CRISPR/Cas9 kullanarak Gene sitokin bağımlı hematopoetik hücreler Mutant Calreticulin Oncogenic etkinliğini araştırmak için düzenleme

Bu deneyin genel amacı, onkojenik aktivitelerini incelemek için sitokin bağımlı hematopoietik hücrelerdeki kalretikülin mutasyonlarını modellemek için CRISPR / Cas9 gen düzenlemesini kullanmaktır. Bu yöntem, fizyolojik seviyelerde ifade edildiklerinde sürücü mutasyonlarının biyolojik işlevi gibi hematolojik maligniteler alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kanserde yer alan genlerin biyolojik işlevini modellemek ve incelemek için CRISPR / Cas9 gen düzenleme sistemini kullanmasıdır.

Oligoları tavlamak ve fosforile etmek için, reaktifleri buz üzerinde tutulan bir PCR tüpüne toplam 10 mikrolitreye ekleyin. Programı termocycler'da ayarlayın. Döngü tamamlandıktan sonra reaksiyonu seyreltmek için su kullanın.

lentiGuide-Puro vektörünü sindirmek için 50 mikrolitre sindirici reaksiyonu hazırlayın. Ardından, bir ısı bloğunda 55 santigrat derecede sindirim reaksiyonunu başlatın. Bir saat sonra, ilave bir mikrolitre BsmB1 kısıtlama enzimi ekleyin ve reaksiyona bir saat daha devam edin.

Kesilen kemiği fosforilattan arındırmak için, sindirim vektörüne yedi mikrolitre fosfataz reaksiyon tamponu ve iki mikrolitre fosfataz enzimi ekleyin. Daha sonra karışımı 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Zaten kesilmiş ve fosiflenmiş sırt kemiğini ticari bir kit kullanarak saflaştırın.

Ligasyon karışımını hazırlamak için, buz üzerinde tutulan bir PCR tüpüne 15 nanogram sindirilmiş sırt kemiği ve diğer reaktifleri ekleyin ve hacmi su ile 10 mikrolitreye ayarlayın. Reaksiyonu oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Daha sonra STBL3 uyumlu hücreleri iki mikrolitre ligasyon karışımı ile dönüştürün.

Ve sonra mililitre ampisilin başına 100 mikrogram içeren lizojeni et suyu agar plakası üzerine plaka. Bundan sonra, plakayı gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Üç koloni seçin ve onları aşılayın.

Her kültür için mini hazırlık yapın ve oligo yerleştirme bölgesini bir U6 promotör bölge primeri ile sıralayın. 10 santimetrelik bir tabakta hek293t hücrelerini tohumlayın. Ve gece boyunca kuluçka için bırakın.

DNA karışımını transfeksiyon için hazırlamak için, transfeksiyon reaktifinden 45 mikrolitre DNA'ya pipetleyin. DNA ve transfeksiyon reaktifini dikkatlice karıştırmak için bir pipet kullanın ve 20 dakika bekletin. Bundan sonra, DNA transfeksiyon karışımını tohumlanmış hücrelerin üzerine damla damla ekleyin.

Plakaları yavaşça döndürün. Ve bir gün% 5 karbondioksit ve 37 santigrat derecede inkübe edin. Süpernaten içeren virüsü 24 ve 48 saat sonra 0.22 mikromiter filtreden geçirerek hasat edin.

Ve her kriyo şişesinde 1.6 mililitre süpernaten aliquot. Daha sonra süpernatanı aspire edin ve hücreleri birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek Ba / F3 hücrelerini ortamdaki yeniden süspanse edin. Altı kuyucuklu bir doku kültürü plakasına 500 mikrolitre yeniden süspanse edilmiş hücre, 1.5 mililitre viral süpernatant, dört mikrolitre polibren ve mililitre başına 10 nanogram murin interlökin 3 ekleyin.

Plakayı 440 G'de 37 santigrat derecede 120 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra,% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede gece boyunca inkübasyon için plakayı bir inkübatöre aktarın. Bundan sonra, hücreleri üç dakika boyunca 440 G'de döndürün.

Ve altı oyuklu bir plakada beş mililitre taze ılık ortamda yeniden süspanse edin. Cas9 ile enfekte olmuş hücreleri seçmek için önce hücreyi aşağı doğru döndürün. Daha sonra, 48 saatlik spdezenfeksiyondan sonra mililitre blasticidin başına beş mikrogram ile desteklenmiş taze ılık ortamda yeniden süspanse edin.

Tüm enfekte olmamış hücreler ölene kadar blasticidin ile dokuz gün boyunca hücre seçmeye devam edin. Daha sonra, dirençli hücreleri mililitre blasticidin başına bir mikrogram içeren bir ortama aktarın. Ebeveyn hücrelerini ve Cas9'u pXPR-011 raportör yapısı ile stabil bir şekilde eksprese eden hücreleri lentiviral enfeksiyon yoluyla dönüştürün.

Enfeksiyondan 48 saat sonra, üç gün boyunca mililitre puromisin başına iki mikrogram ile hücreleri seçmeye devam edin. Cas9 eksprese eden hücreleri lentivirüs kullanarak tek kılavuz ribonükleik asit ile enfekte edin. Daha sonra, spinfectiondan 48 saat sonra üç gün boyunca hücreleri seçmek için mililitre puromisin başına iki mikrogram kullanın.

Ektopik Cas9'u ve ilgilenilen tek kılavuz ribonükleik asidi eksprese eden üstel olarak büyüyen Ba/F3 hücrelerini bin edin. Süpernatanı aspire edin ve hücreleri beş mililitre fosfat tamponlu tuzlu su ile yıkayın. Hücreleri döndürün ve fosfat tamponlu tuzlu su ile üç kez yıkayın.

Ardından, bir hücre canlılığı analizörü kullanarak hücre sayısını sayın. Bundan sonra, tohum hücreleri, altı kuyucuklu kültür plakasında interlökin 3 içermeyen iki mililitre taze ortamda üç kopya halindedir. Hücreleri sekiz gün boyunca her iki günde bir izlemeye ve saymaya başlayın.

Ebeveyn Ba/F3 hücresinde Cas9 aktivitesini ve Ba/F3 aşırı eksprese eden Cas9 hücrelerini gösteren temsili akış psikometrik verileri burada gösterilmektedir. Yeşil floresan protein sinyali, Ba / F3 aşırı eksprese eden Cas9 hücrelerinde% 76 oranında azalır, bu da sağlam Cas9 aktivitesini gösterirken, ebeveyn Ba / F3 hücrelerinde, yeşil floresan protein sinyali% 100'de kalır Kalretikülinin onkojenik aktivitesini gösteren hücreler için temsili büyüme eğrileri burada gösterilmiştir. CRISPR/Cas9 aracılı artı bir baz çifti çerçeve kayması mutasyonu, m1 ve m2 tek kılavuz RNaz kullanılarak ekzon dokuz kalretikülin lokusunda tanıtıldı.

Kalretikülin hedefli Ba / F3 trombopoietin reseptörü Cas9 hücreleri için büyüme eğrileri, murin interlökin 3'ten bağımsız büyümeyi gösterir. Bununla birlikte, diğer hücre tipleri için büyüme eğrileri sitokinden bağımsız herhangi bir büyüme göstermez. Dizileme sonuçları, m1 ve m2 tek kılavuz RNaz kullanılarak kalretikülin hedefli Ba/F3 trombopoietin reseptörü Cas9 hücrelerinde endojinöz kalretikülin ekzon dokuzunun hedef üzerinde düzenlenmesini doğrulamaktadır.

Artı bir baz çifti çerçeve kayması mutasyonları siyah renkle gösterilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulanırsa iki hafta içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, istenen fenotipten ilgilenilen gende ne tür mutasyonların sorumlu olabileceğini anlamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, hastalığa neden olan mekanizmayı daha iyi anlamak için hücre sinyalizasyonundaki veya protein protein etkileşimlerindeki rolü gibi mutasyonu daha fazla karakterize etmek için başka yöntemler de gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, hematoloji alanındaki araştırmacıların, Ba / F3 hematopoetik hücrelerinde fizyolojik düzeylerde fonksiyon kazancı mutasyonlarının hücre transformasyonu üzerindeki etkisini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, sitokin bağımlı hematopoietik hücrelerde fonksiyon kazancı mutasyonlarının onkojenik aktivitesini araştırmak için CRISPR/Cas9 gen düzenleme metodolojisinin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.

Lentivirus ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman bir BL2 plus tesisinde çalışmak gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.