Name: Roman besleyici-Alerjik sistemi fare doğal katil hücreler Vitro seri üretim için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Öğrenin, besleyici katman içermeyen bir sistem kullanarak fare kemik iliğinden yüksek saflıkta doğal katil hücrelerin seri üretimi için geliştirilmiş yöntemi. Bu teknik, doğuştan gelen bağışıklık ve kanser immünoterapisi araştırmalarını kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışmada araştırma hibe Konseyi, Hong Kong (GRF 468513, CUHK3/CRF/12R) ve yenilik ve Hong Kong Teknoloji Fonu (Its/227/15, Its INP/164/16 Its-INP/242/16), doğrudan hibe tarafından araştırma-CUHK (2016.035) ve Hong Kong bilim adamı desteklenmiştir Program.
H.-yl tasarlanmış ve tüm deneylerin denetimli ve el yazması hazırlanması için katkıda bulunmuştur. Saatleri arasında-K.T. gerçekleştirilen deneyler, veri analiz ve el yazması hazırlanması için katkıda bulunmuştur. PC-T. T., J.Y.-F.C., js-C., H., s.-M.W., ve G.-yl hayvan numuneleri ve hayvan deneylerinde katıldı. Js, X.-R.H., ve K.-F.T. el yazması hazırlanması için katkıda bulunmuştur.

Alma ve kemik iliği türevi NK ayırt (BM-NK) hücreleri için protokolü daha önce yayımlanmış yöntemleri20,21,22dayanır. Fareler ile tüm yordamlar tarafından hayvan etik deneysel Komitesi (AEEC) Hong Kong Çin Üniversitesi'nde onaylanmış olması.
1. OP9 koşullu orta hazırlanması
<ol><li>Fare stroma hücre hattında OP9 Alfa-MEM %20 FBS, 100 U/mL penisilin G ve hava/CO2 oksijen bir atmosferde 37 ° C'de 100 µg/mL streptomisin içeren kültür (% 95: % 5).<ol>
<li>Bir hemasitometre, o zaman tohum 2 x 106 OP9 hücrelerin her 75 cm2 kültür şişesi ile orta 15 mL içeren hücreleri saymak. Kültür 48 h için.</li>
		<li>Kültür % 80 izdiham ulaştığında, PBS 10 mL ile şişeye yıka ve düz Alfa-MEM orta (olmadan FBS ve antibiyotik) flask başına 20 mL ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kültür balon, 24 h OP9 durumu orta toplamak, 0.25 µm polyethersulfone (PES) filtresi ile hücre artıkları kadar temiz ve 4 ° c (2 hafta içinde kullanım) korumak.</li>
</ol>2. izolasyon fare kemik iliği hücrelerinin
<ol><li>Bir pentobarbitone aşırı doz (100 mg/kg, mayi enjeksiyon) 12 haftalık C57BL/6J fareyle ötenazi. Nefes, eksikliği nedeniyle ölüm onaylamak sonra uyluk kemikleri ile cerrahi bıçak kesim kavşak kemikleri arasında hasat ve nazik çizilmemesi tarafından bıçakla kalan kas kaldırın.</li>
	<li>Kemikleri soğutulmuş steril Alfa-MEM içeren bir 50 mL santrifüj tüpü yerleştirin ve sonra bir biyogüvenlik kabini içinde aşağıdaki adımları gerçekleştirin.</li>
	<li>Alfa-MEM orta atmak ve kemikler için %30 70 etanol ile durulayın s.</li>
	<li>Kemikler iki kere kalan etanol temizlemek için buz gibi steril PBS ile yıkayın.</li>
	<li>5 mL buz gibi PBS de içeren bir harç kemiklerde aktarmak ve yavaşça kemikleri bir havaneli ile fragmentize (onları ezmek değil).</li>
	<li>Kemikleri hafifçe kemik iliği hücre PBS serbest bırakmak için havaneli dönen tarafından tahrik. PBS içeren kemik iliği hücreleri yeni bir 50 mL santrifüj tüpüne toplamak.</li>
	<li>Beyaz renkli kemik parçaları haline kadar 2.6 için dört kez tekrarlayın.</li>
	<li>Tüp 4 ° C'de 5 min için 465 x g, santrifüj kapasitesi sonra süpernatant atmak.</li>
	<li>Pelet 18 mL steril distile su ile resuspend ve o 30 için stand izin s kırmızı kan hücreleri kaldırmak için.</li>
	<li>Buz gibi 10 2 mL ekleyin X reaksiyon durdurmak için PBS daha sonra karışımı lysed kırmızı kan hücreleri kaldırmak için 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla filtre uygulayın.</li>
	<li>Tüp 4 ° C'de 5 min için 465 x g, santrifüj kapasitesi Pelet buz gibi PBS 20 mL ile resuspend.</li>
	<li>Hücreleri adım 2.11 ikinci kez tekrar ederek yıkayın.</li>
	<li>Bir 100-mm steril Petri 20 ile desteklenmiş çanak içine 10 mL OP9 koşullu orta adım 1.2 ile hücre Pelet transfer % FBS ve 0,5 ng/mL karışımı fare IL-7, 30 ng/mL fare SCF ve 100 U/mL fare flt3L.</li>
	<li>Çanak %5 CO2 2 h. Transfer için 37 ° C'de ekli olmayan hücreleri bir yoğunluğu 5 x 105 canlı hücre/mL (hemasitometre trypan-mavi dışlama ile tarafından hücreleri hesaplama), yeni bir kültür kaba adım 2,13 olduğu gibi aynı orta formülüyle kuluçkaya ve % 5 CO237 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>4 günde değişiklik OP9 koşullu orta kültür durumuna FBS ve fare IL-2 2.000 U/mL % 20 ile desteklenmiştir.</li>
	<li>Kültür orta 3 günde yeniler; Olgun NK hücreleri gün 7 tarafından elde edilen ve 4 bölümde olduğu gibi nitelikli.</li>
</ol>3. siRNA aracılı Gene Silencing ayırt NK hücre
<ol><li>SiRNA veya saçma denetim (NC) ürün kılavuzuna göre bir transfection maddesi ile premix.</li>
	<li>3.1 herhangi bir zamanda noktada 0 günden beri adımıysa.</li>
	<li>50 ekleyin siRNA veya hücreleri NC karışıma adım 2,14 nM.</li>
	<li>3.1 her orta ferahlık (örneğin, 0, 4 ve 7 gün) üzerinde deneysel son noktaya kadar adımları yineleyin.</li>
</ol>4. NK hücre farklılaşması kullanarak Akış Sitometresi Analizi
<ol><li>Bir uygun zamanda noktada hücreleri ayırt süspansiyon toplamak ve buz gibi PBS ile yıkayın.</li>
	<li>Hücreleri hücre fiksasyon arabelleği ürün kılavuzuna göre ile düzeltmek.</li>
	<li>Buz gibi PBS sabit hücrelerle yıkama ve Akış Sitometresi boyama arabellek içeren Cy3 Birleşik Anti-fare NKp46 100 µL hücrelerde 1 x 106 ve seyreltme oranı 1: 100 anti-fare CD244 antikor PE Birleşik resuspend.</li>
	<li>Örnek 2 h için oda sıcaklığında karanlık leke.</li>
	<li>PBS, 300 µL lekeli örnekleriyle resuspend sonra FACS veri elde etmek ve Cytobank platform20 ile (http://cytobank.org/) analiz.</li>
</ol>

<ol><li>Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunoediting%3A+integrating+immunity%27s+roles+in+cancer+suppression+and+promotion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer immunoediting: integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion.</a> Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).</li>
<li>Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+tumour+micro-environment+heterogeneity+on+therapeutic+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response.</a> Nature. 501 (7467), 346-354 (2013).</li>
<li>Rusakiewicz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+infiltrates+are+prognostic+factors+in+localized+gastrointestinal+stromal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Immune infiltrates are prognostic factors in localized gastrointestinal stromal tumors.</a> Cancer Res. 73 (12), 3499-3510 (2013).</li>
<li>Mamessier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+breast+cancer+cells+enhance+self+tolerance+by+promoting+evasion+from+NK+cell+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Human breast cancer cells enhance self tolerance by promoting evasion from NK cell antitumor immunity.</a> J Clin Invest. 121 (9), 3609-3622 (2011).</li>
<li>Stern, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-emptive+immunotherapy+with+purified+natural+killer+cells+after+haploidentical+SCT%3A+a+prospective+phase+II+study+in+two+centers%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Pre-emptive immunotherapy with purified natural killer cells after haploidentical SCT: a prospective phase II study in two centers.</a> Bone Marrow Transplant. 48 (3), 433-438 (2013).</li>
<li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+adoptive+transfer+and+in+vivo+expansion+of+human+haploidentical+NK+cells+in+patients+with+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Successful adoptive transfer and in vivo expansion of human haploidentical NK cells in patients with cancer.</a> Blood. 105 (8), 3051-3057 (2005).</li>
<li>Rubnitz, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKAML%3A+a+pilot+study+to+determine+the+safety+and+feasibility+of+haploidentical+natural+killer+cell+transplantation+in+childhood+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">NKAML: a pilot study to determine the safety and feasibility of haploidentical natural killer cell transplantation in childhood acute myeloid leukemia.</a> J Clin Oncol. 28 (6), 955-959 (2010).</li>
<li>Curti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+transfer+of+alloreactive+haploidentical+KIR+ligand-mismatched+natural+killer+cells+after+infusion+in+elderly+high+risk+acute+myeloid+leukemia+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Successful transfer of alloreactive haploidentical KIR ligand-mismatched natural killer cells after infusion in elderly high risk acute myeloid leukemia patients.</a> Blood. 118 (12), 3273-3279 (2011).</li>
<li>Bachanova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+acute+myeloid+leukemia+by+haploidentical+natural+killer+cells+is+improved+using+IL-2+diphtheria+toxin+fusion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Clearance of acute myeloid leukemia by haploidentical natural killer cells is improved using IL-2 diphtheria toxin fusion protein.</a> Blood. 123 (25), 3855-3863 (2014).</li>
<li>Stringaris, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemia-induced+phenotypic+and+functional+defects+in+natural+killer+cells+predict+failure+to+achieve+remission+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Leukemia-induced phenotypic and functional defects in natural killer cells predict failure to achieve remission in acute myeloid leukemia.</a> Haematologica. 99 (5), 836-847 (2014).</li>
<li>Rouce, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TGF-%CE%B2%2FSMAD+pathway+is+an+important+mechanism+for+NK+cell+immune+evasion+in+childhood+B-acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">The TGF-β/SMAD pathway is an important mechanism for NK cell immune evasion in childhood B-acute lymphoblastic leukemia.</a> Leukemia. 30 (4), 800-811 (2016).</li>
<li>Derynck, R., Akhurst, R. J., Balmain, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+signaling+in+tumor+suppression+and+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genet%22%5BJournal%5D)">TGF-β signaling in tumor suppression and cancer progression.</a> Nature Genet. 29 (2), 117-129 (2001).</li>
<li>Massague, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18662538">TGFbeta in cancer.</a> Cell. 134 (2), 215-230 (2008).</li>
<li>Ikushima, H., Miyazono, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta+signalling%3A+a+complex+web+in+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">TGFbeta signalling: a complex web in cancer progression.</a> Nat Rev Cancer. 10 (6), 415-424 (2010).</li>
<li>Pickup, M., Novitskiy, S., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+TGF%CE%B2+in+the+tumour+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The roles of TGFβ in the tumour microenvironment.</a> Nat Rev Cancer. 13 (11), 788-799 (2013).</li>
<li>Rook, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+transforming+growth+factor+beta+on+the+functions+of+natural+killer+cells%3A+depressed+cytolytic+activity+and+blunting+of+interferon+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Effects of transforming growth factor beta on the functions of natural killer cells: depressed cytolytic activity and blunting of interferon responsiveness.</a> J Immunol. 136 (10), 3916-3920 (1986).</li>
<li>Bellone, G., Aste-Amezaga, M., Trinchieri, G., Rodeck, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+NK+cell+functions+by+TGF-beta+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of NK cell functions by TGF-beta 1.</a> J Immunol. 155 (3), 1066-1073 (1995).</li>
<li>Trotta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+utilizes+SMAD3+to+inhibit+CD16-mediated+IFN-%CE%B3+production+and+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity+in+human+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">TGF-β utilizes SMAD3 to inhibit CD16-mediated IFN-γ production and antibody-dependent cellular cytotoxicity in human NK cells.</a> J Immunol. 181 (6), 3784-3792 (2008).</li>
<li>Shull, M. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1436033">Targeted disruption of the mouse transforming growth factor-β1 gene results in multifocal inflammatory disease.</a> Nature. 359 (6397), 693-699 (1992).</li>
<li>Chen, T. J., Kotecha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytobank%3A+providing+an+analytics+platform+for+community+cytometry+data+analysis+and+collaboration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Microbiol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cytobank: providing an analytics platform for community cytometry data analysis and collaboration.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 377, 127-157 (2014).</li>
<li>Williams, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+NK1.1%2B%2C+Ly49%2B+NK+cells+from+flt3%2B+multipotent+marrow+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of NK1.1+, Ly49+ NK cells from flt3+ multipotent marrow progenitor cells.</a> J Immunol. 163 (5), 2648-2656 (1999).</li>
<li>Fathman, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+earliest+natural+killer+cell-committed+progenitor+in+murine+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Identification of the earliest natural killer cell-committed progenitor in murine bone marrow.</a> Blood. 118 (20), 5439-5447 (2011).</li>
<li>Tang, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smad3+promotes+cancer+progression+by+inhibiting+E4BP4-mediated+NK+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Smad3 promotes cancer progression by inhibiting E4BP4-mediated NK cell development.</a> Nat Commun. 6 (8), 14677(2017).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Mevcut çalışma, kemik iliği türevi fare NK hücreleri içinde vitroüretimi için yeni bir yöntem anlatmıştık. Özgün sistem21,22 cep besleyiciye başarıyla büyük ölçüde daha farklılaşma sistem istikrarlı OP9 hücreleri koşullu medyum tarafından değiştirilir. Buna ek olarak, sistem yüksek miktar üretebilir ve olgun NK saflığı vitro hem de in vivo hücre deneyleri, mekanik çalışma gibi insan hastalıkları NK hücreleri translasyonel araştırma kola...

Kanser ilerleme dahil olmak üzere ana bilgisayar kaynaklı immunocytes, örneğin, NK hücreleri tümör microenvironment1,2' de, büyük ölçüde bağlıdır. Çeşitli çalışmalar intratumoral NK hücreleri ile tümör ilerleme3,4olumsuz correlated gösterdi. Buna ek olarak, klinik çalışmalar NK hücre evlat edinen tedavisi kanser5,6,7,8,9için olası bir strateji olduğunu gösterdi. NK hücre tabanlı kanserli hastalarda son zamanlarda solid tümör için bir tedavi seçeneği olarak önerildi ama immünsüpresif sitokinler salgılanmasını ve downregülasyon ligandlar solid tümör microenvironment içinde etkinleştirme nedeniyle sorunlar yok 10,11. Dönüştürme büyüme faktörü-β (TGF-β) karsinojenezis içinde baskılayıcı bir rol oynamaya önermek, ama garip bir şekilde kanser hücrelerinin da tümör gelişimi12,13,14 desteklemek için TGF-β1 üretmek , 15. TGF-β sinyal NK hücreleri aşağı düzenleyen interferon responsiveness ve CD16 aracılı interferon-gamma (IFN-γ) üretim vitro16,17, via cytolytic faaliyet bastırmak 18.
TGF-β tümör microenvironment sinyal kesintileri kanserleri ortadan kaldırmak için olası bir yol olabilir, ancak tamamen TGF-β sinyal engelleme anti-inflamatuar fonksiyonu, nedeniyle otoimmün hastalıklar gelişimi tarafından kanıtlanan neden olur olumsuz yan etkileri sistemik inflamasyon da dahil olmak üzere, kardiyovasküler kusur ve otoimmünite Mouse modelleri19. Böylece, TGF-β-aracılı immünosupresyon çalışma mekanizması anlama kanser tedavisi için erişilebilir bir terapötik hedef tanımlaması sağlayacaktır.
NK hücre gelişimi için gerekli moleküler olayları aydınlatmak için fare kemik iliği hematopoetik kök hücreler NK içine ayırt20hücreleri için Williams ve ark. bir vitro sistemi kurdu. Bu sistem mekanik çalışma kimliği roman ataları NK hücreleri21de dahil olmak üzere NK hücre gelişimi büyük ölçüde kolaylaştırır. Ancak, kemik iliği ataları OP9 stromal hücreler bir besleyici katman20,21destekleyici sistemdeki kültürlü ve bu türdeş olmayan hücre nüfus büyük ölçüde gen engellemeden, daha fazla uygulama sınırları araçları (örneğin, gen siRNA aracılı susturmak) ayırt NK hücreleri için özel olarak uygulanan.
Burada, daha fazla Williams ve ark20in vitro sistemi değiştirerek geliştirilmiştir besleyici-free sistemi açıklanmaktadır. Sistemimizde, OP9 stromal besleyici hücreler gerekli değildir, ve bunun yerine Koşullu orta NK hücreleri vitrove bu farklılaşma son zamanlarda etkilemeden kullanılır OP9 bizi TGF-β kanser ilerlemesi yoluyla teşvik yapabiliyor ortaya çıkarmak için tümör microenvironment22E4bp4 bağımlı NK hücre gelişimi bastırmak. Bu yeni sistem başarıyla NK hücre gelişimi belirli koşullar altında moleküler mekanizması elucidating bir ücretsiz arka plan yöntem sağlar (örneğin, yüksek TGF-β1, gen siRNA aracılı susturmak, vs.) vitro.

<table><tbody><tr><td>OP9 hücre hattı</td><td>ATCC</td><td>ATCC &reg; CRL-2749 ve ticaret; </td><td></td></tr><tr><td>MEM &alpha;, nükleosit yok</td><td>Gibco</td><td>22561021</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Gibco</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Murin IL-7</td><td>PEPROTECH</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Murin SCF</td><td>PEPROTECH</td><td>250-03</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Murin Flt3-Ligand</td><td>PEPROTECH</td><td>250-31L</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Murin IL-2</td><td>PEPROTECH</td><td>212-12</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamin RNAiMAX Transfeksiyon Reaktifi</td><td>Invitrogen</td><td>1377815</td><td></td></tr><tr><td>IC Fiksasyon Tamponu&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>00-8222-49</td><td></td></tr><tr><td>Akış Sitometrisi Boyama Tamponu&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>00-4222-26</td><td></td></tr><tr><td>PE konjuge anti-fare CD244</td><td>eBioscience</td><td>12-2441-83</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 konjuge anti-fare NKp46</td><td>Bioss</td><td>bs-2417R-cy3</td><td></td></tr><tr><td>Anlamsız kontrol (NC)</td><td>Ribobio</td><td>siN05815122147</td><td></td></tr><tr><td>siRNA fareye karşı E4BP4 mRNA</td><td>Ribobio</td><td>N/A</td><td>5&prime;-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3& asal;</td></tr></tbody></table>

roman besleyici-alerjik sistemi fare doğal katil hücreler vitro seri üretim için

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Doğal öldürücü (NK) hücreleri doğuştan gelen bağışıklık sistemine ait olan ve ilk satır anti-kanser bağışıklık savunma; Ancak, tümör microenvironment görüntülenmez ve altta yatan mekanizma hala büyük ölçüde bilinmiyor. NK hücre tutarlı ve güvenilir bir kaynak eksikliği NK hücre dokunulmazlık araştırma ilerlemesini sınırlar. Burada, yüksek kalite ve kemik iliği türevi fare NK hücreleri besleyici-Alerjik bir koşulda miktarı sağlayabilir bir vitro sistem raporu. Daha da önemlisi, biz da siRNA aracılı gen susturmak başarıyla E4bp4 bağımlı NK hücre olgunlaşma bu sistemi kullanarak engeller olduğunu göstermektedir. Böylece, sistem ayırt bu roman vitro NK hücre dokunulmazlık araştırma için bir biomaterial çözümdür.

Temsilcisi sonuçları açıklanan protokol sonrası elde edilir. Toplam kemik iliği süspansiyon hücre farklılaşma besleyici-Alerjik sistemi altında 11 gün boyunca ekili; nükleer silahların yayılmasına karşı oranı önemli artış gün 7 gün 0 (şekil 1A) toplam hücre sayısı ile karşılaştırıldığında tarafından gözlenmiştir. Olgun NK hücreleri sitoplazmik için nükleer oranı yüksek ve granül-zengin sitoplazma Morfoloji sistemi (şekil ...

Burada, mekanik çalışma içinde in vitro ve in vivoiçin bir besleyici-Alerjik farklılaşma sistemi kullanılarak gen susturmak fare NK hücreleri toplu üretim için bir protokol mevcut.

Roman besleyici-Alerjik sistemi fare doğal katil hücreler Vitro seri üretim için

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Bu yeni besleyici içermeyen sistemin genel amacı, in vitro ve in vivo deneyler için yüksek saflıkta doğal öldürücü hücrelerin seri üretimi için bir yöntem sağlamaktır. Bu yöntem, doğal öldürücü hücre gelişimi ve kanser bağışıklığı dahil olmak üzere doğuştan gelen immünolojideki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, bu yeni besleyici içermeyen sistemin, üretilen doğal öldürücü hücrelerin saflığını büyük ölçüde artırabilmesidir.Bu, in vitro ve in vivo olarak aşağıdaki testleri önemli ölçüde kolaylaştırır. Bu tekniğin endikasyonu, doğal öldürücü bağışıklığa kadar uzanır, çünkü murin doğal öldürücü hücrelerin seri üretimi, kişisel immünoterapi için analiz ve modifikasyon için kanser hastalarının kemik iliğinden üretilebilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler mücadele edecektir çünkü tüketilen ortam, yük fazı büyümesi geçiren OP9 hücresinden toplanmalıdır.Kemik iliği talimat adımlarının öğrenilmesi zor olduğu için bu yöntemin yüz gösterimi kritik öneme sahiptir, çünkü canlılığı korumak için kemiklerin etanol ile en uygun zamanda steril olması gerekir. Bu prosedüre başlamak için, OP9 hücrelerini bir kültür şişesinden toplayın. Tripsin sindirimi

a-novel-feeder-free-system-for-mass-production-murine-natural-killer

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Burada genişletmek ve verimli bir şekilde arındırmak çok sayıda insan NK hücre ve kendi fonksiyonunu değerlendirmek için bir metodu tanımlar.

Genişleme, Saflaştırılması, ve İnsan Periferik Kan NK Hücrelerinin Fonksiyonel Değerlendirme

Bu videoda, doğal öldürücü (NK) hücrelerin bir besleyici hücre hattı kullanılarak doğrudan periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) genişletilmesi için bir teknik gösterilmektedir. PBMC'ler, zara bağlı interlökin-21 (mIL-21) eksprese eden genetik olarak modifiye edilmiş lenfoblastoid besleyici hücrelerle birlikte kültürlenir ve kültür, interlökin-2 (IL-2) ve interlökin-15 (IL-15) sitokinleri ile desteklenir. Birlikte, bu ligand kokteyli, NK hücrelerinin yüksek saflıkta uzun süreli...

Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinden Doğal Öldürücü Hücrelerin Ex Vivo Genişlemesi

Bu protokol, geliştirme, genişleme ve hESC ve iPSCs türetilen NK hücreleri, in vivo görüntüleme açıklar.

Geliştirme, Genişleme ve<em&gt; In vivo</em&gt; İnsan Embriyonik Kök Hücreleri (hESC) den İnsan NK Hücrelerinin İzleme ve ve Bağlı Pluripotent Kök Hücre (iPSCs)

Bu çalışmada, Flt3 ligandı varlığında ortak lenfoid progenitörleri AC-6 besleyici hücrelerle birlikte kültürleyerek verimli bir şekilde pDC üretebilen bir in vitro kültür sistemi sunuyoruz.

AC-6 Besleyici Sistemi kullanılarak Ortak Lenfoid progenitörlerin dan Fare plazmositoid dendritik hücreler İn Vitro Nesil

Burada, fare dalağından çok sayıda murin değişmez doğal öldürücü T hücresi oluşturmak için kullanılabilecek uyarlanmış bir protokol sunuyoruz. Protokol, splenik iNKT hücrelerinin sınırlı sayıda hayvan ve reaktif kullanılarak in vitro olarak zenginleştirilebileceği, izole edilebileceği ve genişletilebileceği bir yaklaşımı özetlemektedir.

Fare Dalak Değişmeyen Doğal Öldürücü T Hücreleri İzolasyon ve Yaygınlaştırılması için optimize Yöntemi

Değişmez doğal öldürücü T (iNKT) hücrelerini fare dalağını zenginleştirmek ve in vitro ve in vivo çalışmalar için uygun sayılara genişletmek için hızlı ve sağlam bir protokol açıklıyoruz.

In vitro ve in vivo Çalışmalar için Fare Değişmez Doğal Öldürücü T Hücrelerinin Saflaştırılması ve Genişlemesi

Burada, periferik kan doğal öldürücü (PBNK), karaciğer dokularından NK hücreleri ve periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) veya kordon kanından (CB) türetilen kimerik antijen reseptörü (CAR)-NK hücrelerini genişletmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu protokol, genişlemiş NK hücrelerinin optimize edilmiş saflığına ek olarak, 221-mIL-21 besleyici hücreler kullanılarak NK ve CAR-NK hücrelerinin genişlemesini göstermektedir.

Doğal Öldürücü (NK) ve Membran Bound-IL-21-Modifiye B Hücre Hattı Kullanarak CAR-NK Hücre Genleşme Yöntemi

Mevcut protokol, hafif sitotoksisiteye sahip CD3-/CD45+CD56+ hücrelerinin, hem 3D hem de 2D kültür koşulları altında insan genişlemiş potansiyel kök hücrelerinden (hEPSC'ler) nasıl ayırt edileceğini göstermektedir. Bu, karmaşık mikro çevrenin tahrip edilmeden rutin fenotipik doğrulamaya izin verir.

İnsan Genişletilmiş Potansiyel Kök Hücrelerden Doğal Öldürücü Hücrelerin Üretilmesi

Doğal öldürücü hücre kaynaklı hücre dışı veziküller (NK-EV'ler), kanser biyoterapötikleri olarak umut verici bir potansiyele sahiptir. Bu metodolojiye dayalı çalışma, büyük miktarlarda yüksek saflıkta NK-EV'leri sürekli olarak üretmek ve izole etmek için tasarlanmış, ölçeklenebilir bir kapalı döngü biyoüretim iş akışı sunmaktadır. Biyo-üretim iş akışı boyunca süreç içi kontrol testi gerçekleştirilir ve EV'lerin ürün piyasaya sürülmesi için kalite standartlarını karşılaması sağlanır.

Doğal öldürücü hücre kaynaklı hücre dışı vezikül bazlı kanser biyoterapötiklerini üretmek ve izole etmek için ölçeklenebilir biyoüretim iş akışı

Bu protokol, Benimseyen Hücre Tedavileri (ACT) ürünlerinin genişletilmesi için ölçeklenebilir bir yöntemi tanımlar; yani Kimerik Antijen Reseptörü (CAR)-T hücreleri ve Sitokin İndüklenen Katil (CIK) hücreleri, gaz geçirimli Hızlı Genişleme (G-Rex) cihazları kullanılarak, klinik açıdan ilgili bir ortamda verimli ve sağlam büyüme göstermektedir.

GMP ölçeklenebilir cihazlarda CAR-T ve sitokin kaynaklı katil hücrelerin verimli ve hızlı üretimi

Öğrenin, besleyici katman içermeyen bir sistem kullanarak fare kemik iliğinden yüksek saflıkta doğal katil hücrelerin seri üretimi için geliştirilmiş yöntemi. Bu teknik, doğuştan gelen bağışıklık ve kanser immünoterapisi araştırmalarını kolaylaştırır.

Roman besleyici-Alerjik sistemi fare doğal katil hücreler Vitro seri üretim için

Daha fazla video keşfet