Görselleştirme bir otomatik mikrosıvısal aygıtı kullanarak Candida albicans biyofilm oluşumu

Bu protokolün genel amacı, Candida albicans'ın biyofilm oluşumunu konak fizyolojik koşulları altında gerçek zamanlı olarak görselleştirmektir. Bu yöntem, biyofilm oluşumunun gerçek zamanlı olarak geliştikçe gözlemlenmesini sağlar ve antimikrobiyal ajanların etkinliğini test etmek veya genetik mutantları değerlendirmek için kullanılabilir. Bu teknik, potansiyel terapötiklerin biyofilmlere karşı yüksek verimli bir şekilde aktivite açısından taranması için kullanılabilir ve etkinlikleri ölçülebilir, görselleştirilebilir ve mevcut tedavilerle karşılaştırılabilir.

Bu tekniğin temel avantajı, araştırmacıların ilgisini çeken birkaç farklı koşul altında biyofilm oluşumunu test etmek için kullanılabilmesidir. Bu yöntem özellikle Candida albicans biyofilm oluşumunu incelemek için geliştirilmiş olsa da, bakterilerin yanı sıra diğer mantar türleri de dahil olmak üzere diğer biyofilm oluşturan mikroorganizmalara da uygulanabilir. Başlamak için, standart mikrobiyolojik uygulamaları izleyerek maya özütü pepton dekstroz veya YPD orta agar üzerine kaplanmış hücrelerden farklı C.albicans suşlarının tek koloni kültürlerini hazırlayın.

Ardından, denetleyiciyi, iki güç kaynağı ünitesini, mikroskobu, kamerayı ve sisteme bağlı bilgisayarı içeren mikroakışkan sistemi açın. Bilgisayar yüklendikten sonra, sistemi kontrol eden yazılımı açın. Kullanılan plakanın barkod numarasını bulun ve yazılım tarafından istendiğinde numarayı girin.

Ardından kontrol modülünde, mikroakışkan sistem sıcaklığını 37 santigrat dereceye ayarlayın. Ardından, I1, I7, I13 ve I19 giriş kuyularına tıklayın ve yoğuşmayı gidermek için steril havayı arayüz plakası tüplerinden beş dakika boyunca akıtın. Tüm yoğuşma buharlaştığında, 48 kuyulu 0-20 dyne mikroakışkan plakayı mikroskop tablasına yerleştirin.

12 saatlik bir biyofilm oluşum deneyi için, giriş kuyucuklarına 600 mikrolitre önceden ısıtılmış ortam ekleyerek başlayın. Temizlenmiş arayüz plakasını 48 oyuklu mikroakışkan plakanın üzerine yavaşça indirin. Ardından, tüpler giriş ve çıkış kuyularının üzerine yerleştirilene ve yerine kilitlenene kadar arayüz plakasını hafifçe sola kaydırın.

Yazılımın kesme kontrolü bölümünde, akış modunu sabit olarak ayarlayın ve maksimum kesmeyi santimetre kare başına bir dyne olarak ayarlayın. Ardından, kanalı doldurmak için girişten çıkış kuyularına medya akışını başlatmak için medya ile giriş kuyularına tıklayın. Beş dakikalık akıştan sonra, yazılımın kuyu plakası kontrol bölümündeki durdur düğmesine tıklayın.

Ardından arayüz plakasını çıkarın ve mikroakışkan plaka kuyularını gözlemleyin. Çıkış kuyularında sadece küçük bir damla medya görünmelidir. Yabani tip ve mutant C.albicans suşlarını test etmek için, örümcek ortamındaki 50 mikrolitre vahşi tip SC5314 hücre kültürünü iki çıkış kuyusuna ekleyin, örümcek ortamındaki bcr1 mutantını iki çıkış kuyusuna ekleyin ve örümcek ortamındaki EFG1 mutantını iki çıkış kuyusuna ekleyin.

Arayüz plakasını tekrar mikroakışkan plakaya yerleştirin ve kapağı yerine kilitleyin. Yazılımın kesme kontrolü bölümüne geri dönün, akış modunu sabit olarak ayarlayın ve maksimum kesmeyi santimetre kare başına iki dyne olarak ayarlayın. C.albicans'ın tohumlanmasına başlamak için çıkıştan giriş kuyularına ortam akışını başlatmak için hücreli çıkış kuyularına tıklayın.

Üç saniye sonra, hücrelerin giriş kuyularına girmesini önlemek için kuyu plakası kontrol bölümündeki durdur düğmesine tıklayın. İlk hücre yapışması için hücrelerin görüntüleme kanalında 10-20 dakika boyunca akış olmadan sabit kalmasına izin verin. Görüntüleme modülü penceresinde, çok boyutlu çekim modülünü açın ve sol taraftaki menüde yer alan aşama sekmesine tıklayın.

Aşama bölümünde, 48 kuyucuklu 0-20 dyne mikroakışkan plakası için ana aşama listesini yükleyin. Ardından, numune yeniden yükleme ayarını açın ve aşamayı mutlak konum modüllerine taşıyın. Örnek yeniden yükleme ayarlama modülünde, artı işaretli bir görüntü önizlemesi görmek için canlı düğmesine basın.

Joystick'i kullanarak, kuyu plakasını, görüntüleme kanalı dördüncü'nün yanındaki okun ucu yazılımdaki artı işaretiyle aynı hizaya gelecek şekilde konumlandırın. Ardından sahneyi mutlak konuma taşı menüsüne gidin ve başlangıç noktasını ayarla düğmesine basın. Ardından, numune yeniden yükleme ayar modülüne geri dönün, sol taraftaki menüdeki ilk referans noktası bölümüne tıklayın ve 48 kuyulu 0-20 dyne mikroakışkan plaka için dosyayı yükleyin.

Çok boyutlu alım modülünün sahne bölümünde, mikroskop görüntüleme aşamasını ve kamera odağını kanal 22.2'yi görüntüleyerek ok işaretçisine yaklaştırmak için sahne konumu 22'ye çift tıklayın. Ardından, kuyu plakasını, görüntüleme kanalı 22'nin yanındaki okun ucu artı işaretiyle aynı hizada olacak şekilde konumlandırmak için joystick'i kullanın. Çok boyutlu alım modülündeki Y koordinatını 'nin Y konumuna kopyalayın.

2 Örnek yeniden yükleme ayarlama modülünün Referans Noktalarını Güncelle sekmesinde. Son olarak, örnek yeniden yükleme ayarlama modülünün güncelleme aşaması konumları sekmesinde, MDA aşama listesine uygula'ya tıklayın. Görüntüleme modülü penceresinde, çok boyutlu çekim modülünü kullanın ve sol menüde yer alan kaydet sekmesine tıklayın.

Ardından, denemenin dosya adını ve alınan görüntülerin bilgisayarda depolanacağı klasörü seçin. Ardından, timelapse sekmesine tıklayın ve her görüntü arasında beş dakika içinde toplam 145 görüntü elde edecek şekilde ayarlayın. Ardından dalga boyları sekmesinde, dalga boyu sayısını bire ayarlayın ve 12-20 milisaniyelik pozlama süresiyle %50 Parlak Alan ve %50 kamerada yakalayın.

Kazancı 0,6'ya ve sayısallaştırıcıyı 20 miliHertz'e ayarlayın. Odağı ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi ayarladıktan sonra, tüm alt aşamalar için yapıştırılmış hücrelerin ön temizleme görüntülerini yakalamaya başlamak için al'ı seçin. Kesme kontrolü bölümünde, akış modunu sabit ve maksimum kesmeyi santimetre kare başına bir dyne olarak ayarlayın.

Ardından, yapışmamış hücreleri çıkarmak için girişten çıkış kuyularına ortam akışını başlatmak için giriş kuyularına tıklayın. Beş dakika sonra, kuyu plakası kontrol bölümündeki durdur düğmesine tıklayın. İkinci bir görüntü turunun alınmasına izin verin ve ardından yamultma kontrolü bölümünde, maksimum yamultma akışını santimetre kare başına 0,5 dyne olarak ayarlayın ve değişikliği onaylayın.

Görüntüleme modülü penceresinde, analiz araçları sekmesini seçin ve açılır menüden çok boyutlu verileri incele'ye tıklayın. Ardından temel dosya seç'e tıklayın. Bu, çok boyutlu veri kümesi yardımcı programları penceresini açacaktır.

Ardından, dizin seç düğmesine tıklayın ve deneyi kaydetmek için kullanılan klasörü seçin. Veri kümeleri listesinde, deneme dosyası günlüğünü seçin. Günlük yüklendikten sonra, görüntüle düğmesine tıklayın.

Sol taraftaki dalga boyları menüsündeki seçeneklere tıklayarak dalga boyunu seçin ve açılır menüden görüntülenecek sahne konumunu seçin. Görüntü numarasına sağ tıklayarak modülün üst kısmında bulunan numaralardan yüklenecek görüntüyü seçin. Ardından, hızlandırılmış bir video yapmak için tüm görüntüleri seçin.

Seçilen görüntüler yeni bir pencerede video olarak açılacaktır. Görüntüleme modülü penceresindeki dosya sekmesine tıklayın ve açılır menüden farklı kaydet'i seçin. Ortaya çıkan videoyu varsayılan dosya formatı olarak kaydedin.

Son olarak, kaydedilen video dosyasını açın ve resim J.In resim J'ye yükleyin, dosya sekmesine tıklayın ve ardından farklı kaydet'e tıklayın. Açılır menüden AVI'yi seçin ve saniyede 10 kare olarak ayarlanmış JPEG dönüştürmeyi kullanarak dosyayı bir AVI dosyasına dönüştürün. RPMI 1640 ortamındaki vahşi tip koşullar altında, birkaç hücre kanala güçlü bir şekilde yapıştı.

Hifler oluştururlar ve hiflerin ve maya hücrelerinin iç içe geçmesiyle kalın bir biyofilm gözlenebilir. Mikroakışkan deneyin sonlarına doğru, vahşi tip biyofilm bu izleme kanalını tamamen doldurur. Bununla birlikte, amfoterisin B'nin varlığı, biyofilm oluşumunu azaltmada belirgin bir etkiye sahiptir.

Spesifik olarak, hücrelerin yapışması azalır ve ortamın kesme akışıyla birkaç hücrenin aktığı görülebilir. Bu kez örümcek ortamında büyütülen vahşi tip kontrol hücreleri, RPMI'de büyüdüğü gösterilene benzer bir biyofilm oluşturdu. Ayrıca bu ortamda yetiştirilen iki biyofilm kusurlu mutanttır.

Her iki suş da kontrole kıyasla ciddi şekilde azalmış biyofilm oluşumu gösterir. Bu hücre popülasyonunda, yapışık hücreler hif oluşturmaz ve ortaya çıkan biyofilm ciddi şekilde kusurludur. Bu diğer suş hem biyofilm oluşumunda hem de kanala yapışma kabiliyetinde kusurludur.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu deney bir saatten daha kısa sürede kurulabilir. Bu yöntemi kullanarak, ilk hücre yapışması, biyofilm olgunlaşması ve hücre dağılımı dahil olmak üzere biyofilm oluşumunun bir dizi farklı yönü hakkında çok şey öğrenilebilir. Bu protokol son derece özelleştirilebilir ve çok yönlüdür.

Krallıklar arasında farklı mikrobiyal türleri değerlendirmek için ayarlanabilir. Akış hızları, sıcaklıklar, kuluçka süreleri ve ortamlar karışık türlerin biyofilmlerini incelemek için de kullanılabilir. Bu mikroakışkan biyofilm testini, in vivo hayvan testlerinden önce kullanılmak üzere bir in vitro test olarak şiddetle tavsiye ediyoruz.

Deneyimlerimize göre, bu testten elde edilen sonuçlar mevcut in vivo biyofilm testleriyle çok iyi bir korelasyon göstermektedir.