Name: Görselleştirme bir otomatik mikrosıvısal aygıtı kullanarak Candida albicans biyofilm oluşumu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Keşfedin, otomatik mikrosıvısal aygıt kullanarak Candida albicans biyofilm oluşumunu gerçek zamanlı görselleştirme yöntemini. Bu teknik antimikrobiyal etkinliği ve genetik mutantları değerlendirmeye olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biyofilm deneyleri üzerinde tüm üyeleri için yararlı tartışmalar Nobile laboratuarı, teşekkür ederim. Bu çalışmada Sağlık (NIH) hibe R21 AI125801 (C.J.N.) ulusal Enstitüleri tarafından desteklenmiştir. DLR Üniversitesi California Meksika ve Amerika Birleşik Devletleri (UC-MEXUS) ve Consejo Nacional de Ciencia y Technologia (CONACYT) Enstitüsü'nden Doktora Bursu tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Nobile, C. J., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+Biofilms+and+Human+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Candida albicans Biofilms and Human Disease.</a> Annu Rev Microbiol. 69, 71-92 (2015).</li>
<li>Kojic, E. M., Darouiche, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+infections+of+medical+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Candida infections of medical devices.</a> Clin Microbiol Rev. 17 (2), 255-267 (2004).</li>
<li>Fox, E. P., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFox%2C+EP+%22Candida+albicans%3A+Symptoms%2C+Causes+and+Treatment+Options%22">Candida albicans: Symptoms, Causes and Treatment Options</a>. Dietrich, L. A., Friedmann, T. S. , Nova Science Publishers. 1-24 (2013).</li>
<li>Gulati, M., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+biofilms%3A+development%2C+regulation%2C+and+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms.</a> Microbes Infect. 18 (5), 310-321 (2016).</li>
<li>Uppuluri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispersion+as+an+important+step+in+the+Candida+albicans+biofilm+developmental+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Dispersion as an important step in the Candida albicans biofilm developmental cycle.</a> PLoS Pathog. 6 (3), e1000828(2010).</li>
<li>Andes, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+an+in+vivo+central+venous+catheter+Candida+albicans+biofilm+model%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of an in vivo central venous catheter Candida albicans biofilm model.</a> Infect Immun. 72 (10), 6023-6031 (2004).</li>
<li>Nett, J. E., Marchillo, K., Spiegel, C. A., Andes, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+an+in+vivo+Candida+albicans+biofilm+denture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Development and validation of an in vivo Candida albicans biofilm denture model.</a> Infect Immun. 78 (9), 3650-3659 (2010).</li>
<li>Nett, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+indwelling+urinary+catheter+model+of+Candida+albicans+biofilm+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Rat indwelling urinary catheter model of Candida albicans biofilm infection.</a> Infect Immun. 82 (12), 4931-4940 (2014).</li>
<li>Krom, B. P., Willems, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Models+for+Candida+Biofilm+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In Vitro Models for Candida Biofilm Development.</a> Methods Mol Biol. 1356, 95-105 (2016).</li>
<li>Hawser, S. P., Douglas, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+by+Candida+species+on+the+surface+of+catheter+materials+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation by Candida species on the surface of catheter materials in vitro.</a> Infect Immun. 62 (3), 915-921 (1994).</li>
<li>Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+method+for+in+vitro+antifungal+susceptibility+testing+of+Candida+albicans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms.</a> Antimicrob Agents Chemother. 45 (9), 2475-2479 (2001).</li>
<li>Nett, J. E., Cain, M. T., Crawford, K., Andes, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+a+Candida+biofilm+microtiter+plate+model+for+measurement+of+antifungal+susceptibility+by+tetrazolium+salt+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Optimizing a Candida biofilm microtiter plate model for measurement of antifungal susceptibility by tetrazolium salt assay.</a> J Clin Microbiol. 49 (4), 1426-1433 (2011).</li>
<li>Krom, B. P., Cohen, J. B., McElhaney Feser, G. E., Cihlar, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+candidal+biofilm+microtiter+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized candidal biofilm microtiter assay.</a> J Microbiol Methods. 68 (2), 421-423 (2007).</li>
<li>Lohse, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+and+Optimizations+of+Candida+albicans+In+Vitro+Biofilm+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Assessment and Optimizations of Candida albicans In Vitro Biofilm Assays.</a> Antimicrob Agents Chemother. 61 (5), (2017).</li>
<li>Winter, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Identification+of+Biofilm-Specific+Proteolysis+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Global Identification of Biofilm-Specific Proteolysis in Candida albicans.</a> mBio. 7 (5), (2016).</li>
<li>Nobile, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recently+evolved+transcriptional+network+controls+biofilm+development+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans.</a> Cell. 148 (1-2), 126-138 (2012).</li>
<li>Fox, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+expanded+regulatory+network+temporally+controls+Candida+albicans+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An expanded regulatory network temporally controls Candida albicans biofilm formation.</a> Mol Microbiol. 96 (6), 1226-1239 (2015).</li>
<li>Nobile, C. J., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cell-surface+genes+and+biofilm+formation+by+the+C.+albicans+transcription+factor+Bcr1p%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p.</a> Curr Biol. 15 (12), 1150-1155 (2005).</li>
<li>Baker, K. <a target="_blank" href="https://www.cshlpress.com/link/atbench2.htm">At the bench: A laboratory navigator</a>. 27, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).</li>
</ol>

Clarissa J. Nobile BioSynesis, Inc, inhibitörleri ve C. albicans biyofilmler teşhis gelişen bir şirket kurucusudur.

Burada açıklanan özelleştirilebilir mikrosıvısal biyofilm tahlil biyofilm oluşumu görselleştirme sağlar gerçek zamanlı bir sabit oranlı laminar akış ve sabit sıcaklık maruz bir tek hücre düzeyinde. Vahşi-türü ve mutant suşları biyofilmler gelişimi çalışma için güçlü bir araç sağlar ve klinik ayarlarında antimikrobiyal Ajan tedavilerinin biyofilmler fizyolojik koşulları taklit koşullar altında üzerinde etkileri görülmektedir. Çoğu vitro biyofilm deneyleri, gerçek zamanlı olarak gelişmekte olan bir biyofilm muayen...

Ancak bu aynı zamanda bir fırsatçı patojen, yüzeysel ve ciddi mantar enfeksiyonları1,2neden yeteneğine candida albicans insan microbiota komensal bir üyesidir. Bir büyük virülans özellik C. albicans , onun yetenek forma esnek ve ilaca dirençli biyofilmler, hücre toplulukları bir yüzeye yapıştırılır ve bir hücre dışı matriks malzeme1,3' te alınmış. C. albicans biyofilmler son derece yapısal, birden çok hücre tiplerinin birkaç kat içeren (tomurcuklanma Maya biçimli yuvarlak hücreler, oval pseudohyphal hücreleri ve tübüler hyphal hücreleri)4. C. albicans biyofilm geliştirme yüzeyde bu hücrelerin çoğalması tarafından takip bir yüzey (biyofilm tohum), yuvarlak mantar biçimli hücrelerin bağlılık ile başlar ve sonra olgunlaşmamış biyofilm olgunlaşma yapısı içine bir hücre dışı matriks malzeme4tarafından çevrili tam olarak kurulan biyofilm. Olgun biyofilm ağırlıklı olarak biyofilm4mimari istikrar sağlayarak yoğun ve bağlantılı ağlar oluşturmak uzun hyphal hücreleri oluşur. Biyofilm yaşam döngüsü boyunca mayası yuvarlak hücreler olgun biyofilm dağıtmak ve Dissemine enfeksiyonlara neden veya diğer siteler4,5yeni biyofilmler tohum vücudun diğer bölgelerine seyahat olabilir. C. albicans biyofilmler biyotik yüzeylerde, Mukozal yüzeyler gibi ve ana bilgisayar doku, boyunca ve Kateterler, Kalp pilleri, takma diş ve protez eklemler gibi abiyotik yüzeylerde oluşabilir. Biyofilmler inatçı özelliklerini, nedeniyle ortadan kaldırmak son derece zordur ve çoğu zaman tek etkili tedavi stratejisi enfekte cihaz4çıkartılmasıdır. Böylece biyofilm oluşumu gözlenen klinik ayarlarında benzer koşullarda araştırmak önemlidir.
C. albicans biyofilm oluşumu6,7,8eğitim için kullanılan çeşitli kritik in vivo hayvan modelleri vardır; Ancak, bu çalışmalar ve pahalı, zaman alıcı olabilir suşları ve belirli bir zamanda test edilebilir antimikrobiyal ajanlar sayısıyla sınırlıdır. Vitro biyofilm deneyleri, öte yandan, antifungal bileşikler ve mutant suşları hızlı, yüksek üretilen iş değerlendirmesi için izin ve çok daha düşük maliyetli ve taşınan biyofilm deneyleri daha etik hayvan out modelleri9, 10,11,12,13,14. Burada geliştirilen ve biyofilm oluşumu laminar akış özelleştirilebilir mikrosıvısal aygıt14,15kullanarak geçici altında gözlemlemek için en iyi duruma getirilmiş bir vitro tahlil açıklayın. Tahlil her aşamasında ilk bağlılık adım, hücre çoğalması, biyofilm olgunlaşma ve hücre dağılımı gibi biyofilm oluşumu görselleştirme için sağlar. Tahlil de hücre morfolojisi değişiklikleri bir biyofilm gelişimi boyunca görselleştirmek yararlıdır.
Genellikle yüksek üretilen iş, süre vitro biyofilm deneyleri için kullanılmaktadır Microtiter levha, kontrollü akış koşulları için izin vermez. Geleneksel laminar akım hücre sistemleri biyofilm oluşumu kontrollü akış koşullarında sürekli değerlendirilmesi için izin, ancak bunlar çoğu kez kurmak ve dinamik aralık denetimi ve işlem hacmi sınırlıdır eğilimindedir için zaman alıcı. Burada kullanılan mikrosıvısal cihaz bu sınırlamalar (48 wells içeren) yüksek işlem hacmi plakaları birleştirerek yerleşik laminar akış odası ile üstesinden gelir ve son derece çok yönlü, tekrarlanabilir ve özelleştirilebilir.
Burada, bir vahşi-türü C. albicans biyofilm oluşumu değerlendirmek için piyasada bulunan otomatik mikrosıvısal cihazın kullanımı için bir protokol tarif zorlanma, bilinen bir antifungal ajan bir biyofilm ve biyofilm gelişimi üzerine etkisi daha önce biyofilm için rapor edilmiştir (bcr1Δ/Δ ve efg1 Δ/Δ) iki mutant suşları oluşumunda vitro ve in vivo16,17,18kusurları. Açıklanan Protokolü biyofilm oluşumu bir biyofilm gelişimi boyunca inhibe antimikrobiyal ajanların etkinliğini test etmek ve mutant kitaplıkları eleme tarafından normal biyofilm gelişimi için gerekli genler tanımlamak için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>BioFlux 1000z</td><td>Fluxion</td><td></td><td>Canlı hücre analizi için otomatik mikroakışkan cihaz</td></tr><tr><td>48 oyuklu plaka 0-20 dyne</td><td>Fluxion</td><td>910-0047</td><td>Mikroakışkan plaka</td></tr><tr><td>Montaj Yazılımı</td><td>Fluxion</td><td>Sürüm 7.8.4.0</td><td>Görselleştirme analiz yazılımı</td></tr><tr><td>ImageJ Yazılımı</td><td>NIH</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr> <tr><td>Maya Özü</td><td>Kriter</td><td>C7341</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Dekstroz (D-Glikoz)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>D163</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Fosfat Monobazik</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6504</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3183</td><td></td></tr><tr><td>Besin Suyu Kriteri</td><td></td><td>C6471</td><td></td></tr><tr><td>Difco D-Mannitol</td><td>BD Biosciences</td><td>217020</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Kriteri</td><td>C5001</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterisin B</td><td>Corning</td><td>30-003-CF</td><td></td></tr><tr><td>Steril Aşılama Döngüleri</td><td>VWR</td><td>30002-094</td><td></td></tr><tr><td>Şeffaf Kapaklı Petri Kapları</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Küvetler</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-127</td><td></td></tr><tr><td>Lens Kağıdı</td><td>VWR</td><td>52846-001</td><td></td></tr><tr><td>Mikroplaka ve Küvet Spektrofotometresi</td><td>BioTek</td><td>EPOCH2TC</td><td></td></tr><tr><td>Çalkalama İnkübatörü</td><td>Eppendorf</td><td>M12820004</td><td></td></tr></tbody></table>

görselleştirme bir otomatik mikrosıvısal aygıtı kullanarak candida albicans biyofilm oluşumu

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans hastane edinilen sepsis vakaların yaklaşık % 15'i neden insanlar, en sık görülen mantar patojen var. Bir büyük virülans C. albicans özniteliktir onun yetenek-e doğru formu biyofilmler, biyotik ve abiyotik yüzeylere bağlı hücre yapılandırılmış topluluklar. C. albicans biyofilmler Mukozal katmanlar gibi ana bilgisayar doku ve tıbbi cihazlar, Kateterler, Kalp pilleri, protez ve eklem protezleri gibi oluşabilir. Fiziksel ve kimyasal tedirginlikler için son derece dayanıklıdır ve tohum için rezervuarlar enfeksiyonlar Dissemine hareket edebilir çünkü biyofilmler önemli klinik sorunlar teşkil. Çeşitli vitro deneyleri C. albicans biyofilm oluşumu, microtiter plaka deneyleri, Kuru Ağırlık ölçüleri, hücre canlılığı deneyleri ve confocal tarama lazer mikroskobu gibi eğitim için kullanılmıştır. Tüm bu deneyleri tek son nokta deneyleri, nerede biyofilm oluşumu belirli bir zaman noktasında değerlendirilir vardır. Burada, biz gerçek zamanlı laminar akış koşullar altında bir otomatik mikrosıvısal aygıt kullanarak biyofilm oluşumu çalışma için bir protokol tanımlamak. Biyofilm zaman içinde bu ana bilgisayarın bu vasküler kateter karşılaştı gibi taklit özelleştirilebilir koşul kullanma geliştikçe bu yöntem biyofilm oluşumu gözlem için sağlar. Bu iletişim kuralı genetik mutantlar biyofilm kusurlarý yanı sıra biyofilm geliştirme gerçek zamanlı olarak antimikrobiyal ajanlar inhibitör etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir.

Biz burada bir vahşi türünü kullanarak açıklanan mikrosıvısal biyofilm tahlil gerçekleştirilen C. albicans baskı altında iki ortam koşulları (RPMI-1640 ve örümcek medya), yaban tipi zorlanma bilinen antifungal ilaç RPMI, Amfoterisin B (16 µg/mL) huzurunda ve iki mutant suşları daha önce biyofilm oluşumu (bcr1Δ/Δ ve efg1 Δ/Δ) örümcek medya kusurları olup bildirdi.
Video 1 yaban tipi biyofilm gelişimi RP...

Bu protokol ana bilgisayar fizyolojik koşullar altında Candida albicans biyofilm oluşumu görselleştirmek için özelleştirilebilir otomatik mikrosıvısal aygıt kullanımını açıklar.

Görselleştirme bir otomatik mikrosıvısal aygıtı kullanarak Candida albicans biyofilm oluşumu

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Bu protokolün genel amacı, Candida albicans'ın biyofilm oluşumunu konak fizyolojik koşulları altında gerçek zamanlı olarak görselleştirmektir. Bu yöntem, biyofilm oluşumunun gerçek zamanlı olarak geliştikçe gözlemlenmesini sağlar ve antimikrobiyal ajanların etkinliğini test etmek veya genetik mutantları değerlendirmek için kullanılabilir. Bu teknik, potansiyel terapötiklerin biyofilmlere karşı yüksek verimli bir şekilde aktivite açısından taranması için kullanılabilir ve etkinlikleri ölçülebilir, görselleştirilebilir ve mevcut tedavilerle karşılaştırılabilir.Bu tekniğin temel avantajı, araştırmacıların ilgisini çeken birkaç farklı koşul altında biyofilm oluşumunu test etmek için kullanılabilmesidir. Bu yöntem özellikle Candida albicans biyofilm oluşumunu incelemek için geliştirilmiş olsa da, bakterilerin yanı sıra diğer mantar türleri de dahil olmak üzere diğer biyofilm oluşturan mikroorganizmalara da uygulanabilir. Başlamak için, standart mikrobiyolojik uygulamaları izleyerek maya özütü pepton dekstroz veya YPD orta agar üzerine kaplanmış hücrelerden farklı C.albicans suşlarının tek koloni kültürlerini hazırlayın.Ardından, denetleyiciyi, iki güç kaynağı ünitesini, mikroskobu, kamerayı ve sisteme bağlı bilgisayarı içeren mikroakışkan sistemi açın. Bilgisayar yüklendikten sonra, sistemi kontrol eden yazılımı açın. Kullanılan plakanın barkod numarasını bulun ve yazılım tarafından istendiğinde numarayı girin.Ardından kontrol modülünde, mikroakışkan sistem sıcaklığını 37 santigrat dereceye ayarlayın. Ardından, I1, I7, I13 ve I19 giriş kuyularına tıklayın ve yoğuşmayı gidermek için steril havayı arayüz plakası tüplerinden beş dakika boyunca akıtın. Tüm yoğuşma buharlaştığında, 48 kuyulu 0-20 dyne mikroakışkan plakayı mikroskop tablasına yerleştirin.12 saatlik bir biyofilm oluşum deneyi için, giriş kuyucuklarına 600 mikrolitre önceden ısıtılmış ortam ekleyerek başlayın. Temizlenmiş arayüz plakasını 48 oyuklu mikroakışkan plakanın üzerine yavaşça indirin. Ardından, tüpler giriş ve çıkış kuyularının üzerine yerleştirilene ve yerine kilitlenene kadar arayüz plakasını hafifçe sola kaydırın.Yazılımın kesme kontrolü bölümünde, akış modunu sabit olarak ayarlayın ve maksimum kesmeyi santimetre kare başına bir dyne olarak ayarlayın. Ardından, kanalı doldurmak için girişten çıkış kuyularına medya akışını başlatmak için medya ile giriş kuyularına tıklayın. Beş dakikalık akıştan sonra, yazılımın kuyu plakası kontrol bölümündeki durdur düğmesine tıklayın.Ardından arayüz plakasını çıkarın ve mikroakışkan plaka kuyularını gözlemleyin. Çıkış kuyularında sadece küçük bir damla medya görünmelidir. Yabani tip ve mutant C.albicans suşlarını test etmek için, örümcek ortamındaki 50 mikrolitre vahşi tip SC5314 hücre kültürünü iki çıkış kuyusuna ekleyin, örümcek ortamındaki bcr1 mutantını iki çıkış kuyusuna ekleyin ve örümcek ortamındaki EFG1 mutantını iki çıkış kuyusuna ekleyin.Arayüz plakasını tekrar mikroakışkan plakaya yerleştirin ve kapağı yerine kilitleyin. Yazılımın kesme kontrolü bölümüne geri dönün, akış modunu sabit olarak ayarlayın ve maksimum kesmeyi santimetre kare başına iki dyne olarak ayarlayın. C.albicans'ın tohumlanmasına başlamak için çıkıştan giriş kuyularına ortam akışını başlatmak için hücreli çıkış kuyularına tıklayın.Üç saniye sonra, hücrelerin giriş kuyularına girmesini önlemek için kuyu plakası kontrol bölümündeki durdur düğmesine tıklayın. İlk hücre yapışması için hücrelerin görüntüleme kanalında 10-20 dakika boyunca akış olmadan sabit kalmasına izin verin. Görüntüleme modülü penceresinde, çok boyutlu çekim modülünü açın ve sol taraftaki menüde yer alan aşama sekmesine tıklayın.Aşama bölümünde, 48 kuyucuklu 0-20 dyne mikroakışkan plakası için ana aşama listesini yükleyin. Ardından, numune yeniden yükleme ayarını açın ve aşamayı mutlak konum modüllerine taşıyın. Örnek yeniden yükleme ayarlama modülünde, artı işaretli bir görüntü önizlemesi görmek için canlı düğmesine basın.Joystick'i kullanarak, kuyu plakasını, görüntüleme kanalı dördüncü'nün yanındaki okun ucu yazılımdaki artı işaretiyle aynı hizaya gelecek şekilde konumlandırın. Ardından sahneyi mutlak konuma taşı menüsüne gidin ve başlangıç noktasını ayarla düğmesine basın. Ardından, numune yeniden yükleme ayar modülüne geri dönün, sol taraftaki menüdeki ilk referans noktası bölümüne tıklayın ve 48 kuyulu 0-20 dyne mikroakışkan plaka için dosyayı yükleyin.Çok boyutlu alım modülünün sahne bölümünde, mikroskop görüntüleme aşamasını ve kamera odağını kanal 22.2'yi görüntüleyerek ok işaretçisine yaklaştırmak için sahne konumu 22'ye çift tıklayın. Ardından, kuyu plakasını, görüntüleme kanalı 22'nin yanındaki okun ucu artı işaretiyle aynı hizada olacak şekilde konumlandırmak için joystick'i kullanın. Çok boyutlu alım modülündeki Y koordinatını 'nin Y konumuna kopyalayın.2 Örnek yeniden yükleme ayarlama modülünün Referans Noktalarını Güncelle sekmesinde. Son olarak, örnek yeniden yükleme ayarlama modülünün güncelleme aşaması konumları sekmesinde, MDA aşama listesine uygula'ya tıklayın. Görüntüleme modülü penceresinde, çok boyutlu çekim modülünü kullanın ve sol menüde yer alan kaydet sekmesine tıklayın.Ardından, denemenin dosya adını ve alınan görüntülerin bilgisayarda depolanacağı klasörü seçin. Ardından, timelapse sekmesine tıklayın ve her görüntü arasında beş dakika içinde toplam 145 görüntü elde edecek şekilde ayarlayın. Ardından dalga boyları sekmesinde, dalga boyu sayısını bire ayarlayın ve 12-20 milisaniyelik pozlama süresiyle %50 Parlak Alan ve %50 kamerada yakalayın.Kazancı 0,6'ya ve sayısallaştırıcıyı 20 miliHertz'e ayarlayın. Odağı ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi ayarladıktan sonra, tüm alt aşamalar için yapıştırılmış hücrelerin ön temizleme görüntülerini yakalamaya başlamak için al'ı seçin. Kesme kontrolü bölümünde, akış modunu sabit ve maksimum kesmeyi santimetre kare başına bir dyne olarak ayarlayın.Ardından, yapışmamış hücreleri çıkarmak için girişten çıkış kuyularına ortam akışını başlatmak için giriş kuyularına tıklayın. Beş dakika sonra, kuyu plakası kontrol bölümündeki durdur düğmesine tıklayın. İkinci bir görüntü turunun alınmasına izin verin ve ardından yamultma kontrolü bölümünde, maksimum yamultma akışını santimetre kare başına 0,5 dyne olarak ayarlayın ve değişikliği onaylayın.Görüntüleme modülü penceresinde, analiz araçları sekmesini seçin ve açılır menüden çok boyutlu verileri incele'ye tıklayın. Ardından temel dosya seç'e tıklayın. Bu, çok boyutlu veri kümesi yardımcı programları penceresini açacaktır.Ardından, dizin seç düğmesine tıklayın ve deneyi kaydetmek için kullanılan klasörü seçin. Veri kümeleri listesinde, deneme dosyası günlüğünü seçin. Günlük yüklendikten sonra, görüntüle düğmesine tıklayın.Sol taraftaki dalga boyları menüsündeki seçeneklere tıklayarak dalga boyunu seçin ve açılır menüden görüntülenecek sahne konumunu seçin. Görüntü numarasına sağ tıklayarak modülün üst kısmında bulunan numaralardan yüklenecek görüntüyü seçin. Ardından, hızlandırılmış bir video yapmak için tüm görüntüleri seçin.Seçilen görüntüler yeni bir pencerede video olarak açılacaktır. Görüntüleme modülü penceresindeki dosya sekmesine tıklayın ve açılır menüden farklı kaydet'i seçin. Ortaya çıkan videoyu varsayılan dosya formatı olarak kaydedin.Son olarak, kaydedilen video dosyasını açın ve resim J.In resim J'ye yükleyin, dosya sekmesine tıklayın ve ardından farklı kaydet'e tıklayın. Açılır menüden AVI'yi seçin ve saniyede 10 kare olarak ayarlanmış JPEG dönüştürmeyi kullanarak dosyayı bir AVI dosyasına dönüştürün. RPMI 1640 ortamındaki vahşi tip koşullar altında, birkaç hücre kanala güçlü bir şekilde yapıştı.Hifler oluştururlar ve hiflerin ve maya hücrelerinin iç içe geçmesiyle kalın bir biyofilm gözlenebilir. Mikroakışkan deneyin sonlarına doğru, vahşi tip biyofilm bu izleme kanalını tamamen doldurur. Bununla birlikte, amfoterisin B'nin varlığı, biyofilm oluşumunu azaltmada belirgin bir etkiye sahiptir.Spesifik olarak, hücrelerin yapışması azalır ve ortamın kesme akışıyla birkaç hücrenin aktığı görülebilir. Bu kez örümcek ortamında büyütülen vahşi tip kontrol hücreleri, RPMI'de büyüdüğü gösterilene benzer bir biyofilm oluşturdu. Ayrıca bu ortamda yetiştirilen iki biyofilm kusurlu mutanttır.Her iki suş da kontrole kıyasla ciddi şekilde azalmış biyofilm oluşumu gösterir. Bu hücre popülasyonunda, yapışık hücreler hif oluşturmaz ve ortaya çıkan biyofilm ciddi şekilde kusurludur. Bu diğer suş hem biyofilm oluşumunda hem de kanala yapışma kabiliyetinde kusurludur.Bir kez ustalaştıktan sonra, bu deney bir saatten daha kısa sürede kurulabilir. Bu yöntemi kullanarak, ilk hücre yapışması, biyofilm olgunlaşması ve hücre dağılımı dahil olmak üzere biyofilm oluşumunun bir dizi farklı yönü hakkında çok şey öğrenilebilir. Bu protokol son derece özelleştirilebilir ve çok yönlüdür.Krallıklar arasında farklı mikrobiyal türleri değerlendirmek için ayarlanabilir. Akış hızları, sıcaklıklar, kuluçka süreleri ve ortamlar karışık türlerin biyofilmlerini incelemek için de kullanılabilir. Bu mikroakışkan biyofilm testini, in vivo hayvan testlerinden önce kullanılmak üzere bir in vitro test olarak şiddetle tavsiye ediyoruz.Deneyimlerimize göre, bu testten elde edilen sonuçlar mevcut in vivo biyofilm testleriyle çok iyi bir korelasyon göstermektedir.

visualization-biofilm-formation-candida-albicans-using-an-automated

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Biz oluşumu için basit, hızlı ve sağlam bir bir yöntem...

İzleme Oluşumu ve Antifungal Duyarlılık Testi için 96 Şey microtiter Levha tabanlı Yöntemi Candida albicans Biyofilmler

Biz 3D nano-biyofilm oluşan yüksek yoğunluklu mikroarray platformu...

Yüksek verim Antifungal İlaç Tarama Candida albicans Biyofilm Chip (Ca BChip)

Kaynak: Kurz, D. L. ve diğerleri. Gözenekli ortamlarda biyotıkanmayı incelemek için mikrofluidik platform. J. Vis. Exp. (2022)Video, biyofilm oluşumunu incelemek için mikrofluidik cihazın kullanıldığını gösteriyor. Mikrokanala bakteriyel bir süspansiyon getirilir ve ardından biyofilm gelişimi için kuluçka yapılır. Akış daha sonra yeniden başlatılır ve basınç izleme ile görüntüleme kullanılarak biyofilm oluşumu ve gözenek tıkanıklığı zamanla tespit edilir.

Biyofilm oluşumu sırasında gerçek zamanlı görüntüleme ve basınç takibi için mikrofluidik bir cihaz

Bu video, Candida albicans'ın deri altı dokuda biyofilm oluşumunu incelemek için bir in vivo fare modelinin geliştirilmesini göstermektedir. Deney, Candida ile enfekte olmuş cihazların biyofilm gelişimi için hayvanın sırt bölgesine implante edilmesini içeriyor.

Candida albicans Bir İn Vivo Fare Modelinde Biyofilm Oluşumu

Bu videoda, mikroskopi kullanarak mantar hifleri üzerinde bakteriyel biyofilmleri büyütmek ve kalitatif olarak analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bakteriyel biyofilmler sıklıkla mantar yüzeylerinde oluşur ve metabolik işbirliği, rekabet veya avlanma gibi çok sayıda bakteri-mantar etkileşim sürecini içerir.

Mantar Hifleri Üzerinde Biyofilm Oluşturan Bakterileri Görselleştirmek için Numune Hazırlama Yöntemi

Gözenekli ortamı taklit eden mikroakışkan bir cihazda biyofilm oluşumunun incelenmesi için protokoller tartışılmaktadır. Mikroakışkan cihaz, bir dizi mikro sütundan oluşur ve bu cihazda Pseudomonas floresanları tarafından biyofilm oluşumu incelenir.

Mikro-ayağı ile bir mikroakışkan Aygıt Biyofilm Çıtası Formasyonu Protokolü

Bir fare deri altı modelinde Candida albicans biyofilm gelişiminin deneysel bir prosedürünü sunuyoruz. Mantar biyofilmleri, koloni oluşturan birimlerin sayısının belirlenmesi ve üretilen ışık miktarının canlı hücre sayısına karşılık geldiği invaziv olmayan bir biyolüminesans görüntüleme ile ölçüldü.

Biyoparlaklık Görüntüleme Ardından Fare Subkutan Modeli Tıbben-ilgili yabancı Organları Candida albicans Biyofilm Geliştirme

Bu yöntemler kağıt amacı tipik insan Mikrobiyal dental plak tespit türler içeren çok tür biyofilm gelişmesi için mikroakışkan sisteminin kullanımını tarif etmektir. Yöntem biyofilm mimarisi, biyofilm canlılığı ve vurgulanır kültür-bağımlı veya kültür-bağımsız analizler için hasat biyofilm bir yaklaşım açıklamak için.

Yüksek verimli bir kullanımı<em&gt; İn Vitro</em&gt; Mikroakışkan Sistemi Ağız Çok türler biyofilm Geliştirmek İçin

Bu protokol büyümek ve niteliksel konfokal ve elektron mikroskobu ile mantar hif bakteri biyofilm analiz etmek için yeni bir yöntem açıklanır.

Yeni Bir Yöntem Filamentli Mantar kolonileri ile ilgili Bakteriyel Biyofilmler Niteliksel Çok ölçekli Analizi için kullanılması Eşodaklı ve Elektron Mikroskobu

Biz derleme işlemi, tarif ve gerçek zamanlı akış iken altında görüntü mantar biyofilm oluşumu için bir akış cihazları temizlik tasarlanmış. Biz de sağlamak ve elde edilen görüntülerde kullanılmak üzere sayısal algoritmalar tartışıyorlar.

Gerçek zamanlı görüntüleme ve miktar iki aşamalı dolaşım akış sistemi kullanarak mantar biyofilm gelişimi

Candida albicans biyofilmlerinin iç özelliklerini görüntülemek ve ölçmek için, kırılma indisi eşleştirmesi ile açıklığa kavuşturulan sabit bozulmamış numuneler hazırlıyoruz. Daha sonra, optik kesit mikroskopisi biyofilmin tam kalınlığı na rağmen üç boyutlu görüntü verilerini elde etmek için kullanılabilir.

Aydınlatma ve Görüntüleme Candida albicans Biyofilmler

Keşfedin, otomatik mikrosıvısal aygıt kullanarak Candida albicans biyofilm oluşumunu gerçek zamanlı görselleştirme yöntemini. Bu teknik antimikrobiyal etkinliği ve genetik mutantları değerlendirmeye olanak tanır.

Görselleştirme bir otomatik mikrosıvısal aygıtı kullanarak Candida albicans biyofilm oluşumu

Daha fazla video keşfet