Name: Zika virüs belirli tanılama Epitope bulma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Keşfedin Zika virüsüne özgü peptitleri tanı için yüksek yoğunluklu mikrodizi kullanarak. Bu yöntem IgM ve IgG antikorlarını tespit ederek enfeksiyon zaman çizelgesi sağlar ve diğer patojenlere uyarlanabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Geçerli destek NIDCRR44 DE024456 bir SBIR (küçük iş yenilik araştırma) yönetim ek grant tarafından sağlanır. NIDCR dışında gelişti NIDCR HIV verme doğrulayıcı bir bakım noktası kontrol kalkınma HIV U01 DE017855 verin. Biz minnetle kabul Silke Weisenburger(PEPperPRINT Heidelberg, Germany) onun teknik yardım ve tür destek için. Ayrıca NYU Langone Tıp Merkezi LI-COR Odyssey görüntüleme sistemi için teşekkür ediyoruz.

Bu veri, New York University College, diş hekimliği bir devam eden araştırma parçasıdır ve New York Üniversitesi Tıp Fakültesi, IRB kurumsal inceleme kurulca onaylanmış # H10-01894. Bu çalışmada kullanılan klinik örnekler daha önce kullanılan tanı ve izinle üzerinden Wadsworth Center, New York Dışişleri Bakanlığı Sağlık, Albany, NY de-tespit edildi.
1. ZIKV yüksek yoğunluklu peptid Mikroarray slayt yükleme içinde belirli bir kuluçka tepsi
<ol><li>Cam slayt pudrasız eldiven kullanarak kenarları tarafından ele. Cam slayt 75.4 mm 25.0 mm ve 1 mm kalın boyutlardır. Slaydı yukarı dönük olacak şekilde Mikroarray yüzeyli kuluçka tepsisine yerleştirin.</li>
	<li>Aşağıya doğru Mikroarray yazdırılan yüzeye karşı karşıya mühür parlak yanına koyun. İyi bir pozisyon sağlamak için vida deliklerini taban plakası ve mühür üst üste.</li>
	<li>Üst kısmındaki tepsiyi Mikroarray odası oluşturmak için mühür üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Slayt içinde belgili tanımlık tepsi eşit taktıktan birbiri ardına sağ alt tarafından takip sol üst başlayarak bir alternatif model elle sıkılaştırma tarafından güvenli. Kuluçka tepsisi kapağını yerleştirin.</li>
</ol>2. arka plan etkileşim algılama: Mikroarray ikincil antikorlar ile boyama
Not: bir pipet (Standart ve engelleme arabellekleri, seyreltilmiş ikincil antikorlar) çözümleri Mikroarray odası köşede yatırmak için kullanabilir.
<ol><li>Standart arabelleği (0,45 µm filtre ile filtre 1 fosfat tamponlu tuz (PBS), %0.05 ara 20, pH 7.4, x) ile Mikroarray kuluçkaya (toplam hacmi 2.000 µL/Mikroarray), oda sıcaklığında (RT) üzerinde bir orbital Çalkalayıcı 140 devirde 15 dakika.</li>
	<li>Standart arabellek Mikroarray odası köşesinden bir pipet ile alıyorum tarafından kaldırın. Boş slayt sahipleri Mikroarray slayt kırma önlemek için boş slaytlar ile doldurun.</li>
	<li>RT üzerinde bir orbital Çalkalayıcı 140 RPM, 60 dk için engelleme arabellek (toplam hacmi 2.000 µL/Mikroarray) ile Mikroarray engelleyin.</li>
	<li>Engelleme arabellek Mikroarray odası köşesinden bir pipet ile alıyorum tarafından kaldırın.</li>
	<li>İkincil antikor, Birleşik Anti-insan IgM fluorochrome ile Mikroarray kuluçkaya, RT, 30 dk içinde bir orbital Çalkalayıcı 140, karanlık için (%10 standart arabellek arabellek engelleme) seyreltilmiş 1: boyama içinde 5.000 (toplam hacmi 2.000 µL/Mikroarray) tampon d/dak.</li>
	<li>İkincil antikor Mikroarray odası köşesinden bir pipet ile alıyorum tarafından kaldırın.</li>
	<li>3 Mikroarray yıkama x, 1 min başına yıkama ile standart arabellek (2.000 µL/Mikroarray RT bir orbital Çalkalayıcı 140 devirde tarih itibariyle toplam hacmi. Her yıkama sonra standart arabellek Mikroarray odası köşesinden bir pipet ile alıyorum tarafından kaldırın.</li>
	<li>Slayt 2 sokmak içine taze hazırlanmış daldırma arabellek (1 mM Tris, pH 7,4) x, (toplam hacmi 200 mL).</li>
	<li>Mikroarray dikkatle, yaklaşık 1 dakika için slayt altına çok dikkatli bir şekilde üstten aşırı sıvı slayt yüzeyine dokunmadan alıyorum tarafından kuru. Slayt içinde a microarray tarayıcı okuyucu analiz.</li>
</ol>3. Serum barındırması Mikroarray pozlama
Dikkat: Seviye 2 (BSL-2) serum örnekleri potansiyel bulaşıcı doğası nedeniyle laboratuvar güvenlik koşulları altında bu adımı gerçekleştirin. Bir sınıf II biyolojik güvenlik içinde dolap (BSC) çalışır.
<ol><li>Serum örneği için 30 dk 56 ° C'de ve 16.000 rcf, santrifüj 4 ° C135 min için devre dışı bırakabilirsiniz. Not: bir pipet (boyama, standart tampon ve seyreltik serum) çözümleri Mikroarray odası köşede yatırmak için kullanabilir.</li>
	<li>Serum örneği boyama arabelleği 1:1,000 (toplam hacmi 2.000 μL/Mikroarray) seyreltme ile başlayan sulandırmak. 4 ° C'de kullanımı kadar devam et.</li>
	<li>RT bir orbital Çalkalayıcı 140 devirde tarih itibariyle 15 dakika Mikroarray boyama arabelleği (toplam hacmi 2.000 μL/Mikroarray) ile kuluçkaya.</li>
	<li>Boyama arabellek Mikroarray odası köşesinden bir pipet ile alıyorum tarafından kaldırın.</li>
	<li>Gecede 4 ° C'de bir orbital Çalkalayıcı 140 devirde üzerinde seyreltik serum örneği ile Mikroarray kuluçkaya.</li>
	<li>Seyreltik serum örneği tarafından Mikroarray odası köşesinden bir pipet ile alıyorum kaldırın.</li>
	<li>3 Mikroarray yıkama x, 1 min başına yıkama ile standart arabellek (2.000 μL/Mikroarray RT bir orbital Çalkalayıcı 140 devirde tarih itibariyle toplam hacmi. Her yıkama sonra standart arabellek Mikroarray odası köşesinden bir pipet ile alıyorum tarafından kaldırın.</li>
</ol>4. ikincil antikorlar ve etiketli denetim antikorlar ile boyama
Not: bir pipet (Standart arabellekleri, seyreltilmiş ikincil ve etiket antikorlar) çözümleri Mikroarray odası köşede yatırmak için kullanabilir.
<ol><li>İkincil antikor boyama arabellekte sulandırmak. Not: Kullanım Anti-insan IgM fluorochrome antikor veya anti-insan IgG fluorochrome konjuge antikor 1:5,000 (toplam hacmi 2.000 µL/Mikroarray) Boyama arabellekte bir seyreltme, Birleşik.</li>
	<li>Mix kontrol etiket antikor (monoklonal anti-HA fluorochrome Birleşik), daha önce tampon boyama seyreltilmiş ikincil antikor ile tampon boyama içinde 1:1,000 (toplam hacmi 2 000 µL/Mikroarray) seyreltme.</li>
	<li>RT, 30 dk içinde karanlık bir orbital Çalkalayıcı 140 devirde Mikroarray ile kuluçkaya.</li>
	<li>Seyreltilmiş ikincil ve etiket antikorlar tarafından Mikroarray odası köşesinden bir pipet ile alıyorum kaldırın.</li>
	<li>3 x standart arabellek (toplam hacmi 2.000 µL/Mikroarray) ile yıkayın. Her yıkama 1dk bir orbital Çalkalayıcı 140 devirde üzerinde içindir. Her yıkama sonra standart arabellek Mikroarray odası köşesinden bir pipet ile alıyorum tarafından kaldırın.</li>
</ol>5. Mikroarray tarama
<ol><li>Slayt 2 sokmak x içine taze hazırlanmış daldırma arabellek (1 mM Tris, pH 7,4) (toplam hacmi 200 mL).</li>
	<li>Kuru Mikroarray dikkatle, çok dikkatli bir şekilde en baştan slayt köküne slayt yüzeyine dokunmadan alıyorum tarafından yaklaşık 1 dk,.</li>
	<li>Tarayıcının talimatları Mikroarray inceden inceye gözden geçirmek. Slayt tarayıcı üzerine yazdırılan yüzeye yukarı dönük olacak şekilde yerleştirin.</li>
	<li>Yeni bir proje oluşturmak ve tarama alanını seçin. Tarayıcı parametreleri olarak belirleme: çözünürlük: 21 µm, 700 ve 800 nm kanallar için yoğunluğu: 7.0, tarama kalitesi: Orta ve uzaklık: 0.8.</li>
	<li>Elde etmek ve tarama raw görüntü bir 16-bit gri tonlamalı TIFF dosya biçiminde kaydedin.</li>
</ol>6. Mikroarray belirli bir yazılım kullanarak çözümleme
<ol><li>Ham görüntü (TIFF İmaj) açın. Dizi kılavuz dosyasını açın.</li>
	<li>Bilgisayar fare veya klavye ok tuşları ile tarama görüntü dizi kılavuza hizalayın.</li>
	<li>"Ölçmek seçimi" sinyal yoğunluğu her nokta için arka plan değeri ve karşılık gelen peptit dizisi içeren bir okuma dosyası oluşturur belirli yazılımında seçin. Not: Bu çıkış dosyası Ayrıca ek çözümleme ve grafik için bir elektronik tablo programına aktarılabilir.</li>
</ol>7. Mikroarray depolama
<ol><li>Oksijen serbest azot veya argon gazı altında 4 ° C'de karanlıkta mühürlü Mikroarray saklayın.</li>
</ol>

<ol><li>Kelser, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meet+dengue%27s+cousin%5BTitle%5D)+AND+%22Zika.+Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Meet dengue's cousin.</a> Zika. Microbes Infect. 18 (3), 163-166 (2016).</li>
<li>Musso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Zika+virus+in+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Virol%22%5BJournal%5D)">Detection of Zika virus in saliva.</a> J Clin Virol. 68, 53-55 (2015).</li>
<li>Siqueira, W. L., et al. <a target="_blank" href="https://www.oralhealthgroup.com/features/oral-clinical-manifestations-patients-infected-zika-virus/">Oral Clinical Manifestations of Patients Infected with Zika Virus.</a> Oral Health. , (2016).</li>
<li>Duarte, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+of+Zika+Virus+Infection+in+Pregnant+Women%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Bras+Ginecol+Obstet%22%5BJournal%5D)">Challenges of Zika Virus Infection in Pregnant Women.</a> Rev Bras Ginecol Obstet. 38 (6), 263-265 (2016).</li>
<li>Buus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+mapping+of+linear+antibody+epitopes+using+ultrahigh-density+peptide+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays.</a> Mol Cell Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).</li>
<li>Kouzmitcheva, G. A., Petrenko, V. A., Smith, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+diagnostic+peptides+for+lyme+disease+through+epitope+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Identifying diagnostic peptides for lyme disease through epitope discovery.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 8 (1), 150-160 (2001).</li>
<li>Hamby, C. V., Llibre, M., Utpat, S., Wormser, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Peptide+library+screening+to+detect+a+previously+unknown+linear+diagnostic+epitope%3A+proof+of+principle+by+use+of+lyme+disease+sera%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Use of Peptide library screening to detect a previously unknown linear diagnostic epitope: proof of principle by use of lyme disease sera.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 12 (7), 801-807 (2005).</li>
<li>t Hoen, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+display+screening+without+repetitious+selection+rounds%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Phage display screening without repetitious selection rounds.</a> Anal Biochem. 421 (2), 622-631 (2012).</li>
<li>Townend, J. E., Tavassoli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traceless+Production+of+Cyclic+Peptide+Libraries+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Traceless Production of Cyclic Peptide Libraries in E. coli.</a> ACS Chem Biol. 11 (6), 1624-1630 (2016).</li>
<li>Turchetto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+expression+of+animal+venom+toxins+in+Escherichia+coli+to+generate+a+large+library+of+oxidized+disulphide-reticulated+peptides+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">High-throughput expression of animal venom toxins in Escherichia coli to generate a large library of oxidized disulphide-reticulated peptides for drug discovery.</a> Microbial Cell Factories. 16 (1), 6(2017).</li>
<li>Carmona, S. J., Sartor, P. A., Leguizamon, M. S., Campetella, O. E., Aguero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+Peptide+Discovery%3A+Prioritization+of+Pathogen+Diagnostic+Markers+Using+Multiple+Features%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Diagnostic Peptide Discovery: Prioritization of Pathogen Diagnostic Markers Using Multiple Features.</a> Plos One. 7 (12), e50748(2012).</li>
<li>Lagatie, O., Van Dorst, B., Stuyver, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+three+immunodominant+motifs+with+atypical+isotype+profile+scattered+over+the+Onchocerca+volvulus+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Identification of three immunodominant motifs with atypical isotype profile scattered over the Onchocerca volvulus proteome.</a> PLoS Negl Trop Dis. 11 (1), e0005330(2017).</li>
<li>Basile, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+an+ELISA+kit+%28YF+MAC-HD%29+to+detect+IgM+to+yellow+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Development and validation of an ELISA kit (YF MAC-HD) to detect IgM to yellow fever virus.</a> J Virol Methods. 225, 41-48 (2015).</li>
<li>Madden, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK153387/">The BLAST Sequence Analysis Tool.</a> The NCBI Handbook. , 2nd ed, (2013).</li>
<li>Services, U. S. D. oH. aH. <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/">Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL)</a>. , 5th ed, Vol. HHS Publication No. (CDC) 21-1112 (2009).</li>
<li>Pellois, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individually+addressable+parallel+peptide+synthesis+on+microchips%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Individually addressable parallel peptide synthesis on microchips.</a> Nat Biotech. 20 (9), 922-926 (2002).</li>
<li>Stafford, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22261726">Physical Characterization of the "Immunosignaturing Effect".</a> Mol Cell Proteomics. 11 (4), (2012).</li>
<li>Gardner, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+screening+for+anti-CMV+biologics+identifies+a+broadly+neutralizing+epitope+of+an+essential+envelope+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Functional screening for anti-CMV biologics identifies a broadly neutralizing epitope of an essential envelope protein.</a> Nat Commun. 7, (2016).</li>
<li>Nixon, C. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28468980">Identification of protective B-cell epitopes within the novel malaria vaccine candidate P. falciparum Schizont Egress Antigen-1.</a> Clin Vaccine Immunol. , (2017).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Biz tüm Zika virüs protein (Fransız Polinezya zorlanma) sıra içeren bir yüksek yoğunluklu peptid Mikroarray kullanan bir iletişim kuralı tasarlanmıştır. Mikrodizi yazdırma 3,423 farklı örtüşen doğrusal peptidler tarafından üretildi. Her peptid 15 amino asitler yapıldı ve onun en yakın komşu sırada (Yani, 14 kalıntı örtüşme) üzerinden tek bir kalıntı tarafından çeşitli. Daha kısa örtüştüğü yazdırılabilmesi için epitope eşleme ile uzun örtüştüğü daha kesin olsa da. Her peptid güvenilirliği artırmak için yinelenen ...

Vektörel çizimler, dağılım ve belirtiler Dang Chikungunya virüsü enfeksiyonu ve1ile paylaşır çünkü Zika virüs (ZIKV) tanı klinik belirtiler dayalı meydan okuyor. Olumsuz gebelik çıktıları gebelik sırasında ZIKV ile enfekte kadınlarda için risk göz önüne alındığında, 3 virüs arasında ayırt etmek önemlidir. Geçerli moleküler tanı testleri belirli olmasına rağmen onlar sadece akut enfeksiyon2,3nispeten kısa dönemde kan ya da tükürük yararlıdır. Serolojik deneyleri enfeksiyon4bu başlangıç dönemi dışında tanı için gereklidir.
ZIKV belirli serolojik tahlil gelişimi iki nedenden dolayı zordur: ilk olarak, insan bağışıklık sistemi yanıt Zika antijenleri şu anda bilinmemektedir; ve ikincisi, korunmuş flaviviruses amino asit dizileri antikor olan teşvik. Hedefimiz işlem Tanı'daki kullanılmak üzere benzersiz ZIKV belirli peptidler keşfetmek oldu. FAJ, bakteriyel, dahil olmak üzere tüm proteinler kapsayan ekran peptid kitaplıkları için farklı yaklaşımlar geliştirilmiştir ve Maya yüzey görüntülemek5,6,7,8,9, 10. Hızlı ve ucuz yüksek üretilen iş serolojik gösterimleri11,12 izin veren bir yüksek yoğunluklu peptid Mikroarray kullanmak bizim strateji olmuştur ve daha sonra belirlenen peptidler geçerli serolojik geliştirmek için kullanılabilir deneyleri ZIKV enfeksiyon algılanması için.
Bu iletişim kuralı bir yüksek yoğunluklu peptid Mikroarray (şekil 1) kullanarak Zika virüs belirli tanılama peptidler keşfi sağlar. Yüksek yoğunluklu peptid Mikroarray peptid lazer baskı teknolojisi kullanılarak üretilmiştir. 3,423 amino asit kalıntıları eklenmesi ile oluşan tüm ZIKV protein sıra tabanlı Fransız Polinezya strain (GenBank: KJ776791.2), 14 amino asit kalıntılarında için yinelenen bir çakışma ile 15 doğrusal kalıntılarının bloklar halinde standart cam slayt üzerinde yazılı bir Toplam 6,846 peptid noktalar. Tüm Zika protein sıra peptidler yanı sıra Mikroarray grip hemagglutinin kullanır (HA) peptidler iç kontrol için.
Bir Zika olumlu Wadsworth Merkezi'nden (Albany, NY), elde edilen serum örneği belirli immünglobulin M (IgM) ve immünoglobulin G (IgG) Reaktif peptidler tanımlamak için kullanılan geçerliliği. Örnek ile gecede kuluçka sonra Mikroarray bir ikincil fluorochrome konjuge antikoru (Anti-insan IgM veya anti-insan IgG) ile lekeli ve Mikroarray tarayıcı üzerinde analiz. Miktar spot yoğunluklarda ve peptid ek açıklama Mikroarray üretilen aynı şirket tarafından sağlanan özel bir yazılım ile gerçekleştirildi.

<table><tbody><tr><td>PEPperCHIP Özel Peptit Mikrodizisi</td><td>PEPperPRINT</td><td>PPC.001.001</td><td>Özel peptit mikrodizisi: mikrodizimiz tüm Zika virüsü protein dizisini içerir</td></tr><tr><td>PEPperCHIP kuluçka tepsisi 3/1</td><td>PEPperPRINT</td><td>PPC.004.001</td><td></td></tr><tr><td>PEPperCHIP Boyama Kiti (680 nm) (anti-HA, DyLight etiketleme)</td><td>PEPperPRINT</td><td>PPC.037.002</td><td></td></tr><tr><td>PepSLide Analiz Cihazı</td><td>PEPperPRINT</td><td>PSA.004.001</td><td>Windows için 14 günlük ücretsiz Lisans</td></tr><tr><td>Rockland Engelleme tamponu</td><td>Rockland</td><td>MB-070</td><td></td></tr><tr><td>anti-insan IgM (mu zinciri) DyLight 800</td><td>Rockland</td><td>609-145-007</td><td></td></tr><tr><td>anti-insan IgG Fc DyLight 680</td><td>Thermo Scientific</td><td>SA5-10138</td><td></td></tr><tr><td>LI-COR Odyssey Görüntüleme Sistemi</td><td>LI-COR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbital çalkalayıcı cihazı</td><td>IKA</td><td>MTS 2/4 dijital mikro titre çalkalayıcı</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deltagraph</td><td>Redrocks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

zika virüs belirli tanılama epitope bulma

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

Yüksek yoğunluklu peptid microarrays tek standart mikroskobu slaytta altı binden fazla peptidler tarama sağlar. Bu yöntem ilaç bulma, terapötik hedef tanımlama ve geliştirme için uygulanabilir teşhis. Burada, belirli Zika virüs (ZIKV) tanı peptidler yüksek yoğunluklu peptid Mikroarray kullanarak keşfetmek için bir protokol mevcut. ZIKV enfeksiyon 3,423 benzersiz 15 doğrusal amino asit (aa) kalıntıları bir 14-aa kalıntısı örtüşme ile tercüme tüm ZIKV protein içeren bir yüksek yoğunluklu peptid Mikroarray ile inkübe için doğrulanmış bir insan serum örneği içinde yinelenen baskılı. Aynı dizi içinde farklı ikincil antikorlar ile boyama, immünglobulin M (IgM) ve immünoglobulin G (IgG) antikor serum içinde mevcut bağlayabilirsiniz peptidler tespit ettik. Bu peptidler daha fazla doğrulama denemeleri için seçildi. Bu protokol için tasarım, işlemek ve yüksek yoğunluklu peptid Mikroarray çözümlemek için takip strateji tanımlarlar.

Açıklanan protokolü kullanılarak elde edilen sonuçları Şekil 2 ' de gösterilen ve şekil 3. Hiçbir arka plan etkileşimleri Mikroarray ikincil Anti-insan IgM (veri gösterilmez) ile önceden boyama zaman kaydedilmiştir. Anti-bir insanla IgM boyama eşlenik yukarıda arka plan yeşil Floresans yoğunluklarını, IgM ile Bu peptidler (Şekil 2) ana bilgisayar serum örneğinde bağlama gösteren birç...

Bu protokol için bir yüksek yoğunluklu peptid Mikroarray kullanarak Zika virüs belirli tanılama peptidler keşfetmek için bir teknik açıklar. Bu iletişim kuralı readly ortaya çıkan diğer bulaşıcı hastalıklar için adapte edilebilir.

Zika virüs belirli tanılama Epitope bulma

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

Bu deneyin genel amacı, Zika virüsü antikorlarını tespit etmek için bir tanı testinde kullanılmak üzere Zika virüsüne özgü peptitleri tanımlamaktır. Bu çok önemlidir, çünkü virüs yaklaşık 10 gün içinde kandan kaybolur ve antikorlar yıllarca devam eder. Bu yöntem, enfekte bir bireyden alınan bir serum örneğinde IgM veya IgG antikorlarını yakalayan peptitleri tanımlamak için tüm Zika proteomunun bir mikrodizisini kullanarak antijenleri ve epitopları tanımlamamıza izin verir.Hem erken antikorları, IgM'yi hem de daha sonraki antikorları, IgG'yi tespit etmenin ana avantajı, klinisyene enfeksiyonun bir zaman çizelgesini sağlamaktır. Ve bu özellikle hamile kadınlarda önemlidir. Bu protokol, Zika virüsü enfeksiyonunun nedeni hakkında bilgi sağlarken, protein dizisi biliniyorsa bu patojen için spesifik bir mikrodizi kullanılarak diğer patojenlere uygulanabilir.Pudrasız eldivenler kullanarak cam sürgüyü kenarlarından tutun. Cam sürgü boyutları 75,4 milimetre x 25,0 milimetre ve 1 milimetre kalınlığındadır. Slaytı, mikrodizi yüzeyi yukarı bakacak şekilde inkübasyon tepsisine yerleştirin.Mikrodizi slaytının kırılmasını önlemek için boş slayt tutucuları boş slaytlarla doldurun. Contanın parlak tarafını aşağı bakacak şekilde mikrodizi baskılı yüzeye yerleştirin. İyi bir konum sağlamak için, contanın ve taban plakasının vida deliklerini üst üste getirin.Bir mikrodizi odası oluşturmak için tepsinin üst kısmını contanın üzerine yerleştirin. Kelebek vidaları birbiri ardına alternatif bir düzende elinizle eşit şekilde sıkarak sürgüyü tepsiye sabitleyin. Sol üstten başlayın ve sağ alta doğru ilerleyin.Kapağı inkübasyon tepsisine yerleştirin. Mikrodizi yüzeyinin çizilmesini önlemek için mikrodizinin dikkatli bir şekilde kullanılması çok önemlidir. Çözeltiler, mikrodizi odasının köşesine eklenir ve daha sonra köşeden çıkarılır.İyi bir tarama görüntüsü sağlamak için mikrodizinin kurutulması da önemlidir. Mikrodiziyi, mikrodizi başına 2.000 mikrolitre standart tampon ile oda sıcaklığında 140 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde 15 dakika inkübe edin. Mikrodizi odasının köşesinden bir pipetle aspire ederek standart tamponu çıkarın, ardından mikrodiziyi 60 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 140 dakika boyunca bir engelleme tamponu ile bloke edin.Mikrodizi odasının köşesinden bir pipetle aspirasyon yaparak engelleme tamponunu çıkarın. Boyama tamponunda 1: 5.000 oranında seyreltilmiş anti-insan IgM florokrom konjuge ikincil antikoru mikrodiziye ekleyin. Daha sonra mikrodiziyi karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 140 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.Mikrodizi odasının köşesinden aspire ederek ikincil antikoru çıkarmak için bir pipet kullanın. Mikrodiziyi, 2000 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında mikrodizi başına standart tampon ile 140 mikrolitre ile bir dakika yıkayın. Gösterilen tekniği kullanarak standart tamponu çıkarın ve yıkamayı iki kez tekrarlayın.Ardından, slaytı iki kez yeni hazırlanmış 200 mililitre daldırma tamponuna daldırın. Slayt yüzeyine dokunmadan fazla sıvıyı slaytın üstünden altına çok dikkatli bir şekilde aspire ederek mikrodiziyi yaklaşık bir dakika boyunca dikkatlice kurutun. Bu videonun ilerleyen bölümlerinde gösterildiği gibi slaydı bir mikrodizi tarayıcı okuyucusunda analiz edin.Serum örneğini 56 santigrat derecede 30 dakika boyunca etkisiz hale getirin. Daha sonra numuneyi 16.000 RCF'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Numuneyi kullanana kadar dört santigrat derecede tutun.Daha sonra mikrodiziyi boyama tamponu ile oda sıcaklığında 140 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde 15 dakika inkübe edin. Mikrodizi odasının köşesinden bir pipetle aspire ederek boyama tamponunu çıkarın. Serum örneğini ve boyama tamponunu 1: 1.000 seyreltme ile başlayarak seyreltin.Seyreltilmiş numuneyi, 140 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde dört santigrat derecede gece boyunca mikrodizi ile inkübe edin. Gösterilen tekniği kullanarak seyreltilmiş serum örneğini çıkarın. Ardından mikrodiziyi daha önce olduğu gibi üç kez yıkayın.Boyama tamponundaki ikincil antikoru seyreltin. Boyama tamponunda 1: 5.000 seyreltmede anti-insan IgM florokrom konjuge antikor veya anti-insan IgG florokrom konjuge antikor kullanın. Daha sonra kontrol etiketli antikoru, seyreltilmiş ikincil antikor ile boyama tamponunda 1:1000 oranında bir seyreltmede karıştırın.Mikrodizi ile oda sıcaklığında karanlıkta 30 dakika ve 140 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. Seyreltilmiş ikincil ve etiketli antikorların karışımını, mikrodizi odasının köşesinden bir pipetle aspire ederek çıkarın. Ardından mikrodiziyi standart tamponla üç kez yıkayın.Her yıkama, 140 rpm'de bir orbital çalkalayıcıda bir dakika sürer. Son olarak, yıkama tamponunu daha önce olduğu gibi mikrodizi odasından çıkarın. Mikrodizi taraması yapmak için, slaytı iki kez 200 mililitre yeni hazırlanmış daldırma tamponuna daldırın.Slayt yüzeyine dokunmadan slaytın üstünden altına doğru çok dikkatli bir şekilde aspire ederek mikrodiziyi yaklaşık bir dakika kurutun. Tarayıcının talimatlarını izleyerek mikrodiziyi tarayın. Slaytı, yazdırılan yüzeyi yukarı bakacak şekilde tarayıcıya yerleştirin.Yeni bir proje oluşturun ve tarama alanını seçin. Tarayıcı parametrelerini 21 mikron çözünürlük, hem 700 hem de 800 nanometre kanallar için 7,0 yoğunluk, orta tarama kalitesi ve 0,8 ofset ile ayarlayın. Tarama çizimi görüntüsünü 16 bit gri tonlamalı TIF dosya formatı olarak alın ve kaydedin.Verileri analiz etmek için ham görüntüyü açın. Ardından dizi ızgara dosyasını açın. Bilgisayarın faresi veya klavyesinin ok tuşlarını kullanarak dizi ızgarasını tarama görüntüsüne hizalayın.Her nokta için sinyal yoğunluğunu, arka plan değerini ve karşılık gelen peptit dizisini içeren bir okuma dosyası oluşturan belirli yazılımda seçimi nicelleştir'i seçin. Son olarak, karanlıkta kapalı olarak oksijensiz nitrojen veya argon gazı altında dört santigrat derecede kapalı olarak saklayın. Burada gösterilen, 1:250 oranında seyreltilmiş spesifik bir Zika virüsü serum numunesi ile inkübe edildikten sonra mikrodizinin anti-insan IgG ile boyanmasının ham floresan görüntüsüdür.HA kontrol peptitleri mikrodiziyi çerçeveler. IgG'ye güçlü bir şekilde tepki veren peptitler yakınlaştırma panelinde gösterilir. Benzer şekilde, burada gösterilen, 1:250 oranında seyreltilmiş spesifik bir Zika virüsü serum numunesi ile inkübe edildikten sonra mikrodizinin anti-insan IgM ile boyanmasının ham bir floresan görüntüsüdür.Yine, HA kontrol peptitleri mikrodiziyi çerçeveler. IgM'ye güçlü bir şekilde tepki veren peptitler yakınlaştırma panelinde gösterilir. Burada, konakçı serum numune peptitlerinde IgM ile reaksiyona giren temsili bir Zika virüsü epitop konsensüs dizisi gösterilmektedir.Epitop konsensüs dizisindeki peptitler kırmızı renkle vurgulanır ve en yüksek floresan yoğunluğuna sahip peptit kalın harflerle işaretlenir. Bu videoyu izledikten sonra, yüksek yoğunluklu bir peptit mikrodizisinin nasıl işleneceğini iyi anlamış olmalısınız. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa 24 saat içinde yapılabilir.Bu prosedürü denerken, mikrodizi yüzeyinin çizilmesini önlemek için mikrodiziyi dikkatli bir şekilde tutmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, tanımlanan peptitlerin diğer Flavivirüs antikorlarına değil, spesifik olarak Zika virüsü antikorlarına bağlanıp bağlanmadığını belirlemek için ELISA veya bir yüzey plazmon rezonans bağlama testi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, serum ve tükürük örneklerini kullanarak tanısal peptitlerin keşfi için tanı alanındaki araştırmacıların önünü açacaktır.Zika virüsü gibi bulaşıcı ajanlarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken serum örneğinin ısıyla etkisiz hale getirilmesi ve Biyogüvenlik Seviye 2 tesislerinde çalışma gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

zika-virus-specific-diagnostic-epitope-discovery

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Ortaya çıkan bir patojen olan Zika Virüsü (ZIKV), fetal gelişimsel anormallikler ve mikrosefali ile bağlantılıdır. Etkili bir enfeksiyöz hücre kültürü sisteminin kurulması, ZIKV replikasyonu çalışmalarının yanı sıra aşı ve ilaç geliştirme çalışmaları için de çok önemlidir. Bu çalışmada ZIKV ile ilgili çeşitli virolojik analizler gösterilmiş ve tartışılmıştır.

Zika Virüs Bulaşıcı hücre kültürü sistemine ve<em&gt; İn Vitro</emİnterferonların&gt; profilaktik etkisi

Burada yazarlar, saflaştırılmış bir monoklonal antikor ve nokta-leke hibridizasyonulama yoluyla peptit taraması kullanarak doğrusal bir antijenik epitop tanımlamak için basit ve verimli bir protokol sunmaktadır. Tanımlanan epitop daha sonra terapötik ve tanısal uygulamalarda kullanılabilir.

Peptid, bir monoklonal antikor tarafından tanınan lineer B-hücresi epitopunun belirlenmesi: Tarama destekli

Bu protokol, iki-plazmid bulaşıcı bir cDNA klonundan bulaşıcı Zika virüsünün iyileşmesini tanımlıyor.

Yeni Bir Dünyadan Rekombinant Virüsün Kurtarılması ve Karakterizasyonu Zika Virüsü Bulaşıcı Klon

Geçerli Zika, chikungunya ve dang virüs karmaşık numune hazırlama ve pahalı araçları gerektirir ve düşük kaynak ortamlarda kullanmak zor tespit etmek için teşhis multiplexed. Algılamak ve yüksek duyarlılık ve özgüllük ile bu virüs ayırt etmek için hedef özgü strand displaceable probları ile izotermal amplifikasyon kullanan bir tanı gösteriyoruz.

Çoğaltılmış izotermal amplifikasyon Zika, Chikungunya ve dang 1 tespit etmek için teşhis platformu dayalı

Ifnar1- / - fare modeli immunoprivileged organlarda Zika virüs (ZIKV) enfeksiyon için antijen spesifik T-hücre yanıtları değerlendirmek için bir protokol açıklanmıştır. Bu yöntem koruma hücresel mekanizmaları ve immunopathogenesis ZIKV aşı soruşturma için çok önemli ve aynı zamanda onların etkinliğini değerlendirme için değerlidir.

Virüslü Ifnar1- / - farelerin Immunoprivileged organlarında Zika virüs özgü T hücreli yanıt-e doğru değerlendirilmesi

Biz insan serumu, birincil insan hücreleri ve enfeksiyon miktar nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu tarafından kullanarak Zika virüs enfeksiyonu önceden varolan bağışıklık dang virüs karşı etkisini değerlendirmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Antikor-bağımlı donanýmýn birincil insan hücrelerinde Zika şunun miktar

Protokolün amacı, enfeksiyon sonrasında faredeki birden fazla organdan Zika virüsünü izole ederek ve ölçerek viral hastalıkları araştırmak için kullanılan teknikleri göstermektir.

Farede Birden Fazla Organdan Zika Virüsünün İzolasyon ve Nicelikselleştirilmesi

Sunulan protokol, Aedes aegypti sivrisinek popülasyonlarının Zika gibi belirli bir virüs için vektör yeterliliğini bir muhafaza ortamında belirleyebilir.

Zika Virüsü Kullanan Aedes aegypti Sivrisineklerinde Vektör Yetkinlik Analizleri

Bu çalışmada, Zika virüsü replikasyonunun inhibitörlerini yüksek verimli bir tarama formatında taramak için replikon bazlı ve viral enzim bazlı tahlillerde kullanılan protokolleri açıklıyoruz.

Zika Virüs Replikasyonunun inhibitörlerini taramak için yüksek verimli Antiviral Tahliller

Multipleks floresan immünolojik testler, seroloji testleri için bir referans haline geliyor. Ancak bunların uygulamaları, karmaşıklık ve zaman alıcı boncuk-analit birleştirme işlemleri nedeniyle sınırlıdır. Bu rapor, standart yöntemle karşılaştırılabilir ve sonuç alma süresini önemli ölçüde azaltan yarı otomatik, tekrarlanabilir bir multipleks mikroküre boncuk birleştirme protokolü sunar.

Arbovirüslere Karşı Antikor Yanıtlarının Tespiti için Multipleks Serolojik Test

Keşfedin Zika virüsüne özgü peptitleri tanı için yüksek yoğunluklu mikrodizi kullanarak. Bu yöntem IgM ve IgG antikorlarını tespit ederek enfeksiyon zaman çizelgesi sağlar ve diğer patojenlere uyarlanabilir.

Zika virüs belirli tanılama Epitope bulma

Daha fazla video keşfet