mabuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+Dot+Photon+Statistics+Measured+by+Three-Dimensional+Particle+Tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Quantum Dot Photon Statistics Measured by Three-Dimensional Particle Tracking.</a> Nano Lett. 7 (11), 3535-3539 (2007).</li>
<li>Juette, M. F., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Tracking+of+Single+Fluorescent+Particles+with+Submillisecond+Temporal+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Tracking of Single Fluorescent Particles with Submillisecond Temporal Resolution.</a> Nano Lett. 10 (11), 4657-4663 (2010).</li>
<li>Katayama, Y., Burkacky, O., Meyer, M., Bräuchle, C., Gratton, E., Lamb, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Nanomicroscopy+via+Three-Dimensional+Single-Particle+Tracking%5BTitle%5D)+AND+%22ChemPhysChem%22%5BJournal%5D)">Real-Time Nanomicroscopy via Three-Dimensional Single-Particle Tracking.</a> ChemPhysChem. 10 (14), 2458-2464 (2009).</li>
<li>Perillo, E. P., Liu, Y. -L., Huynh, K., Liu, C., Chou, C. -K., Hung, M. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+and+high-resolution+three-dimensional+tracking+of+single+particles+using+nonlinear+and+multiplexed+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Deep and high-resolution three-dimensional tracking of single particles using nonlinear and multiplexed illumination.</a> Nat Commun. 6, (2015).</li>
<li>Hou, S., Lang, X., Welsher, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+real-time+3D+single-particle+tracking+using+a+dynamically+moving+laser+spot%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Robust real-time 3D single-particle tracking using a dynamically moving laser spot.</a> Opt. Lett. 42 (12), 2390-2393 (2017).</li>
<li>Chenouard, N., Smal, I., de Chaumont, F., Maska, M., Sbalzarini, I. F., Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Objective+comparison+of+particle+tracking+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Objective comparison of particle tracking methods.</a> Nat Meth. 11 (3), 281-289 (2014).</li>
<li>Shechtman, Y., Weiss, L. E., Backer, A. S., Sahl, S. J., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+3D+scan-free+multiple-particle+tracking+over+large+axial+ranges+with+Tetrapod+point+spread+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Precise 3D scan-free multiple-particle tracking over large axial ranges with Tetrapod point spread functions.</a> Nano Lett. 15 (6), 4194-4199 (2015).</li>
<li>Lee, H. -lD., Sahl, S. J., Lew, M. D., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+double-helix+microscope+super-resolves+extended+biological+structures+by+localizing+single+blinking+molecules+in+three+dimensions+with+nanoscale+precision%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">The double-helix microscope super-resolves extended biological structures by localizing single blinking molecules in three dimensions with nanoscale precision.</a> Appl. Phys. Lett. 100 (15), 153701(2012).</li>
<li>Pavani, S. R. P., Thompson, M. A., Biteen, J. S., Lord, S. J., Liu, N., Twieg, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional%2C+single-molecule+fluorescence+imaging+beyond+the+diffraction+limit+by+using+a+double-helix+point+spread+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional, single-molecule fluorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 2995-2999 (2009).</li>
<li>Sancataldo, G., Scipioni, L., Ravasenga, T., Lanzanò, L., Diaspro, A., Barberis, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.osapublishing.org/optica/abstract.cfm?uri=optica-4-3-367">Three-dimensional multiple-particle tracking with nanometric precision over tunable axial ranges.</a> Optica. 4 (3), 367-373 (2017).</li>
<li>Balzarotti, F., Eilers, Y., Gwosch, K. C., Gynnå, A. H., Westphal, V., Stefani, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanometer+resolution+imaging+and+tracking+of+fluorescent+molecules+with+minimal+photon+fluxes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes.</a> Science. 355 (6325), 606(2017).</li>
<li>Duocastella, M., Theriault, C., Arnold, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+particle+tracking+via+tunable+color-encoded+multiplexing%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional particle tracking via tunable color-encoded multiplexing.</a> Opt. Lett. 41 (5), 863-866 (2016).</li>
<li>Duocastella, M., Sun, B., Arnold, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+imaging+of+multiple+focal+planes+for+three-dimensional+microscopy+using+ultra-high-speed+adaptive+optics%5BTitle%5D)+AND+%22BIOMEDO%22%5BJournal%5D)">Simultaneous imaging of multiple focal planes for three-dimensional microscopy using ultra-high-speed adaptive optics.</a> BIOMEDO. 17 (5), (2012).</li>
<li>Mermillod-Blondin, A., McLeod, E., Arnold, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+varifocal+imaging+with+a+tunable+acoustic+gradient+index+of+refraction+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">High-speed varifocal imaging with a tunable acoustic gradient index of refraction lens.</a> Opt. Lett. 33 (18), 2146-2148 (2008).</li>
<li>Wang, Q., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+strategy+for+trapping+single+fluorescent+molecules+in+solution+using+the+ABEL+trap%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+B%22%5BJournal%5D)">Optimal strategy for trapping single fluorescent molecules in solution using the ABEL trap.</a> Appl. Phys. B. 99 (1), 23-30 (2010).</li>
<li>Fields, A. P., Cohen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+tracking+of+a+Brownian+particle%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Optimal tracking of a Brownian particle.</a> Opt. Express. 20 (20), 22585-22601 (2012).</li>
<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+Nanometer+Localization+Analysis+for+Individual+Fluorescent+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes.</a> Biophys. J. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.

3D tek parçacık yöntemleri izleme birçok çeşidi son yıllarda ortaya çıkan, yüksek hızlı 3D Difüzyon düşük foton sayısı hesaplı basit bir kurulum ile sağlam gerçek zamanlı izleme hala önemli biyolojik onun uygulamaya sınırlayan bir meydan okuma olsa da sorunları. 3D-DyPLoT yöntemi bu iletişim kuralı adreslerini bu sorunlar çeşitli yollarla nitelendirdi. İlk olarak, uyarma ve algılama yolları büyük ölçüde basit ve sağlam hizalama yapma diğer uygulamaları ile karşılaştırıldığında basitleştirilmiştir. İkinci olarak, hareketl...

Gelişmiş görüntüleme teknikleri ortaya çıkması tüm yol aşağı moleküler seviyede hücresel olayların her zamankinden daha detaylı yapısını görmek için bir pencere açtı. Stokastik optik imar mikroskobu (fırtına)1,2,3, fotoğraf-harekete geçirmek yerelleştirme mikroskobu (PALM)4,5,6,7 gibi yöntemleri , yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM)8,9,10,11ve uyarılmış emisyonu tükenmesi mikroskobu (STED)12,13, 14 kadar yapısı ve fonksiyonu canlı hücre benzersiz detay sunmak için kırınım sınırını aşan gitti. Ancak, nasıl bu sistemlerinden davranır tam anlayış dinamik bilgi hem de yapısal bilgi gerektirir. Yukarıda listelenen süper çözünürlük yöntemleri Uzaysal çözünürlük ve zamansal çözünürlük, hangi ile dinamik süreçler probed zamansal hassas sınırlama arasında bir denge içerir. Sağlar yüksek uzaysal duyarlık ve zamansal çözünürlük RT-3D-SPT15,16,17,18,19,20bir yöntem 21,22,23,24,25,26,27,28,29. Burada, bir ayrım çizmek arasında geleneksel 3D-SPT30 ve RT-3D-SPT. geleneksel 3D-SPT sadece (ve ya kullanarak confocal mikroskop ya da bir epifluorescence mikroskobu alınan üç boyutlu görüntü verilerini bir saat serisi gerektirir «««verilir) doğru yapılandırma. Geleneksel 3D SPT içinde parçacık koordinatlarını veri toplama sonra parçacık her görüntü yığınında bulma ve art arda gelen birimler yerlerde birleştirerek oluşan bir yörünge oluşturmak için belirler. Bu yöntemler için nihai zamansal çözünürlük hacimsel görüntüleme hızı tarafından belirlenir. Kolayca saniye saniye onlarca ölçekte bu confocal mikroskoplar için. Neyin Aksiyel konum bilgileri elde edilebilir böylece optik yol manipüle, epifluorescence yöntemleri için zamansal çözünürlük fotoğraf makinesi Pozlama veya okuma zaman sınırlıdır. Bu epifluorescent yöntemler üzerinde eksenel bilgiler toplanabilir aralığında sınırlıdır, Fourier uçak aşamasında son ilerleme maskeleri rağmen tasarım ve adaptif optik uzanan bu aralıklar 10 µm veya daha fazla31,32 , 33 , 34.
Buna ek olarak, RT-3D-SPT bir 3D görüntü yığını edinme ve parçacıklar aslında sonra bulma dayanmaz. Bunun yerine, gerçek zamanlı konum bilgileri tek nokta dedektörleri ile elde edilir ve geri bildirim için etkili bir şekilde "kullanımı ile bir yüksek hızlı piezoelektrik sahne objektif lens odak hacmine parçacık kilit" uygulanır. Bu parçacığın konum sınırlı sürekli ölçümü sadece kaç fotonlar toplanabilir tarafından sağlar. Ayrıca, uzun aralıklarında hareket ederken bu yöntem parçacık spektral sorgulama sağlar. RT-3D-SPT etkin inşaat benzer-e doğru neyin parçacık sürekli probed ve büyük lazer gücü gerek kalmadan gerçek zamanlı veya optik ölçülen Nano nesneleri, kuvvet-Alerjik optik tuzak zorlar. Verilen bu RT-3D-SPT hızlı diffusive nesneleri (ilâ 20 µm2/s)25,29 düşük foton sayısı oranları20,29üç boyutlu olarak sürekli sorgulama için bir araç sağlar, 35, bunu sağlamak bir pencere içine hızlı veya geçici biyolojik süreçlerin hücre içi kargo taşımacılığı, ligand-reseptör bağlama ve tek virions ekstrasellüler dinamikleri gibi. Ancak, şu ana kadar RT-3D-SPT uygulanması bu teknoloji ilerlemek için çalışma grupları avuç sınırlı olmuştur.
Çeşitlidir RT-3D-SPT yöntemler tarafından gerekli optik düzen karmaşıklığı bir engeldir. En yöntemleri için optik görüş piezoelektrik bir sahne ile sağlanır. İçinde X, Y veya Z, dökümanları tek nokta dedektörleri üzerinden hata işlevleri için dönüştürülür ve de beslenen parçacık yapar küçük hareketleri olarak piezoelektrik nanopositioner için yüksek hızlı içinde açmak parçacığın hareketi, etkili bir şekilde karşı koymak için örnek taşır yerde objektif lens göreli kilitleme. X, küçük pozisyonel hareketleri ölçmek için Y ve Z, birden çok Dedektörler (4 veya 5 uygulama bağlı olarak)15,18,21 ya da birden çok uyarma noktalar (2-4, hangi daha düşük eğer uygulanabilir bir amplifikatör kilit-in X ayıklamak için kullanılır ve bir döner kullanarak Y konumunu lazer nokta)25,28 uygulanır. Bu birden fazla algılama ve emisyon noktalarından örtüşme sistemleri hizalayın ve korumak zor yapmak.
Burada, biz 3D-DyPLoT29denen bir basitleştirilmiş optik tasarımı ile yüksek hızlı hedefe kitlendik 3D-SPT yöntemi mevcut. 3D-DyPLoT dinamik olarak odaklı lazer nokta yüksek bir oranı (50 kHz XY, 70 kHz Z) objektif odak seste aracılığıyla taşımak için bir 2D EOD ve etiket objektif36,37,38 kullanır. Lazer odak konumu ve foton varış saati birleştiren parçacığın 3B konumlandırma hızla bile düşük foton sayısı oranları elde edilecek sağlar. 1 x 1 µm X-Y düzlemde bir kare boyutu ile bir şövalyenin Tur Model39 ' lazer odak 2D EOD sürücüler ve etiket objektif lazer odak aralığı 2-4 µm ile eksenel yönde hareket eder. 3D parçacık pozisyon bir en iyi duruma getirilmiş konum tahmin algoritması29,40 3D ile elde edilir. Çığ fotodiyot (APD), gerçek zamanlı parçacık pozisyonu hesaplama, piezoelektrik sahne geri bildirim ve veri kayıt sayma 3D dinamik olarak hareketli lazer nokta, foton kontrolünü bir alan programmable gate array (FPGA) yapılmaktadır.Bu iletişim kuralı, biz 3D-DyPLoT mikroskop optik uyum, kalibrasyon ile sabit parçacıklar, dahil olmak üzere adım adım inşa etmek nasıl açıklar ve nihayet parçacık izleme ücretsiz. Bir gösteri 110 nm floresan boncuk sürekli suda dakika bir anda için takip.
Burada açıklanan yöntemi nerede sürekli virüsler, nano tanecikleri ve veziküller gibi endosomes gibi düşük seviyelerde hafif, hızlı hareket eden floresan sonda izlemek için istenen herhangi bir uygulama için ideal bir seçim var. Önceki yöntemler aksine, yalnızca bir tek uyarma ve tek algılama yolu, hizalama ve bakım basit yapma işte. Ayrıca, kolayca düşük sinyal seviyeleri (aşağı 10 kHz), izleme özelliği bu yöntem düşük ışık uygulamaları29için ideal yapar iken hızlı parçacıklar, difüzyon kadar almak bu mikroskop büyük algılama alanı sağlar.

<table><tbody><tr><td>2D Elektro-optik Deflektör&nbsp;</td><td>ConOptics</td><td>M310A</td><td>2 EOD</td></tr><tr><td>için gerekli güç kaynağı</td><td>ConOptics</td><td>412</td><td>FPGA çıkışını EOD için yüksek voltaja dönüştürür</td></tr><tr><td>TAG&nbsp; Lens</td><td>TAG Optics</td><td>TAG 2.0</td><td>Lazeri eksenel yön boyunca saptırmak için kullanılır</td></tr><tr><td>XY piezoelektrik nano konumlandırıcı</td><td>MadCity Labs</td><td>Nano-PDQ275HS</td><td>Parçacığı objektif odak hacminde kilitlemek için numuneyi hareket ettirmek için kullanılır&nbsp;</td></tr><tr><td>Z piezoelektrik nanopoziter,</td><td>MadCity Labs</td><td>Nano-OP65HS</td>, <td>Yayılan parçacığı takip etmek için objektif lensi hareket ettirmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Mikro konumlandırıcı</td><td>MadCity Labs</td><td>MicroDrive</td> Objektif Lensi <td>kaba bir şekilde konumlandırmak, numuneyi değerlendirmek ve değerlendirmek için kullanılır</td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td>PlanApo</td><td>En iyi hassasiyet için yüksek sayısal diyafram açıklığı gereklidir. 100X, 1.49 NA, M27, Zeiss</td></tr><tr><td>sCMOS kamera</td><td>PCO</td><td>pco.edge 4.2</td><td>Parçacığın konumunu izlemek için kullanılır</td></tr><tr><td>APD</td><td>Excelitas</td><td>SPCM-ARQH-15</td><td>Daha düşük karanlık sayımlar faydalı</td></tr><tr><td>Alan programlanabilir kapı dizisi</td><td>Ulusal Cihazlar</td><td>NI-7852r</td><td></td></tr><tr><td>Yazılımı</td><td>Ulusal Aletler</td><td>LabVIEW</td><td></td></tr><tr><td>İzleme uyarma lazeri</td><td>JDSU</td><td>FCD488-30</td><td></td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-150-A-ML</td><td>L1</td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>L2</td></tr><tr><td>İğne Deliği</td><td>ThorLabs</td><td>P75S</td><td>PH</td></tr><tr><td>Glan-Thompson Polarize</td><td>ThorLabs</td><td>GTH5-A</td><td></td></tr><tr><td>GT Yarım dalga plakası</td><td>ThorLabs</td><td>WPH05M-488</td><td>WP</td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-75-A-ML</td><td>L3</td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-250-A-ML</td><td>L4</td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>L5</td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>L6</td></tr><tr><td>Dikroik Ayna Kroması</td><td></td><td>ZT405/488/561/640RPC</td><td>DC</td></tr><tr><td>Floresan Emisyon</td><td>Filtresi Chroma</td><td>D535/40m</td><td>F</td></tr><tr><td>10/90 ışın ayırıcı</td><td>Chroma</td><td>21012</td><td>BS</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>190 nm floresan nanopartiküller</td><td>Bangs laboratuvarları</td><td>FC02F/9942</td><td></td></tr><tr><td>110 nm floresan nanopartiküller</td><td>Bangs laboratuvarları</td><td>FC02F/10617</td><td></td></tr><tr><td>Lamel</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545A</td> Güç Ölçer <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Thorlabs PM100D</td><td></td></tr><tr><td>CMOS</td><td>Thorlabs</td><td>DCC1545M</td><td></td></tr><tr><td>Iris</td><td>Thorlabs</td><td>SM1D12D</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskobu</td><td>Mad City Labs</td><td>RM21</td><td></td></tr></tbody></table>

gerçek zamanlı 3d tek parçacık izleme için bir iletişim kuralı

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Gerçek zamanlı üç boyutlu tek parçacık (RT-3D-SPT) izleme hücresel sistemlerinde hızlı, 3D işlemler ışık potansiyeline sahiptir. Her ne kadar son yıllarda çeşitli RT-3D-SPT yöntemler ileri koymak, yüksek hızlı izleme düşük foton sayısı oranları parçacıklar Difüzyon 3D bir meydan kalır. Ayrıca, RT-3D-SPT kurulumları genellikle biyolojik ilgili sorunların yaygın uygulama sınırlama uygulamak, zor ve karmaşık. Bu iletişim kuralı düşük foton sayısı hesaplı (aşağı 10 kHz) 3D dinamik foton yerelleştirme hangi parçacıklar (en fazla 20 µm2/s) yüksek diffusive hız ile izleyebilirsiniz izleme (3D-DyPLoT), adlı bir RT-3D-SPT sistemi sunar. Akort akustik degrade (TAG) objektif bir tek odaklı sürücü lazer nokta dinamik olarak 3D ve 3D-DyPLoT bir 2D elektro-optik saptırıcı (2D-EOD) istihdam. Bir en iyi duruma getirilmiş konum tahmin algoritması ile birlikte, 3D-DyPLoT yüksek izleme hız ve yüksek yerelleştirme hassasiyet ile tek parçacıklar üzerine kilitleyebilirsiniz. Tek uyarma ve tek algılama yol yerleşim nedeniyle, 3D-DyPLoT sağlam ve kurulumu kolay. Bu iletişim kuralı, 3D-DyPLoT adım adım inşa anlatılmaktadır. İlk olarak, optik düzen açıklanmıştır. Ardından, sistemi kalibre edilmiş ve 190 nm floresan boncuk piezoelektrik nanopositioner ile tarama raster tarafından optimize edilmiştir. Son olarak, gerçek zamanlı 3D yetenek izleme göstermek için 110 nm floresan boncuk suda izlenir.

Sabit parçacık (şekil 4) tarama ve izleme serbestçe akışkanın 110 nm floresan parçacık (şekil 5) Yukarıdaki protokol sonrası yapıldı. Parçacık tarama tarama, her bir noktada pozisyon aynı anda parçacığın hesaplama tahmini piezoelektrik nanopositioner ve depo gözü fotonlar hareket tarafından gerçekleştirildi. Bir kare bile yoğunluk (şekil 4a) tarama görüntü gösterir ve tahmini konumları parçacığın ger...

İnşaat ve gerçek zamanlı 3D tek parçacık izleme mikroskop izleme Nano floresan yetenekli probları yüksek diffusive hızları ve düşük foton sayısı oranları bu protokolü ayrıntıları.

Gerçek zamanlı 3D tek parçacık izleme için bir iletişim kuralı

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

Bu protokolün genel amacı, gerçek zamanlı, 3 boyutlu, tek parçacık izleme mikroskobu uygulamaktır. Bu tekniğin temel avantajı, tek bir difüzyon nano ölçekli nesnenin foton sınırlı zamansal çözünürlükle sürekli olarak izlenebilmesidir. Bu teknik, tüm enfeksiyon süreci boyunca tek bir viryonu takip etmek gibi viroloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Cihazı optik bir masa üzerinde hazırlayın. Bu kurulum kalibrasyon için hazırdır. Temel bileşenler arasında 488 nanometre katı hal lazeri, ışının yolu boyunca uzanan iki elektro-optik deflektör, ayarlanabilir bir akustik gradyan lensi ve mikro ve nano konumlandırıcılara sahip bir numune aşaması bulunur.Kurulumun bu şeması ek ayrıntılar sağlar. İşte numune aşamasına giden lazer ışını yolu. Elektro-optik deflektörler ve ayarlanabilir akustik lens, ışının yolu boyuncadır.Bu cihazlar, numune aşamasında lazer noktasını dinamik olarak hareket ettirir. Numuneden alınan fotonlar bir çığ foto diyotu ile sayılır. Bir kamera parçacığın konumunu izler.Numunenin konumu mikro ve nano kontrolörler kullanılarak ayarlanır. Alanda programlanabilir bir kapı dizisi, lazer noktasını, gerçek zamanlı parçacık konumu hesaplamasını, aşama geri bildirimini ve foton sayımını kontrol eder. İki numune hazırlanmalıdır.Birincisi, fosfat tamponlu tuzlu su içinde seyreltilmiş 190 nanometre floresan boncuk gerektirir. Sabit bir partikül numunesi hazırlamak için bir kapak fişi kullanın. 400 mikrolitre boncuk solüsyonunu kapak fişinin üzerine yerleştirin.Şimdi, serbest hareket eden parçacıklar örneğini üretin. Suda seyreltilmiş 110 nanometre floresan boncuk gerektirir. 400 mikrolitre çözeltiyi bir kapak kızağı üzerine yerleştirerek serbest hareket eden bir parçacık örneği oluşturun.Sabit parçacık örneğini monte etmek için mikroskoba alın. Örnek, XY nano konumlandırıcı üzerindedir. Lazeri, fotoğraf dedektörünü, ışın hattı elemanları için kontrolörleri ve konumlandırıcıları açın.Piezo nano konumlandırıcıyı kapalı bir döngüde çalıştırın. Ardından, floresan emisyon filtresini fotoğraf dedektörünün önünden çıkarın. Ardından, mikro konumlandırıcı ile numunenin z konumunu değiştirin.Konum değiştikçe, lazerin yansımasının yoğunluğunu izlemek için fotoğraf dedektörünü kullanın. Objektif merceğin odak düzlemini belirlemek için yoğunluğu en üst düzeye çıkarın. Örnek odak düzlemindeyken, floresan emisyon filtresini değiştirin.Şimdi, bilgisayar kontrol yazılımı ile çalışın. Örneği raster taramak için özel yazılım kullanın. İlk olarak, başlangıç ve bitiş arasındaki fark olan geniş bir tarama aralığı ayarlayın.Burada, aralık Y'de 10 mikrometre ve X'te 10 mikrometredir.Ayrıca, her yönde büyük bir adım boyutu ayarlayın. Burada, 200 nanometre. Her iki Z alanını da odak düzleminin önceden tanımlanmış konumuna ayarlayın.Taramaya basıldığında Raster taraması başlatılır. Taramayı başlatın. Yazılım, elektro-optik deflektörleri bir gece turunda çalıştırır, fotoğraf dedektöründen sayımları toplar, nano konumlandırıcıyı çalıştırır ve konum hesaplamaları yapar.Tarama, yazılımda bir plata floresan yoluyla tanımlanabilen bir parçacık bulacaktır. Taramadaki her bölge için yazılım, elektro nesne saptırıcı taramasının merkezine göre X ve Y'deki parçacık konumunun tahminlerini de belirleyecektir. Parçacığı bulduktan sonra, etrafındaki tarama aralığını X ve Y'de iki mikrometreye küçültün.Ayrıca, her ikisi için de adım boyutunu 100 nanometreye düşürün.Floresan odağı braketlemek için Z yönünde iki mikrometrelik bir tarama aralığı ekleyin. Z adım boyutunu 200 nanometre olarak ayarlayın. Floresan odağı bulmak için 3D tarama taramasını başlatın.Taramadan üretilen veriler, ayarlanabilir akustik gradyan lensi açılmadan önce odak düzlemini gösterir. Kontrol yazılımındaki ayarlanabilir akustik lens ayarıyla çalışmaya devam edin. Önce bağlan'a tıklayın, ardından gücü açın.Darbe ve geçit kontrolü bölümüne gidin, çıkış tetikleme modunu RGB'den çok düzlemli olarak değiştirin. Ardından, çıkış fazının değiştirilmesine izin vermek için tekrar RGB olarak değiştirin. Çıkış fazını sıfır derece, 90 derece ve 270 derece arasında ayarlamak için kaydırıcıları kullanın.Ardından, frekans kontrolü bölümüne gidin. Orada, 68, 500 hertz'lik bir rezonans frekansı seçin. Ekranın üst kısmına gidin ve gelişmiş'i tıklayın.Ardından, ayarlar sekmesini seçin. Yeni ekranda, sıfır sütununun maksimum frekansını bulun. Frekans arama aralığını değiştirmek için ayarlayın.Tıklayın, kalibrasyonu kaydedin, ardından kalibrasyondan çıkın. Frekans kontrollerine dönün ve rezonans frekansını değiştirin. Kalibrasyonun etkili olması için hemen tekrar 68.500 hertz olarak değiştirin.Genlik kontrolü bölümünde, genliği yavaşça %35'e yükseltmek için kaydırıcıyı kullanınBundan sonra, rezonansı kilitle'yi tıklayın. Frekans kilitlendiğinde, rezonansın kilidini aç'a tıklayın. Raster tarama yazılımına geri dönün.X ve Y'deki parçacık merkezli iki mikrometre tarama aralığı girin.100 nanometrelik bir adım boyutu kullanın. Parçacığı, 200 nanometrelik bir adım boyutuyla Z'de dört mikrometre aralığında ortalayın. Elde edilen tarama görüntüsünde, parçacığı temsil eden aydınlatma bölgesi yaklaşık bir mikrometre genişliğindedir.Buna dayanarak, XY ölçek parametresini, X ve Y'deki tahmini konumlar negatif 0,5 ila 0,5 mikrometre arasında olacak şekilde ayarlayın. Z ölçeği ile benzer bir prosedürden sonra, nano konumlandırıcıyı sıfır konumuna ayarlayın. Devam etmeden önce nano konumlandırıcıya giden gücü kapatın.Sabit partikül numunesini serbestçe hareket eden partikül numunesi ile değiştirin. Ardından, tüm ekipmanın açık olduğundan emin olun. Piezo nano konumlandırıcıyı açık döngüde çalıştırın.Bilgisayarda, ayarlanabilir akustik gradyan lens yazılımını daha önce olduğu gibi ayarlayın. Floresan emisyon filtresini fotoğraf dedektörüne giden yoldan çıkarın. Örnek Z konumunu değiştirerek ve kapak kaymasından lazer yansımasının yoğunluğunu en üst düzeye çıkararak odak düzlemini bulun.Odak düzlemini bulduktan sonra, odak konumunu çözeltiye 15 mikrometre artırın. Floresan emisyon filtresini değiştirin. Özel izleme yazılımını açın.Konum tahmin parametrelerini optimizasyon sırasında bulunan değerlere ayarlayın. Şimdi, nano konumlandırıcının tepki hızını belirleyen entegre kontrol sabitlerini ayarlayın. X sabiti ile başlayın.Düşük bir değer girin ve yavaşça artırın. Parçacık konumu okumasında salınımlar başladığında, kontrol sabitinin değerini not edin. İntegral kontrol sabitini, salınımın başlangıcındaki değerinin yaklaşık %70'ine düşürün.Y ve Z kontrol sabitleri ile adımları tekrarlayın. Parça eşiğini izlemeye başlamak için tetiği üç kilohertz'e ayarlayın. İzlemeyi sonlandırmak için tetikleyici olan minimum parça değerini 1,5 kilohertz olarak ayarlayın.Aramayı ve ardından otomatik izlemeyi tıklayarak denemeyi başlatın. Bu film, sudaki 110 nanometre floresan nano parçacığın difüzyon hareketini izlemek için üç boyutlu, dinamik foton lokalizasyon izleme mikroskobunun kullanılmasının sonucunu göstermektedir. Nano konumlandırıcının konum okuması kullanılarak ölçülen parçacığın konumu, 3D eksenlerde gösterilir.İç kısım, bilimsel deniz yosunu kamerasının okunmasıdır. Parçacığın, izleme sistemi tarafından odak hacminde kilitlendiğini gösterir. Parçacık izlendi ve konumu iki dakikadan fazla bir süre boyunca kaydedildi.Bir kez ustalaştıktan sonra, sistem uygun şekilde hizalanmışsa ve kalibrasyon parametreleri ayarlanmışsa, bu teknik 50 dakikadan kısa sürede yapılabilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, ilaç dağıtımı alanındaki araştırmacıların, hücresel yükün içselleştirilmesi ve taşınması yollarını keşfetmelerine yardımcı olacaktır. Bu videoyu izledikten sonra, sıfır zamanlı, 3D tek parçacık izleme mikroskobunun nasıl çalıştırılacağını iyi anlamış olmalısınız.

a-protocol-for-real-time-3d-single-particle-tracking

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu protokol, canlı hücrelerin yüzeyindeki tek reseptörleri görselleştirmek ve izlemek ve böylece reseptör yanal hareketliliğini, reseptör komplekslerinin boyutunu analiz etmek ve ayrıca geçici reseptör-reseptör etkileşimlerini görselleştirmek için toplam iç yansıma floresan mikroskobunun nasıl kullanılacağını açıklar. Bu protokol diğer zar proteinlerine genişletilebilir.

Tek molekül Floresan Mikroskopi Reseptör Dinamiği Yüksek çözünürlüklü Spatiotemporal Analizi

Bu video protokolünde, modifiye edilmiş iki fotonlu bir mikroskopta orbital izleme yöntemini kullanarak, canlı hücreler içindeki floresan olarak işaretlenmiş lizozomları - yüksek hızda ve üç boyutta - izliyoruz.

Modifiye İki foton mikroskop 3D Orbital Takip: Hücre içi veziküllerin İzlemeye Bir Uygulama

Dört görünüm ayırıcı ile yüksek hızlı kamera dayalı üç boyutlu parçacık izleme velosimetri (3D-PTV) sistem burada tanımlanmıştır. Teknik alt ≈ 7.000 Re Reynolds sayısı on çap çevresinde dairesel bir borudan, bir jet akışı uygulanır.

Türbülans Uygulamaları için üç boyutlu Parçacık Takip Akımları: Jet Akış Örneği

Sıvılarda "yüzebilen" ve 3B yörüngelerini belirleyebilen katalitik olarak aktif Janus kolloidlerini hazırlamak için bir yöntem sunulmaktadır.

Katalitik Yüzme Cihazların Hazırlanması ve 3D İzleme

El yazması, hareketli parçacıkların görüntü analizi ile izlendiği yatay yüklü tortu nakil deneylerinin iletimi için bir protokol sunmaktadır. Deney tesisi, çalıştırma gerçekleştirme ve veri işleme prosedürleri ve nihayet bazı kavramsal kanıt-proof sonuçları burada sunulmuştur.

Yatak Yüklü Deneylerde Görüntü Tabanlı Lagrangian Parçacık İzleme

Burada, tek parçacık kantitatif değerlendirilmesi Difüzyon katsayıları, Floresans mikroskobu tarafından algılanan tek parçacıkların hareket ve küme boyutları türleri sağlar görüntü analizi izleme için bir iletişim kuralı mevcut.

Görüntü membran reseptörleri Floresans mikroskobu tarafından küme boyutunu ve Difüzyon analizi için protokol işleme

Bu protokolün amacı, üç boyutlu aktif sıvıların akış hızlarını kontrol etmek için sıcaklığı kullanmaktır. Bu yöntemin avantajı sadece yerinde akış hızlarının düzenlenmesine izin vermez, aynı zamanda akış hızlarını yukarı ve aşağı ayarla gibi dinamik kontrol sağlar.

Sıcaklık Kullanarak Mikrotübül Bazlı 3D Aktif Sıvıların Akış Hızlarını Kontrol Etme

Bu protokol, moleküler kütlenin ve lipit membranlarla etkileşime giren makromoleküllerin difüzyon davranışının eşzamanlı olarak araştırılmasını sağlayan iSCAT tabanlı bir görüntü işleme ve tek parçacık izleme yaklaşımını açıklar. Numune hazırlama, kütleden kontrasta dönüştürme, film edinme ve son işleme için adım adım talimatlar, olası tuzakları önlemek için talimatlarla birlikte sağlanır.

Membranla İlişkili Makromolekül Dinamiğini Karakterize Etmek için Kütleye Duyarlı Partikül İzleme

Doğası gereği düzensiz birçok proteinin, çok sayıda hücresel süreç için önemli bir davranış olan oldukça dinamik biyomoleküler kondensatların oluşumuna katıldığı gösterilmiştir. Burada, canlı hücrelerdeki biyomoleküler kondensatlarda proteinlerin birbirleriyle etkileşime girdiği dinamikleri ölçmek için tek moleküllü görüntüleme tabanlı bir yöntem sunuyoruz.

Biyomoleküler Kondensatlarda Protein Etkileşim Dinamiğinin Tek Moleküllü Ölçümü

Bu makale, katı destekli lipid çift katmanlarında tek protein izleme için örnekler nasıl oluşturulacağına dair ayrıntılı bir açıklama sunmaktadır. Ayrıca, tek molekül hassasiyeti ve hızlı kare hızına sahip basit bir floresan mikroskobu da açıklar. Son olarak, tek protein yörüngelerinin çıkarılması prosedürünü özetliyoruz.

Lipid çift katmanlarında tek proteinlerin floresan mikroskopisi kullanılarak takibi

Keşfedin gerçek zamanlı 3D tek parçacık izleme mikroskobunu, nanometre ölçekli floresan prob ve virionları sürekli gözlemlemek için. Bu yöntem, düşük foton sayılarında bile yüksek zamansal çözünürlük sağlar.

Gerçek zamanlı 3D tek parçacık izleme için bir iletişim kuralı

Daha fazla video keşfet