Zika virüs belirli tanılama Epitope bulma

Bu deneyin genel amacı, Zika virüsü antikorlarını tespit etmek için bir tanı testinde kullanılmak üzere Zika virüsüne özgü peptitleri tanımlamaktır. Bu çok önemlidir, çünkü virüs yaklaşık 10 gün içinde kandan kaybolur ve antikorlar yıllarca devam eder. Bu yöntem, enfekte bir bireyden alınan bir serum örneğinde IgM veya IgG antikorlarını yakalayan peptitleri tanımlamak için tüm Zika proteomunun bir mikrodizisini kullanarak antijenleri ve epitopları tanımlamamıza izin verir.

Hem erken antikorları, IgM'yi hem de daha sonraki antikorları, IgG'yi tespit etmenin ana avantajı, klinisyene enfeksiyonun bir zaman çizelgesini sağlamaktır. Ve bu özellikle hamile kadınlarda önemlidir. Bu protokol, Zika virüsü enfeksiyonunun nedeni hakkında bilgi sağlarken, protein dizisi biliniyorsa bu patojen için spesifik bir mikrodizi kullanılarak diğer patojenlere uygulanabilir.

Pudrasız eldivenler kullanarak cam sürgüyü kenarlarından tutun. Cam sürgü boyutları 75,4 milimetre x 25,0 milimetre ve 1 milimetre kalınlığındadır. Slaytı, mikrodizi yüzeyi yukarı bakacak şekilde inkübasyon tepsisine yerleştirin.

Mikrodizi slaytının kırılmasını önlemek için boş slayt tutucuları boş slaytlarla doldurun. Contanın parlak tarafını aşağı bakacak şekilde mikrodizi baskılı yüzeye yerleştirin. İyi bir konum sağlamak için, contanın ve taban plakasının vida deliklerini üst üste getirin.

Bir mikrodizi odası oluşturmak için tepsinin üst kısmını contanın üzerine yerleştirin. Kelebek vidaları birbiri ardına alternatif bir düzende elinizle eşit şekilde sıkarak sürgüyü tepsiye sabitleyin. Sol üstten başlayın ve sağ alta doğru ilerleyin.

Kapağı inkübasyon tepsisine yerleştirin. Mikrodizi yüzeyinin çizilmesini önlemek için mikrodizinin dikkatli bir şekilde kullanılması çok önemlidir. Çözeltiler, mikrodizi odasının köşesine eklenir ve daha sonra köşeden çıkarılır.

İyi bir tarama görüntüsü sağlamak için mikrodizinin kurutulması da önemlidir. Mikrodiziyi, mikrodizi başına 2.000 mikrolitre standart tampon ile oda sıcaklığında 140 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde 15 dakika inkübe edin. Mikrodizi odasının köşesinden bir pipetle aspire ederek standart tamponu çıkarın, ardından mikrodiziyi 60 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 140 dakika boyunca bir engelleme tamponu ile bloke edin.

Mikrodizi odasının köşesinden bir pipetle aspirasyon yaparak engelleme tamponunu çıkarın. Boyama tamponunda 1: 5.000 oranında seyreltilmiş anti-insan IgM florokrom konjuge ikincil antikoru mikrodiziye ekleyin. Daha sonra mikrodiziyi karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 140 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.

Mikrodizi odasının köşesinden aspire ederek ikincil antikoru çıkarmak için bir pipet kullanın. Mikrodiziyi, 2000 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında mikrodizi başına standart tampon ile 140 mikrolitre ile bir dakika yıkayın. Gösterilen tekniği kullanarak standart tamponu çıkarın ve yıkamayı iki kez tekrarlayın.

Ardından, slaytı iki kez yeni hazırlanmış 200 mililitre daldırma tamponuna daldırın. Slayt yüzeyine dokunmadan fazla sıvıyı slaytın üstünden altına çok dikkatli bir şekilde aspire ederek mikrodiziyi yaklaşık bir dakika boyunca dikkatlice kurutun. Bu videonun ilerleyen bölümlerinde gösterildiği gibi slaydı bir mikrodizi tarayıcı okuyucusunda analiz edin.

Serum örneğini 56 santigrat derecede 30 dakika boyunca etkisiz hale getirin. Daha sonra numuneyi 16.000 RCF'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Numuneyi kullanana kadar dört santigrat derecede tutun.

Daha sonra mikrodiziyi boyama tamponu ile oda sıcaklığında 140 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde 15 dakika inkübe edin. Mikrodizi odasının köşesinden bir pipetle aspire ederek boyama tamponunu çıkarın. Serum örneğini ve boyama tamponunu 1: 1.000 seyreltme ile başlayarak seyreltin.

Seyreltilmiş numuneyi, 140 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde dört santigrat derecede gece boyunca mikrodizi ile inkübe edin. Gösterilen tekniği kullanarak seyreltilmiş serum örneğini çıkarın. Ardından mikrodiziyi daha önce olduğu gibi üç kez yıkayın.

Boyama tamponundaki ikincil antikoru seyreltin. Boyama tamponunda 1: 5.000 seyreltmede anti-insan IgM florokrom konjuge antikor veya anti-insan IgG florokrom konjuge antikor kullanın. Daha sonra kontrol etiketli antikoru, seyreltilmiş ikincil antikor ile boyama tamponunda 1:1000 oranında bir seyreltmede karıştırın.

Mikrodizi ile oda sıcaklığında karanlıkta 30 dakika ve 140 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. Seyreltilmiş ikincil ve etiketli antikorların karışımını, mikrodizi odasının köşesinden bir pipetle aspire ederek çıkarın. Ardından mikrodiziyi standart tamponla üç kez yıkayın.

Her yıkama, 140 rpm'de bir orbital çalkalayıcıda bir dakika sürer. Son olarak, yıkama tamponunu daha önce olduğu gibi mikrodizi odasından çıkarın. Mikrodizi taraması yapmak için, slaytı iki kez 200 mililitre yeni hazırlanmış daldırma tamponuna daldırın.

Slayt yüzeyine dokunmadan slaytın üstünden altına doğru çok dikkatli bir şekilde aspire ederek mikrodiziyi yaklaşık bir dakika kurutun. Tarayıcının talimatlarını izleyerek mikrodiziyi tarayın. Slaytı, yazdırılan yüzeyi yukarı bakacak şekilde tarayıcıya yerleştirin.

Yeni bir proje oluşturun ve tarama alanını seçin. Tarayıcı parametrelerini 21 mikron çözünürlük, hem 700 hem de 800 nanometre kanallar için 7,0 yoğunluk, orta tarama kalitesi ve 0,8 ofset ile ayarlayın. Tarama çizimi görüntüsünü 16 bit gri tonlamalı TIF dosya formatı olarak alın ve kaydedin.

Verileri analiz etmek için ham görüntüyü açın. Ardından dizi ızgara dosyasını açın. Bilgisayarın faresi veya klavyesinin ok tuşlarını kullanarak dizi ızgarasını tarama görüntüsüne hizalayın.

Her nokta için sinyal yoğunluğunu, arka plan değerini ve karşılık gelen peptit dizisini içeren bir okuma dosyası oluşturan belirli yazılımda seçimi nicelleştir'i seçin. Son olarak, karanlıkta kapalı olarak oksijensiz nitrojen veya argon gazı altında dört santigrat derecede kapalı olarak saklayın. Burada gösterilen, 1:250 oranında seyreltilmiş spesifik bir Zika virüsü serum numunesi ile inkübe edildikten sonra mikrodizinin anti-insan IgG ile boyanmasının ham floresan görüntüsüdür.

HA kontrol peptitleri mikrodiziyi çerçeveler. IgG'ye güçlü bir şekilde tepki veren peptitler yakınlaştırma panelinde gösterilir. Benzer şekilde, burada gösterilen, 1:250 oranında seyreltilmiş spesifik bir Zika virüsü serum numunesi ile inkübe edildikten sonra mikrodizinin anti-insan IgM ile boyanmasının ham bir floresan görüntüsüdür.

Yine, HA kontrol peptitleri mikrodiziyi çerçeveler. IgM'ye güçlü bir şekilde tepki veren peptitler yakınlaştırma panelinde gösterilir. Burada, konakçı serum numune peptitlerinde IgM ile reaksiyona giren temsili bir Zika virüsü epitop konsensüs dizisi gösterilmektedir.

Epitop konsensüs dizisindeki peptitler kırmızı renkle vurgulanır ve en yüksek floresan yoğunluğuna sahip peptit kalın harflerle işaretlenir. Bu videoyu izledikten sonra, yüksek yoğunluklu bir peptit mikrodizisinin nasıl işleneceğini iyi anlamış olmalısınız. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa 24 saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, mikrodizi yüzeyinin çizilmesini önlemek için mikrodiziyi dikkatli bir şekilde tutmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, tanımlanan peptitlerin diğer Flavivirüs antikorlarına değil, spesifik olarak Zika virüsü antikorlarına bağlanıp bağlanmadığını belirlemek için ELISA veya bir yüzey plazmon rezonans bağlama testi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, serum ve tükürük örneklerini kullanarak tanısal peptitlerin keşfi için tanı alanındaki araştırmacıların önünü açacaktır.

Zika virüsü gibi bulaşıcı ajanlarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken serum örneğinin ısıyla etkisiz hale getirilmesi ve Biyogüvenlik Seviye 2 tesislerinde çalışma gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.