Name: İnsan hipofiz adenom doku Proteom analizi için kütle spektrometresi yöntemleri ile birleştiğinde iki boyutlu Jel Elektroforez (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 34 s
Description: Keşfedin, iki boyutlu jel elektroforez ve kütle spektrometrisi ile insan hipofiz adenom dokusu proteomunu ayırma ve tanımlama yöntemini. Bu teknik, düşük bolluktaki proteinleri yüksek hassasiyetle tespit ederek kanser proteomik araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Çin (Grant Hayır 81572278 ve 81272798 olarak XZ), Çin "863" planı Projesi (Grant No XZ için 2014AA020610-1), Hunan ve yetenek Giriº (XZ) Xiangya hastane fon gelen hibe Ulusal doğal Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir Çin'in il doğal Bilim Vakfı (XZ için Grant No. 14JJ7008). Yazarlar da Dr Dominic M. Desiderio Tennessee Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi içinde bilimsel katkısını kabul. X.Z. sürekli olarak geliştirilen ve 2DE-MS yöntemleri 2001'den başlayarak hipofiz adenom Proteom çözümlemek için kullanılan, mevcut el yazması için kavram gebe, yazdı ve el yazması revize, ilgili çalışmaları koordine ve sorumlu mali desteği ve karşılık gelen çalışma. Yl el yazması revizyonunda katıldı. Y.H başvurular topluluğu ve el yazması revizyonu'na katılmıştır. Tüm yazarlar son el yazması onayladı.

<ol><li>Zhan, X., Wang, X., Cheng, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pituitary+adenoma+proteomics%3A+new+progresses+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Human pituitary adenoma proteomics: new progresses and perspectives.</a> Front. Endocrinol. 7 (54), (2016).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteomics+analysis+of+human+pituitary+adenomas%3A+Current+status+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Comparative proteomics analysis of human pituitary adenomas: Current status and future perspectives.</a> Mass Spectrom. Rev. 24 (6), 783-813 (2005).</li>
<li>Wang, X., Guo, T., Peng, F., Long, Y., Mu, Y., Yang, H., Ye, N., Li, X., Zhan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+and+functional+profiles+of+a+follicle-stimulating+hormone-positive+human+nonfunctional+pituitary+adenoma%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Proteomic and functional profiles of a follicle-stimulating hormone-positive human nonfunctional pituitary adenoma.</a> Electrophoresis. 36 (11-12), 1289-1304 (2015).</li>
<li>Karppinen, A., Kivipelto, L., Vehkavaara, S., Ritvonen, E., Tikkanen, E., Kivisaari, R., Hernesniemi, J., Setälä, K., Schalin-Jäntti, C., Niemelä, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+from+microscopic+to+endoscopic+transsphenoidal+surgery+for+nonfunctional+pituitary+adenomas%5BTitle%5D)+AND+%22World+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Transition from microscopic to endoscopic transsphenoidal surgery for nonfunctional pituitary adenomas.</a> World Neurosurg. 84 (1), 48-57 (2015).</li>
<li>Liu, X., Ma, S., Dai, C., Cai, F., Yao, Y., Yang, Y., Feng, M., Deng, K., Li, G., Ma, W., Xin, B., Lian, W., Xiang, G., Zhang, B., Wang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiproliferative%2C+antiinvasive%2C+and+proapoptotic+activity+of+folate+receptor+%CE%B1-targeted+liposomal+doxorubicin+in+nonfunctional+pituitary+adenoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Antiproliferative, antiinvasive, and proapoptotic activity of folate receptor α-targeted liposomal doxorubicin in nonfunctional pituitary adenoma cells.</a> Endocrinol. 154 (4), 1414-1423 (2013).</li>
<li>Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pituitary+adenoma+nitroproteomics%3A+current+status+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Oxid.+Med.+Cell.+Longev%22%5BJournal%5D)">Pituitary adenoma nitroproteomics: current status and perspectives.</a> Oxid. Med. Cell. Longev. 2013, 580710(2013).</li>
<li>Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+analysis+of+nitrotyrosine-containing+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins.</a> Mass Spectrom. Rev. 34 (4), 423-448 (2015).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reference+map+of+a+pituitary+adenoma+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">A reference map of a pituitary adenoma proteome.</a> Proteomics. 3 (5), 699-713 (2003).</li>
<li>Desiderio, D. M., Zhan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+human+pituitary+proteome%3A+The+characterization+of+differentially+expressed+proteins+in+an+adenoma+compared+to+a+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A study of the human pituitary proteome: The characterization of differentially expressed proteins in an adenoma compared to a control.</a> Cell. Mol. Biol. 49 (5), 689-712 (2003).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+analysis+of+the+human+pituitary+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity analysis of the human pituitary proteome.</a> Clin. Chem. 49 (10), 1740-1751 (2003).</li>
<li>Zhan, X., Evans, C. O., Oyesiku, N. M., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+and+tanscriptomics+analyses+of+secretagogin+down-regulation+in+human+non-functional+pituitary+adenomas%5BTitle%5D)+AND+%22Pituitary%22%5BJournal%5D)">Proteomics and tanscriptomics analyses of secretagogin down-regulation in human non-functional pituitary adenomas.</a> Pituitary. 6 (4), 189-202 (2003).</li>
<li>Moreno, C. S., Evans, C. O., Zhan, X., Okor, M., Desiderio, D. M., Oyesiku, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+molecular+signaling+in+human+clinically+non-functional+pituitary+adenomas+identified+by+gene+expression+profiling+and+proetomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Novel molecular signaling in human clinically non-functional pituitary adenomas identified by gene expression profiling and proetomic analyses.</a> Cancer Res. 65 (22), 10214-10222 (2005).</li>
<li>Zhan, X., Wang, X., Long, Y., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+analysis+of+the+proteomes+in+clinically+nonfunctional+pituitary+adenomas%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity analysis of the proteomes in clinically nonfunctional pituitary adenomas.</a> BMC Med. Genomics. 7, (2014).</li>
<li>Zhan, X., Giorgianni, F., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+analysis+of+growth+hormone+isoforms+in+the+human+pituitary%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomics analysis of growth hormone isoforms in the human pituitary.</a> Proteomics. 5 (5), 1228-1241 (2005).</li>
<li>Kohler, M., Thomas, A., Püschel, K., Schänzer, W., Thevis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+pituitary+growth+hormone+variants+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of human pituitary growth hormone variants by mass spectrometry.</a> J. Proteome Res. 8 (2), 1071-1076 (2009).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+pituitary+nitroproteome%3A+detection+of+nitrotyrosyl-proteins+with+two-dimensional+Western+blotting%2C+and+amino+acid+sequence+determination+with+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">The human pituitary nitroproteome: detection of nitrotyrosyl-proteins with two-dimensional Western blotting, and amino acid sequence determination with mass spectrometry.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 325 (4), 1180-1186 (2004).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitroproteins+from+a+human+pituitary+adenoma+tissue+discovered+with+a+nitrotyrosine+affinity+column+and+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry.</a> Anal. Biochem. 354 (2), 279-289 (2006).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+ion-trap+mass+spectrometric+characterization+of+human+pituitary+nitrotyrosine-containing+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Linear ion-trap mass spectrometric characterization of human pituitary nitrotyrosine-containing proteins.</a> Int. J. Mass Spectrom. 259, 96-104 (2007).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M., Wang, X., Zhan, X., Guo, T., Li, M., Peng, F., Chen, X., Yang, H., Zhang, P., Li, X., Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+proteomic+variations+of+invasive+relative+to+noninvasive+nonfunctional+pituitary+adenomas%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Identification of the proteomic variations of invasive relative to noninvasive nonfunctional pituitary adenomas.</a> Electrophoresis. 35 (15), 2184-2194 (2014).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+pathway+networks+mined+from+human+pituitary+adenoma+proteomics+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Signal pathway networks mined from human pituitary adenoma proteomics data.</a> BMC Med. Genomics. 3, 13(2010).</li>
<li>O’Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+two-dimensional+electrophoresis+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins.</a> J. Biol. Chem. 250 (10), 4007-4021 (1975).</li>
<li>Klose, J., Kobalz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+electrophoresis+of+proteins%3A+an+updated+protocol+and+implications+for+a+functional+analysis+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional electrophoresis of proteins: an updated protocol and implications for a functional analysis of the genome.</a> Electrophoresis. 16 (6), 1034-1059 (1995).</li>
<li>Zhan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+two-dimensional+gel+electrophoresis+and+multi-dimensional+liquid+chromatography+as+proteomic+separation+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Chromatogr.+Sep.+Tech%22%5BJournal%5D)">Current status of two-dimensional gel electrophoresis and multi-dimensional liquid chromatography as proteomic separation techniques.</a> Ann. Chromatogr. Sep. Tech. 1 (2), 1009(2015).</li>
<li>Wasinger, V. C., Cordwell, S. J., Cerpa-Poljak, A., Yan, J. X., Gooley, A. A., Wilkins, M. R., Duncan, M. W., Harris, R., Williams, K. L., Humphery-Smith, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+with+gene-product+mapping+of+the+Mollicutes%3A+Mycoplasma+genitalium%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Progress with gene-product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium.</a> Electrophoresis. 16, 1090-1094 (1995).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+spatial+and+quantitative+reproducibility+between+two+second-dimensional+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Differences in the spatial and quantitative reproducibility between two second-dimensional gel electrophoresis.</a> Electrophoresis. 24 (11), 1834-1846 (2003).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spot+volume+vs.+amount+of+protein+loaded+onto+a+gel.+A+detailed%2C+statistical+comparison+of+two+gel+electrophoresis+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Spot volume vs. amount of protein loaded onto a gel. A detailed, statistical comparison of two gel electrophoresis systems.</a> Electrophoresis. 24 (11), 1818-1833 (2003).</li>
<li>Zhan, X. Two-dimensional electrophoresis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhan%2C+X+%22Experimental+Protocols+for+Medical+Molecular+Biology+in+Chinese+and+English%22">Experimental Protocols for Medical Molecular Biology in Chinese and English</a>. Zheng, W. , Peking Union Medical College Press. Beijing. 93-108 (2005).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Electrophoresis+in+Practice%3A+A+guide+to+Methods+and+Applications+of+DNA+and+Protein+Separations%22">Electrophoresis in Practice: A guide to Methods and Applications of DNA and Protein Separations</a>. Westermeier, R. , VCH Wiley. Weinheim. (1997).</li>
<li>Zhan, X., Yang, H., Peng, F., Li, J., Mu, Y., Long, Y., Cheng, T., Huang, Y., Li, Z., Lu, M., Li, N., Li, M., Liu, J., Jungblut, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+many+proteins+can+be+identified+in+a+2DE+gel+spot+within+an+analysis+of+a+complex+human+cancer+tissue+proteome%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome?</a> Electrophoresis. , (2018).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir çatışma olduğunu ilan eder.

2DE 2DE-MS PMF ve 2DE-MS/MS, MS yöntemleri ile birleştiğinde, başarılı bir şekilde kullanılmıştır bizim uzun vadeli programı - insan NFPA proteomik varyasyonları ve moleküler ağ çeşitleri için moleküler mekanizmaları aydınlatma çalışmaya proteomik kullanımı ve NFPAs için etkili biyolojik keşfi. İyi tekrarlanabilirlik ile karşılaştırmalı proteomik 2DE tabanlı NFPA proteomik varyasyonları9,10,11,12</su...

PA insan endokrin sisteminde önemli roller oynar hipotalamus-hipofiz-hedef organ eksen sistemleri insan hipofiz bezinde oluşan ortak bir tümördür. PA klinik olarak fonksiyonel ve işlevsiz PAs (odak ve NFPA)1,2içerir. NFPA erken aşamada tanı ve tedavisi nedeniyle sadece biraz yüksek hormon düzeyleri (örneğin, LH ve FSH) kan kan3,4 karşılık gelen hormon düzeyleri önemli ölçüde artmıştır odak göre zordur ,5. Moleküler mekanizmalar açıklama ve etkili biyolojik keşfi tanı, tedavi ve NFPA Prognozunda önemli klinik öneme sahip. Uzun vadeli hedefimiz geliştirmek ve NFPA onun moleküler mekanizmaları netleştirmek için güvenilir biyolojik keşfi için çalışmaya proteomik yöntemleri kullanın ve tanılama ve prognostik işaretleri yanı sıra etkili tedavi hedefleri tanımak olduğunu. 2-DE MS yöntemleri ile birleştiğinde kapsamlı bir şekilde kullanıldığını Proteom başvuru kurulması da dahil olmak üzere insan PA Proteom1,2,6,7, ilgili uzun vadeli araştırma programımızda 3,8, analiz differentially ifade protein profilleri9,10,11,12,13, hormon türevleri14 haritalar ,15, fosforilasyon14 ve tirozin nitration16,17,18gibi translasyonel modifikasyon, göreli olarak invazif proteomik varyasyonu invaziv olmayan NFPAs19ve birden çok önemli yolu (mitokondrial disfonksiyon, hücre döngüsü bozukluk, oksidatif stres ve ağları MAPK sinyal keşfi yol açan NFPA alt türlerinden13, proteomik heterojen Sistem anormallik) NFPA13,19,20dakikaya değişmiş.
2DE ayıran proteinler isoelectric noktası (PI) (isoelectric odaklanarak, IEF) ve molekül ağırlığı (yolu ile Sodyum Lauryl Sülfat polyacrylamide Jel Elektroforez, SDS-sayfa) göre1,2,3, 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. bu ortak ve klasik ayırma proteomik, alanında Proteom ve proteomik içinde 199524kavramlarını giriş beri bir tekniktir. MS 2DE ayrılmış proteinlerin PMF ve MS/MS stratejileri de dahil olmak üzere kimlik bulmak için çok önemli bir tekniktir. MS aletleri, özellikle de algılama hassasiyeti ve çözünürlük, LC sistemi, geliştirilmesi ile birlikte yönleri çok hızlı gelişimi büyük ölçüde düşük veya çok düşük bereket proteinler arasında en üst düzeye çıkarmak için bir Proteom kimlik geliştirir bir Proteom kapsama. Bu da bizim geleneksel kavramları yalnızca bir meydan okuyor veya iki protein 2B jel karmaşık insan dokusu Proteom analizinde bir nokta mevcut ve birden çok protein 2B jel karmaşık insan dokusu analizinde bir nokta belirlemek için bir fırsat sağlar Proteom ve NFPA Proteom kapsama en üst düzeye çıkarmak.
Burada 2DE-maldı MS PMF, 2DE-maldı MS detaylı protokolleri açıklamak/MS ve 2DE-LC-MS/başarıyla insan NFPA Proteom analizinde kullanılan MS. İletişim kuralları hazırlık içerir örnekleri, ilk ikinci boyut (isoelectric odaklanarak, IEF), (SDS-sayfa), görselleştirme (Gümüş boyama ve Coomassie mavi boyama) proteinlerin boyut, görüntü analiz 2D jel, jel tripsin sindirim, Arıtma tryptic peptidler, PMF, MS/MS ve3,8,25,26yakıcı veritabanı. Ayrıca, bu iletişim kuralı kolayca diğer insan dokusu proteomes analiz için çevirir.

<table><tbody><tr><td>Ettan IPGfor 3&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>izoelektrik odaklama sistemi.</td></tr><tr><td>Ettan DALTsix multijel teker</td><td>Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, ABD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ettan DALT II Sistemi</td><td>Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, ABD</td><td></td><td>Dikey elektroforez sistemi</td></tr><tr><td>Ettan IPGfor şerit tutucu</td><td>Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, ABD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ettan DALTsix multijel teker</td><td>Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, ABD</td><td></td><td>Multijel tekerlek</td></tr><tr><td>Voyager DE STR MALDI-TOF MS&nbsp;</td><td>ABI, Foster City, CA</td><td></td>, <td>MALDI-MS, PMF</td></tr>, <tr><td>MALDI-TOF-TOF</td><td>Autoflex III, Bruker</td><td></td>, <td>MALDI-MS/MS kütle spektrometresi</td></tr><tr>,<td>LTQ-OrbiTrap, Velos Pro, ETD</td>, <td>Thermo Scientific, Waltham, MA,</td><td></td> ABD, <td>ESI-MS/MS kütle spektrometresi</td></tr>, <tr><td>EASY-nano LC sistemi&nbsp;</td><td>Proxeon Biosystems, Odense, Danimarka</td><td></td><td>Yüksek performanslı sıvı kromatografi sistemi</td></tr><tr><td>PepMap C18 tuzak kolonu&nbsp;</td><td>300 &mu; M Kimlik ve Süreler; 5 mm uzunluk; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, ABD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RP C18 sütun</td><td>75 &mu; m i.d., 15 cm uzunluk; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, ABD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KimWipe</td><td>Kimvipe&nbsp;</td><td></td><td>Çözünmeyen kağıt havlu</td></tr><tr><td>Watter</td><td>PURELAB flex cihazı</td><td></td><td></td>tarafından üretilmiştir</tr><tr><td>Polytron Model P710/35 homojenizatör</td><td>Brinkmann Instruments, Westbury, NY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDQuest</td><td>Bio-Rad,&nbsp; Hercules, CA</td><td></td><td>2D jel görüntü analiz yazılımı</td></tr><tr><td>SEQUEST&nbsp;</td><td>Thermo Proteome Discoverer 1.3 (sürüm No. 1.3.0.339)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DataExplore (ver. 4.0.0.0) yazılımı</td><td></td><td></td><td>MS spektrum işleme yazılımı</td></tr><tr><td>Maskot yazılımı</td><td></td><td></td><td>PMF tabanlı protein arama yazılımı&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Maskot yazılımı</td><td></td><td></td><td>MS/MS tabanlı protein arama yazılımı</td></tr><tr><td>Proteome Discoverer yazılımı v.1.3 beta</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xcalibur yazılımı v.2.1</td><td></td><td></td><td>MS/MS veri edinilmiş yönetim yazılımı&nbsp;</td></tr><tr><td>Uniprot versiyon 201410.1_HUMAN.fasta</td><td></td><td></td><td>İnsan protein veritabanı</td></tr><tr><td>SEQUEST (versiyon No. 1.3.0.339)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>MS/MS tabanlı protein arama yazılımı I</td></tr><tr><td>MASCOT (versiyon 2.3.02)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>MS/MS tabanlı protein arama yazılımı II</td></tr><tr><td>C18 ZipTip mikrokolon</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PeptideMass Standart kiti&nbsp;</td><td>Perspektif Biyosistemler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Test Kiti&nbsp;</td><td>Termo&nbsp; Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>2-D Quant Kit</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6483-56</td><td></td></tr><tr><td>BIS-AKRILAMID</td><td>AMRESCO</td><td>0172</td><td></td></tr><tr><td>AKRİLAMİN</td><td>AMRESCO</td><td>0341</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Tiyoüre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8656</td><td></td></tr><tr><td>Üre</td><td>VETEC</td><td>V900119</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>AMRESCO</td><td>0227</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>AMRESCO</td><td>0465</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>AMRESCO</td><td>M146</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum Persülfat</td><td>AMRESCO</td><td>M133</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Promega, Madison, WI, ABD</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>IPG tampon pH 3-10, NL</td><td>GE Sağlık</td><td>17-6000-87</td><td></td></tr><tr><td>İmmobilin Kuru Şerit pH 3-10NL, 18cm</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1235-01</td><td></td></tr></tbody></table>

İnsan hipofiz adenom doku proteom analizi için kütle spektrometresi yöntemleri ile birleştiğinde iki boyutlu jel elektroforez

Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome

İnsan hipofiz adenom (PA) insan hipofiz bezi hipotalamus-hipofiz-hedef organ eksen sisteminde oluşur ve klinik olarak işlev veya işlevsiz PA (odak ve NFPA) sınıflandırılabilir ortak bir tümördür. NFPA erken aşamada tanı ve tedavi ancak odak için karşılaştırıldığında kan hormon yükselen nedeniyle zordur. Uzun vadeli hedefimiz güvenilir biyolojik açıklama PA moleküler mekanizmaları ve etkili tanı, prognostik işaretleri ve tedavi hedefleri tanınması için keşfetmek için proteomik yöntemleri kullanmaktır. Kütle spektrometresi (MS) yöntemlerle birleştiğinde etkili iki boyutlu Jel Elektroforez (2DE) buraya örnekleri, 2D Jel Elektroforez, protein görselleştirme, görüntü analizi, jel hazırlanması da dahil olmak üzere insan PA proteomes analiz sunuldu Tripsin sindirim, peptid kitle parmak izi (PMF) ve tandem spektrometresi (MS/MS) kitle. 2-boyutlu Jel Elektroforez matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaşma kütle spektrometresi PMF (2DE-maldı MS PMF), 2DE-maldı MS/MS ve 2DE-sıvı Kromatografi (LC) MS/MS yordamları başarıyla uygulanan NFPA Proteom analizinde bir. Bir yüksek-duyarlı Kütle Spektrometre kullanımıyla, birçok protein ile her 2D jel insan PA Proteom kapsamını maksimize etmek için karmaşık PA doku analizinde bir spot 2DE-LC-MS/MS yönteminde tespit edilmiştir.

1. 2DE-maldı MS PMF: yukarıda açıklanan deneysel bir işlem ile toplam 150 µg proteinlerin NFPA FSH ifade edilen dokulardan elde (erkek; 50 yıl yaşlı, ACTH (-), GH (-), PRL (-), LH (-), FSH (+) ve TSH (-)) ve bir 18 cm ile dizilmiş IPG Şerit (pH 3-10 NL) ve bir geniş formatlı SDS-sayfa jeli, gümüş boyama ile görüntülenir. NFPA doku Proteom (şekil 1), bir ortalama konum sapma 1,98 ± IEF yönde 0,75 mm ile ve 1.62 ± 0.68 mm SDS-s...

Burada, kütle spektrometresi (ayırmak ve bir iyi ve tekrarlanabilir 2DE desen sunar insan hipofiz adenom doku Proteom tanımlamak için MS) ile birleştiğinde bir iki boyutlu Jel Elektroforez (2DE) mevcut. Çoğu protein her 2DE yerde karmaşık kanser Proteom yüksek-duyarlı MS kullanımı ile analiz ederken gözlenir.

İnsan hipofiz adenom doku Proteom analizi için kütle spektrometresi yöntemleri ile birleştiğinde iki boyutlu Jel Elektroforez

Human pituitary adenoma (PA) is a common tumor that occurs in the human pituitary gland in the hypothalamus-pituitary-targeted organ axis systems, and may ...

Kütle spektrometresi prosedürü ile birleştirilmiş bu iki boyutlu jel elektroforezinin genel amacı, insan hipofiz adenomu doku proteomunu ayırmak ve tanımlamaktır. Bu yöntem, proteomlar alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Proteom yüksekliği gibi.Ve protein durumunun keşfi, protein dört ve protein geniş. Bu tekniğin ana avantajı, iki boyutlu jel elektroforezinin, proteomu, özellikle düşük bolluktaki proteinleri tanımlamak için yüksek hassasiyetli kütle spektrometresi ile kolayca birleştirilmesidir. Protein durumu, protein dört ve protein geniştir.Bu tekniğin uygulamaları hayvan terapisinin PQ itery'sine yöneliktir. Protein için anahtar protein geniş veya protein paterni nedeniyle hastaların tanısında faydalıdır. İki boyutlu jel elektroforez adımlarının öğrenilmesi zor olduğundan, bu yöntemin bir gösteriminin kritik olduğunu gösteriyoruz, çünkü zaman alıcı, emek yoğun ve birkaç deneysel hile var.Bu işleme başlamak için, 13 santimetrelik bir IPG şerit tutucunun her bir yuvasına 250 mikrolitre önceden hazırlanmış bir protein numune çözeltisi ekleyin. Kabarcıkları önlemek için her bir protein numunesi çözeltisinin üzerine jel tarafı aşağı bakacak şekilde 18 santimetrelik bir IPG şeridi yerleştirin. Ardından, her bir IPG şeridini kaplamak için üç ila dört mililitre mineral yağ ekleyin.Ardından, her bir IPG şerit tutucusunu, sivri ucu arka plakada ve kare ucu ön plakada olacak şekilde bir izoelektrik odaklama sistemine monte edin. IPG şeritlerini oda sıcaklığında 18 saat boyunca yeniden sulandırdıktan sonra, izoelektrik odaklama sisteminde IEF parametrelerini toplam 7.5 saat ve 36.875 volt saat çalışma süresi ile ayarlayın. IEF'den sonra, her bir IPG şeridini izoelektrik odaklama sisteminden çıkarın ve fazla mineral yağı çözünmeyen bir kağıt havluyla çıkarın.Ardından her şeridi bir streç filme sarın ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. %12'lik bir jel dökmek için çift damıtılmış su, 1.5 molar tris-hidroklorik tampon, %40 akrilamid, bis-akrilamid stok çözeltisi, %10 immodium persülfat ve bir behere zamanlanmış ekleyin. Kabarcıkları önlemek için jel çözeltisini nazikçe karıştırın.Jel çözeltisini, beklenen jel yüksekliği olan 19 santimetreye kadar çok döküm bir odaya yavaşça dökün. Her bir çözünen jeli kaplamak için çok döküm haznesine hemen yaklaşık üç mililitre çift damıtılmış su ekleyin ve her bir jelin yaklaşık bir saat polimerize olmasına izin verin. Bu adım, yüksek kaliteli bir SDS-PAGE jeli hazırlamak için çok önemlidir ve her jelin üzerine hemen su eklenmelidir.İki litre elektroforez tamponu hazırlayın, ardından tamponu bir elektroforez ayırma ünitesi tampon tankına ekleyin. Odaklanmış IPG şeritlerini dondurucudan çıkardıktan sonra, bir mililitre indirgeyici denge tamponu ve bir miktar bromofenol mavisi içeren plastik bir kaba koyun ve hafifçe sallayarak 10 dakika dengeleyin. İndirgeyici denge tamponunu çıkardıktan sonra, IPG şeritlerine dört mililitre ekselasyon denge tamponu ve bir miktar bromofenol mavisi ekleyin ve hafifçe sallayarak 10 dakika dengeleyin.Jel dengesi sırasında, çoklu döküm haznesini sökün ve hazırlanan çözünen jel kasetini çıkarın. Jel kasetini çift damıtılmış suyla üç kez durulayın, ardından jel kasetindeki erişim suyunu çözünmeyen bir kağıt havluyla çıkarın ve bir jel standerine yerleştirin. Bunu takiben, dengelenmiş IPG şeritlerini elektroforez tamponu ile durulayın ve her bir IPG şeridi yüzeyindeki fazla sıvıyı çözünmeyen bir kağıt havluyla alın.Çözülen SDS-PAGE jelinin üzerine bir IPG şeridi yerleştirin ve IPG şeridinin plastik tarafının, sivri ucu sola bakacak şekilde daha uzun cam plakaya temas etmesine izin verin. Şimdi, IPG şeridini her bir SDS-PAGE jelinin üstüne kapatmak için hızlı bir şekilde üç ila dört mililitre sıcak %1 agaroz ve SDS elektroforez tamponu ekleyin ve IPG şeridinin üst tarafını daha kısa cam plakanın üstüne yerleştirin, kabarcıkları önlemek için. Bu adımlar, IPG şeridini SDS-PAGE jele kapatmak için çok önemlidir.Sıcak agaroz çözeltileri hemen eklenmeli ve IPG şeridi hemen SDS jelinin üstüne yerleştirilmelidir. Polimerizasyondan sonra, monte edilmiş jel kasetini dikey bir elektroforez sisteminde plastik contalar arasına dikey olarak yerleştirin. Jelin üst kısmını, katodun yanındaki IPG şeridi ile yerleştirin.Ardından, elektroforez sistemine uygun hacimde tampon ekleyerek jel kasetini daldırmak için elektroforez tamponunun seviyesini ayarlayın. Güç kaynağını bağlayın ve sabit voltaj modunda ayarlayın ve boyayı izlerken yaklaşık 370 dakika boyunca 200 voltta çalıştırın. Çalışma tamamlandıktan sonra jel kasetini elektroforez sisteminden çıkarın ve jelin yırtılmamasına dikkat ederek jeli jel kasetinden nazikçe çıkarın.Jeli dikkatlice 250 mililitre fiksasyon solüsyonu içeren bir tepsiye aktarın ve jeli 20 dakika boyunca hafifçe çalkalayın. Bunu takiben, çözeltiyi atın ve tepsiye 250 mililitre% 50 metanol ekleyin. Ardından jeli 10 dakika boyunca hafifçe çalkalayın.Jeli çift damıtılmış suda çalkaladıktan sonra,% 0.02 sodyum sülfat içeren 250 mililitre hassaslaştırma tamponu ekleyin. Jeli bir dakika boyunca hafifçe çalkalayın. Jeli çift damıtılmış suda iki kez çalkaladıktan sonra, 250 mililitre gümüş reaksiyon çözeltisi ekleyin ve jeli 20 dakika boyunca hafifçe çalkalayın.Jeli çift damıtılmış suda çalkaladıktan sonra, 250 mililitre geliştirme solüsyonu ekleyin ve istenen lekelenme elde edilene kadar hafifçe çalkalayın, bu tipik olarak bir ila üç dakikadır. Şimdi lekelenmeyi sonlandırmak için 250 mililitre% 5 asidik asit ekleyin ve jeli 10 dakika boyunca hafifçe çalkalayın. Jeli çift damıtılmış suda çalkaladıktan sonra, 250 mililitre% 8.8 gliserol ekleyin ve jeli analize kadar dört santigrat derecede saklayın.NFPA doku proteomunun tekrarlanabilir ve iyi bir iki boyutlu jel modeli, iki boyutlu jel haritasında tespit edilen ve esas olarak pH dört ila sekiz alanı ve kütle 15 ila 150 kilodalton içinde dağılmış olan yaklaşık 1.200 protein noktası ile jel elektroforezinden elde edildi. MALDI-MS PMF analizinde analiz edilen 337 jel noktasından 141 jel noktasından toplam 192 yedekli protein tespit edildi ve kalan 196 noktada protein tanımlanmadı. Commassie mavisi ile boyama, invaziv NFPA doku proteomunun tekrarlanabilir ve yüksek kaliteli iki boyutlu jel paterni ve esas olarak pH dört ila sekiz aralığında ve kütle 15 ila 150 kilodalton arasında dağılmış iki boyutlu bir jel haritasında tespit edilen yaklaşık 1.100 protein noktası verdi.MALDI tof tof MS MS analizi ile nokta başına ortalama bir protein tanımlandı. LC-ESI-MS/MS analizi ile karşılık gelen her noktada çok sayıda protein tanımlandı. Bu veriler, her iki boyutlu jel noktasının karmaşık insan kanser dokusu proteomunda birçok protein içerdiğini açıkça göstermektedir.Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde yapılırsa iki boyutlu jel elektroforezi için 32 saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, özellikle protokole göre adımları takip etmeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, proteomdaki proteinlerin kodlanması gibi ek soruları yanıtlamak için kararlı etiketleme gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, protein karışımı alanındaki araştırmacıların, model koşullarında, hastalarda ve organ sistemlerinde daha büyük ölçekli düşük bollukta protein translasyon sonrası modifikasyonlar, protein uzmanlaşması, protein geniş ve protein dörtünü keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, kütle spektrometresi ile birleştirilmiş iki boyutlu jel elektroforezinin nasıl gerçekleştirileceğini, iyi ve tekrarlanabilir iki boyutlu jel elektroforezi modelinin nasıl elde edileceğini ve her noktada birçok proteinin nasıl tanımlanacağını iyi anlamalısınız. SDS akreomi ve TEMED ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman plastik eldiven giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.

two-dimensional-gel-electrophoresis-coupled-with-mass-spectrometry

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu videoda, insan fonksiyonel olmayan hipofiz adenomunun (NFPA) tümör dokularından elde edilen karmaşık bir protein karışımından tek tek proteinleri ayıran iki boyutlu bir jel elektroforezi yöntemi gösteriyoruz. Proteinler, birinci boyutta elektrik yüklerine göre ayrılır ve ikinci boyutta moleküler ağırlıklara göre daha da ayrılır.

İki Boyutlu Poliakrilamid Jel Elektroforezi: Yük ve Moleküler Ağırlığa Dayalı Kompleks Protein Karışımındaki Proteinlerin Analizi İçin Bir Ayırma Tekniği

Kaynak: Wulf, M., et.al.  Nöromelanin granüllerinin proteomik profilinin LC-MS/MS Analizi için Lazer Mikrodiseksiyon Tabanlı Protokol. J. Vis. Uzm. (2021). Bu video, insan ölüm sonrası beyin dokusundan izole edilen nöromelanin granüllerinden (NMG'ler) peptit örneklerinin analizini göstermektedir. Peptitler önce yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) kullanılarak ayrılır ve daha sonra kütle-yük oranlarını (m/z) belirlemek için kütle spektrometresi ile analiz edilir. Hedeflenen peptitler,...

İnsan Beyin Dokusundan İzole Edilen Nöromelanin Granüllerinin Proteomik Profilinin LC-MS/MS Analizi

İnsan ve fare beyin dokusu için üre / tiyoüre / SDS tamponu kullanılarak ortak bir protein ekstraksiyon protokolü sağlar: 2D-dige ve mini 2DE immunoblotting kendi müteakip özellik tayini ile protein indentification. Bu yöntem, insan biyopsi ve deneysel modellerden gerçekleştirilen daha güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için bir olanak sağlar.

Konsensus Beyin kaynaklı protein, 2D-DIGE ve Mini 2DE İmmünoblotting Hem kullanma İnsan ve Kemirgen Beyin proteomun Çalışmaları Ekstraksiyon Protokolü

Burada, iki çift proteomik teknikleri, yani Elektroforez (2DE) ve kütle spektrometrisi (MS) 2 boyutlu, diferansiyel primer örnekleri, iki veya daha fazla grup arasından / translasyon sonrası modifiye edilmiş proteinler olarak ifade teşhis edilmesi için bir protokol açıklar. Bu yaklaşım, birbirine işlevsel deneyler ile, prognostik parametreler / terapötik hedeflerin tanımlanması ve karakterizasyonu sağlar.

Protein fonksiyonu için bir 2DE-Jel Spot: Kronik Lenfositik Lösemide HS1 öğrendim Ders

Kanser hücresi proteomlarının derinlemesine analizleri, yeni ilaç hedeflerinin ve tanısal biyobelirteçlerin tanımlanmasını kolaylaştırır. Sıvı ve katı tümörlerden türetilen kanser hücresi alt popülasyonlarındaki (fosfo-) proteomların kantitatif analizi için deneysel bir iş akışı açıklıyoruz. Bu, hücresel zenginleştirme stratejilerinin kantitatif Super-SILAC tabanlı kütle spektrometresi ile birleştirilmesiyle elde edilir.

Sıvı ve Katı Tümörler Kaynaklanan Kanser hücre Proteomlar Kantitatif Kitle Spektrometrik Profil

Burada bir etiket bilgilerini kantitatif kütle spektrometresi kullanılarak protein korelasyon profil ardından afinite protein komplekslerinin saflaştırılması ve mavi doğal PAGE ile onların ayrılması için protokoller, mevcut. Bu yöntem, farklı protein kompleksleri halinde interactomes çözmek için yararlıdır.

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Protokol, klinik örneklerden elde edilen proteinlerin Çoklu Reaksiyon İzlemesi (MRM) için üçlü dörtlü kütle spektrometresi kullanımını sağlamayı amaçlamaktadır. Alınması gereken tüm önlemlerle klinik numuneler için numune hazırlamadan veri analizine kadar sistematik bir iş akışı sağladık.

İnsan Beyin Dokusundan Proteinlerin Çoklu Reaksiyon İzleme Tabanlı Tespiti Kullanılarak Nicel Proteomik İş Akışı

Bu yöntem, histon proteoform karakterizasyonu ve araştırması için basit ve hızlı bir stratejiyi tanımlar.

2D-TAU Jel Elektroforezi Kullanılarak Histon Proteoformlarının Ortaya Çıkarılması

Burada, formalinle sabitlenmiş, parafine gömülü doku kesitlerinde izole edilmiş ilgi alanlarını kullanarak kütle spektrometresi tabanlı bir proteomik yöntem oluşturuyoruz. Bu protokol, arşivlenmiş formalinle sabitlenmiş, parafine gömülü doku kesitlerindeki belirli doku alanlarından proteomu analiz etmek için kullanılır.

Seçilmiş Doku Bölgelerini Kullanan Kütle Spektrometresi Tabanlı Proteomikler için Kolaylaştırılmış Bir Yaklaşım

Bu protokol, tümör anjiyogenezinin nicel proteomik analizi için lazer-yakama mikrodiseksiyonu kullanarak glioma örneklerinden yeterli yüksek kaliteli neovasküler doku hazırlamış, geleneksel olarak anjiyojenik faktörlere odaklanan çalışmaların sınırlamalarını aşmış ve glioma anjiyogenezinin geniş ölçekli proteomik profilini sağlamıştır.

İnsan Glioma Dokularından Neovasküler Dokuların Tümör Anjiyogenezinin Nicel Proteomik Analizi İçin Hazırlanması

Keşfedin, iki boyutlu jel elektroforez ve kütle spektrometrisi ile insan hipofiz adenom dokusu proteomunu ayırma ve tanımlama yöntemini. Bu teknik, düşük bolluktaki proteinleri yüksek hassasiyetle tespit ederek kanser proteomik araştırmalarına katkı sağlar.

İnsan hipofiz adenom doku Proteom analizi için kütle spektrometresi yöntemleri ile birleştiğinde iki boyutlu Jel Elektroforez

Daha fazla video keşfet