Embriyonik Neurogenesis çalışmak için bir Model olarak fare arka beyin

Bu prosedürün genel amacı, gelişim sırasında fare embriyonik arka beyninin tüm organına ve histolojik analizine izin vermektir. Bu yöntem, bir memeli model organizmanın arka beynindeki nörojenez ile ilgili gelişmelerin incelenmesine izin verir. Gelişmekte olan fare arka beyni, tüm organ boyunca nörojenez modellerinin gözlemlenmesini kolaylaştıran düz mimarisi nedeniyle nöral progenezin aktivitesini incelemek için mükemmel bir modeldir.

Bu prosedüre, gerekli gebelik aşamasında etik olarak onaylanmış bir prosedür kullanarak zamanlanmış bir hamile dişi fareye ötenazi yaparak başlayın. Keskin bir makas kullanarak periton boşluğunu kesin ve uterusu dikkatlice çıkarın. Embriyoları içeren eksize edilmiş uterusu 20 mililitre buz gibi soğuk PBS içeren 60 milimetrelik plastik bir kaba yerleştirin.

Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak tüm diğer diseksiyonları gerçekleştirin. Beş numaralı Watchmaker forsepslerini kullanarak, embriyoları ortaya çıkarmak için uterus kas duvarını yırtın. Göbek kordonunu keserek her embriyoyu serbest bırakın ve yumurta sarısı kesesini çıkarın.

Her embriyoyu buz gibi PBS ile temiz bir plastik kaba aktardıktan sonra, kafayı kesmek için 55 numaralı Watchmaker forsepslerini kullanın. İsteğe bağlı olarak, genomik DNA izolasyonu ve müteakip genotipleme için küçük bir doku parçasını saklayın. 55 numaralı Watchmaker forsepslerini kullanarak, arka beyin nöro epiteline paralel ve hemen altında arka beyni içeren dokuyu yüz ve ön beyin dokusundan ayırmak için eksize edin.

Arka beyin ve kaudal kafa dokusunu, sırt tarafı yukarı gelecek şekilde konumlandırın ve çatı plakası olarak bilinen ince bir doku tabakasıyla kaplı dördüncü ventrikülü tanımlayın. 55 numaralı Watchmaker forsepslerini kullanarak tavan plakasını dikkatlice delin ve forseps ile fazla dokuyu soyun, orta hat boyunca orta beyin üzerinde rostral olarak ve ardından arka arka beyin ve omurilik üzerinde kaudal olarak hareket edin. Arka beyin şimdi açık bir kitap hazırlığında açığa çıkarılmalıdır.

Arka beyinleri tam montajlı immün etiketlemeye hazırlamak için, kalan mezenşim başını ve arka beynin soyulmuş tarafına bağlı herhangi bir meninksleri dikkatlice uzaklaştırmak için 55 numaralı Watchmaker forsepslerini kullanın. Sadece arka beyin dokusunu bırakmak için orta beyin ve omurilik dokusunu çıkarın. Arka beyinleri vibratom ve kriyo kesitine hazırlamak için, orta beyin ve omurilik dokusunu çıkarmak için 55 numaralı Watchmaker forsepslerini kullanın.

Arka beyinleri plastik tabaktan bir Pasteur pipeti kullanarak yuvarlak tabanlı iki mililitrelik tüplere aktarın. Tüm PBS'yi aspire ettikten sonra, PBS'de çözünmüş hacim başına taze çözülmüş %4 ağırlıkta formaldehit içinde hafif çalkalama ile arka beyinleri iki saat boyunca dört santigrat derecede sabitleyin. Son olarak, arka beyinleri PBS ile üç kez durulayın.

Gerekirse, PBS'deki metanol sanrılarını seri olarak azaltarak oda sıcaklığında her konsantrasyonda beş dakika boyunca arka beyinleri rehidre edin. Ardından, arka beyinlere PBS'ye aktarın. Hafif çalkalama ile PBT içeren PBS'de dört santigrat derecede 30 dakika boyunca arka beyinleri geçirgen hale getirin.

Daha sonra arka beyinleri% 10 ısıyla etkisiz hale getirilmiş keçi serumu içeren PBT'de dört santigrat derecede bir saat inkübe edin. Daha sonra,% 1 ısı ile inaktive edilmiş serum ve birincil antikorlar içeren PBT'de daha önce olduğu gibi arka beyinleri gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, arka beyinleri dört santigrat derecede PBT ile her biri bir saat boyunca yıkayın.

Yıkamayı takiben, kullanılan birincil antikorlara karşı hedeflenen uygun florofor konjuge ikincil antikorları içeren PBT'de arka beyinleri gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Floroforları foto ağartmadan korumak için arka beyinleri bu noktadan itibaren karanlıkta tutun. Daha önce olduğu gibi PBT ile yıkadıktan sonra, antikor bağlanmasının uzun süreli korunması için arka beyinleri PBS'de% 4 formaldehit içinde oda sıcaklığında 15 dakika sonra sabitleyin.

Bu arada, bir cam mikroskop slaytını iki kat siyah elektrik bandı ile örtün ve arka beyni tutacak kadar büyük bir cep oluşturmak için katmanlı banttan küçük bir kare çıkarın. Arka beyni PBS'de iki kez kısa bir süre duruladıktan sonra, bir Pasteur pipeti ile cebe aktarın. Fazla sıvıyı çıkarın ve cebe uygun bir solma önleyici reaktif ekleyin.

Ardından, lamel altında hava kabarcıklarının sıkışmasını önlemek için arka beyni bir cam lamel ile yavaşça örtün. Lameli kapatın ve ince bir oje tabakası ile slayta yapıştırın. Görüntü elde edilene kadar slaytı karanlıkta dört santigrat derecede saklayın.

Arka beyinleri, damıtılmış suda hazırlanan hacim başına ağırlıkça %3 oranında erimiş agaroza gömün. Cut, bir vibratom kullanarak arka beyin bölümlerini 70 mikron kalınlığa aktarır. Yeni kesilmiş her bir bölümü bir boya fırçası ile buz gibi soğuk PBS içeren 24 oyuklu bir plakanın bir kuyusuna aktarın.

Kayan bölümleri metin protokolünde ayrıntılı olarak belirtildiği gibi etiketledikten sonra, PBS'de kısa bir süre yıkayın. Yüzen bölümleri bir boya fırçası kullanarak dikkatlice bir cam mikroskop lamına aktarın. Kurutma kağıdı veya kağıt mendil kullanarak bölümün etrafındaki fazla PBS'yi silin.

PBS'de% 80 gliserol kullanan bölümler değil. Ve hava kabarcıklarının sıkışmasını önlemek için üzerlerini yavaşça bir cam lamel ile örtün. Görüntü elde edilene kadar slaytı karanlıkta dört santigrat derecede saklayın.

Donmadan önce arka beyinleri kriyo ile korumak için arka beyinleri dört santigrat derecede PBS'de hacim başına %30 ağırlıkta sakarozla inkübe edin. Arka beyinleri optik kesme sıcaklığı bileşiğine veya OCT'ye batırın. Daha sonra, arka yağmurları içeren kalıpları kuru buz üzerinde 40 ila 50 santigrat dereceye kadar soğutulmuş izopentana aktararak hızlı bir şekilde dondurun.

Daha sonra, transferlerin arka beyin bölümlerini bir kriyostat kullanarak 10 mikron kalınlığa kadar kesin. Arka beyin bölümlerini elektrostatik olarak yapışkan mikroskop slaytlarına aktarın. Slaytlara bölümleri kurutmak için slaytları oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.

Ardından, OCT'yi çözmek için kriyo bölümlerini PBS ile yıkayın. Bir PAP kalemi kullanarak kriyo bölümlerinin etrafında hidrofobik bir bariyer işaretleyin. Numuneleri, sulu ortama monte edilmiş slaytlar için uygun lenslerin yanı sıra immüno etiketleme için kullanılan floroforlar için uygun optik filtrelerle donatılmış bir Epi-floresan veya konfokal lazer tarama mikroskobu kullanarak görüntüleyin.

Tüm arka beyni veya arka beyin bölümünü görüntülemek için 10 kat büyütme için bir lens kullanın. Niceleme için arka beyin alanlarını görselleştirmek için 40 kat büyütme kullanın. Ve tek tek hücreleri görselleştirmek için 63 kat büyütmeli bir lens kullanın.

Burada, ventriküler bölgedeki nöral progenitör hücrelerin bölünmesini gözlemlemek için tam montajlı immün etiketli arka beyinlerden elde edilen temsili sonuçlar gösterilmiştir. Bu görüntüler, gelişimin ardışık aşamalarında mitotik belirteç fosfo histon H3 kullanılarak elde edildi. Transvers vibratom kesitleri, kinetik ötesi nükleer göç geçiren arka beyin nöral progenitör hücrelerinin yanı sıra ventriküler yüzeydeki mitotik fosfo-histon H3 pozitif hücreleri vurgulamak için bir saatlik bir EdU darbesinin ardından etiketlendi.

Kendini yenileyen nöral progenitör hücrelerin genel oranı, BrdU uygulamasından bir gün sonra embriyolardan alınan enine arka beyin kriyo kesitlerinde kırmızı ve sarı renkli tüm BrdU pozitif hücreler arasında sarı renkli Ki67 BrdU çift pozitif hücrelerinin yüzdesi hesaplanarak belirlenebilir. Arka beyin vibratom bölümleri, nöral progenitör hücre uç ayaklarını ve çıkıntılarını görselleştirmek için RC-2 olarak da bilinen ara filament proteini Nestin için bir antikor ile immüno-etiketlenebilir. Bu videoyu izledikten sonra, düz bir montaj preparatının veya arka beynin enine doku bölümlerinin nasıl analiz edileceğini iyi anlamış olmalısınız.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bir saatten kısa bir sürede 10'a kadar arka beyin diseke edilebilir. Bu prosedürü denerken, ilk önce arka beyin mikro diseksiyonu hakkında bilgi ediniyorsanız, doku korumasını sağlamanın yanı sıra meninkslerden ayrılmayı kolaylaştırdığı için buz gibi soğuk PBS kullanmak önemlidir. Bu prosedürü takiben, nöral progenitörleri diğer hücre tiplerinden ayırmak için arka beynin tek hücreli süspansiyonları üzerinde akış sitometrisi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.

Bu tekniğin kurulması, gelişimsel nörobiyoloji alanındaki araştırmacıların, geleneksel olarak kullanılan omurilik ve ön beyin modellerine alternatif olarak arka beyni kullanarak memeli nörojenez mekanizmalarını keşfetmelerinin yolunu açmıştır. Bu yöntem, memeli arka beyin nörojenezi hakkında fikir verebilir, ancak türler arasındaki yapısal ve moleküler benzerlik derecesi göz önüne alındığında, gelişmekte olan diğer omurgalılara da uygulanabilir. Bu teknik, nörojenezi kontrol eden yeni mekanizmaların keşfedilmesine yardımcı olabilir ve eksenin başka bir yerinde tanımlananların omurgalı beyninin bu bölümünde özetlenip özetlenmediğini belirlemeye yardımcı olabilir.