Name: Vivo Sirkadiyen saat gen ekspresyonu floresans gazetecilere kullanarak fare Suprachiasmatic çekirdeği olarak izlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Öğrenin, farelerde sirkadiyen ritim araştırmaları için suprakiazmatik çekirdekte gerçek zamanlı saat geni ekspresyonunu floresans gazetecilikle izleme yöntemini. Bu teknik hem aydınlık-karanlık hem de karanlık-karanlık koşullarında çalışır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Teknik yardım sağlamak için uyarıcı tartışmalar ve Üyeler Zhan laboratuarında sağlamak için Zhang laboratuarında üye teşekkür. Bu araştırma hibe NSFC, Çin ' in M.O.S.T. üzerinden 973 programının (için E.E.Z. ve C.Z.) 2012CB837700 31500860 (C.Z. için) ve Pekin Belediye hükümetten fon tarafından desteklenmiştir. E.E.Z. Çinliler "İşe alım programı küresel gençlik uzmanlar" tarafından desteklendi.

Bu iletişim kuralı tüm prosedürleri ile onayı kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Ulusal Biyolojik Bilimler Enstitüsü, Pekin, Çin'in devlet düzenlemelerine uygun olarak yapılmıştır.
1. Cry1 floresan muhabir inşaatı
Not: önceki sirkadiyen çalışmalarda bioluminescence sistem2,12kullanarak,13 ritmik dLuc ifade ikna etmek için sirkadiyen bir organizatörü bir hale luciferase (dLuc) ile sigorta. Bir floresan muhabir geliştirmek için bozulma luciferase ritmik dVenus ifade ikna etmek için istikrarsızlığın floresans protein ile (dVenus) değiştirildi. P (Cry1) nesil-dVenüs muhabir aşağıda açıklanmıştır, hangi yapı şu anda Addgene için teslim ediliyor ve yakında akademik kullanıma açık olacak.
<ol><li>İşlevsel fare Cry1 organizatörü (+328 Cry1 gen, transkripsiyon başlangıç sitesi ''-'' 1 belirlenmiş-1208 bp bölgesine) yükseltmek. PCR enzim (KOD Plus Neo) kullanın, astar F1 ve R1 (bkz. Tablo 2), fare genom Cry1 organizatörü DNA parçası yükseltmek için bir şablon ve üreticinin PCR protokolü gibi.</li>
	<li>İntron 336 Cry114sirkadiyen saat fonksiyonu için önemli olan Cry1 gen yükseltmek. PCR enzim astar F2 ve R2, fare genom bir şablon ve intron 336 DNA parçası yükseltmek için üreticinin PCR protokolü olarak kullanın.</li>
	<li>Venüsyükseltmek. PCR enzim astar F3 ve R3, pVENUS-N1 plazmid bir şablon ve Venüs DNA parçası yükseltmek için üreticinin PCR protokolü olarak kullanın.</li>
	<li>NLS-D2 DNA parçası yükseltmek. PCR enzim astar F4 ve R4, pcDNA3.3-d2eGFP plazmid NLS-D2 DNA parçası yükseltmek için üreticinin PCR Protokolü ve bir şablon olarak kullanın.</li>
	<li>DNA parçası 1 exon 1 sentez.</li>
	<li>DNA parçası 2 intron 336 ve Venüs DNA parçası arasındaki bağlayıcı olarak sentez.</li>
	<li>PAAV-EF1a-çift floxed-hChR2 (H134R) kesme - mCherry - WPRE-HGHpA vektör plazmid MluI ve EcoRI enzimleri ile. Jel ekstraksiyon kiti daha büyük DNA parçası arındırmak için kullanın. Üreticinin iletişim kuralını kullanırlar.</li>
	<li>Gibson derleme mix ve onun standart protokolü kullanarak, birlikte pAAV-P (Cry1)-intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA muhabir üretmek için DNA parçalarının hepsini topla. Üreticinin iletişim kuralını kullanırlar.</li>
</ol>2. virüs Adeno ilişkili15 imalatı
<ol><li>Aşağıdaki plazmid DNA stokları hazırlamak: 31.25 µg, pRV1, pH21 31.25 µg, pFdelta6 125 µg ve pAAV-p (Cry1) - intron336 - 62.5 µg Venüs-NLS - D2-WPRE-HGHpA.</li>
	<li>293T hücre beş 15 cm yemekleri hazırlamak ve hücreleri % 90 birleşmesi olana kadar bekle.</li>
	<li>Plazmid transfection reaktif protokol sonrası 297T hücrelere transfect. Her yemek için kullanın pRV1 6.25 µg, pH21, pFdelta6, 25 µg, pAAV-p (Cry1) 12.5 µg 6.25 µg-intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA ve 120 µL transfection reaktif.</li>
	<li>72 h transfection sonra bir pipet silah kullanarak her plaka hücrelerden ayırmak; hücreleri iki 50 mL tüpler içine hasat.</li>
	<li>Hücreleri 800 x g 10 dk de cips ve süpernatant atın. Hücreleri fosfat tamponlu tuz (PBS) 20 mL her tüpün içine yerleştirerek yıkayın; hücreleri 800 x g 10 dk de cips ve süpernatant atın.</li>
	<li>Granül 150 mM NaCl ve 20 mM Tris çözüm, pH 8.0 resuspend; çözüm/tüp 25 mL kullanın. Taze hazırlanmış % 10 sodyum deoxycholate (içinde dH2O) 1,25 mL her tüp için ekleyin. Benzonase nükleaz mL başına 50 adet son bir konsantrasyon ekleyin ve iyice karıştırın. 1s için 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>Hücresel enkaz 3000 x g 15dk için de centrifuging tarafından kaldırın. Daha fazla tüm enkaz 0,45 mikron şırınga filtreden karışımı iterek kaldırıldığından emin olmak; Bu adımı heparin sütunlarının engelleme engellemeye yardımcı olur.</li>
	<li>Peristaltik pompa kullanarak heparin sütunlarını ayarlama; 1 mL/dk, yok hava kabarcıkları sütunlara tanıtıldı sağlanması için akış hızı ayarlayın.</li>
	<li>Bir 150 mM NaCl, 20 mM Tris çözüm, pH 8,0 10 mL içeren sütunlar equilibrate. Her sütun için virüs içeren çözüm ekleyin. Bir 100 mm NaCl, 20 mM Tris çözüm, pH 8.0 20 mL sütunlarla yıkayın. Sonra 5 mL şırınga kullanarak, ardından 1 mL 300 mm NaCl ve 20 mM Tris çözüm, pH 8.0 sütunlar 1 mL 200 mm NaCl ve 20 mM Tris çözüm pH 8.0, ile yıkayın.</li>
	<li>450 mM NaCl, 20 mM Tris çözüm, faz 8.0, 4 mL tarafından takip 3 mL 400 mM NaCl, 20 mM Tris çözüm, faz 8.0, virüs elute için bir 5 mL şırınga kullanın ve son olarak 3 mL 500 mm NaCl tarafından , 20 mM Tris çözüm, faz 8.0. Ayıklanan malzemeleri toplamak.</li>
	<li>Rekombinant adeno ilişkili virüs (rAAV) konsantrasyon için çıkarılan malzemeler, bir anda 4 mL santrifüj filtre cihazları 100.000 moleküler ağırlığı kesme yüklemek. Her 4-mL örnek akış yoluyla atarak oda sıcaklığında 5 min için 2000 x g, santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Tüm çıkarılan malzemeler santrifüj filtre cihazları çalıştırdığınız zaman PBS 4 mL ekleyin ve karışımı yaklaşık 250 μL santrifüj kapasitesi. RAAVs Kaldır (viral titresi-meli var olmak hakkında 2-8 x 1012 viral parçacıkların mL başına) santrifüj filtre cihazları, aliquot ve-80 ° C kadar kullanım mağazasında. Bu aşamada, virüs için birkaç ay depolanabilir.</li>
</ol>3. rAAV enjeksiyon ve yetişkin fare SCN (sahne) içine Optik Fiber ekleme
<ol><li>Sirkadiyen floresans muhabir taşıyan rAAVs enjeksiyon SCN içine<ol>
<li>5 µL rAAV yük (virüs titresi ilgili 2-8 x 1012 virüs parçacıkları mL başına) mikro şırınga içine.</li>
		<li>Bir yetişkin fare (2 için 5-aylık, C57BL/6 arka plan) tedavisiydi (80 mg/kg) ile mayi enjeksiyon yolu ile anestezi. Yeterli bir ayak parmağı-çimdik yanıt eksikliği ile anestezi derinliği için kontrol edin.</li>
		<li>Kürk fare başından kaldırın ve sonra fareyi stereotaksik aparatı monte için makas kullanın. Yolu ile dolaşan sıcak su battaniye ya da başka bir ısıtma cihazı imzalat hayvanlar için bir ısı kaynağı sağlar. Not: Alternatif olarak, kürk kaldırmak için depilatory krem veya elektrikli saç kesme makineleri kullanın.</li>
		<li>Cerrahi sitesi uygun dezenfeksiyon ajanlar ile temizleyin. Örneğin, bu arasında steril su ya da alkol ve iyot, betadin veya klorheksidin scrubs alternatif olarak sulandırmak. En az 3 kere tekrar edin. Cerrahi sitesi asmak.</li>
		<li>Bir kesik kafa derisi içinde yapmak ve kafatası maruz makas kullanın.</li>
		<li>Bregma ve lambda aynı yatay düzlemde çoğu stereotaksik aparatı ayarlayın; bregma iki sathını aynı yatay düzlemde olun.</li>
		<li>Kullanım bir steril pamuklu çubukla H2O2/h2O beyin kapaklarini zarar için %4 oranında batırılmış. O zaman bir temiz, steril pamuklu çubukla temizleyin ve kafatası yüzeyini kuru için kullanın.</li>
		<li>Mikro bir matkap kullanarak, bir delik yaklaşık 1 mm çap 0,46 mm arka ve 0,25 mm bregma için yanal olun.</li>
		<li>
Fi Temiz pamuk steril bez fizyolojik serum çözüm ile kemik parçaları beynin maruz yüzeyinden temizlemek için kullanın.</li>
		<li>Beyin, mikro şırınga ucu 0,46 mm arka olduğunu kontrol ettikten ve kafatası yüzeyinden 0,25 mm lateral bregma ve 5.7 mm derin bir mikro şırınga takın.</li>
		<li>500 enjekte rAAV (50 nL min-1) mikro şırınga rAAV tam difüzyon sağlamak için enjeksiyon sonra 10 dk için yerinde bırakarak SCN (sahne), içine nL.</li>
		<li>Yavaş yavaş mikro şırınga geri alıyorum.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fiber optik sahne alanı'na ekleyin.<ol>
<li>Bir fiber optik bıçak kullanarak, bir lif 17 mm uzunluğu, optik fiber her iki tarafında düzgün olduğundan emin kesti.</li>
		<li>Optik lif seramik yüksük yerleştirin ve fiber optik ve seramik hakla yüzeylerin floş sağlama optik fiber ile metil etil keton peroksit (AB tutkal), seramik hakla için düzeltin.</li>
		<li>Soğuk sterilant çözüm veya etilen oksit varlığımla temiz.</li>
		<li>Sonra rAAV enjeksiyon (adım 3.1.11), seramik hakla içeren optik fiber SCN (sahne) yerleştirin.</li>
		<li>Seramik hakla ve diş reçine kullanarak kafatası üzerine fiber optik düzeltmek ve kurumasını sağlar.</li>
		<li>Diş reçine yüzey ile arka oje sürün. 3.1.2 için 3.2.5, rAAV denetimi için gerçek enjeksiyon atlama özetlenen yordamları yineleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ameliyat sonrası bakım<ol>
<li>Fareler gibi buprenorfin 2 mg/kg vücut ağırlığı, ameliyat sonrası ağrı kesici sağlamak subkutan, günde iki kez.</li>
		<li>Anesteziden geliyorlar iken fare kurtarma kafese koyun.</li>
		<li>Tek tek bir koşulda 12 h açık/koyu (ışık şiddeti ~ 100 lux kafesin dibinde) gıda/su kullanılabilir ad libitumile ev fareler. Sekiz gün daha fazla deneme önce yeterli kurtarma süresi için izin vermek ve en uygun floresan muhabir ifade sağlamak için ayrılan.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. in vivo floresans sinyal izleme ve veri toplama
<ol><li>Sekiz gün ameliyat sonra bağlanmak fare kafasına fiber floresans sinyal kayıt memurlar ile (Örn., Gene Observer). Arka plan sinyal kurmak için denetim fareler SCN floresans sinyal kontrol edin. Gözlem ve floresan sinyal İzleyicisi'ni kullanarak bu sinyal ölçümü yapmak.</li>
	<li>Deneysel fare floresans sinyalinin kontrol fare aynı operasyonu ile değerlendirin. Bu büyük olasılıkla belgili tanımlık uç optik fiber SCN kaçırdı gösterir gibi olan viral vektör alınan ama hangi yalnızca arka plan sinyal analizi, görüntüler fare hariç. Bu ilk önlemleri sonra fareler floresans sinyal stabilize etmek için izin vermek başka bir 2 hafta için ev onların kafes dönün.</li>
	<li>3 hafta sonra farelerin floresans sinyal kayıt memurlar ile bağlayın. 15 floresans ölçmek s 100 Hz frekansta her 10 min. Bu ölçümler sırasında fareler yiyecek/su kullanılabilir ad libitumile onların kafes içinde serbestçe hareket ediyor. Bir ışık şiddeti ~ 100 lux, kafesin altındaki kullanın ve bir uç arasında 15-20 µW optik fiber lazer güç.</li>
	<li>Tüm kayıtları tamamlanmasından sonra fare ile % 4 paraformaldehyde, sıvı ve kaldırmak ve optik fiber yerleşimini kontrol etmek için beyin dilim. Optik fiber uç doğru SCN implante değil Eğer fareler çözümleme dışı bırakmak.</li>
</ol>5. veri analizi ve sunum
<ol><li>Ölçü floresans sinyal her 10 min 15 s, 100 Hz 1500 veri noktaları verim, bir frekansta. Bu 1500 puan ortalama floresans sinyal vasıl birisi tutkucun zaman nokta çevirir. Zaman içinde birden çok ortalamalar komplo Cry1 transkripsiyon ritmi altında serbestçe fare hareket eden bir denetim ışık koşulunda SCN (sahne) karşılık gelen bir sinyal zaman eğrisi oluşturur.</li>
</ol>

<ol><li>Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suprachiasmatic+nucleus%3A+cell+autonomy+and+network+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties.</a> Annual Review of Physiology. 72, 551-577 (2010).</li>
<li>Zhang, E. E., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clocks+not+winding+down%3A+unravelling+circadian+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Clocks not winding down: unravelling circadian networks.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 764-776 (2010).</li>
<li>Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+architecture+of+the+mammalian+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock.</a> Nature Reviews Genetics. 18, 164-179 (2017).</li>
<li>Yoo, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PERIOD2%3A%3ALUCIFERASE+real-time+reporting+of+circadian+dynamics+reveals+persistent+circadian+oscillations+in+mouse+peripheral+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101, 5339-5346 (2004).</li>
<li>Davidson, A. J., Castanon-Cervantes, O., Leise, T. L., Molyneux, P. C., Harrington, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+jet+lag+in+the+mouse+suprachiasmatic+nucleus+and+peripheral+circadian+timing+system%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Visualizing jet lag in the mouse suprachiasmatic nucleus and peripheral circadian timing system.</a> European Journal of Neuroscience. 29, 171-180 (2009).</li>
<li>Savelyev, S. A., Larsson, K. C., Johansson, A. S., Lundkvist, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slice+preparation%2C+organotypic+tissue+culturing+and+luciferase+recording+of+clock+gene+activity+in+the+suprachiasmatic+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Slice preparation, organotypic tissue culturing and luciferase recording of clock gene activity in the suprachiasmatic nucleus.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).</li>
<li>Yamaguchi, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/35055628">Gene expression: View of a mouse clock gene ticking.</a> Nature. 409, 684-684 (2001).</li>
<li>Ono, D., Honma, K. I., Honma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+and+ultradian+rhythms+of+clock+gene+expression+in+the+suprachiasmatic+nucleus+of+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Circadian and ultradian rhythms of clock gene expression in the suprachiasmatic nucleus of freely moving mice.</a> Science Reports. 5, 12310(2015).</li>
<li>Ono, D., Honma, S., Honma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+PER2%3A%3ALUC+rhythms+in+the+olfactory+bulb+of+freely+moving+mice+depend+on+the+suprachiasmatic+nucleus+but+not+on+behaviour+rhythms%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Circadian PER2::LUC rhythms in the olfactory bulb of freely moving mice depend on the suprachiasmatic nucleus but not on behaviour rhythms.</a> European Journal of Neuroscience. 42, 3128-3137 (2015).</li>
<li>Ono, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+Per1+and+Bmal1+circadian+rhythms+in+the+suprachiasmatic+nucleus+in+parallel+with+behavioral+outputs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dissociation of Per1 and Bmal1 circadian rhythms in the suprachiasmatic nucleus in parallel with behavioral outputs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 114, E3699-E3708 (2017).</li>
<li>Reppert, S. M., Weaver, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+circadian+timing+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coordination of circadian timing in mammals.</a> Nature. 418, 935-941 (2002).</li>
<li>Liu, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redundant+function+of+REV-ERBalpha+and+beta+and+non-essential+role+for+Bmal1+cycling+in+transcriptional+regulation+of+intracellular+circadian+rhythms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms.</a> PLoS Genetics. 4, e1000023(2008).</li>
<li>Maywood, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+core+circadian+feedback+loop+in+suprachiasmatic+nucleus+of+mCry1-luc+transgenic+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Analysis of core circadian feedback loop in suprachiasmatic nucleus of mCry1-luc transgenic reporter mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110, 9547-9552 (2013).</li>
<li>Ukai-Tadenuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delay+in+feedback+repression+by+cryptochrome+1+is+required+for+circadian+clock+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Delay in feedback repression by cryptochrome 1 is required for circadian clock function.</a> Cell. 144, 268-281 (2011).</li>
<li>McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+titering+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Journal of Visualized Experiments. 57, e3348(2011).</li>
<li>Yamaguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+genetically+deficient+in+vasopressin+V1a+and+V1b+receptors+are+resistant+to+jet+lag%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mice genetically deficient in vasopressin V1a and V1b receptors are resistant to jet lag.</a> Science. 342, 85-90 (2013).</li>
<li>Nagano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+abrupt+shift+in+the+day%2Fnight+cycle+causes+desynchrony+in+the+mammalian+circadian+center%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">An abrupt shift in the day/night cycle causes desynchrony in the mammalian circadian center.</a> Journal of Neuroscience. 23, 6141-6151 (2003).</li>
<li>Golombek, D. A., Rosenstein, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+Circadian+Entrainment%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Physiology of Circadian Entrainment.</a> Physiological Reviews. 90, 1063-1102 (2010).</li>
<li>Mei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+recording+of+circadian+rhythms+in+brains+of+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, 4276-4281 (2018).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Dilim kültür4,5, RT-PCR16ve in situ hibridizasyon17, hayvanların öldürülmesi gerektiren gibi ex vivo Yöntemler aksine kayıt yöntemi içinde vivo sağlar Müfettişler sirkadiyen gen ekspresyonu yaşayan hayvan çalışmaya. Bu nedenle, bu teknoloji farklı fiziksel tedirginlikler (Örneğin, uykusuzluk, stres, gıda alımı, vb) sinir sirkadiyen saat üzerinde etkisini değerlendirmek iç...

Memelilerde, bütün vücudun sirkadiyen ritim eksojen çevresel değişiklikler (Örneğin, ışık, sıcaklık, stres, vb)1bir kişinin yanıt koordine etmek suprachiasmatic çekirdeği (SCN) yönetir. Çekirdek saat bileşenleri Per1-3, Cry1-2, saatve Bmal1oluşur ve her hücrenin sirkadiyen saat düzenleyen merkezi bir rol oynamaktadır. Transkripsiyon harekete geçirmek, saat/BMAL1, başına ifade ikna etmek için heterodimerdir davranan SCN her hücrede ve CRY. PER / CRY karmaşık sonra 24 saat tam2,3' e alır bir transkripsiyon çeviri geri besleme döngüsü oluşturmak için saat/BMAL1 işlevini engeller.
SCN önceki çalışmaları esas olarak ex vivo SCN dilim kültür Yöntem4,5,6 istihdam ve bu yaklaşım değerli bilgileri sağlamış olması iken, kendi sınırlamaları yeteneğimizi inhibe eksojen uyaranlara (Örneğin, ışık) etkisi kritik bu bölgede ikamet eden hücrelerin yanı sıra diğer beyin çekirdekleri SCN üzerinde etkisi ile ilgili verileri alır. 2001 yılında Hitoshi Okamura'nın grup içinde vivo monitör sirkadiyen saat gen ekspresyonu bioluminescence sisteme serbestçe fare7hareketli SCN (sahne) kullanmak için ilkti. Ken-Ichi Honma'nın grup daha fazla kayıt sistemi SCN (sahne)8',9,10bioluminescence vivo içinde gelişmekte olan son birkaç yıl harcadı. Birlikte, bu çalışmalarda araştırmacılar ile sirkadiyen saat sürekli karanlık veya ışık nabız sonra izleme olanağı sağladı. Ancak, bioluminescence sürekli açık/koyu döngüsü sırasında ışık sirkadiyen saat11, SCN-aracılı sürüklenme için gerekli baskın sinyal olması ile birleştiğinde izlenmesi için izin vermek için çok karanlık olduğu için yoktur bioluminescence kayıt ile ilgili sınırlamalar üstesinden deneysel Yöntem geliştirme için artan talebi. Geçerli raporu fareler serbestçe hareket SCN vivo içinde sirkadiyen saat izlemek için inşa edilmiş bir floresan tabanlı sistem açıklar. Bu kullanımı kolay yöntem sürekli açık/koyu döngüsü sırasında izleme izin verir ve gerçek zamanlı olarak ve yüksek zamansal çözünürlükte SCN sirkadiyen saat genlerin transkripsiyon uzun vadeli gözlenmesi için izin verir.

<table><tbody><tr><td>KOD Plus Neo</td><td>TOYOBO</td><td>KOD-401</td><td>Reaktifi</td></tr><tr><td>pVENUS-N1</td><td>addgene</td> <td># 61854</td><td>Plazmid</td></tr><tr><td>pcDNA3.3_d2eGFP</td><td>addgene</td> <td># 26821</td><td>Plazmid</td></tr><tr><td>pAAV-EF1a-çift floxed-hChR2 (H134R) -mCherry-WPRE-HGHpA</td><td>addgene</td> <td># 20297</td><td>Plazmid</td></tr><tr><td>MluI</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD0564</td><td>Reaktifi</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD0274</td><td>Reaktif</td></tr><tr><td>Gibson Montaj Karışımı</td><td>NEB</td><td>E2611s</td><td>Reaktif</td></tr><tr><td>Lipofektamin 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>12566014</td><td></td></tr><tr><td>Reaktif Şırınga Filtresi</td><td>EMD Millipore</td><td>SLHV033RS</td><td>0.45&nbsp; &mikro; m&nbsp;</td></tr><tr><td>HiTrap heparin</td><td>kolonları jelifesciences</td><td>17-0406-01</td><td>1 mL&nbsp;</td></tr><tr><td>Amicon ultra-4 santrifüj filtre</td><td>EMD Millipore</td><td>&nbsp; UFC810024</td><td>100.000 MWCO</td></tr><tr><td>Benzonaz nükleaz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014</td><td>Reaktif</td></tr><tr><td>Sodyum deoksikolat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5670</td><td>Her parti</td></tr><tr><td>fare stereotaksik aparatı</td> için taze çözelti yapın <td>B& E TEKSYSTEMS LTD</td><td>#SR-5M / 6M Ekipman</td><td></td></tr><tr><td>pentobarbital</td><td>SigmaAldrich</td> <td># 1507002</td><td>Reaktif</td></tr><tr><td>fare stereotaksik aparatı</td><td>B & E TEKSYSTEMS LTD</td><td>#SR-5M / 6M</td><td>Ekipman</td></tr><tr><td>Hidrojen peroksit çözeltisi</td><td>SigmaAldrich</td> <td># 216763</td><td>Reaktif</td></tr><tr><td>Fiber Optik Thorlabs</td><td></td><td>FT200EMT</td><td>0.39 NA, & Oslash; 200 ve mikro; m</td></tr><tr><td>mikroşırınga pompası</td><td>Nanolitre 2000 Enjektör, WPI</td><td></td><td>Ekipmanları</td></tr><tr><td>seramik yüksük</td><td>Şangay Fiblaser</td><td></td><td>230 &thinsp; &mu; m İç Çap, 2,5 mm Dış Çap</td></tr><tr><td>Gen Gözlemci</td><td>BiolinkOptics</td><td></td><td>Ekipmanları</td></tr></tbody></table>

vivo sirkadiyen saat gen ekspresyonu floresans gazetecilere kullanarak fare suprachiasmatic çekirdeği olarak izlenmesi

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

Bu teknik aracılı fiber optik floresans kayıtları rekombinant adeno ilişkili virüs dayalı gen gazetecilere kesin teslim ile birleştirir. Bu yeni ve kullanımı kolay vivo içinde floresans izleme sistemi saat gene, Cry1, transkripsiyon ritmine fareler serbestçe hareket suprachiasmatic çekirdeğinde (SCN) kaydetmek için geliştirilmiştir. Bunu yapmak için bir Cry1 transkripsiyon floresans muhabir tasarlanmış ve Adeno ilişkili virüs paketlenmiş. Arıtılmış, konsantre virüs SCN (sahne) o zaman beynin yüzeyine tespit edildi bir optik kablo, ekleme ve ardından fare içine enjekte ettiler. Hayvanlar için ev onların kafes döndü ve bir 1 ay ameliyat sonrası iyileşme döneminde yeterli muhabir ifade emin olmak izin. Floresan sonra serbestçe fareler bir vivo içinde bizim kurum olarak inşa edilmiş sistem izleme yoluyla hareket kaydedildi. Kayıt sistemi içinde vivo için 488 nm lazer ile bir 1 × 4 ışın-kırık ışık eşit güç dört lazer uyarma çıkışları bölünmüş birleştiğinde. Bu kurulum bize aynı anda dört hayvanlardan kaydetmek etkin. Her biri verilmiş floresan sinyallerini bir photomultiplier tüp ve bir veri alma kartı toplanmıştır. Buna ek olarak önceki bioluminescence vivo içinde sirkadiyen saat kayıt tekniği için kayıt sistemi bu floresans in vivo sirkadiyen saat gen ekspresyonu ışık döngüsü sırasında kayıt izin.

Floresans muhabir tasarımı Cry1 Şekil 1Agösterisinde idi. Yaklaşımı kullanarak ayrıntılı 500 yukarıda, nL rAAV-p (Cry1) - intron336 - Venüs-NLS-D2 başarıyla bir yetişkin fare SCN enjekte ettiler ve sağlam Venüs ifade (Şekil 1B, 1 C) sergilenmektedir. Floresan sinyallerini 12 h/12 h açık/koyu (LD) ve karanlık/koyu (DD) koşulları (Şekil 2) altında kaydedilen koşulları...

Bu yeni geliştirilmiş floresans tabanlı teknoloji uzun vadeli, suprachiasmatic çekirdeği (SCN) sirkadiyen saat genlerde transkripsiyonu gerçek zamanlı olarak ve yüksek zamansal çözünürlükte fareler serbestçe hareket izleme sağlar.

Vivo Sirkadiyen saat gen ekspresyonu floresans gazetecilere kullanarak fare Suprachiasmatic çekirdeği olarak izlenmesi

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene ...

Bu yöntem, serbestçe hareket eden farelerde sirkadiyen saat gen ekspresyonunu gerçek zamanlı olarak yüksek zamansal çözünürlükte izlemenin bir yolunu sağlar. Bu tekniğin temel avantajı, sirkadiyen saat çalışmaları için kritik öneme sahip olan hem aydınlık-karanlık hem de karanlık-karanlık koşullarında çalışmasıdır. Fiber optik bir bıçak kullanarak 17 milimetre uzunluğunda bir fiber kesin.Optik fiberin her iki tarafının da pürüzsüz olduğundan emin olun. Optik fiberi seramik yüksüğe yerleştirin ve optik fiberi metil etil keton peroksit içeren bir seramik yüksüğe sabitleyin. Optik fiber ve seramik yüksük yüzeylerinin aynı hizada olduğundan emin olun.Optik fiberi% 75 etnol ile ıslatılmış bir pamuklu çubukla temizleyin. Ve yerleştirmeye hazır olana kadar temiz tutun. Enjeksiyon prosedürüne önce beş mikrolitre rekombinant AAV'yi bir mikroşırıngaya yükleyerek başlayın.Daha sonra, kurumsal olarak onaylanmış bir protokol kullanarak yetişkin bir fareyi uyuşturduktan sonra, ayak parmağı sıkışma tepkisi olmaması nedeniyle yeterli anestezi derinliğini kontrol edin. Ardından, farenin kafasındaki kürkü çıkarmak için makas kullanın. Ve sonra farenin kafasını stereotaksik bir cihaza monte edin.Kafa

in-vivo-monitoring-circadian-clock-gene-expression-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Yetişkin fare hipotalamik suprakiazmatik nükleus (SCN) ve kültür ile hızlı bir şekilde Organotipik kültür durumda SCN doku içeren dilimleri, hazırlama prosedürü rapor edilmiştir. Ayrıca, salınım saat gen protein ekspresyonu dinamik lusiferaz muhabiri teknolojisini kullanarak ölçüm açıklanmıştır.

Dilim hazırlanması, Organotipik Doku ekimi ve suprakiazmatik nükleus Saat Gen Faaliyet Lusiferaz Kayıt

Sirkadiyen saatler tek tek hücrelerin içinde fonksiyon, yani, bu hücre-özerktir. Burada, non-invaziv, lusiferaz tabanlı gerçek zamanlı biyolüminesans teknolojisini kullanarak cep özerk saat modelleri üretme yöntemleri açıklanmaktadır. Muhabir hücreleri sirkadiyen biyoloji eğitimi için uysal, fonksiyonel model sistemleri sağlıyoruz.

Lusiferaz Biyoparlaklık Gazeteciler kullanma Gen Ekspresyonunun Hücre-özerk Sirkadiyen Saat Ritimleri İzlenmesi

sirkadiyen saat Arabidopsis transcriptome yaklaşık üçte düzenler, ancak timekeeping içine geri besleme genlerin yüzdesi bilinmemektedir. Burada hızla geçici protoplastlar ifade bir sirkadiyen muhabiri Işıklı görüntüleme kullanarak Arabidopsis herhangi mutant doğrultusunda sirkadiyen fenotipleri değerlendirmek için bir yöntem görselleştirmek.

Bir Lüminesans Saat Reporter ile Arabidopsis Protoplasts transfekte içinde Sirkadiyen fenotipleri Hızlı Analizi

Burada, paralel sirkadiyen biyolüminesansı ve insan adacık hücrelerinin ve birincil miyotüplerin salgı aktivitesini izlemek için ayarları açıklıyoruz. Bunun için, bir lusiferaz çekirdek saat raportörünün lentiviral gen iletimini, ardından in vitro senkronizasyonu ve sürekli hücre perifüzyonu ile çıkış ortamının toplanmasını kullandık.

İnsan Primer Hücre Kültürleri içinde Sirkadyen Saat Gen İfade ve Hormon salgısını Paralel Ölçümü

Hücresel sirkadiyen ritim meme epitel hücreleri belirlemek için bir vitro bioluminescence tahlil sunulur. Bu yöntem memeli hücre muhabir plazmid istikrarsızlığın luciferase dönem 2 gen düzenleyici denetimi altında ifade kullanır. Sirkadiyen ritim organ özgü etkileri değerlendirmek için diğer hücre tipleri için uyarlanabilir.

Vitro Sirkadiyen ritim meme epitel hücreleri ayırdetmek için bioluminescence tahlil

Genetik olarak kodlanmış luciferase gen ekspresyonu popüler bir non-invaziv muhabir var. Gaz ve sıcaklık optimize Kaydedici (timsah) Imaging otomatik bir boyuna luciferase çok çeşitli koşullar altında kollarındaki hücrelerden Boylamsal kayıt sağlar. İşte nasıl timsah sirkadiyen ritim araştırma bağlamında kullanılabilir göstermektedir.

Kollarındaki gazetecilere bir otomatik boyuna Luciferase gaz ve sıcaklık optimize Kaydedici (timsah) Imaging kullanarak esnek ölçüm

Bu iletişim kuralının amacı ile uzun vadeli Floresans hızlandırılmış görüntüleme moleküler sirkadiyen ritimler izlemek için en iyi duruma getirilmiş ex vivo Drosophila larva beyin kültür kurmaktır. Bu yöntem uygulamaya farmakolojik deneyleri de ele alınmıştır.

Tek hücreli çözünürlük Floresans canlı görüntüleme Drosophila sirkadiyen saatler larva beyin kültür

Nöral kök/progenitor hücreleri, hücresel olayların farklı sonuçlarına yol açan Çentik sinyal bileşenlerinin çeşitli ifade dinamiklerini sergilerler. Bu tür dinamik ifade, gen ekspresyonlarında hızlı değişimlerin görselleştirilmesini sağlayan son derece hassas biyolüminesans görüntüleme sistemi kullanılarak statik analizle değil, gerçek zamanlı izleme ile ortaya çıkabilir.

Murin Nörogenezi Sırasında Çentik Sinyal Dinamiğinin Gerçek Zamanlı Biyolüminesans Görüntülemesi

Çoğu organizmada bulunan sirkadiyen ritimler, biyolojik süreçlerin zamansal organizasyonunu düzenler. 3D organoidler son zamanlarda fizyolojik olarak ilgili bir in vitro model olarak ortaya çıkmıştır. Bu protokol, organoidlerde sirkadiyen ritimleri gözlemlemek için biyolüminesan raportörlerin kullanımını açıklar ve çok hücreli sistemlerde sirkadiyen ritimlerin in vitro olarak araştırılmasını sağlar.

Organoidlerde Biyolüminesans Raportörü ile Sirkadiyen Salınımların İzlenmesi

Bu çalışma, gündüz sirkadiyen faz kaymasını güvenilir şekilde mümkün kılmak için kemogenetik ve mor ışığı temelli stratejiler sunmaktadır.

Kemogenetik ve spektral yaklaşımlarla gündüz sirkadiyen faz kaymalarını indüklemek

Öğrenin, farelerde sirkadiyen ritim araştırmaları için suprakiazmatik çekirdekte gerçek zamanlı saat geni ekspresyonunu floresans gazetecilikle izleme yöntemini. Bu teknik hem aydınlık-karanlık hem de karanlık-karanlık koşullarında çalışır.

Vivo Sirkadiyen saat gen ekspresyonu floresans gazetecilere kullanarak fare Suprachiasmatic çekirdeği olarak izlenmesi

Daha fazla video keşfet