Bir Kinetik Floresans tabanlı Ca^{2 +} seferberlik tahlil G Protein birleştiğinde reseptör agonistleri, antagonistleri ve Allosteric modülatörler tanımlamak için

Bu hücre bazlı testin genel amacı, G proteinine bağlı reseptör aracılı hücre içi kalsiyum mobilizasyonunu uyarabilen veya inhibe edebilen molekülleri tanımlamak ve karakterize etmektir. Bu yöntem, G proteinine bağlı reseptör ilaç keşfi için değerli bir test olabilir, çünkü reseptör aracılı hücre içi kalsiyum cisimlerini değiştiren molekülleri taramak için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, agonistik veya antagonistik özelliklere sahip moleküllerin aynı tahlil içinde tanımlanmasına izin vermesidir.

Bu test, birçok insan hastalığında rol oynayan terapötik hedefler vaat eden G proteinine bağlı reseptörler üzerinde etkili olan yeni ilaç adaylarının keşfine yardımcı olabilir. Hücre geçişi gününde, siyah duvarlı polistiren 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğunu, 100 mikrolitre% 0.1 jelatin çözeltisi ile şeffaf diplerle kaplayın ve plakaları oda sıcaklığında iki saat inkübe edin. Jelatin katılaşırken, ilgilenilen hücreleri kültür şişelerinin dibinden kaldırmak için bir tripsin EDTA çözeltisi kullanın, hücreleri ayrıldıktan sonra 50 mililitrelik bir konik tüpte taze büyüme ortamında yeniden süspanse edin.

Saydıktan sonra, hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peleti taze büyüme ortamında mililitre konsantrasyonu başına bir kez 10 ila beşinci canlı hücreye kadar yeniden süspanse edin. Plakalar hazır olduğunda, fazla jelatin çözeltisini atın ve plakaları bir laboratuvar dokusu üzerinde kurutun. Daha sonra kuyucukları 200 mikrolitre PBS ile yıkayın ve yıkamayı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bir gece inkübasyon için oyuk başına 200 mikrolitre hücre ile değiştirin.

Ertesi sabah, büyüme ortamını kuyulardan atmak için plakaya hafifçe vurun ve plakayı bir kağıt havlu üzerinde baş aşağı kurulayın. Daha sonra her bir oyuktaki hücreleri oyuk başına 100 mikrolitre yükleme boya çözeltisi ile etiketleyin ve plakayı karanlıkta oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin. Hücreler inkübe edilirken, kemokin plakasına oyuk başına 75 mikrolitre CXCL12 ve bileşik plakanın her bir oyuğuna 50 mikrolitre ilgilenilen bileşik ekleyin.

Ardından, floresan plaka okuyucunun soğutucu ünitesini ve ardından plaka okuyucunun kendisini açın. Sistemin başlaması için birkaç dakika izin verdikten sonra plaka okuyucu yazılımını açın. Test protokolünü ayarlamak için, ayarlar sekmesi altında okuma modunu ve yükleme boyası için uygun uyarma ve emisyon dalga boylarını seçin.

Bileşik plakadaki bileşiklerin otomatik olarak karıştırılması için transfer sıvısı ile karışım sekmesini seçin. Sıvı transferi sekmesinde, ölçüm plakasına aktarılacak bileşik plakadan her bir oyuktan 20 mikrolitre ayarlayın ve pipet uçlarını sıvı yüzeyinin 20 mikrolitre altına yerleştirin. Aspirasyon hızını saniyede 50 mikrolitreye ve dağıtım hızını saniyede 25 mikrolitreye ayarlayın ve transfer sıvısı ile okumaya tıklayın.

İlk aralık sırasında, bileşikler ölçüm plakasına dağıtılmadan önce kaydedilecek 10 okuma ve sonrasında tamamlanacak 10 okuma ile bir saniyelik okuma aralığı süresine sahip 60 okuma seçin. 30 saniyelik bir okuma aralığı süresi ve 18 okuma ile ikinci aralığı ayarlayın. Protokol için üç uçlu yıkama seçin, her yıkama adımını uygun yıkama sıvısını, bir yıkama döngüsünü, hızlı bir pompa hızını ve yıkama başına beş vuruşu içerecek şekilde ayarlayın.

Pipetleyicinin 300 saniyelik duraklamasını dahil etmek için pipetleyiciyi duraklatma işlevini kullanın ve CXCL12 çözeltisinin kemokin plakası içinde otomatik olarak karıştırılmasına izin vermek için transfer sıvısı ile karışım ayarını kullanın. Sonraki transfer sıvısı sekmesinde, ölçüm plakasına aktarılacak kemokin plakasının her bir oyuğundan 25 mikrolitre ayarlayın ve uçları sıvı yüzeyinin 20 mikrolitre altına yerleştirin. Aspirasyon hızını saniyede 50 mikrolitreye ve dağıtım hızını saniyede 25 mikrolitreye ayarlayın.

İlk aralığı, bir saniyelik okuma aralığı süresiyle 145 okumayı içerecek şekilde ayarlamak için transfer sıvısı ile okuma düğmesini kullanın. İkinci aralığı altı saniye ve 20 okuma aralığı süresine ayarlayın. Üç yıkama ucu döngüsü daha seçin.

Ardından sahne sıcaklığını ayarla'ya tıklayın ve cihaz sıcaklığını 37 santigrat dereceye ayarlayın. Yükleme boyası inkübasyonunun sonunda, tamponu ölçüm plakasından atın ve plakayı bir laboratuvar dokusu üzerinde kurutun. Hücreleri tahlil tamponu kuyusu başına 150 mikrolitre ile yıkayın ve tamponu iki dakika sonra 80 mikrolitre tahlil tamponu ile değiştirin.

Ölçüm plakasını okuma konumuna, bileşik plakayı kaynak iki konumuna, kemokin plakasını kaynak üç konumuna ve kaynak bir konuma bir kutu siyah uç yerleştirin. Cihazı kapatın ve plaka üzerindeki arka plan bağıl ışık birimlerini ve floresan varyansını belirlemek için protokol sinyali testine tıklayın. Açılan pencerede test sinyalini seçin.

8.000 ila 10.000 bağıl ışık birimi arka plan değerleri elde edilirse, güncelle'yi seçin ve ana protokolü kaydetmek için kaydet'e tıklayın. Ardından testi başlatmak için çalıştır'a basın. Bu grafikte, kalsiyum salınımındaki doza bağlı artış ile ilişkili floresanda doza bağlı bir artış gözlenebilir.

CXCL12 ile indüklenen floresan seviyelerinin artması, kemokin ilavesinden sonraki ilk ölçüm ile protokoldeki son ölçüm arasındaki taban çizgisi üzerinden minimum ve maksimum yanıt arasındaki farka dayalı olarak bir doz yanıt eğrisinin oluşturulmasına izin verir. Karşılık gelen fonksiyonel kemokin reseptörü CXCR4'ten yoksun hücreler kullanıldığında yüksek konsantrasyonda bile CXCL12 tarafından floresan kalsiyum ile ilgili hiçbir yanıt uyandırılmadı, bu da CXCL12 ile uyarılmış ölçümün reseptör özgüllüğünü gösterdi. Bu hücre bazlı test için önemli bir uygulama, ön inkübasyonu takiben, yanıtı inhibe etmeyen aktif olmayan kontrol bileşiklerine kıyasla, hücrelerde CXCL12'nin neden olduğu kalsiyum mobilizasyonunu doza bağlı olarak inhibe eden küçük molekülleri tanımlamaktır.

Küçük moleküllerin inhibitör gücünü belirlemek için, doğrusal olmayan regresyon kullanılarak inhibitör moleküller için bir doz yanıt eğrisi oluşturulabilir. Bu test, başka bir kemokin reseptörü olan CCR5, doğal kemokin agonisti CCL5 ile uyarıldığında, floresanda doza bağlı bir artışın gözlendiği bu deneyde, daha fazla optimizasyon olmadan veya çok az daha fazla optimizasyonla diğer G proteinine bağlı reseptörleri incelemek için kullanılabilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, reseptör aktivasyonu üzerine hücre içi kalsiyum iyonlarının mobilizasyonu yoluyla sinyal veren diğer birçok G-proteinine bağlı reseptörü incelemek için kullanılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, bu hücresel testin CXCL4 kemokin reseptörünün agonistlerini ve antagonistlerini tanımlamak için nasıl kullanılabileceğini iyi anlamış olmalısınız.