Gerçek zamanlı analiz bağlama, transkripsiyon, çeviri ve ciro hücresel etkinleştirme sırasında küresel olayları görüntülemek üzere transkripsiyon faktörü

Bu deney düzeneğinin genel amacı, bir uyarana veya tedaviye yanıt olarak meydana gelen temel moleküler mekanizmaları ortaya çıkarmak için RNA ve DNA düzenlemesinin ana katmanlarını tanımlamaktır. Bu yöntem, genel olarak bağışıklık tepkileri ve aynı zamanda ilaç tedavisine moleküler yanıtlar gibi birçok farklı biyolojik alandaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, zaman içinde birden fazla gen düzenleme katmanını aynı anda görüntülemenizi sağlamasıdır.

Bu nedenle, her yöntem için aynı hücre havuzunu kullanmak önemlidir. Genel olarak konuşursak, bu üç protokol ilk önce ilgilenilen hücrelerin farklı zaman noktalarına manipüle edilmesini içerir. Her manipülasyondan sonra, hücreler toplanır ve her tahlil için bir tane olmak üzere üç gruba ayrılır.

Videonun bu bölümü, 4sU etiketleme kullanılarak en son üretilen transkriptlerin etiketlenmesini ve saflaştırılmasını açıklar. Her protokol nihayetinde dizileme için hazır numuneler üretir. İlk olarak, ilgilenilen hücre hattı için gereken gerekli 4sU konsantrasyonunu ve inkübasyon süresini arayın.

Örneğin, T hücrelerinde bir saat boyunca 200 mikromolar 4sU kullanılır. Tedaviden sonra hücre havuzunu her yöntem ve zaman noktası için ayrı bir kaba ayırın. Daha sonra, gerekli sayıda 4sU alikotunu tamamen çözün ve 4sU'yu doğrudan hücre ortamına ekleyin ve kültürleri belirtildiği gibi inkübe edin.

Ardından, 4sU etiketli hücreleri polipropilen tüplerde toplayın. Ardından hücreleri santrifüjleyin. Peletleri TRIzol içinde mililitre başına yaklaşık üç milyon hücrede yeniden süspanse edin ve hücreleri TRIzol içinde oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.

Şimdi 30 ila 80 mikrogram veya daha fazla RNA hazırlayın, Radle ve şirketin yöntemini kullanarak. Daha sonra, tiyola özgü biyotinilasyon reaksiyonunu bu sırayla karıştırın. Nükleaz içermeyen su ile başlayın, ardından 10 kat tampon, ardından RNA ve son olarak biotin-HPDP ile başlayın.

Daha sonra pipetleme ile karıştırın ve inkübe edin. Etiketlenmemiş, önceden var olan RNA ile karıştırılmış yeni kopyalanmış biyotinile RNA örneklerini üretmek için temizleme adımına devam edin. Ardından, numuneleri 10 dakika boyunca 65 santigrat dereceye ısıtın.

Ardından, hemen buzun üzerine yerleştirin. Her numune soğuduktan sonra, 100 mikrolitre streptavidin boncuğu ekleyin ve 15 dakika boyunca döndürerek oda sıcaklığında inkübe edin. Şimdi, manyetik bir sütun kullanarak yeni kopyalanmış RNA ile süslenmiş boncukları izole edin ve ardından RNA'yı sıralama için 11 mikrolitre nükleaz içermeyen suda elüte edin.

Bu bölüm, aktif olarak çevrilmekte olan RNA'nın nasıl izole edileceğini açıklamaktadır. Bu transkriptlerin sıralanması, dinamik translatozomu inceler. RNA dizileme verileriyle birleştiğinde, bu tahlil, RNA devir hızı ve translasyon oranlarının hesaplanmasına izin verir.

Süspansiyona sikloheksimid ekleyerek ve inversiyonlar kullanarak karıştırarak başlayın. Oda sıcaklığında bir dakika sonra, hücreleri santrifüjleyin, ortamı çıkarın ve hücreleri sikloheksimid ile desteklenmiş en az 10 mililitre PBS ile yıkayın. Daha sonra, ortamı aspire edin ve 10 milyon hücre başına 100 mikrolitre memeli hücre lizis tamponu ile değiştirin.

20 ila 25 gauge bir iğne kullanarak hücreleri parçalamak için karışımı ezin. Daha sonra, hücre lizatını önceden soğutulmuş 1.50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve lizatı periyodik inversiyonlarla 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. 10 dakika sonra, lizatı santrifüjleyin ve süpernatanı 1,5 mililitrelik serin bir tüpe aktarın.

Daha sonra, nükleaz içermeyen suda lizatın bir ila 10 oranında seyreltilmesini hazırlayın ve emilimi 260 nanometrede ölçün. Daha sonra, seyreltilmemiş lizatın 200 mikrolitrelik alikotlarını oluşturun ve her birine her bir emicilik birimi için 7.5 birim nükleaz uygulayın. Nükleazın 45 dakika boyunca reaksiyona girmesine izin verin ve ardından 15 mikrolitre RNase inhibitörü kullanarak reaksiyonu sonlandırın veya negatif 80 santigrat derecede saklayın.

Ardından, ticari bir kit kullanarak RPF RNA'yı saflaştırın ve yine bir kit kullanarak bir rRNA tükenmesi ile takip edin. Ardından, 500 nanogram izole RPF RNA üzerinde bir PAGE saflaştırması gerçekleştirin. Numuneleri jele yüklemek için hazırladıktan sonra, bunları denatüre edin, ikincisi ve 95 santigrat derecede beş dakikalık bir inkübasyon ile kontrol edin.

Ardından, numuneleri yaklaşık 75 dakika boyunca 180 voltta çalıştırın ve sonuçları değerlendirin. Jel dilimi toplama için, steril 20 gauge iğne kullanarak 0,5 mililitrelik bir tüpün dibine delikler açın. Daha sonra, 28 ila 30 baz nükleotid bölgesine karşılık gelen jel dilimlerini çıkarın ve bunları hazırlanan 0.5 mililitrelik tüplere aktarın.

Kontaminasyonu kontrol etmek için RNA kontrolünün bir örneğini ve negatif kontrolün bir örneğini ekleyin. Ardından, küçük, kapaklı numune tüplerini daha büyük mikrosantrifüj tüplerine yükleyin. Ardından, jeli parçalamak için tertibatları santrifüjleyin ve numuneyi 1,5 mililitrelik tüpe aktarın.

Daha sonra, RNA'yı dört santigrat derecede bir gece reaksiyonunda elüte etmek için numune tüplerine su, amonyum asetat ve SDS ekleyin. Ardından, küçük RNA'dan bir cDNA kütüphanesi yapmak için ticari bir kit kullanın ve cDNA kütüphanesini dizilemeye devam edin. ChIP-seq, bir genom boyunca ilgilenilen bir transkripsiyon faktörünün bağlanmasını haritalamak için kullanılır.

Ribozom profillemesi ve tüm yeni transkriptlerin araştırılmasından elde edilen verilerle birleştirildiğinde, ChIP-seq, transkripsiyon faktörü bağlanmasının gerçek etkisini ortaya koymaktadır. Başlamak için, formaldehit kullanarak hücre örneklerini %1'lik bir nihai konsantrasyona çapraz bağlayın Oda sıcaklığında hafif sallama ile 10 dakika sonra, glisin konsantrasyonunu 0.125 molar'a yükselterek reaksiyonu durdurun. Daha sonra, hücreleri toplayın ve buz gibi soğuk PBS ile üç kez yıkayın ve hücre peletini eksi 80 santigrat derecede dondurun.

Daha sonra, hücre peletini yeni eklenmiş proteaz inhibitörleri ile bir mililitre buz gibi soğuk hücre lizis tamponunda yeniden süspanse edin ve hücreleri buz üzerinde 10 dakika inkübe edin. 10 dakika sonra, hücreleri aşağı doğru döndürün, süpernatanı aspire edin ve lizis tamponu ilavesini ve inkübasyonu tekrarlayın. Daha sonra, 200 ila 1.000 baz çifti arasında kesilmiş kromatin üretmek için sonikasyon kullanın.

Daha sonra, kromatini antikor kaplı manyetik boncuklara bağlayın ve protein-DNA komplekslerini 50 mikrolitre elüsyon tamponunda elüte edin. Daha sonra, beş mikrolitre% 40 RNaz ve elüsyon tamponu ekleyin ve numuneyi 30 dakika inkübe edin. Daha sonra, numuneye bir birim proteinaz K ve 20 mikrogram glikojen ekleyin ve iki saat inkübe edin.

Ardından, çapraz bağlamayı tersine çevirmek için numuneyi gece boyunca 65 santigrat dereceye taşıyın. Ertesi gün, numuneyi en az 30 saniye boyunca mıknatısa yerleştirin ve ardından ilgilenilen DNA'yı içeren süpernatanı toplayın. Ardından, DNA'yı saflaştırın, doğrulama için kantitatif PCR kullanın ve DNA'yı sıralayın.

4sU etiketleme hücreleri strese sokabilir ve apoptoza yol açabilir. Apoptotik ve ölü hücreleri tanımlamak için Annexin V ve 7-AAD boyaması kullanıldı. Th1 hücrelerini 30 veya 60 dakikalık tedaviler kullanarak 4sU ile etiketledikten sonra, hücreler ölmedi veya apoptoz geçirmedi.

RNA'nın bütünlüğü, RNA'yı işlerken büyük önem taşıdığından, standart bir tahlil kullanılarak dizilemeden önce her zaman kontrol edildi. Güçlendirilmiş kütüphaneler sağlıklı bir nükleotid aralığına sahipti. Aşırı adaptör dimerlerinin PAGE tarafından daha fazla saflaştırılması gerekiyordu.

Çok fazla şablon veya çok fazla döngü, ağır nükleotidler, bulaşmış ürünler ve adaptör dimer ürünleri ile sonuçlanır Kromatin kesmenin, kesilen kromatinin ana fraksiyonu yaklaşık 1.000 baz çifti veya biraz daha az olduğunda en iyi sonucu verdiği bulundu. Antikorun kromatin immünopresipitasyon dizilimine uygulanabilirliğini test etmek için kantitatif PCR kullanıldı. Negatif kontrol primerleri, ilgilenilen hücrelerde eksprese edilmeyen genler içindir.

Bu prosedürü denerken, 4sU'nun ne zaman ekleneceğine ve her yöntem için hücrelerin ne zaman toplanacağına ilişkin bir zaman çizelgesi de dahil olmak üzere, deney düzeneğinin ayrıntılı bir planını yapmayı unutmamak önemlidir. 4sU'nun hücre canlılığı ve stres tepkisi üzerindeki etkisini önceden test ederek her zaman en uygun 4sU etiketleme koşullarını doğrulayın. Özetle, bu yaklaşım, bir hücresel aktivasyon süreci sırasında meydana gelebilecek tüm gen düzenleme olaylarını görselleştirmemize izin verir.

Bu yöntem aynı zamanda birincil bağışıklık hücreleri ve bunların bir uyarana veya ilaca tepkileri için de kullanılabilir.